CN113845448B - 一种放射性18f标记化合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种放射性¹⁸F标记化合物及其应用，其结构式为

其中，R₁为H或¹⁸F，R₂为H或¹⁸F，R₃为H或¹⁸F，R₄为H或¹⁸F，R₅为CH₂CH₂OTs或CH₂CH₂Cl或CH₂CH₂ ¹⁸F，R₆为CH₂CH₂OTs或CH₂CH₂Cl或CH₂CH₂ ¹⁸F，且R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的至少之一为¹⁸F标记。本发明可在硝基还原酶的作用下特异性还原成可以与DNA偶联的分子，不受体内其他分子的干扰。结合PET显像技术可实现硝基还原酶活性相关的生物过程，如细菌感染、乏氧肿瘤等相关疾病的显像诊断和治疗。本发明探针有效解决荧光探针穿透深度不足，同时具有制备简单产率高，体内显像和治疗效果良好等优点，具有很好的临床应用。

Description

一种放射性18F标记化合物及其应用

技术领域

本发明属于医学影像探针技术领域，具体涉及一种放射性¹⁸F标记化合物及其应用。

背景技术

硝基还原酶(Nitroreductase，NTR)是一类依赖于黄素单核苷酸或黄素腺嘌呤二核苷酸的细胞质酶，可以在NADH或NADPH的辅助下将芳香族硝基或杂环硝基逐步还原为氨基。NTR不仅在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中均有表达，在乏氧实体瘤中也有高表达。因此，NTR可以作为体内细菌感染和乏氧肿瘤的标志物。目前的研究中有设计荧光探针通过检测体内硝基还原酶的活性来对相关疾病进行显像。

CN104592984A公开了一种硝基还原酶的特异性荧光探针及其应用，该特异性探针底物为5-硝基苊醌，可用于测定生物体系中硝基还原酶的酶活性。该探针经硝基还原酶代谢后可生成具有双光子荧光属性的代谢产物。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活性及抑制活性评价快速高效等特点。CN105732564A公开了一种新的荧光探针，化学名称为6-((4-硝基苄基)氧基)-2，3，4，4a-四氢-呫吨-1-酮。该探针随硝基还原酶含量的增加荧光强度显著增强，因此，可以通过荧光成像技术检测肿瘤缺氧区域的硝基还原酶含量，从而评价和研究肿瘤缺氧区域的缺氧水平。CN105884734A公开了一种可以检测硝基还原酶的双光子荧光探针，所述荧光探针命名为3-硝基-7-二乙胺基香豆素，该技术方案公开的双光子荧光探针对细胞中的硝基还原酶有响应，并且随着细胞内硝基还原酶浓度的增加，荧光强度相应增强，本发明提供的探针可以通过荧光成像对肿瘤内乏氧区域的硝基还原酶进行检测。CN106749153A公开了一种硝基还原酶的特异性荧光探针及其制备和将其应用于肿瘤靶向荧光成像和监测肿瘤缺氧程度的试剂，由肿瘤生物标记物识别基团(sensor)、肿瘤靶向基团(target)、荧光基团(dye)通过化学键连接而成。该试剂基于肿瘤的缺氧性和硝基还原酶在缺氧肿瘤中的高表达，可在具有缺氧微环境，并高表达硝基还原酶的肿瘤中应用，具有高灵敏度，高特异性的特点，为医学上研究肿瘤和临床上监测、治疗肿瘤转移提供了有效的工具。CN107056618A公开了一种可以检测硝基还原酶的聚集诱导发光(AIE)型荧光探针，所述荧光探针命名为[2-(4-硝基苯基)-1，1，2-三苯基]乙烯。该探针可以通过荧光成像对肿瘤细胞乏氧状态下的硝基还原酶进行检测。CN107446571A公开了一种内质网靶向的双光子硝基还原酶荧光探针，其化学名称为：4-硝基-N-(2-(4-甲基苯磺酰胺基)乙)基-萘酰亚胺。该探针可定位于内质网，对细胞或组织进行双光子荧光检测，灵敏度高，可抗多种干扰物质的干扰。CN109456264A公开了一种检测硝基还原酶的荧光探针及其制备方法与酶促反应的应用，属于工业分析检测技术领域。所述荧光探针为3-(4-(2-(4′-(二苯胺基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-[1，1′-联苯基]-4-基)乙烯基)喹啉-1-溴)丙烷-1-磺酸盐。该技术方案的探针化合物通过引入亲水性基团磺酸根和喹啉盐类增强其亲水性，在硝基还原酶的催化下发生1，6-重排和消除反应，生成羟基，通过分子内电荷转移效应(ICT)引发的荧光变化来实现对酶促反应中NTR的检测分析。该方法具有制备简便、产率较高、且适用于检测酶促反应中高浓度酶含量等优点，在化工领域中的酶促反应体系酶检测领域显示了极大的应用前景。CN109627236A公开一种用于活体检测硝基还原酶的光声探针及其制备方法与应用。该发明克服了荧光探针在活体检测中荧光信号的散射和组织吸收的问题，制备的探针具有光声信号穿透深度大，实现深层组织的成像，反应速度快，特异性好，比率检测更准确。该探针可以用于活体检测硝基还原酶，从而监控肿瘤的乏氧情况；或用于细胞中、生物样品中的硝基还原酶检测。CN110951484A公开了一种苯并噻唑类衍生物作为硝基还原酶荧光探针的应用，具体分子结构为6-(2-(6-硝基苯并噻唑-2-基)乙烯基)萘-2-酚，可用于检测癌细胞缺氧程度。随着硝基还原酶含量的增加探针的荧光强度也显著增强，此外，该探针成功实现了癌细胞缺氧程度的高灵敏检测。CN111303102A公开了一种硝基还原酶响应的乏氧探针的制备与应用。该荧光探针通过分子内电荷转移机制构建，为信号增强型探针，背景信号小。可实现对肿瘤微环境乏氧相关硝基还原酶的高灵敏、高特异性的响应，并应用于乏氧分析和显像研究。CN108727223A公开了一种双光子荧光检测硝基还原酶探针的制备，属于有机荧光探针。该探针可以精确检测细胞内的硝基还原酶含量且避免细胞内的其他还原剂的干扰，同时具有很好的化学稳定性生物兼容性和选择性等特点。该探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用，可以实现细胞水平硝基还原酶含量的检测并指示细胞低氧情况。

在上述的现有技术公开的探针几乎都是基于光学显像的探针，光学探针具有灵敏度高，分辨率好的特点，但由于荧光探针的穿透深度比较低，只能用于细胞或者小动物成像，且在体内光信号容易淬灭，因此难以运用到临床应用。在现有技术中尚未报道有放射性核素标记的探针用于硝基还原酶的检测或者基于硝基还原酶响应用于乏氧肿瘤或者细菌感染的显像研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种放射性¹⁸F标记化合物。

本发明的另一目的在于提供上述放射性¹⁸F标记化合物的应用。

本发明的技术方案如下：

一种放射性¹⁸F标记化合物，其结构式为

其中，

R₁为H或¹⁸F，

R₂为H或¹⁸F，

R₃为H或¹⁸F，

R₄为H或¹⁸F，

R₅为CH₂CH₂OTs或CH₂CH₂Cl或CH₂CH₂ ¹⁸F，

R₆为CH₂CH₂OTs或CH₂CH₂Cl或CH₂CH₂ ¹⁸F，

且R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆中的至少之一为¹⁸F标记。

在本发明的一个优选实施方案中，R₁、R₂、R₃和R₄均为H，R₅为CH₂CH₂ ¹⁸F，R₆为CH₂CH₂OTs。

进一步优选的，其合成路线为：

在本发明的一个优选实施方案中，R₁、R₃和R₄均为H，R₂为¹⁸F，R₅和R₆均为CH₂CH₂Cl。

进一步优选的，其合成路线为：

本发明的另一技术方案如下：

上述放射性¹⁸F标记化合物在制备检测体内硝基还原酶活性的试剂中的应用。

上述放射性¹⁸F标记化合物在制备硝基还原酶高表达相关疾病的诊断试剂中的应用。

在本发明的一个优选实施方案中，所述硝基还原酶高表达相关疾病为细菌感染和乏氧肿瘤。

本发明的有益效果是：

1、本发明可在硝基还原酶的作用下特异性还原成可以与DNA偶联的分子，不受体内其他分子的干扰，解决了荧光探针穿透深度不足的问题，同时具有高灵敏度、高特异性，具有很好的临床应用。重要的是，目前国内外研究中未见报道这类基于硝基还原酶响应的放射性核素标记探针的研究。

2、本发明在细菌感染的小鼠模型中可以有效检测到大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染区域，并有效区分细菌性感染和非细菌性感染，给临床细菌炎症诊断提供有效参考。在非小细胞肺癌模型中，本发明在肿瘤部位具有很好的特异性摄取，而在其他区域代谢较快，信噪比高。

3、本发明所述探针合成过程简单，最终标记产率高且重复性好，均可实现自动化标记模块进行标记，且生产工艺稳定，生产规模、产率及产品质量可满足临床放射性药物的使用需求，有利于探针的商业化应用和临床推广。

附图说明

图1为本发明实施例中的化合物1在硝基还原酶的作用下还原分析图。

图2为本发明实施例中的化合物1在细菌感染模型的PET显像图。

图3为本发明实施例中的化合物1和2在细菌感染和非细菌性感染模型的PET显像图。

图4为本发明实施例中的化合物1和化合物2在非小细胞肺癌皮下瘤模型的PET显像图。

图5为本发明实施例中的化合物2在肝癌、黑色素瘤、胰腺癌、结肠癌、脑胶质瘤模型小鼠的PET显像图。

图6为本发明实施例中的化合物9在非小细胞肺癌肿瘤鼠的治疗效果。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1：化合物1的合成与标记

化合物1的结构式为

化合物1的合成路线如下：

具体包括如下步骤：

(1)准确称取13.8g4-氯硝基苯，25g二乙醇胺和41.4g碳酸钾置于250mL圆底烧瓶中，120℃回流4h。反应后冷却至室温，缓慢滴加到500mL去离子水中。得到的水溶液过滤后用1.5L乙酸乙酯萃取三遍，萃取后的乙酸乙酯溶液通过旋蒸除去溶剂得到红色粗产物。粗产物经柱层析分离(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1)得到化合物5。

(2)准确称取2.26g化合物5溶于20mL二氯甲烷，加入2.01g三乙胺。混合溶液在0℃下反应30min。4.75g对甲苯磺酰氯溶于5mL二氯甲烷溶液，逐滴加入到化合物5与三乙胺的混合溶液中。反应30min后，反应液用二氯甲烷稀释至100mL，并用饱和食盐水洗涤三遍。旋蒸除去有机溶剂，粗产物经柱层析分离(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶5)得到化合物3。

(3)准确称取2.67g化合物3和3.13g四丁基氟化铵，溶于50mL乙腈中，混合液80℃反应1h。反应后旋蒸除去溶剂经柱层析分离(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶8)得到化合物6。

(4)准确称取0.16g氯化铵和0.168g还原铁粉，溶于5mL甲醇和5mL水的混合溶液，室温搅拌30min。0.382g化合物6溶于2mL甲醇，逐滴加入到氯化铵和还原铁粉的混合溶液中。反应液在80℃反应1h，反应后过滤除去固体杂质，滤液旋蒸除去大部分溶剂，粗产物经柱层析分离(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶3)得到化合物7。

(5)准确称取12mg化合物3溶于3mL无水乙腈中，得到4mg/mL的标记前体溶液。准确量取1mL前体溶液置于自动标记模块8号位置的注射器中。仪器自检完成后，从回旋加速器中传入大约500mCi[¹⁸F]^-于模块中，吹干后的[¹⁸F]^-与前体溶液混合，90℃反应10min。反应后经半制备HPLC分离得到目标化合物1，化合物1溶于含有2-3％乙醇的生理盐水中，最终产品活度浓度约为3.5-5mCi/mL。

实施例2：化合物2的合成与标记

化合物2的结构式为

化合物2的合成路线如下：

具体包括如下步骤：

(1)准确称取10g 3，4-二硝基氯苯、3.48g碳酸钾和10g二乙醇胺于100mL圆底烧瓶中，50℃反应10min。反应结束后，反应液用100mL甲醇稀释粗产物经柱层析分离(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1)得到化合物8。

(2)准确称取3.14g化合物8，溶于20mL二氯甲烷中，加入3.03g三乙胺，室温搅拌30min。反应液在冰水浴条件下逐滴加入氯化亚砜的二氯甲烷溶液(2.61g于5mL二氯甲烷)。滴加完成后，加热回流2h。反应液冷却至室温后加入饱和碳酸氢钠100mL除去反应过程产生的盐酸。旋蒸除去有机溶剂，粗产物经柱层析分离(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶2)得到化合物4。

(3)准确称取0.307g化合物4、0.087g氟化钾和0.564g K_2.2.2溶于5mL二甲亚砜，反应液90℃反应2h。反应液冷却至室温，加入100mL去离子水，水溶液用乙酸乙酯萃取三遍。旋蒸除去乙酸乙酯，粗产物经柱层析分离(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶5)得到化合物9。

(4)准确称取0.16g氯化铵和0.168g还原铁粉，溶于5mL甲醇和5mL水的混合溶液，室温搅拌30min。0.28g化合物9溶于2mL甲醇，逐滴加入到氯化铵和还原铁粉的混合溶液中。反应液在80℃反应1h，反应后过滤除去固体杂质，粗产物经HPLC分离(A相：去离子水；B相：甲醇；A∶B＝65％：35％；1mL/min)得到化合物10。

实施例3：硝基还原酶还原化合物1

在0.5mL pH 7.4的Tris缓冲溶液中加入10μg/mL的硝基还原酶溶液(100μL)、200μM NADPH(100μL)以及500μCi化合物1注射液(20mL)。混合溶液在氮气保护条件下，37℃孵育3h。反应后的溶液(100μL)载入HPLC分析。HPLC条件：A相：去离子水；B相：乙腈；A∶B＝50％∶50％；1mL/min.

从HPLC分析结果可以看出，化合物1与硝基还原酶孵育3h后，有88％的原药被转为其他物质，其中37％被还原，即分子上的硝基被还原为氨基，由吸电子基团变为供电子基团。说明本发明实施例中的探针化合物可以在硝基还原酶的作用下还原，具体结果见图1。

实施例4：化合物1在细菌感染模型的PET显像：

实验选取20只3-4周龄BABL/c小鼠，麻醉后，在小鼠左前肢接种100μL(10⁷CFU/mL)金黄色葡萄球菌，右前肢接种100μL(10⁷CFU/mL)大肠杆菌。接种24h后，通过尾静脉注射200-300μCi化合物1注射液(100μL)，在注射后30-60min进行PET显像。

PET显像图显示，在小鼠的左右两侧三角肌区域均有明显的探针摄取，信号弥散在肌肉组织中。同时，右侧大肠杆菌区域的摄取要比左侧金黄色葡萄球菌区域的摄取要高。对PET显像进行定量显示，小鼠正常肌肉的摄取为0.65±0.09ID％/g，与正常肌肉的摄取相比，两种细菌感染的摄取均要比正常肌肉摄取高。小鼠金黄色葡萄球菌感染区域为1.63±0.15ID％/g，大肠杆菌感染区域细菌摄取为2.4±0.2％ID/g，是金黄色葡萄球菌感染区域的1.47倍，是正常肌肉摄取的4倍。因此，本发明实施例中的探针化合物1可以有效检测活体内的细菌感染区域，且对于金黄色葡萄球菌感染效果要比大肠杆菌好，具体结果见图2。

实施例5：化合物1和2在细菌感染和非细菌感染模型的PET显像

实验选取20只3-4周龄BABL/c小鼠，麻醉后，在小鼠左前肢接种100μL(10⁷CFU/mL)大肠杆菌，右前肢接种100μL的弗氏佐剂溶液。接种24h后，通过尾静脉注射200-300μCi化合物1或2注射液(100μL)，在注射后30-60min进行PET显像。

从PET显像结果可以看出，在大肠杆菌感染区域有明显的摄取，在弗氏佐剂注射区域则没有。化合物1的PET显像进行定量显示小鼠正常肌肉的摄取值为0.48±0.07％ID/g，非细菌感染一侧的摄取值为0.67±0.08％ID/g，与正常肌肉摄取无显著性差异。小鼠大肠杆菌感染区域的摄取值为1.73±0.15％ID/g，是非细菌感染区域的2.58倍，正常肌肉摄取的3.6倍。化合物2的显像结果显示小鼠正常肌肉摄取值为1.02±0.22％ID/g，非细菌感染区域的摄取为1.52±0.17％ID/g，与正常肌肉摄取无显著性差异。而在大肠杆菌感染区域，化合物2的摄取值为3.9±0.3％ID/g，是非细菌感染区域的2.5倍，是正常肌肉的3.8倍。这两个化合物的显像结果说明本发明实施例中的探针可以对体内细菌感染进行诊断，同时可以有效区分细菌性感染炎症和非细菌性炎症，具体结果详见图3。

实施例6：化合物1和化合物2在非小细胞肺癌皮下瘤模型的PET显像

实验选取20只3-4周龄BABL/c裸小鼠，在小鼠右前肢皮下接种A549细胞100μL(10⁶细胞)。接种三周后，肿瘤直径大约5-7mm，尾静脉注射200-300μCi化合1或化合物2注射液(100μL)，注射后40-60min，进行PET显像。同时选取5只肿瘤小鼠，在显像前0.5h小鼠肿瘤区域注射双香豆素抑制肿瘤区域的硝基还原酶。

从PET显像结果可以看出，注射化合物1和化合物2后，化合物1组的肿瘤的最大摄取值为1.95±0.37％ID/g，瘤肉比为2.6，注射化合物2后，肿瘤的最大摄取值为2.86±0.49％ID/g，瘤肉比为3.44，而在硝基还原酶清除的小鼠中，瘤肉比为1.26。这个PET显像结果说明探针在非小细胞肺癌中有很好的特异性摄取。具体结果详见图4。

实施例7：化合物2在其类型皮下瘤模型的PET显像

实验选取10只3-4周龄C57小黑鼠，在小鼠右前肢皮下接种Panc02、B16、MC38细胞100μL 10⁶细胞)。接种2周后，肿瘤直径大约5-7mm，尾静脉注射200-300μCi化合物2注射液(100μL)，注射后40-60min，进行PET显像。

实验选取10只3-4周龄BABL/c小鼠，在小鼠右前肢皮下接种H22细胞100μL(10⁶细胞)。接种2周后，肿瘤直径大约5-7mm，尾静脉注射200-300μCi化合物2注射液(100μL)，注射后40-60min，进行PET显像。

实验选取10只3-4周龄BABL/c裸小鼠，在小鼠右前肢皮下接种U87细胞100μL(10⁶细胞)。接种三周后，肿瘤直径大约5-7mm，尾静脉注射200-300μCi化合物2注射液(100μL)，注射后40-60min，进行PET显像。

PET显像结果显示化合物2在上述肿瘤中均有较好的摄取，从图中可以看出化合物2在H22和B16肿瘤中的摄取要比PanC02、MC38和U87的摄取高。五种肿瘤摄取值相比较，由大到小分别为H22＞B16＞PanC02＞MC38＞U87。化合物2在不同肿瘤中的摄取值差异可能是由于不同类型的肿瘤，其内部乏氧程度不一致所导致的。对显像进行定量分析显示，H22模型小鼠的瘤肉比为3.18，B16模型小鼠的瘤肉比为2.4，PanC02模型小鼠的瘤肉比为2.33，MC38模型小鼠的瘤肉比为1.95，U87肿瘤小鼠的瘤肉比为1.8。具体结果见图5。

实施例7：化合物9用于非小细胞肺癌的治疗

实验选取20只3-4周龄BABL/c裸小鼠，在小鼠右前肢皮下接种A549细胞100μL(10⁶细胞)。肿瘤直径大约2-4mm，随机分为对照组和治疗组，准确测量分组后每一只小鼠的肿瘤直径和小鼠体重。对照组腹腔注射100μL生理盐水，治疗组小鼠腹腔注射100μL化合物9溶液(5mg/Kg)。给药后每间隔3天测量一次小鼠肿瘤直径和小鼠体重。

治疗结果显示，在给药治疗后的第6天，对照组小鼠肿瘤体积显著大于治疗组，且随着时间的增加，对照组肿瘤体积增长迅速，而治疗组则增长缓慢。治疗的第32天，对照组小鼠肿瘤体积平均值达到915mm³，而治疗组小鼠肿瘤体积平均值为199mm³，两组具有显著性的差异。此外，治疗过程中，治疗组小鼠体重与对照组无明显差异，说明化合物9在抑制肿瘤生长的同时，具有较好的生物安全性。具体结果见图6。

从以上结果可以看出，本发明实施例中的硝基还原酶响应的探针具有合成简单，标记率高，易于生产转化等突出特点。化合物1-2可以在硝基还原酶的作用下还原成一个可以与DNA偶联的探针。在细菌感染区域探针有很好的摄取，且可以有效区分细菌感染和非细菌性感染，这对于临床上对炎症的判断和是否采取抗生素治疗有重要的参考作用。此外，本发明实施例中的化合物1和化合物2在乏氧肿瘤中有一定的特异性摄取，具有较好的瘤肉比，可用于乏氧肿瘤的诊断。同时化合物9对于乏氧肿瘤的生长有很好的抑制效果，可以用于乏氧肿瘤的治疗。因此，化合物2是一种既可以用于乏氧肿瘤的显像，同时其标准品化合物9也可以通过显像指导治疗。此类分子实现了同一分子结构性的诊疗一体化，具有很好的临床转化潜力。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (4)

1.一种放射性¹⁸F标记化合物，其特征在于：其结构式为

其中，

R₁、R₂、R₃和R₄均为H，R₅为CH₂CH₂ ¹⁸F，R₆为CH₂CH₂OTs或R₁、R₃和R₄均为H，R₂为¹⁸F，R₅和R₆均为CH₂CH₂Cl。

2.权利要求1所述的放射性¹⁸F标记化合物在制备检测体内硝基还原酶活性的试剂中的应用。

3.权利要求1所述的放射性¹⁸F标记化合物在制备硝基还原酶高表达相关疾病的诊断试剂中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述硝基还原酶高表达相关疾病为细菌感染和乏氧肿瘤。

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