KR100251888B1

KR100251888B1 - 긴 사슬의 지방족 알콜을 가진 아실카르니틴 에스테르와 항박테리아 활성을 지닌 그의 약제조성물

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Publication number: KR100251888B1
Application number: KR1019930000522A
Authority: KR
Inventors: 모세 산타니엘로; 마리아 오르넬라 틴티; 도메니코 미시티; 피에로 포레스타
Original assignee: 알도 파시; 시그마타우 인두스트리에 파르마슈티케 리우니테 에스.피.에이.
Priority date: 1992-01-16
Filing date: 1993-01-16
Publication date: 2000-05-01
Also published as: JP3294653B2; ITRM920027A1; ATE144492T1; CA2087085A1; EP0552137A3; ITRM920027A0; GR3021479T3; US5498632A; EP0552137A2; KR930016391A; DE69305540T2; DE69305540D1; DK0552137T3; US5498633A; JPH05339218A; EP0552137B1; HK1005724A1; ZA93162B; IT1254135B; ES2093395T3

Abstract

본 발명은 다음 일반식(I)로 표시되는 긴 사슬의 지방족 알콜을 가진 아실 L-카르니틴의 에스테르에 관한 것이다.

상기식에서, R은 탄소수 2~16, 바람직하게는 탄소수 4~12의 직쇄 또는 가지난 사슬의 아실기이며, 특히 이소부티릴기와 이소발레릴기이고, n은 7~15의 정수, 특히 10이고, X-는 약제학적으로 허용 가능한 산의 음이온이다.

Description

긴 사슬의 지방족 알콜을 가진 아실카르니틴 에스테르와 항박테리아 활성을 지닌 그의 약제조성물

상기 일반식(I)의 에스테르로서는 이소발레릴 L-카르니틴운데실에스테르 및 이소부티릴 L-카르니틴운데실에스테르가 특히 바람직하다.

상기 일반식(I)의 에스테르는 그램양성과 그램음성 박테리아에 대해 잠재적인 항박테리아 활성을 가지고 있고, 특히 캄필로박터(Campylobacter)속과 헬리코박터(Helicobacter) 속의 박테리아에 특히 유효한데, 이들은 각각 인체의 장염과 동물의 생식기염의 원인균인 병인학적(病因學的)제제(aetiologic agent)이고 (Campylobacter fetus, jejuni coli), 또는 사람에 있어 B-타입의 위염과 십이지장궤양에 관여하고 있다(Helicobacter pyroli).

따라서, 본 발명은 장염, B-타입의 위염 및 십이지장궤양을 위해 인체에 유용한 경구적 또는 비경구적으로 투여할 수 있는 약제조성물에 관한 것이다. 또한 동물에 있어 장염 및 생식기염의 치료에 유용한 약제조성물에 관한 것을 포함한다.

미(微)호기성그램음성 박테리아를 포함하는 캄필로박터 속은 최근까지 병인학적제제로서의 역할로 인하여 수많은 사람과 동물들에게 질병을 감염시키고 또한 그 치료가 어렵기 때문에 미생물학자들의 주목을 받아왔다.

수많은 균주들이 박테리아 세포를 침투하는 바시트라신(Bacitracin), 노보바이오신(Novobiocin), 리팜피신(Rifampicin), 스트렙토그라민 B(Streptoramin B), 트리메토프림(Trimethoprim), 반코마이신(Vancomycin) 및 세팔로틴(Cephalotyn) 등과 같은 약제의 불활성으로 인하여 많은 항생물질에 선천적인 저항을 가지고 있는 것으로 알려지고 있다.

이러한 저항성의 다른 유형은 순차적인 리보좀 방어 또는 3'-아미노글리코사이드포스포트랜스페라제 생산을 가지는 테트라사이클린(Tetracycline), 카나마이신(Kanamycin) 및 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 같은 플라스미드 형태와 스트렙토마이신(Streptomycin), 스펙티노마이신(Spectinomycin), 에리쓰로마이신(Erythromycin), 암피실린(Ampicillin) 및 날리디씩산(Nalidixic acid)와 같은 6-아미노글리코사이드 뉴클레오트랜스페라제 또는-락탐아제에 의해 야기되는 크로모놈 형태 등 두가지 타입의 후천적 저항성과 서로 관계가 있는 것으로 알려져 있다.

최근, 배양기술, 생화학, 형태학 및 항생물질에 대한 감수성 등에 대한 기술진보에 따라 피롤리(Pyroli)와 머스테레(mustelae) 종으로 구성된 헬리코박터속의 박테리아는 캄필로박터속과 구별되고 있다.

캄필로박터 속의 페투스(fetus), 제주니(jejuni) 및 콜라이(coli) 종은 사람의 장염, 동물의 장염 및 생식기염에 관계하는 것으로 알려지고 있다.

한편, 헬리코박터속은 사람에 있어 B타입의 위염과 관계가 있는데, 이는 헬리코박터속의 박테리아가 위염환자의 위점막의 염증이 있는 조직에서 계속 발견되고 있기 때문이다(Marshall B. J. WARREN J. R., 1984, Unidentified Curved bacilli in the Stomach of patients with gastritis and peptic ulceration, LANCET. 1 : 1311~1313).

최근까지 B-타입의 위염, 십이지장궤양 및 위암과 헬리코박터 필로리(H. Pylori) 박테리아에 의한 감염간에 아주 밀접한 관계가 있음이 알려져 있다(BLASER M. J. 1990, "Helicobacter pylori" and the Pathogenesis of Gastroduodenal Inflammation. The J. of Infect. Dis. 161 : 626~633).

이러한 헬리코박터속과 부차적으로 캄필로박터 속에 대하여 항박테리아 활성을 가지는 새로운 화합물을 개발하려는 깊은 관심은 상기의 연구들과 과거 많은 실패의 예들을 통해 알 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 일반식(I)의 에스테르는 다음 두가지의 특징적인 합성방법에 의해 제조된다.

하기 합성 반응식(I)에 나타낸 바와같이 그 첫번째 방법은 다음 단계로 이루어진다.

(a) 티오클로라이드와 옥사릴클로라이드(몰비가 1 : 1~1 : 4)와 같은 할로겐화제를 가지고 무수유기불활성용매인 아세토니트릴 또는 메틸렌클로라이드하에서 0~30℃로 1~4시간 반응시켜 아실 L-카르니틴을 할로겐화시킨 다음, 이 조 반응생성물을 농축시켜 다음 단계에서 이용한다.

(b) 아세토니트릴 또는 메틸렌클로라이드와 같은 무수 유기불활성 용매에 상기 단계(a)의 염소산(acid chloride)을 용해시킨 다음, 여기에 1 : 1~1 : 2의 비율로 상기와 동일한 용매에 희석시킨 알콜을 0~30℃, 2~10시간 동안 가하고, 이 용액을 농축시키고 필요하다면 실리카겔상의 크로마토그래피에 의해 화합물을 정제한다.

(c) 그 다음에는 요구되는, HX산에 의해 활성화된 강한 염기이온교환수지(Amberlite IRA402) 또는 약한 염기이온교환수지(Amberlist A21)상에서 물 또는 유기용매에 용해된 생성물을 용출시키고 얼림건조(lyophilization) 또는 농축에 의해 최종 생성물을 분리한다.

하기 합성반응식(2)에 나타낸 바와 같이 두번째 제조방법은 다음과 같은 단계로 구성된다.

(a') 카르니틴 또는 아실카르니틴 내부염을 적절한 알킬할로게나이드, 적당하기로는 브로마이드 또는 아이오다이드와 30~60℃, 8~24시간동안 유기무수불활성용매하에서 반응시킨 후 농축하여 화합물을 분리한다.

(b') 상기 단계(a')에서 출발화합물이 카르니틴인 경우 상기 단계(a')에서 얻은 에스테르는 공지기술에 의해 요구되는 염소산과 아실화 반응시킨다.

(c') 그 다음에는 요구되는 HX산으로 활성화시킨 Amberlite IRA 402 또는 Amberlist A21과 같은 이온교환수지상에서 (a') 또 (b') 단계의 화합물의 수용성 또는 알콜용액을 용출시킨다.

약제학적으로 수용 가능한 산의 음이온 X-는 클로라이드 ; 브로마이드 ; 아이오다이드 ; 아스파르테이트, 특히 아스파르테이트산 ; 시트레이트 특히, 시트레이트산 ; 타르트레이트, 포스페이트, 특히 포스페이트산 ; 푸마레이트, 특히 푸마레이트산 ; 글리세로포스페이트 ; 글루모세포스페이트 ; 락테이트 ; 말레이트, 특히 말레이트산 ; 오로데이트 ; 옥살레이트, 특히 옥살레이트산 ; 설페이트, 특히 설페이트산 ; 트리콜로아세트테이트 ; 트리플루오로아세테이트 및 메탄설포네이트 중에서 바람직하게 선택된다.

[합성반응식 1]

상기식에서, R은 아실기이고, R₁은 탄소원자수 11~16의 알킬기이다.

[합성반응식 2]

상기식에서, R은 H 또는 아실기이고, Y는 할로겐이고, R₁은 탄소원자수 11~16의 알킬기이다.

[실시예 1]

이소발레릴-L-카르니틴 운데실 에스테르 클로라이드의 제조(ST722)

[A : 이소발렐릴-L-카르니틴 클로라이드의 제조]

이소발레릴-L-카르니틴 클로라이드 30g(0.106mole) 무수 CH₂Cl₂100ml에 현탁시켰다. 이 혼합물을 0℃로 냉각시키고 무수 CH₂Cl₂15ml에 희석시킨 옥살릴클로라이드 13ml(0.15mole)을 교반하면서 서서히 가했다.

실온에서 30분 후에 무수 CH₂Cl₂10ml에 희석시킨 옥살릴클로라이드 19ml(0.21mole)을 더 가하였다. 이 용액을 실온에서 2시간동안 교반하면서 방치한 후 진공하에서 농축시켰다.

이와같이 얻어진 잔유물을 무수 CH₂Cl₂로 2번 씻어내고 진공하에서 농축시켰다. 또한 상기에서 얻어진 조생성물은 다음 반응에 사용되었다.

[B : 이소발레릴-L-카르니틴 운데실 에스테르 클로라이드(ST722)의 제조]

미리 준비된 염소산 0.106mole을 무수 CH₂Cl₂40ml에 용해시켰다. 이 용액을 0℃로 냉각시키고 CH₂Cl₂35ml에 희석시킨 운데실산 35ml(0.168mole)을 질소기압하에서 가하였다.

다음 이 용액을 실온에서 2시간동안 교반하면서 방치시킨 후 진공하에서 오일 잔유물이 얻어질 때까지 농축시켰다. 조 반응혼합물을 CH₂Cl₂를 가지고 운데실 알콜의 용출이 끝날 때까지 용출시키고 CH₂Cl₂-MeOH를 9 : 1의 비율로 하여 그 화합물이 용출이 끝날 때까지 용출시키면서 2% NaHPO₄로 완충시킨 실리카겔컬럼으로 크로마토그래피하였다.

이 혼주(混注)한 유분(留分)(Pooled fraction)을 농축시켜 목적화합물 28g을 얻었다. (수율 60%)

[실시예 2]

이소부티릴-L-카르니틴 운데실 에스테르 클로라이드(ST712)의 제조

이소발레릴 L-카르니틴클로라이드 대신 이소부티릴 L-카르니틴 클로라이드를 사용한 것을 제외하고 상기 실시예 1과 동일하게 목적화합물을 제조하였다. (수율 55%)

[실시예 3~19]

상기 실시예 3~19의 화합물들은 유기합성에 있어 통상의 방법인 상기 실시예의 과정에 따라 제조하였다. 각 화합물의 물리화학적 특징을 다음 표 1에 요약하여 나타내었다.

[표 A]

a 컬럼 : Nucleosil-SA(5μ) 1.2mm, i.d. 4.0mm

온도 : 40℃

이동상(mobile phase) : (NH₄)₂HPO₄50mM/CH₃CN 1:1 pH4 con H₃PO₄

유속 : 0.75ml/분

b 컬럼 : Spherisorb-Cl(5μ) 1.2mm, i.d. 4.6mm

온도 : 50℃

이동상 : CH₃OH/KH₂PO₄50mM 60:40

유속 : 0.5ml/분

c 컬럼 : Spherisorb-Cl(5μ) 1.2mm, i.d. 4.6mm

온도 : 50℃

이동상 : CH₃OH/KH₂PO₄50mM 70:30 pH 3.9 con H₃PO₄

유속 : 0.5ml/분

d 컬럼 : Spherisorb-Cl(5μ) 1.2mm, i.d. 4.6mm

온도 : 40℃

이동상 : CH₃OH/KH₂PO₄50mM 65:35 pH 4.5 con H₃PO₄

유속 : 0.5ml/분

e 컬럼 : Nucleosil-SA(5μ) 1.2mm, i.d. 4.0mm

온도 : 30℃

이동상 : (NH₄)₂HPO₄50mM/CH₃CN 65:35 pH 3.5con H₃PO₄

유속 : 0.75ml/분

f 컬럼 : Spherisorb-Cl(5μ) 1.2mm, i.d. 4.6mm

온도 : 40℃

이동상 : CH₃OH/KH₂PO₄50mM 65:35 pH 4.5 con H₃PO₄

유속 : 1ml/분

[실험예 1]

쥐에 있어서 반응과 치사율의 평가

쥐에 있어서 정상반응의 평가는 다음 S. Irwin의 방법(Psychopharmacologia, 13, 222[1968])에 의해 수행되었다. 이 방법은 감지할 수 있는 얼마간의 반응상, 신경생리상 및 신경생장상의 지표에 있어서의 변화를 측정하는 것인데, 이 변화는 육안으로 직접 관찰할 수 있다.

이 방법은 수컷생쥐 Crl을 이용하였는데 이 생쥐는 (CD-1)(ICR)BR 생쥐(Charles River-Italy)로 무게는 22~25g이었고 각 화합물당 4마리를 1군으로 하여 물에 0.5중량%의 카르복시메틸셀룰로오스를 현탁시킨 화합물을 경구 투여하였다.

연속 5일간에 걸쳐 하루에 두번씩 처리를 하여 5시간 동안 쥐의 반응을 계속적으로 관찰하였고, 생쥐의 치사율을 전체 실험기간동안 관찰하여 그 결과를 다음 표에 나타내었다.

쥐에 있어서 반응과 치사율 평가

[실험예 2]

면역독소학적 실험

생쥐에 ST722(실시예 1) 화합물을 경구 투여한 후 면역독소학적 실험을 실시하여 그 결과를 다음에 나타내었다.

[실험 1]

면역된 쥐 SRBC의 비장에서 일차 항체형성(Jerne test)에 따라 ST722의 계속 경구투여시 "in vitro-ex vivo" 효과의 측정

[실험과정]

8주령된 수컷 B₆D₂F₁생쥐(C. River)를 각군당 6마리씩으로 하여 ST722 물질을 하루에 100mg(/kg)씩 -2일부터 +2일에 걸쳐 경구 투여하였다(0일은 면역되어 있음).

멸균된 식염 0.2ml에서 마리당 1.0×10⁸cell로 농축시킨 것을 가지고 복강 내부를 통해 생쥐들을 면역시켰다.

5일 후에 실험에 장애가 되는 비장을 경부탈구(頸部脫臼, Cervical dislocation)에 의해 치사된 생쥐로부터 제거하였다. 1ml당 1.0×10⁷cell로 표준화 시킨 후 비세포(脾細胞, Splenocyte) 0.1ml를 2ml의 따뜻하게 한 한크 아가(Hank's Agar) 및 10% SRBC와 PBS 0.2ml에서 혼합한 다음 페트리접시에 접종하여 3회 테스트한 시료를 만들고 37℃에서 60분간 배양시켰다.

트리스 완충액에 1 : 10으로 희석시킨 기니아 피그 혈청 2ml를 보조제로 첨가한 후 시료를 37℃, 30분간 더 항온시켰다. 용혈반응을 억제시키기 위해 페트리접시를 4℃로 냉각시키고 용혈판을 계수하였다.

SRBC에 대한 항체반응은 비장에 대해서 뿐만 아니라 1.0×10⁶비세포에 대한 판형세포(PFC)의 수로서 나타낸다.

[실험결과]

다음 표 1에 나타낸 바와같이 5일간 연속하여 ST722를 경구투여한 것이 항체도전(antigenic challenge) 후에 PFC수에 있어서 통계적으로 중요한 영향을 끼치지는 못했다.

이들 데이타는 항체형성물질인 B임파구에 면역독소적 효과가 있음을 배제한 것이다.

또한, 다음 표 1에 나타낸 바와 같이 비장과 흉선 같은 림포이드 조직의 무게는 독소효과와 관련하여 변수가 되지 않음을 알 수 있다.

[표 1]

[실험 2]

쥐의 림포이드조직(비장과 흉선)의 중량에 대한 ST722의 반복경구투여효과의 측정

[실험과정]

7주령된 수컷 B₆D₂F₁생쥐(C.River)를 각 군당 7~8마리로 하여 7일간 연속하여 하루에 100mg(/kg)씩 ST722를 경구 투여하였다.

최종 투여 24시간 후에 생쥐는 치사하였고 림포이드 조직을 떼어내어 중량을 측정하였다.

[실험결과]

다음 표 2에 나타낸 바와 같이 수행된 처리가 실험된 집단에 어떠한 면역독소적인 영향도 끼치지 못했다.

[표 2]

7일간 연속하여 하루에 100mg(/kg)씩 ST722 물질을 생쥐에 반복 경구 투여한 후 쥐 림포이드 조직의 중량(X±S.E.)

[실험 3]

생쥐에 있어서 비세포 농축상에서 생쥐중량, 비장 및 흉선중량에 대한 ST722의 연속 경구투여 효과의 측정

[실험과정]

10주령된 수컷 B₆D₂F₁생쥐(C.River)를 각 군당 5마리로 하여 5일간 연속하여 하루에 100mg(/kg)씩 ST722를 경구 투여하였다.

최종 투여 24시간 후에 생쥐는 치사하였고 림포이드 조직을 떼어내어 중량을 측정하였고 비세포의 수를 계수하였다.

[실험결과]

다음 표 3에 나타낸 바와 같이 ST722의 경구투여가 실험집단에 특이한 면역독소적 효과를 나타내기에는 미흡했다.

[표 3]

[실험 4]

생쥐에 있어 복막대식세포(大食細胞)수에 대한 ST722의 반복 경구투여 효과의 측정

[실험과정]

10주령된 수컷 B₆D₂F₁생쥐(C.River)를 각 군당 6마리로 하여 5일간 연속하여 하루에 100mg(/kg)씩 ST722를 경구 투여하였다.

최종 투여 24시간 후에 생쥐는 치사하였고 복막삼출액세포(peritoneal exudate cells, PEC)수와 대식세포수를 측정하였다.

[실험결과]

다음 표 4에 나타낸 바와 같이 PEC대식세포군에 독소효과가 관찰되지 않았다. 반면에 ST722를 투여한 생쥐의 복막대식세포수에 있어서는 약 60% 증가하였다.

[표 4]

[실험예 3]

미생물 실험

[실험 1]

그램양성 박테리아 균주에 대한 15가지의 새로운 화합물의 육즙배지에서의 최소 억제농도(MIC) 측정

[실험과정]

본 실험에서는 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 4종, 스트랩토코커스 패칼리스(Streptococcus faecalis) 8종, 바실러스 퍼밀루스(Bacillus pumilus) 1종 및 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtlis) 1종의 균주가 사용되었고, 실험화합물로는 ST722, ST982, ST983, ST1000, ST1001, ST1032, ST1033, ST1034, ST1036, ST1037, ST1038, ST1050, ST1051, ST1052 및 ST1053이 사용되었다.

MIC는 뮐러-힌톤육즙배지에서 화합물을 두배로 희석시킨 것을 사용하여 표준미세 희석방법으로 측정하였다.

접종물은 0.5 맥파랜드(Mc Farland) 혼탁도 표준액(BRAY W.E., Clinical Laboratory Methods, 5th Ed. C. V. MOSBY, St. Louis, Mo, 1957)을 배합한 뮐러-힌톤육즙배지에서 하룻밤 배양함으로서 제조하였고, 1ml당 5×10⁴개의 균체형성 농도가 되도록 최종농도를 조정하였다.

다음, 박테리아 균주 현탁액과 화합물 용액을 0.1ml씩 마이크로타이터 판(Falcon, 96 wells, round bottom)에 분배하고 습기가 있는 37℃ 인큐베이터에 18시간 동안 방치하였다.

실험결과는 저항성 균주수와 평균 MIC값에 대한 감염성 균주를 MIC값으로 나타내어 다음 표 1~6에 나타내었다.

화합물에 의해 발휘되는 활성형태를 확립하기 위해 최소살균제농도(minimal bactericidal concentration, MBC)는 가시적인 생장이 전혀 일어나지 않은 각 통(well)으로부터 5㎕ 한천배지에 2차 배양함으로써 측정했다.

이러한 방법으로 5개의 균주와 10개의 화합물에 대해 실험하였고 MIC값과 MBC값의 완전한 일치는 본 발명의 화합물이 살균제로서의 효과가 있음을 증명하고 있다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

[표 4]

[표 5]

[표 6]

[실험 2]

그램음성 박테리아 균주에 대한 16가지의 새로운 화합물의 브로쓰(broth)에서의 최소억제농도(MIC)의 측정

[실험과정]

본 실험에서는 엔테로박터(Enterobacter) 1종, 에스케리키아(Escherichia) 3종, 클렙시엘라(Klebsiella) 3종, 프로테우스(Proteus) 3종, 슈도모나스(Pseudomonas) 2종, 살모넬라(Salmonella) 2종, 세라티아(Serratia) 1종의 균주가 사용되었고, 실험화합물로는 ST712, ST722, ST982, ST983, ST1000, ST1001, ST1032, ST1033, ST1034, ST1036, ST1037, ST1038, ST1050, ST1051, ST1052 및 ST1053이 사용되었다.

상기 실험 1에서와 같은 방법으로 실시하여 그 결과를 다음 표 7~12에 나타내었다.

[표 7]

[표 8]

[표 9]

[표 10]

[표 11]

[표 12]

[실험예 4]

캄필러박터 균주 3종과 헬리코박터 균주 1종에 대한 ST722 및 ST712의 한천배지내에서 MIC의 측정

캄필로박터 균주와 헬리코박터 균주에 대해 각각 ST722 및 ST712 화합물의 활성을 측정하였다.

육즙배지 배양에서는 캄필로박터와 특히 헬리코박터의 생장을 쉽게 유지하기가 어렵기 때문에 이들 박테리아 균주들에 대한 화합물들의 "시험관내(in vitro)" 활성의 측정을 돕기 위해 한천희석 기술을 사용하였다.

[박테리아 균주]

본 발명에서는 캄필로박터 페투스(Campylobacter fetus) ATCC27374, 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli) LI048, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 84-ISS 및 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) NCTC 11637 균주를 사용하였다.

배지로는 캄필로박터 균주들에 대해서는 DHB(defribinated horse blood) 7%(v/v)로 보충한 컬럼비아 한천배지를, 헬리코박터 균주에 대해서는 비톡스(Vitox)(Oxoid)를 추가한 상기와 같은 배지를 사용하였다.

10%(v/v) 글리세롤을 함유하는 DHB에 80℃에서 보관한 캄필로박터 및 헬리코박터 균주들을 10%의 이산화탄소를 함유하는 대기하에 37℃이 온도에서 48시간동안 항온시킨 그들 각각의 배양플라스크배지에서 해동시키고 성장시켰다.

이러한 첫번째 성장사이클 후에 박테리아균주들은 상기와 같은 조건에서 두번째 성장사이클을 진행시켰다.

그후 뮐러-힌톤 육즙배지 4~5ml에 재현탁시켜 박테리아 파티나(patina)를 얻었고, 이들의 혼탁도는 멕파랜드 판정기준(BRAY W.E., Clinical Laboratory Methods, 5th Ed. C.V. MOSBY, St. Louis, M., (1957)에 의해 측정하였다.

헬리코박터 현탁액은 ml당 1.0×10⁸~10×10⁹에 가까운 조직농도로 조절하였고 캄필로박터 현탁액은 ml당 1.0×10⁶~10×10⁷의 조직농도로 조절하였다.

스티어(Steer) 타입의 다기능 접종기(STEERS E., FOLTZ E. L., GRAVES S., RIDEN J., 1959. Inocula-replicating apparatus for routine testing of antibacterial susceptibility to antibiotics. Antibiot. Chemoter. 9 : 307-311)로 상기 표준화된 현탁액 1㎕를 앞서 뮐러-힌톤육즙배지 5% DHB를 통당 0.2ml씩 채우고 각기 다른 농도의 실험화합물들을 함유하고 있는 96-통(well) 마이크로 타이터판의 통에 점이전(Spot-transferred)하였다.

이때 판은 10%의 이산화탄소를 함유하는 대기하에서 37℃의 온도로 48~72시간 동안 항온시켰다.

[실험결과]

다음 표 1에 나타낸 바와 같이 헬리코박터와 캄필로박터 균주에 대한 MIC값은 ST72 및 ST712 화합물이 항박테리아 활성을 가지고 있고 이중에서 ST722가 가장 효과적인 화합물임을 나타내고 있다. 게다가, 화합물들의 활성은 전염원에 의존하지 않음을 알 수 있다.

[표 1]

[실험예 5]

헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 균주에 대한 ST722와 차구연산창연(Bismuth subcitrate)의 상승효과의 시험관내 측정

콜로이드 차구연산창연(Colloidal Bismuth Subcitrate, CBS)은 위액의 낮은 pH에서 침전하여 공격적인 요인에 대한 방어층을 형성하는 궤양베이스에서 단백질을 가진 화합물을 형성하는데 이는 발생하는 궤양병변(ulcer lesion)을 치유하는 것으로 여러 연구들은 보고하고 있다(WAGSTAFF, A. J., BENFIELD, P. and MONK J. P., 1088. Colloidal Bismuth Subcitrate. A rewiew of its Pharmacodynamic and Pharmacokinetic Properties, and its Therapeutic use in Peptic Ulcer Disease. Drugs 36, 132-157).

MIC값이 4~32mcg/ml인 헬리코박터에 대한 CBS의 항박테리아 활성의 최근의 연구(Mc NULTY, C.A.M., DENT, J. and WISE, R., 1985. Susceptibility of clinical isolates of "Campylobacter pyloridis" to 11 antimicrobial agents. Antimicrob. Agents Chemoter. 28, 6, 837-838)와 상기 조사들은 여러 연구자들로 하여금 위로부터 박테리아를 완전하고 계속적으로 조절하는데 도움이 되는 항헬리코박터 활성을 가진 CBS와 항생물질의 상승효과에 대해 연구를 촉발시켰다(VAN CAEKENBERGHE, D.L. and BREYSSENS, J., 1987. In vitro synergistic activity between Bismute Subcitrate and various antimicrobial agents against "Campylobacter pyloridis" ("C. pylori"). Antimicrob. Agents Chemoter. 31, 9, 1429-1430).

이들 상기 연구들로부터 우리는 헬리코박터 필로리 균주에 대한 CBS와 ST722의 가능한 상승효과를 알게 되었다.

[실험재료 및 방법]

[화합물]

상업적으로 이용가능한 De-Nol(Gist-Brocades사, 네덜란드), 즉 콜로이드 구연산창연 하이드록사이드의 암모늄포타슘 2가염인 CBS는 1N NaOH에서 10mg/ml 현탁액을 제조함으로써 이용된다.

뮐러힌톤 육즙배지에서 1:10으로 희석한 후에 같은 배지에 8연속의 두배 희석액을 만들었다.

ST722 화합물을 100mcg/ml의 초기농도로 뮐러-힌톤 육즙배지에 용해시키고 7연속의 두배 희석액을 만들었다.

[박테리아 균주]

단독 또는 혼합한 CBS와 ST22의 "시험관내"항헬리코박터 활성은 헬리코박터 필로리 NCTC 11637을 이용하여 측정하였다.

[접종원 제조]

비톡스(Vitox : Oxoid)와 7% DHB가 함유된 콜럼비아 한천배지에서 24시간 배양한 헬리코박터 균주를 뮐러-힌톤 육즙배지에서 세척한다.

농도를 측정(600mm로 측정됨)한 다음, 박테리아 현탁액을 1.0×10⁹cells/㎕의 농도로 조정하고, U자형 바닥의 마이크로타이터판의 96개의 통(well) 각각에 0.2ml씩 분배한다. 그리고나서 이 박테리아 현탁액 1㎕를 스티어형(Steers-type) 복제기를 사용하여 단독 또는 혼합형태로 혼합물을 함유하는 마이크로타이터 판의 통속에 분배한다. 최종 박테리아 접종원은 약 1.0×10⁶개의 박테리아 세포가 내포되어 있다.

[실험과정]

실험과정은 Garrod 등이 사용한 방법을 사용하였다(GARROD, L.P. and WATERWORTH, P.M., 1962. Methods of testing combined antibiotic bactericidal action and the significance of the results. J. Clin. Pathol. 15, 328-338).

간단히 서술하면, 단독 또는 모든 가능한 조합으로 미리 혼합한 각각의 시험화합물 250㎕를 5%의 DHB를 함유하는 뮐러-힌톤 한천배지에 4.5ml씩 가한다. 결과용액 0.2ml/well를 마이크로타이터 판의 통속에 분배하고 나서, 표준 박테리아 현탁액 1㎕/well를 섞고, 최종적으로 10%의 이산화탄소를 함유하는 대기하에 37℃의 온도로 48시간 동안 배양한다.

[실험결과 측정표준]

항생제들의 조합으로 얻은 실험결과의 측정을 위하여 분할억제 농도지수(Frational Inhibitory Concentration Index ; FIC index)의 계산에 근거한 Krogstad 등의 방법(KROGSTAD, D.J. and MOELLERING, R.C., 1983. Antimicrobial combinations. In LORIAN, V., Antibiotics in Laboratory Medicine, 15, 537-549)을 사용하였다.

FIC 지수는 다음과 같이 계산한다.

여기서,

(A)는 조합내의 화합물 A의 MIC값이고, (MIC_A)는 화합물 A 단독에 대한 유기체의 MIC값이며, FIC_A는 화합물 A의 분할억제농도이다.

(B)는 조합내의 화합물 B의 MIC값이고 (MIC_B) 및 FIC_B는 화합물 B에 대하여 상기와 동일하게 정의된다.

이와같은 표준에 의하면, 두가지 화합물의 조합의 효과는 FIC 지수가 0.5 이하인 경우 "상승적", FIC 지수가 1인 경우 "부가적"으로 일컬어지며, FIC 지수가 1이상인 때에는 "길항적"이라고 일컬어진다. 또한 두가지 화합물의 실험결과가 가장 효과적인 화합물 단독의 값, 즉 FIC 지수=FIC_A또는 FIC_B인 때의 실험결과가 상당히 상이한 때에는 "무관한" 효과가 일어난다.

[실험결과]

다음 표 1에 보고된 자료에 의하면 ST722 화합물과 차구연산창연의 H. 필로리 균주에 대한 MIC값은 각각 1.56mcg/ml와 6.25mcg/ml로 나타나 있다.

상기한 두가지 화합물의 조합결과는 ST722 화합물 0.19mcg/ml와 CBS 3.12mcg/ml에서 억제되는 결과를 나타낸다. 관련된 FIC 지수는 0.62로 이 화합이 단순한 부가적 효과를 보이지 않으며, 더우기 지나치게 상승적 효과도 나타내지 않고 있음을 알 수 있다.

[표 1]

[실험예 6]

헬리코박터필로리(플랑크톤 및 무경박테리아)에 대한 ST722 화합물의 살균효과측정과 H. 필로리에 감염된 또는 감염안된 HEp-2 세포에 대한 ST722 화합물의 세포독소 효과의 측정

본 실험은 플랑크톤 헬리코박터세포와 무경 헬리코박터 세포의 ST722 화합물에 대한 감수성 차이를 평가하는 것을 목적으로 한다. 무경 헬리코박터 세포에 대해서는 시험관내 실험모델을 사용하는데, 이는 B형 위염환자의 생체내에서 일어나는 임상조건과 유사하다. 본 실험에는 HEp-2 세포를 사용하는데, 이 HEp-2 세포는 위점막의 점액세포에 의해 보호되는 상피세포선과 같이 H. 필로리 균주에 대하여 동일한 막의 당지질수용체를 보호하는 상피세포선이다(참고문헌 : MEGRAUD, F., TRIMOULET, P., LAMOULIATTE, H. and BOYANOVA, L., 1991. Bacterial effect of Amoxicillin on "H. pylori" in an in vitro model using epithelial cells. Antimicrob. Agents Chemoter. 35(5) : 869-872 and LINGWOOD, C.A., LAW. H. and PELLIZANI, A., 1989. Gastric glycerolipid as a receptor for Campylobacter pylori Lancet i : 238-241).

또한, HEp-2 세포(감염된 것 또는 감염안된 것)의 생존능력은 다음의 시험관내 ST722 화합물 처리로 측정하였다. 세포독소의 정도는 프로피듐요오드로 착색된 HEp-2 세포의 세포형광분석법으로 측정하였다.

[실험물질과 방법]

[세포선(Cell line)]

HEp-2 상피세포선(사람후두암)이 헬리코박터세포(무경세포)의 부착에 사용되었다.

[박테리아균주]

헬리코박터 필로리 균주 NCTC 11637

[HEp-2 배양배지]

10% FCS 함유하는 DMEM

[화합물]

헬리코박터 균주와 HEp-2 세포 각각에 대한 ST722 화합물의 살균 및 세포독소활성은 3가지 서로 다른 농도의 ST722 화합물을 사용한 바, 이들 각각의 H. 필로리 균주 NCTC 11637에 대한 MIC값은 0.1, 1.56 및 4mcg/ml이다.

(1) 항헬리코박터 활성측정을 위한 실험과정

비톡스와 7%의 DHB를 함유하는 콜럼비아 한천배지내의 조직배양 플라스크(37℃, 10% CO2, 96% 습도)에서 24시간동안 세포선을 배양하여 얻은 HEp-2 세포배양액을 준비한다.

우선 박테리아를 10%의 FCS를 함유하는 DMEM 배지에서 배양한 후, HEp-2 세포에 접종하여 플라스크당 5.0×10⁶CFU의 농도로 얻는다.

5% 이산화탄소를 함유하는 대기하에 온도를 37℃로 유지하여 2시간동안 배양하여 상피세포에 박테리아를 고정시킨다. 부착되지 않은 박테리아를 제거하기 위하여 세척한다. ST722 화합물을 HEp-2 세포배양 플라스크에 3가지 각기 다른 농도로 5ml씩 가한다.

헬리코박터균주의 성장 조절용으로 ST722 화합물이 없는 5ml의 배양액이 들어있는 두개의 여분 플라스크를 준비한다.

미리 지정된 시간에 플라스크를 취하고, 배양액은 제거한 후 세포를 세척한다. 세포는 1ml의 인산완충염 용액으로 고무폴리스만으로 걷어내고 균질기로 분쇄한다.

세가지의 판에 각각 0.1ml의 희석액을 접종시킨 현탁액을 희석시킨 후, 배양판들을 미량 산소분위기에서 7일간 배양하고 30~200CFU의 배양판들을 계측한다.

플랑크톤 헬리코박터 세포에 대한 ST722 화합물의 활성은 HEp-2 세포의 부재하에 상기와 동일한 실험조건에서 측정한다. 최종적으로 실험결과는 관련된 무경 또는 플랑크톤배양액에 대한 각각의 견본의 플라스크당 CFU로 표시하였다.

(2) HEp-2 세포의 생존능력측정을 위한 실험과정

HEp-2 세포를 5×10⁴세포/통의 농도가 되도록 24개의 통을 가진 배양판에 심고 5%의 이산화탄소를 함유하는 대기하에서 37℃의 온도로 72시간동안 배양시켜 단일층을 형성시킨다. 한크용액(Hank's solution ; HBSS)으로 세척하고, 1ml의 H. 필로리 현탁액(4.0×10⁵cells/ml)을 각각의 통에 넣는다.

37℃에서 2시간동안 배양하여, 박테리아를 HEp-2 세포 단일층에 부착시키고, 배양판을 HBSS로 1회 세척한 뒤, 10%의 FCS를 함유하는 DMEM 용액내의 3가지 서로 다른 농도를 갖는 ST722 화합물을 가한다.

ST722 화합물은 가한 후 3~24시간 경과후, 세포들의 항트립신성을 파괴시키고 800g에서 원심분리하여 HEp-2 세포입자를 얻는다. 이렇게 얻은 세포입자를 PBS 500㎕에 재현탁시키고, 1mcg/ml의 프로피움요오드원액 6㎕를 가한다.

상기와 동일한 과정을 H. 필로리 균주에 감염되지 않은 HEp-2 세포에 대하여 실시한다.

최종적으로 세포현탁액을 FACScan 세포형광분석기를 사용하여 HEp-2 세포의 생존능력을 측정한다.

[실험결과]

(1) 본 시험관내 실험에서 사용된 헬리코박터 균주는 HEp-2 세포에 느슨하게 부착되는 것으로 밝혀졌다. 실험결과, 1.0×10⁶개의 세포의 접종으로 시작하여 3시간 배양후에 상피세포에는 단지 9.5×10²개의 세포만이 부착되었으며, 계속하여 24시간동안 배양하였을 때 4.2×10⁵개의 세포로 증가했음을 (표 1)에서 확인할 수 있었다.

무경 박테리아세포의 수는 4mcg/ml의 ST722 화합물과 3시간동안 접촉후 약 50%로 감소하였으며, 24시간동안의 접촉으로 동일한 결과를 얻기 위하여는 단지 1.56mcg/ml의 ST722 화합물만이 필요하였다. 이와 유사하게 ST722 화합물은 플랑크톤세포에 대하여 24시간 배양후 헬리코박터 세포의 수를 ST722 화합물 4mcg/ml의 농도에서 5.35×10⁸개에서 1.85×10⁶개로 감소시킬 수 있어 무경박테리아 세포에 비하여 보다 활성이 강한 것으로 나타났다.

ST722 화합물이 플랑크톤 세포에 대하여 보다 효과적으로 나타났지만, 완전한 배양액 멸균을 이루지는 못하였음이 강조되어야 한다.

본 실험에서 채택된 실험조건은 동일한 실험결과를 얻는데 MIC값이 1.56mcg/ml의 한천배양액에서 실시한 실험에 비해 소극적으로 관여한 것 같다.

(2) 죽은 HEp-2 세포의 선택적 염색은, 프로피움요오드-염색세포의 세포형광분석에 의해 검출할 수 있게 하여, HEp-2 세포에 대한 어떠한 독소도 결여된 ST722 화합물의 확인을 가능하게 해준다.

실험결과는 헬리코박터 무경세포에 대하여 효과적인 4mcg/ml 농도의 ST722 화합물일지라도 HEp-2 상피세포에 대한 세포독소의 검출을 유발시킬 수 없음을 나타낸다.

[표 1]

[실험예 7]

스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 실험적으로 피하 감염시킨 생쥐에 있어서 ST722 화합물의 보호 효과 측정

[실험물질과 그 방법]

[실험동물]

생후 9주된 숫생쥐 CD₁을 사용했다(한 그룹당 4마리가 사용되었음).

[박테리아 균주]

본 실험에 쓰인 박테리아 균주로는 전신감염된 생쥐로부터 분리한 스태필로코커스 아우레우스(S. aureus LC₁)의 병원성균주를 사용하였다.

이 균주는 5% 위점소에서 접종시에 생쥐 1마리당 7×10⁶개의 세포에 필적하는 LD₅₀과 같은 발병력을 보유하고 있다. ST722 화합물은 실험에 사용된 스태필로코커스 아우레우스균에 대하여 1.56mcg/ml의 MIC값을 나타낸다.

[접종물 제조]

액체 질소하에 보관된 박테리아 세포를 녹이고, 10ml의 TSB 배지에 심은후 37℃에서 약 18시간 동안 배양한다. 그리고 나서 배양액을 살균한 소금물로 희석시켜 0.2ml의 부피에 2.2×10⁷개의 박테리아세포를 갖도록 만든다.

[처리방법]

공정(Protocol) 1

ST722 화합물을 박테리아 접종후 바로 피하투여 시킨다. 이때 투여량은 0.2ml의 살균소금물에서 5, 20 및 50mcg씩 투여한다(단일처리).

공정(Protocol) 2

ST722 화합물을 박테리아 접종후 바로 0.2ml의 살균 소금물에서 50mcg의 양을 피하 투여하고 5시간 후에 동일량을 재투여하여 생쥐 한마리당 총 100mcg의 양을 투여한다(이중처리).

[실험과정]

생체내 실험모델은 그룬버그(Grunberg) 등이 제시한 방법을 사용하였다.(참고문헌 : GRUNBERG, E., BERGER, J., BESKID, G., CLEELAND, R., PRINCE. N.H. and TITSWORTH, E., 1967. Studies on the "in vitro" and "in vivo" chemotherapeutic properties of the antibiotics myxin. Chemotherapia 12, 272-291).

간략하게 언급하면, 표준화된 박테리아 현탁액을 간단히 피하 주입하고, 동일한 부위에 상기 공정 2와 같이 ST722 화합물을 피하 투여한다. 24시간 후에 생쥐가 죽은 다음 복막을 포함하는 복부벽을 각각의 생쥐로부터 절제한다.

조직견본을 먼저 5ml의 살균소금물에서 Potter-Elvehjjem 조직분쇄기로 균일화시키고, 스태필로코커스 아우레우스 선택성 배지위에 견본을 평판 배양시켜 세균수를 헤아린다. 이때 사용하는 스태필로코커스 아우레우스 선택성 배지는 아텔루트산염(Ey tellurite)을 많이 가한 베어드-파커(Baird-Parker) 한천배지로, 스태필로코커스 콜로니의 수를 쉽게 검출할 수 있는 배지이다.

[실험결과의 측정]

개개의 견본에 대하여 일련의 희석과정을 거쳐서 측정된 세균콜로니의 수는 감염된 조직견본에 존재하는 박테리아세포의 수를 계산하는데 다음과 같이 사용된다.

여기서,

Zi는 수행한 희석회수이고, Ni는 각각의 희석에 쓰여진 배양판의 수이며, Ci는 각각의 희석에 있어서 측정된 박테리아의 총 갯수이다.

[실험결과]

생쥐에 유발시킨 피하감염은 전형적인 감염의 특정예를 표시하며, ST722 화합물로 피하처리한 보호효과를 시험하는데 이용되었다. 이 경우 ST722 화합물을 표피에 단순히 국부침착시킨 후의 침투 능력은 아직 완전히 밝혀지지 않고 있다.

[공정 1]

ST722 화합물 5mcg의 투여로는 감염과정을 감소시킬 수 없었던 반면, 20~50mcg의 투여량은 박테리아감염 정도를 적절한 방식으로 투여량에 비례하여 감소시킨다(표 1). 그렇지만 박테리아를 접종한 다음 24시간 동안 시험한 조직시료로부터 박테리아를 완전하게 제거시키지는 못하였다.

[공정 2]

ST722 화합물을 50mcg씩 2회에 걸쳐 이중 투여한 후 상기와 동일한 유형의 결과를 얻었다. 이 경우에 있어서, 사실상 ST722 화합물의 처리는 박테리아세포의 수를 5.7×10⁷개에서 3.1×10⁵개로 감소시킨다(표 2).

[표 1]

[표 2]

[실험예 8]

운데실 알콜의 살균활성 측정

ST722 화합물 및 ST712 화합물과 같은 운데실 에스테르의 가수분해로부터 얻을 수 있는 운데실 알콜이 살균활성에 영향을 미치는가를 알아보기 위하여, 서로 다른 시험관내 시험을 실시하였다.

이는 분석배지에서의 운데실 알콜의 불용성에서 유래하는 어려움을 극복하기 위하여 시험관내 실험을 실시한 것이다.

상기 문제의 해결을 위하여, 세가지 서로 다른 실험적 시도를 선택하여 다음과 같은 실험결과를 얻었다.

1) 운데실 알콜을 Tween 80에 유화시키고 7그램음성 박테리아 균주를 심은 한천배지에서 300mcg/ml의 농도까지 시험하였다(한천희석시험).

실험결과 : 활성없음

2) 순수 운데실 알콜 0.05ml를 4그램음성 박테리아 균주가 심어진 한천배지에 가하였다(한천확산시험).

실험결과 : 활성없음

3) 운데실 알콜을 Tween 80에 유화시키고 4그램음성 박테리아 균주와 1그램양성 박테리아 균주가 심어진 육즙배지에서 400mcg/ml의 농도까지 시험하였다(육즙배지 희석시험).

실험결과 : 활성없음

Claims

다음 일반식 (I)로 표시되는 아실 L-카르니틴 에스테르.

상기식에서, R은 탄소수 2~16의 직쇄 또는 가지난 사슬의 아실기이고, n은 7~15의 정수이고, X는 약제학적으로 허용 가능한 산의 음이온이다.
제 1항에 있어서, 상기 식중 R은 이소부티릴 또는 이소발레릴임을 특징으로 하는 아실 L-카르니틴 에스테르.
제 1항에 있어서, 상기 식중 n은 10임을 특징으로 하는 아실 L-카르니틴 에스테르.
제 1항에 있어서, 상기 식중 X는 클로라이드; 브로마이드; 아이오다이드; 아스파르테이트; 시트레이트; 타르트레이트; 포스페이트; 푸마레이트; 글리세로포스페이트; 글루모세포스페이트; 락테이트; 말레이트; 오로테이트; 옥살레이트; 설페이트; 트리클로로아세테이트; 트리플루오로아세테이트 또는 메탄설포네이트 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 아실 L-카르니틴 에스테르.
제 1항에 있어서, 상기 에스테르는 이소발레릴 L-카르니틴 운데실 에스테르 클로라이드인 것.
제 1항에 있어서, 상기 에스테르는 이소부티릴 L-카르니틴 운데실 에스테르 클로라이드인 것.
유효성분으로서 다음 일반식 (I)로 표시되는 에스테르와 약제학적으로 허용 가능한 부형제로 이루어진 것임을 특징으로 하는 항박테리아 활성을 지닌 경구 또는 비경구투여용 약제조성물.

상기식에서, R, n 및 X는 각각 상기 청구범위 제 1항에서 정의한 바와 같다.
제 7항에 있어서, 상기 약제조성물은 원인균(actiologic agent)이 캄필로박터(Campylobacter) 또는 헬리코박터(Helicobacter) 속의 박테리아인 질병을 치료하는 것임을 특징으로 하는 약제조성물.
제 8항에 있어서, 상기 약제조성물은 인간의 장염, B-타입의 위염 및 십이지장궤양 치료용 약제인 것임을 특징으로 하는 약제조성물.
제 8항에 있어서, 상기 약제조성물은 동물의 장염 및 생식기염에 사용되는 약제임을 특징으로 하는 약제조성물.
제 7항에 있어서, 상기 약제조성물은 그램음성 또는 그램양성 박테리아에 의해 유발되는 감염치료용 약제임을 특징으로 하는 약제조성물.