KR0177497B1 - 대장균을 이용한 인간 오스테오칼신의 제조방법 - Google Patents

대장균을 이용한 인간 오스테오칼신의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대장균을 이용한 인간 오스테오칼신을 대량으로 발현시키는 방법에 관한 것으로, 인간 오스테오칼신 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 대장균을 인간 오스테오칼신의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 인간 오스테오칼신의 제조방법에 있어서, 상기 인간 오스테오칼신 유전자의 염기서열이 대장균 선호코돈으로 아미노산의 변화없이 치환변형되고 유비퀴틴 유전자와 융합시킨 본 발명의 방법에 의하면 기존의 방법보다 높은 수율로 인간 오스테오칼신을 생산할 수 있다.

Description

대장균을 이용한 인간 오스테오칼신의 제조방법
제1도는 인간 오스테오사코마 세포로부터 유래된 오스테오칼신의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이고,
제2도는 인간 오스테오사코마 세포로부터 유래된 오스테오칼신 유전자 및 이의 변형체를 대장균 발현벡터 pETUB OST 및 pETUB OC로 클로닝하는 과정을 도시한 것이고,
제3도는 인간 오스테오칼신 유전자를 포함하는 발현벡터 pETUB OST로 형질전환된 대장균을 배양하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 결과를 나타낸 것이고,
제4도는 본 발명의 변형된 재조합 인간 오스테오칼신의 염기서열을 나타낸 것이고,
제5도는 본 발명의 발현벡터 pETUB OC로 형질전환된 대장균을 배양하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 인간 오스테오칼신(osteocalcin)을 대량으로 발현시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인간 오스테오사코마(Osteosarcoma) 유래 오스테오칼신의 염기서열을 대장균에서 선호하는 염기코돈으로 아미노산 변화없이 치환하고 유비퀴틴 유전자와 융합하여 발현시킴으로써 인간 오스테오칼신 단백질을 높은 효율로 생산하는 방법에 관한 것이다.
오스테오칼신은 골격 전체 단백질의 1 내지 2%, 비콜라겐 단백질의 20%를 차지하는 골 감마 카르복실 단백질(bone gla (gamma carboxylated protein) protein; BGP)로써 미네랄화 되기(mineralization)전에는 골격중에 매우 미량으로 존재하지만, 골격이 활발한 성장시기 동안에는 그 양이 현저히 증가한다(Hauschka et al., J. Biol, Chem. 258, 176-182(1983)). 인간 오스테오칼신은 칼슘 및 하이드록시 아파타이트와 결합할 수 있으며(Poser, J. W. and Price, P. A., J. Biol. Chem., 254, 431-436(1979)), 먼저 프리-프로-오스테오칼신(pre-pro-Osteocalcin) 상태로 합성되고 여러 효소에 의해 프로세싱되어 최종적으로는 49개의 아미노산을 갖는 5,800 달톤 크기의 펩티드로 된다.
오스테오칼신은 골 기관배양(bone organ culture)(Nishimoto, S. K. and Price. P. A., J. Biol. Chem., 254, 437-441(1979))으로 분리된 골격세포(Beresford, J. N. et al., Netab. Bone Dis. Rel. Res., 5,229-234(1984)), 또는 쥐 세포주인 ROS 17/2 와 같은 골아세포의 오스테오사코마 세포주(Osteoblastic osteosarcoma cell lines)로부터 생체 밖에서 합성되며(Nishimoto, S. K. and Price, P.A., J. Biol. Chem., 255, 6579-6583(1980)), 주요한 칼슘 조절인자로써 알려진 1,25-디하이드록시 비타민 D3(dihydroxy vitamin D3 : 1,25(OH)2D3)가 생체 밖에서 이의 합성을 촉진하는 것으로 밝혀졌다(Price, P.A. and Baukol, S.A., J. Biol. Chem., 255, 1660-11663(1980)), 이러한 보고들은 오스테오칼신이 골 매트리스 턴오버(bone matrix turnover)의 표식자라는 사실을 뒷받침해 준다.
오스테오칼신은 대부분의 척추동물들에서 매우 보존된 아미노산 서열을 가지는 작은 폴리펩티드로써, 알려진 오스테오칼신은 칼슘결합에 필요한 3개의 감마 카르복시 글루타메이트(gamma-carboxy-glutamate(gla)) 잔기와 분자내 디설페이트 결합에 필요한 2개의 시스테인 잔기를 가지고 있다. 3개의 감마 카르복시 글루타메이트 잔기는 12,21 및 24번 위치 글루탐산 잔기의 비타민 K 의존적 후-번역적 카르복실화에 의해 만들어진 것이다.(Poser, J.W., et al., J. Biol. Chem., 255, 8685-8961(1980)),
오스테오칼신은 최근 활발히 연구되고 있지만 아직 그 기능과 대사에 대해서 모두 밝혀지지는 않았다. 여러 보고에 따르면 이 단백질은 골아세포에서 합성되며 뼈의 대사에 매우 밀접히 연관되고 골아세포의 활성 및 새로운 뼈의 생성에 영향이 있다고 알려져 있다(Parviainen, M. T., et al., Calcif Tissue Int. 49, 26-30(1991)). 합성된 오스테오칼신의 대부분은 뼈의 매트릭스에 카르복실화된 상태로 존재하지만 일부는 혈액으로 분비되어 나오게 되는데, 이렇게 분비된 오스테오칼신은 면역 화학 방법에 의해 측정할 수 있다(Power, M. J. and Fottrell, P. F., Chem. 35, 2087-2092(1989); Pastoureau, P. and Delmas, P. P., Clin. Chem. 36, 1620-1624(1990)).
혈청에 존재하는 오스테오칼신은 새롭게 생성된 뼈에서 기인된 것이므로, 혈청에서의 이 단백질의 양은 뼈의 생성속도에 대한 매우 특이적인 지표로써 작용한다(Price, P. A. et al., J. Clin. Invest. 66, 878-883(1980); Duba, R. J. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 66, 951-957(1988)). 혈청내의 오스테오칼신의 농도는 골격의 대사속도가 증가되는 대사적 골격질환을 갖는 환자에게서 증가되는데(Esptein. S., Endocr. Rev., 9, 437(1988)), 혈청내 오스테오칼신의 양을 측정하게 되면 대사적 골격질환 뿐만 아니라, 신장질환(Renal Disorder), 갑상선 항진증(Hyperthyroidism) 및 과다한 글루코코르티코이드(glucocorticoid)와 관련된 질병 등의 임상적 상황을 검사할 수 있다.
혈청내 오스테오칼신의 양을 측정하는 방법으로는 RIA(Radioimmunoassay) 나 EIA(Enzymoimmunoassay)가 있으며 이를 위해 오스테오칼신이 필요하게 된다. 그러나 뼈 조직으로부터 오스테오칼신을 얻기 위해서는 수차례의 정제과정을 거쳐야 하고 활발한 합성이 진행되고 있는 뼈 조직이 많은 양으로 요구되므로 쥐나 소의 뼈로부터 오스테오칼신을 정제하기도 한다. 그러나 이들은 인간의 오스테오칼신과 다소 차이가 있어서 정확한 분석이 어렵다는 문제점이 있다. 또한 기존의 염기서열로 대장균에서 인간 오스테오칼신을 발현시켰을 때에는 대장균 전체 단백질 대비 약 1% 정도의 적은 양만이 발현되므로 경제적인 측면에서 바람직하지 못하다는 문제가 있었다.
이에 본 발명자들은 인간 오스테오칼신을 보다 높은 수율로 얻을 수 있는 방법을 개발하기 위해 계속 연구하던 중, 인간 오스테오칼신 유전자의 염기서열을 대장균 선호코돈으로 아미노산의 변화없이 치환변형시키고, 유비퀴틴 유전자 다음에 융합시켜 발현시킬 때 인간 오스테오칼신을 높은 발현율로 생산할 수 있음을 발견하여 본 발명의 완성에 이르게 되었다.
즉, 본 발명의 목적은 인간 오스테오칼신을 높은 수율로 대량 발현시킬 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 대장균으로부터 높은 수율로 인간 오스테오칼신을 생산하는데 사용되는 인간 오스테오칼신의 변형된 재조합 유전자, 이를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 인간 오스테오칼신 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 대장균을 인간 오스테오칼신의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 인간 오스테오칼신의 제조방법에 있어서, 상기 인간 오스테오칼신 유전자의 염기서열이 대장균 선호코돈으로 아미노산의 변화없이 치환변형되고 유비퀴틴 유전자와 융합된 것을 특징으로 하는 인간 오스테오칼신의 제조방법을 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 하기 염기서열을 갖는 인간 오스테오칼신 유전자 :
상기 유전자를 포함하는 인간 오스테오칼신 발현벡터 : 및 상기 발현벡터 형질전환된 대장균을 제공한다.
이하, 본 발명은 좀더 상세히 설명하면 다음과 같다.
먼저, 인간 오스테오사코마(Osteosarcoma) 세포로부터 리보핵산(RNA)을 추출하여 이것을 역전사 효소의 주형으로 해서 올리고 d(T) 프라이머를 이용하여 cDNA를 만든다. 한편, 인간 오스테오칼신의 염기서열 정보(Michael, C.K.et al., Nucleic Acids Res., 18, 1909(1990)) 로부터 인간 오스테오칼신을 코드하는 인간 오스테오칼신 유전자의 5'-말단과 3'-말단에 대응하는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 PCR이라 함)용 프라이머를 고안 합성한다. 이들 프라이머는 대장균 발현벡터로 클로닝이 용이하도록 5'-말단에 제한효소 인식부위가 존재하도록 하며 이에 대응되는 프라이머에는 종료코돈과 제한 효소 인식부위를 삽입하여, 시작코돈으로부터 단백질이 합성되어 인위적으로 삽입한 종료코돈에서 단백질 합성이 완료되도록 한다.
본 발명에 따르면, 대장균 세포내에서 인간 오스테오칼신을 발현시키는데 최적화하기 위해 그의CDNA 염기서열을 대장균 선호코돈으로 아미노산 서열에는 변화가 없도록 다음과 같이 치환함으로써 인간 오스테오칼신의 발현율을 증가시킬 수 있었다.
상기와 같이 치환된 인간 오스테오칼신CDNA를 주형으로 하고 상기 프라이머를 이용하여 PCR 반응으로 인간 오스테오칼신 유전자를 증폭하고, 증폭된 유전자를 제한효소로 절단하여 얻은 유전자 단편을 적절한 대장균 발현벡터, 예를 들면 본 출원인이 선출원한 대장균 발현벡터인 pETUB A545((KTCC 10667)의 A545 유전자와 치환하여 발현벡터를 제조한다.
이어서 상기 재조합 벡터로 대장균을 형질전환시킨 다음, 본 유전자의 발현에 적당한 조건에서 배양한다. 단백질의 생성여부는 통상적으로 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 확인할 수 있으며, 생성된 단백질은 배양된 대장균 또는 배양액으로부터 공지된 방법에 의해 분리정제할 수 있다.
기존의 염기서열을 갖는 인간 오스테오칼신 유전자는 대장균 전 단백질 대비 약 1%의 인간 오스테오칼신을 발현시키는 것에 비해, 본 발명에 따라 인간 오스테오칼신 유전자의 아미노산 서열에는 변화가 없이 그의 염기서열만 대장균 선호코돈으로 변형시킨 인간 오스테오칼신 유전자를 이용한 경우에는 대장균 전 단백질 대비 약 21% 정도의 인간 오스테오칼신을 발현시킬 수 있다.
이하, 본 발명은 하기 실시예에 의거하여 좀더 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명은 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
[비교예]
[인간 오스테오칼신 유전자의 증폭 및 발현]
[단계 1]
[인간 오스테오사코마 세포로부터 오스테오칼신 유전자의 분리]
인간의 오스테오사코마 세포(Michael, C. K. et al., Nucleic Acids Res., 18, 1909(1990)) 로부터 콜로진스키 등의 방법(Cholozynski, P., et al., Anal. Biochem. 162, 156(1987))에 따라 다음과 같이 RNA 추출을 수행하였다. 5x106세포에 RNA 추출액(4M 구아니디움 티오시아네이트, 25mM 구연산 나트륨, pH 7.0, 0.5% 사르코실, 0.1M 2-머캅토에탄올) 1㎖을 가하고 진탕시켜 세포막을 파괴시킨 다음, 2M 아세트산나트륨(PH 4.0) 0.8㎖, 페놀 0.8㎖, 클로로포름-이소아밀알콜(49:1, v/v)1.6㎖을 가하여 잘 혼합한 후, 4℃에서 15분 동안 12,000G 로 원심분리하였다. 상층의 수용액을 동일 부피의 이소프로판올이 들어 있는 새 용기에 옮기고 -20℃에서 약 1시간 동안 방치한 다음, 4℃에서 20분간 12,000G로 원심분리하여 RNA 침전물을 얻었다. 이 침전물을 75% 에탄올로 세척한 뒤 진공건조시키고 20㎕ 의 TE 완충액(10mM Tris-HCl,PH 7.5, 1mM EDTA)로 용존시켰다.
mRNA 로부터 cDNA 단일가닥을 합성하기 위해서, 상기에서 얻은 RNA 용액 10㎕를 취하여 0.1M 메틸머큐리(CH3HgOH) 2㎕를 가한 다음 상온에서 10분간 방치하여 RNA 의 2차 구조를 풀어준 후 1M의 2-머캅토에탄올 2㎕를 가하여 5분간 반응시켰다. 여기에 10배 농축 역전사 효소 반응용액(500mM Tris-HCl,PH 8.3, 750mM KCl, 30mM MgCl2,10mM Dithiothreitol) 5㎕, 10mM dNTP 혼합액(dGTP, dATP, dTTP 및 dCTP가 각각 10mM) 2.5㎕, 디에틸피로카보네이트(DEPC, diethylpyrocarbonate)24㎕가 처리된 증류수, RNase 억제제(RNasin, 1U/㎕, Promega, U.S.A.) 1.0㎕, 올리고(dT)12-18프라이머(oligo(dT)12-18primer, GibcoBRL, U.S.A.) 1㎕를 가하고 상온에서 10분간 방치시켜 RNA 주형과 프라이머가 잘 붙게 한 다음, 2.5㎕의 역전사 효소(18U/㎕, Superscript RNase H-Reverse transcriptase, BRL, U.S.A.)를 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜CDNA 가닥을 합성하였다.
상기CDNA 로부터 인간 오스테오칼신 유전자를 중합효소 연쇄 반응을 이용해 증폭시키기 위해 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 핵산합성기(DNA Synthesizer, Applied Biosystems Inc., U.S.A.)를 이용하여 합성하였다.
T20ST 프라이머(5'-ATTATCCGCGGTGGTTACCTGTATCAATGGCTGGGAGCCCCAGTCCCCTACCGG-3')는 SacII 인지부위(밑줄)를 포함하며 16번째 핵산부터 인간 오스테오칼신 유전자와 동일한 염기서열을 갖도록 고안되었고, OSTSal 프라이머(5'-ATCATGTCGACTATTAGACCGGGCCGTAGAAGCGCCGATAGGCCTCCTGGAAA-3')는 SalI 인지부위(밑줄)와 두 개의 종료코돈을 갖고 있으며 17번째 핵산부터는 인간 오스테오칼신의 카복시 말단 염기와 상보적인 서열을 갖도록 고안하였다.
cDNA 가닥을 주형으로하여 중합효소 연쇄반응을 수행하되, 상기에서 합성한 cDNA 주형 2㎕, 10배 농축반응 완충용액 10㎕, 25mM MgCl26㎕, 10mM dNTP 2㎕, 0.75㎍ T2OST 프라이머 3㎕, 0.75㎍ OSTSal 프라이머 3㎕, Taq 중합효소 0.4㎕(5U/㎖, Promega, U.S.A.)에 75㎕의 증류슈를 넣어 반응액을 만들고 94℃, 1분 30초; 50℃, 1분; 72℃, 1분 30초의 반응을 40회 반복하여 150 염기쌍의 인간 오스테오칼신 유전자를 증폭하였다.
클리나우 중합효소(Klenow polymerase)와 T7 폴리뉴클레오티드 키나제(polynuclotide kinase, BRL, U.S.A.)를 처리하여 유전자의 양말단을 평활말단(blunt end)으로 만들고, pUC18 벡터(입수처 : NEB(New England BioLabs), U.S.A.)를 HincII 제한효소로 절단하여 접합하였다.(PUC18-OST). 대장균 JM105(ATCC 47016)컴피턴트 세포에 접합 반응액을 첨가하여 주고 하나한의 방법(J. Mol. Biol. 116,557(1983))에 따라 형질전환시킨 후, LB-엠피실린(50㎍/㎖ 엠피실린을 포함하는 LB 배지) 플레이트에 평판배양하여 대장균 형질전환체를 선별하였다.
생거 등의 방법(Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463(1977))에 따라 인간 오스테오칼신 유전자의 전체 핵산염기서열을 확인하여 알려진 인간 오스테오칼신의 염기서열(제1도)과 동일함을 확인하였다.
[단계 2]
[인간 오스테오칼신 유전자의 발현벡터 제조]
본 출원인의 선출원에서의 발현벡터 pETUB A545(KTCC10667) 2㎍을 제한효소 SacII 와 SalI으로 완전절단하고, 1% 아가로즈 겔로 전기영동 분리하여 약 4.5kb의 핵산절편을 얻었다. 이하, 이 절편을 절편 pETUB 라 칭한다. 한편 단계1에서 염기서열이 확인된 플라스미드 pUC18 OST를 제한효소 SacII과 SalI으로 완전절단하고 7% 아크릴아미드 겔 전기영동하여 150 염기쌍의 인간 오스테오칼신 유전자 핵산절편을 분리하였다(절편 OST).
인간 오스테오칼신 핵산절편 OST와 절편 pETUB를 다음과 같이 연결반응시켰다. 100ng의 절편 pETUB, 100ng의 절편 OST, 2㎕의 10배 농도 연결반응 완충용액(500mM Tris-HCl, pH7.8, 100mM MgCl2, 100mM ATP, 250㎍/㎖ BSA), 10단위의 T4 핵산 리가제를 넣고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이 반응액을 대장균 HB101(ATCC 33694) 컴피턴트 세포에 첨가하여 주고 형질전환시킨 후, LB-엠피실린 플레이트에 평판배양하여 대장균 형질전환체를 선별하였다. 선별된 클론의 발현벡터 pETUB OST 핵산을 얻은 후 이를 다시 발현 숙주인 대장균 BL21(DE3)pLys(Novagen Inc., Madison WI53711, U.S.A.)에 형질전환시키고 상기와 동일한 방법으로 LB-엠피실린 플레이트에 평판배양하여 인간 오스테오칼신 유전자를 발현할 수 있는 유전자 재조합 대장균 형질전환체를 선별하였다.
제2도는 인간 오스테오사코마 세포로부터 유래된 오스테오칼신 유전자를 대장균 발현벡터 pETUB OST로 클로닝하는 과정을 도시한 것이다.
[단계 3]
[대장균에서 인간 오스테오칼신의 발현]
상기 단계 2에서 얻은 재조합 대장균 세포를 50㎍/㎖의 엠피실린이 함유된 액체 루리아(Luria) 배지(6% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화나트륨)에서 12시간 동안 진탕배양한 다음, 이중 3㎖을 300㎖의 M9 배지(40mM K2HPO4, 22mM KH2PO4, 8.3mM NaCl, 18.7mM NH4Cl, 1% 포도당, 0.1mM MgSO4, 0.1mM CaCl20.4% 카사미노산, 10㎍/㎖ 비타민 B1, 40㎍/㎖ 엠피실린)로 옮겨서 37℃에서 약 4시간 동안 진탕배양하였다. 박테리아의 흡광도가 650nm에서 약 0.3 정도가 될 때 인돌아크릴산(Indole Acrylic Acid, IAA)을 최종농도가 50㎍/㎖이 되게 첨가하였다. IAA를 첨가한지 약 4시간 후에 세포 배약액의 흡광도를 측정한 다음 원심분리기(Beckman J2-21, JA14 rotor)를 이용하여 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수거하였다. 수거한 세포 침전물을 램리의 방법(Laemmli, et al., Nature 227, 680(1970))에 따라 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동하여 발현을 확인하였다. 덴시토미터로 측정한 결과 플라스미드 pETUB OST로 형질전환된 대장균으로부터 발현된 인간 오스테오칼신은 대장균 전 단백질 대비 1.4%의 발현율을 나타내었다.
제3도는 인간 오스테오칼신 유전자를 포함하는 발현벡터 pETUB OST로 형질전환된 대장균을 배양하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
제3도에서 제1열 내지 제3열은 벡터 pETUB OST를 함유한 대장균을 나타낸 것이고, 제4열은 벡터를 함유하지 않은 대장균을 나타낸 것이고, 제5열은 표준 단백질 분자량을 표시하는 것이다.
[실시예]
[변형된 인간 오스테오칼신 유전자의 발현]
[단계 1]
[변형된 인간 오스테오칼신 유전자 고안 합성 및 클로닝]
인간 오스테오칼신 유전자의 염기서열을 아미노산의 변화가 없도록 하면서 대장균에서 선호하는 염기코돈으로 합성하기 위해 아래와 같은 4개의 프라이머를 고안하였다 :
여기에서, 프라이머 T20C1은 유비퀴틴과 연결하기 위한 SacII의 인지부위를 갖고 유비퀴틴 분해효소의 인지부위인 Arg-Gly-Gly에 해당하는 염기서열을 갖도록 고안되었으며, 또한 프라이머 OC4는 본 발명의 발현벡터와의 연결을 위해 SalI의 인지부위를 포함하고 있다.
이어서, 다음과 같이 중합효소 연쇄반응을 수행하여 전체 유전자를 연결하였다 : 먼저 10배 농축반응 완충용액 10㎕, 25mM MgCl26㎕, 10mM dNTP 2㎕, 0.75㎍ T2OC1 프라이머 3㎕, 0.75㎍ OC4 프라이머 3㎕, 1.6ng OC2 프라이머 3㎕, 1.6ng OC3 프라이머 3㎕ 및 Taq 중합효소 0.4㎕(5U/㎖, Promega, U.S.A.)에 70㎕의 증류수를 넣어 반응액을 만들고 94℃, 1분 30초; 50℃, 1분; 72℃, 1분 30초의 반응을 25회 반복하여 150 염기쌍의 대장균이 선호하는 염기서열을 갖는 변형된 인간 오스테오칼신 유전자를 증폭하였다.
비교예 단계1과 같은 방법으로PUC18 벡터에 삽입하여PUC18-OC를 만들고 염기서열을 확인하여 변형된 인간 오스테오칼신 유전자의 염기서열(제4도)을 확인하였다.
[단계 2]
[변형된 염기서열을 갖는 인간 오스테오칼신 유전자의 발현벡터 제조]
단계1에서 염기서열이 확인된 제조합 발현벡터PUC18 OC를 제한효소 SacII과 SalI으로 완전절단하고 7% 아크릴아미드 겔 전기영동하여 150 염기쌍의 변형된 염기서열을 갖는 인간 오스테오칼신 유전자 핵산절편을 분리하였다(절편 OC).
인간 오스테오칼신 유전자 핵산절편 OC와 절편 pETUB를 다음과 같이 연결반응시켰다. 100ng의 절편 pETUB, 100ng의 인간 오스테오칼신 핵산절편 0C, 10배 농도 연결반응 완충용액 2㎕, 10 단위의 T4 핵산 리가제를 넣고 총부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 동안 연결반응시켰다. 이 반응액을 대장균 HB101(ATCC 33694) 컴피턴트 세포에 첨가하여 주고 형질전환시킨 후, LB-엠피실린(50㎍/㎖ 엠피실린을 포함하는 LB 배지) 플레이트에 평판배양하여 대장균 형질전환체를 선별하였다. 선별된 클론의 발현벡터 pETUB OC 핵산을 얻은 후 이를 다시 발현 숙주인 대장균 BL21(DE3)pLys (Novagen Inc., Madison WI53711, U.S.A.)에 형질전환시키고 LB-엠피실린 플레이트에 평판배양하여, 변형된 염기서열을 갖는 인간 오스테오칼신 유전자를 발현할 수 있는 유전자 재조합 대장균 형질전환체를 선별하였다.
제2도는 본 발명에 따라 변형된 인간 오스테오칼신 유전자를 대장균 발현벡터 pETUB OC로 클로닝하는 과정을 도시한 것이다.
재조합 플라스미드 pETUB OC를 알칼리 용해 방법으로 대량 추출하여 상기 비교예와 동일한 방법으로 대장균에 형질전환시켜 재조합 대장균 콜로니를 얻었다. 상기 형질전환된 대장균 BL21(DE3)pLys/pETUB OC를 1995년 12월 7일자로 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 8714P 호로서 기탁하였다.
[단계 3]
[대장균에서 변형된 염기서열을 갖는 인간 오스테오칼신 유전자의 발현]
상기 단계2에서 얻은 재조합 대장균 세포를 50㎍/㎖의 엠피실린이 함유된 액체 루리아(Luria) 배지(6% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화나트륨)에서 12시간 동안 진탕배양한 다음, 이중 3㎖을 300㎖의 M9 배지(40mM K2HPO4, 22mM KH2PO4,8.3mMNaCl, 18.7mM NH4Cl, 1% 포도당, 0.1mM MgSO4, 0.1mM CaCl20.4% 카사미노산, 10㎍/㎖ 비타민 B1, 40㎍/㎖ 엠피실린)로 옮겨서 37℃에서 약 4시간 동안 진탕배양하여 박테리아의 흡광도가 650nm에서 약 0.3 정도가 될 때 인돌아크릴산(Indole Acrylic Acid, IAA)을 최종농도가 50㎍/㎖이 되게 첨가하였다. IAA를 첨가한지 약 4시간 후에 세포 배양액의 흡광도를 측정한 다음 원심분리기(Beckman J2-21, JA14 rotor)를 이용하여 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수거하였다. 수거한 세포 침전물을 램리 등의 방법(Laemmli, et al., Nature 227, 680(1970))에 따라 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동하여 발현을 확인하였다. 이어서 덴시토미터로 측정한 결과, 플라스미드 pETUB OST로 형질전환된 대장균으로부터 발현된 변형된 염기서열을 갖는 인간 오스테오칼신은 대장균 전 단백질 대비 21.55%의 발현율을 나타내었다.
제5도는 본 발명의 발현벡터 pETUB OC로 형질전환된 대장균을 배양하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
제5도에서 제1열 내지 제6열은 본 발명의 발현벡터 pETUB OC으로 형질전환된 대장균 클론의 추출액 시료이고, 제7열은 벡터를 함유하지 않는 효모의 추출액 시료이고, 제8열은 표준 단백질 분자량을 표시하는 것이다.
상기 결과에서 보듯이, 기존의 염기서열을 갖는 인간 오스테오칼신 유전자의 경우 매우 낮은 발현율을 보이는데 반해, 염기서열을 대장균 선호코돈으로 아미노산 변형시킨 결과 약 15배 이상의 발현율 증가를 얻을 수 있었다. 따라서 본 발명의 생산방법에 따르면 인간 오스테오칼신을 효율적으로 대량 생산할 수 있다.

Claims (6)

  1. 인간 오스테오칼신 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 대장균을 인간 오스테오칼신의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 인간 오스테오칼신의 제조방법에 있어서, 상기 인간 오스테오칼신 유전자가 하기 염기서열을 갖고 유비퀴틴 유전자와의 융합유전자인 것을 특징으로 하는, 인간 오스테오칼신의 제조방법.
  2. 하기 염기서열을 갖는 변형된 인간 오스테오칼신 유전자.
  3. 제2항의 유전자와 유비퀴틴 유전자의 융합유전자를 포함하는 인간 오스테오칼신 발현 벡터.
  4. 제3항에 있어서, pETUB OC.
  5. 제3항의 발현벡터로 형질전환된 대장균.
  6. 제5항에 있어서, 대장균 BL21(DE3)pLys/pETUB OC(KCTC 8714P).
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