KR0155161B1 - 고정화 균주를 이용한 인산화된 아미노글리코시드 항생물질의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

고정화 균주를 이용한 인산화된 아미노글리코시드 항생물질의 제조방법

제1도는 트리톤 X-100(Triton X-100)으로 처리한 균체를 고정화하여 얻은 고정화 균체와 생균을 고정화시킨 고정화 균체를 사용하였을 때 반응시간에 따른 카나마이신 B-3'-인산의 생성수율을 나타내는 것이다.

본 발명은 고정화 균체를 이용하여 인산화된 아미노글리코시드 항생물질을 제조는 방법에 관한 것이다.

지금까지, 아미노글리코시드 항생물질은 인간이나 동물에게 있어서 미생물에 의해 야기되는 질병의 치료에 사용되어 왔다. 그러나 계속적인 아미노글리코시드 항생물질의 사용으로 이 항생물질에 내성을 갖은 수많은 미생물이 출현하게 되었다. 인산화된 아미노글리코시드 항생물질은 이러한 내성균주들의 내성기전중 하나로 인산화효소 포스포트란스훼라제(phosphotransferase)의 촉매작용에 의해 아미노글리코시드 항생물질과 인산공여체로서 에너지 운반물질인 아데노신3인산의 반응에 의하여 생성된다. 이러한 포스포트란스훼라제에 의한 내성기전이 아미노글리코시드 항생물질 내성균주들의 가장 보편화된 내성기전이다.

따라서 인산화에 의한 아미노글리코시드 항생물질의 내성기전에 기초하여 제조된 인산화된 아미노글리코시드 항생물질을 원료로 사용한다면, 기존의 아미노글리코시드 항생물질 내성균주들에 대하여 생육저해작용이 있는 신규 아미노글리코시드 항생물질의 제조가 가능하다. 예를 들면, 특허공보 제 79-1196호, 80-1086 및 미국특허 제 4,029,883호에는 인산화된 아미노글리코시드 항생물질을 원료로 사용하여 데옥시아미노글리코시드 항생물질의 제조법이 보고되었으며, Tsuchiya, T 등은 데옥시아미노글리코시드 항생물질의 불소화합물이 아미노글리코시드 항생물질 내성균주들에 대하여 생육저해효과가 있음을 보고한 바 있다.(J. Antibiotics, 38, 1287 (1985)).

위의 포스포트란스훼라제를 생산하는 미생물의 예로는, 에세리키어 코리 ATCC

21990, 에세리키어 코리 K12ML1629(Science, 157, 1559, (1967)), 에세리키어 코리 K12 1410 R81(J. Antibiotics, 26, 407, (1973)), 에세리키어 코리 K12J5Rll-2(J. Antibiotics, 26, 407, (1973)), 에세리키어 코리 JR66/W677(J. Antibiotics, 25, 748, 1972), 슈도모나스 에루기노사 TI-13(J. Antibiotics, 28, 442, 1975), 슈도모나스 에루기노사 N-9(J. Antibiotics, 21, 154, (1968)) 및 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Antimicrob. Agents Chemother, 15, 190, 1979)등을 들 수 있다. 상기 미생물의 표시중 ATCC 21990은 American Type Culture Collection의 미생물 기탁번호이다. 한편, 현재까지 상기 미생물의 아미노글리코시드 항생물질에 대한 내성기전에 기초하여 인산화된 아미노글리코시드 항생물질의 제조가 산업화된 예가 없다.

종래의 인산화된 아미노글리코시드 항생물질의 제조방법으로는 Science, 157,

1559(1967), Applied Microbiol, 16, 1276(1968), J. Antibiotics, 25, 748(1972), J. Biol. Chem., 248, 2435(1973), J. Antibiotics, 27, 358(1974) 및 Microbiol. Immunol., 22, 515(1978)등을 들 수 있는데, 상기 방법들은 모두 내성균주의 균체를 분해하여 얻은 조효소를 기질용액에 첨가하거나 고정화 효소를 사용하여 인산화된 아미노글리코시드 항생물질을 얻는다.

그러나, 조효소를 사용하여 인산화된 아미노글리코시드 항생물질을 얻기 위하여는 별도의 균체분해 및 조효소액의 분리공정이 필요하다는 공정의 복잡성 분제가 수반된다. 또한, 조효소액의 반복사용이 어려우며 조효소액에 혼재하는 균체의 가용성 성분들이 공정의 수율 및 순도에 영향을 미치므로 산업적 응용시 공정의 복잡성 및 경제성 측면에서 많은 어려움이 있어 왔다. 고정화 효소를 사용하는 경우에도 균체에서 효소를 분리정제하는 공정이 필요하여 많은 비용과 시간이 소요되는 동시에 공정중 전체효소 역가의 상당부분이 손실되므로 산업적 응용시 공정의 복잡성 및 경제적 측면에서 실용적이지 못하다. 따라서 본 발명자들은 상기 방법들의 단점을 해결하여 산업적 응용이 가능하도록 공정의 단순화 및 경제성을 높일 수 있는 인산화된 아미노글리코시드 항생물질의 제조방법에 대해 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명에서는 돌연변이 유발물질을 사용하여 상기의 에세리키어 코리 ATCC 21990 균주에 대하여 돌연변이를 실시하여 선별한 포스포트란스훼라제 고생산성 에세리키어 코리 RA-20(KFCC 10690) 돌연변이주를 배양하여 균체만을 수집한 후 적절한 조건의 디터전트(Detergent)를 처리하여 칼슘알지네이트에 고정화시킨후 이고정화 균체를 사용하여 회분법이나 연속식 방법으로 인산화된 아미노글리코시드 항생물질을 제조하는 방법을 완성하였다. 그 결과, 종래의 방법에 비해 균체분해공정, 조효소 분리공정 및 효소 분리 정제공정 등 복잡한 공정을 생략하고 디터전트를 처리한 균체를 직접 인산화된 아미노글리코시드 항생물질을 제조하기 위한 효소반응에 사용할 수 있었다. 한편, 디터전트를 처리하여 얻은 균체는 반복 사용시 균체회수율을 높이기 위하여 담체에 고정화시킨 고정화 균체를 제조하여 반응에 사용하였다. 또한 상기의 고정화 균체는 디터전트를 처리한 균체를 고정화 하여 제조하였으므로 균체 세포막의 임부 지질 성분들이 제거되어 기질확산 속도가 높아 생균체를 직접 사용하는 경우에 비해 반응 소요시간의 최소화 및 수율증가가 가능하였다.

한예로, Agric. Biol. Chem., 44(7), 1561(1980)에는 생균체를 사용한 인산화된 아미노글리코시드 항생물질의 제조에 관하여 보고되었는데, 그 결과, 0-20% 의 반응수율만을 얻었으며, 이는 생균체의 경우 아미노글리코시드 항생물질의 세포막 투과에 장애가 있가 때문인 것으로 밝히고 있다.

본 발명에서 균체의 디터전트 처리공정은 균체의 형태를 유지하며 세포막의 일부 지질 성분들을 제거하여 포스포트란스훼라제는 균체 오부로 분비되지 않고 아미노글리코시드 항생물질 및 인산화된 아미노글리코시드 항생물질의 투과성을 높일 수 있는 조건을 확립하여 실시되었으며, 반응 종료후 회수한 고정화 균체의 전체 효소활성도의 손실은 거의 없는 것으로 나타났다. 또한, 회수한 고정화 균체는 안정성이 매우 높아 10회이상 재사용하였을때에도 효소활성도가 유지되었다. 이와같이 본 발명자들은 종래 방법에 비해 산업적 응용이 용이한 경제적이고 실용적인 아미노글리코시드 항생물질 제조방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서는, 상기의 에세리키어 코리 ATCC 21990 균주에 대하여 자외선 조사 및 니트로소구아니딘(nitrosoguanidine)을 순차적으로 처리한 후 고농도의 차카나마이신 B 에 내성을 갖는 균주들을 선별하고 이중 생육이 양호한 균주를 선별하여 아미노글리코시드 항생물질 포스포트란스훼라제 생산성을 확인한 후 최종적으로 에세리키어 코리 RA-20(KFCC 10690)을 선발하였다. 그 결과, 에세리키어 코리 RA-20(KFCC 10690)은 원래 균주 에세리키어 코리 ATCC 21990에 비해 아미노글리코시드 포스포트란스훼라제 생산성이 약 4배 증가되었음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 공지의 균주에 비하여 인산화된 아미노글리코시드 항생물질의 생산수율은 크게 향상시킬 수 있는 신규의 에세리키어 코리 변이주를 얻어, 인산화된 아미노글리코시드 항생물질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명을 좀더 구체적으로 설명하면, 에세리키어 코리 ATCC 21990 균주를 30-40℃에서 10-30시간동안 진탕배양한 후 배양액을 원심분리하여 균체를 수확하고 수확된 균체를 생리식염수에 현탁하여 균체현탁액을 만든다. 균체현탁액 5-10ml를 멸균 페트리디쉬(petri dish)에 넣은후 15와트 자외선등으로 20-40 cm 거리에서 20-60초간 조사한 수 카나마이신 B 1mg/ml를 함유하는 뉴트리언트아가(nutrient agar) 평판에 도말하여 30-40℃에서 10-30 시간동안 배양한 후 생육상태가 양호한 집락만을 선별한다. 상기 선별균주를 카나마이신 B 1mg/ml를 함유하는 뉴트리언트 브로스(nutrient broth)에 2회 계대 배양한 후 카나마이신 B 2mg/ml를 함유하는 뉴트리언트 아가 평판에 도말하여 생육상태가 양호한 집략을 선별한다. 상기 선별균주를 카나마이신 B 2mg/ml를 함유하는 뉴트리언트 브로스에서 30-40℃, 10-30 시간동안 진탕 배양한 후 배양액을 원심분리하여 균체를 수확하고 수확된균체를 생리식염수에 현탁하여 균체현탁액을 만든다. 균체현탁액중 니트로소구아니딘 0.05-0.20 mg/ml를 함유하도록 니트로소구아니딘을 첨가한 후 20-40℃에서 20-40분간 반응시키고 원심분리하여 균체를 수확한다. 수확된 균체를 생리식염수로 2-3회 세척하여 니트로소구아니딘을 제거한 후 카나마이신 B 5mg/ml를 함유하는 뉴트리언트 아가 평판에 도말하여 생육상태가 양호한 집락을 선별한다. 상기 선별균주를 카나마이신 B 5mg/ml를 함유하는 뉴트리언트 브로스에서 30-40℃, 10-30시간동안 진탕배양한 후 배양액을 원심분리하여 균체를 수확하고 수확된 균체를 생리식염수에 현탁하여 균체현탁액을 만든다. 균체현탁액중 니트로소구아니딘 0.05-0.20 mg/ml를 함유하도록 니트로소구아니딘을 첨가한 후 20-40℃에서 20-40분간 반응시키고 원심분리하여 균체를 수확한다. 수확된 균체를 생리식염수로 2-3회 세척하여 니트로소구아니딘을 제거한 후 카나마이신 B 20mg/ml를 함유하는 뉴트리언트 아가 평판에 도말하여 생육상태가 양호한 집락을 선별한다. 선별된 균주들에 대하여 카나마이신 B 포스포트란스훼라제 생산성을 확인하여 고생산성 균주를 선발한다.

상기 공정에서 포스포트란스훼라제 고생산성 돌연변이주 에세리키어 코리 RA-20(KFCC 10690)을 얻어 뉴트리언트 브로스(Nutrient Broth)배지에 접종하여 30-40℃에서 10-30시간동안 진탕 배양한 후 배양액을 원심분리하여 균체를 수확하고 수확된 균체를 1-20% (W/V)의 농도가 되도록 생리식염수에 현탁시킨다. 균체현탁액에 디터전트의 농도가 0.1-5% (V/V)가 되도록 디터전트를 가한 후 30-40℃에서 15-120분간 교반시킨 후 원심분리하여 균체를 회수하고 인산 완충액에 현탁시킨 후 칼슘알지네이트에 고정화시킨다. 균체를 칼슘알지네이트에 고정화 시키기 위하여 소듐 알지네이트를 인산완충 용액에 잘 녹인후 동량의 균체현탁액과 잘 섞은 혼합액을 바늘 직경 1mm인 주사기를 사용하여 염화칼슘 용액에 적하하여 직경 1000-4000 마이크로미터의 구슬 모양 고정화 균체를 얻는다. 상기 방법에 의해 제조된 고정화 균체는 회분식 반응기나 연속식컬럼 반응기내에서 아미노글리코시드 항생물질과 아데노신 3인산을 반응시켜 인산화된 아미노글리코시드 항생물질을 제조한다. 상기 반응기내 반응기질의 농도는 아미노글리코시드 항생물질 0.5-1.5% (W/V). 아데노신 3인산 1.0-3.0% (W/V)이며, ph는 6.5-7.5이다. 상기 방법에 위한 고정화 균체는 반응후 여과등의 간편한 조작으로 반응액과 분리되어 쉽게 회수하여 재사용할 수 있으며 10회이상 사용하였을때에도 최초 효소활성도의 70-80%가 유지되었다. 회분식반등기를 사용하는 경우에도 반응기질이 채워진 반응기내에 고정화 균체 10-20% (W/V)를 넣은후 ph를 6.5-7.5로 유지하면서 30-40℃에서 5-10시간동안 교반 반응을 시킨다. 반응 종료후에는 고정화 균체를 분리한 후 반응액을 정제공정으로 이송하여 인산화된 아미노글리코시드 항생물질을 분리정제한다. 연속식 컬럼반응기를 사용하는 경우에는 컬럼반응기내에 고정화 균체를 충진한 후 상승식 방법으로 반응기질을 통액하여 반응을 시킨다. 이때 컬럼 반응기내의 온도는 30-40℃에서 ph는 6.5-7.5 로 유지하고 미반응 아미노글리코시드 항생물질이 함유되 유출액은 재순환시키며, 반응기질 용액의 컬럼반응기내 반응시간은 2-10시간이 적당하다. 한편, 상기 각 공정에서 반응액중 인산화된 아미노글리코시드 항생물질과 미반응 아미노글리코시드 항생물질의 검출을 위하여는 TLC를 사용하였다.

한편, 상기 공정에서 카나마이신 B 포스포트란스훼라제 효소활성도는 다음과 같은 방법을 사용하여 측정한다. 선별된 균주들을 각각 뉴트리언트 브로스에서 30-40℃, 10-30시간동안 진탕 배양한후 배양액을 원심분리하여 균체를 수확하고 수확된 균체를 생리식염수에 현탁하여 균체현탁액을 만들어 초음파 분쇄기로 분해하여 원심분리한 후 잔사를 제거한 조효소액을 얻는다. 조효소액 5-200μl를 반응기질 500μl에 넣어 37℃에서 30분간 반응시킨 후 90℃에서 10분간 열처리하여 반응을 정지시킨후 바실루스섭틸리스(Bacillus subtilis) ATCC 6633을 공시균주로 사용한 발육저지환 측정방법을 사용하여 잔류 카나마이신 B를 정량하고 이로부터 생성된 카나마이신 B-3'-인산을 정량하여 효소활성도를 결정하며 분당 1μmol의 카나마이신 B -3'-인산의 생성에 필요한 효소활성도를 1단위(IU)로 한다. 이때 반응기질의 농도는 카나마이신 B 0.5-1.5% (W/V), 아데노신3인산 1.0-3.0% (W/V)이며, ph는 6.5-7.5이다.

본 발명에서 변이시킨 변이주는 공지균주인 에세리키어 코리 ATCC 21990에 비하여 다음과 같은 특성을 가진다.

즉, 공지 에세리키어 코리 ATCC 21990 은 류신(leucine), 요구성인데 비하여 본 발명의 신규 에세리키어 코리 변이주는 류신(leucine), 이소류신(isoleucine) 및 트레오닌(threonine) 요구성 변니주(auxotroph 변이주)이다.

또한 본 발명의 변이주는 당 이용성에 있어서 아라비노스(arabinose), 과당(fructose), 갈락토오스(galactose), 글리세롤(glycerol), 만노오스(mannose), 포도당(glucose), 솔비톨(sorbitol) 및 트레할로오스(trehalose)등의 당을 이용하고, 아미그달린(amygdalin), 셀로비오스(cellobiose), 덜시톨(dulcitol), 에스쿠린(esculin), 이노시톨(inositol), 이눌린(inulin), 유당(lactose), 맥아당(maltose), 만니톨(mannitol), 멜레지토오스(melezitose), 멜리비오스(melibiose), 라피노오스(raffinose), 살리신(salicin), 소르보오스(sorbose), 전분(starch), 설탕(sucrose) 및 크실로오스(xylose) 등의 당은 이용하지 않는 특성이 있음이 확인되었다.

본 발명의 인산화된 아미노글리코시드 항생물질 고생산성 신규 대장균은 에세리키어 코리 RA-20 으로 명명하였으며, 1990. 5. 8 일자로 한국종균협회에 기탁번호 제 KFCC-10690호로 기탁하였다.

다음에 실새예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

[실시예 1]

뉴트리언트 아가 평판상의 에세리키어 코리 ATCC 21990 집락을 백금니로 취하여 10ml 뉴트리언트 브로스에 접종하여 37℃에서 14시간 진탕 배양한 후 배양액을 원심분리하여 균체를 수확하고 수확된 균체를 생리식염수로 1회 세척하고 다시 생리식염수 10ml에 현탁하여 균체현탁액을 제조하였다. 균체현탁액 5ml를 멸균 페트리디쉬에 옮긴 후 출력 15W 자외선등으로 30cm거리에서 30초간 조사한 후 카나마이신 B 1mg/ml를 함유하는 뉴트리언트 아가 평판에 도말하여 37℃에서 20시간 배양하여 카나마이신 B 1mg/ml의 농도에 내성을 갖는 돌연변이주 8주를 선별하였다. 선별된 8주의 균주등을 카나마이신 B 1mg/ml를 함유하는 10ml 뉴트리언트 브로스에 2회 계대 배양하면서 생육상태가 가장 좋은 균주를 선별하여 에세리키어 코리 RA-1으로 하였다. 에세리키어 코리 RA-1의 2회 계대배양액을 백금니로 취하여 카나마이신 B 2mg/ml를 함유하는 뉴트리언트 아가 평판에 도말하여 37℃에서 20시간 배양한 후 카나마이신 B 2mg/ml 의 농도에 내성을 갖는 돌연변이주 3주를 선별하였다. 선별된 3주의 균주들을 10ml 뉴트리언트 브로스에 2회 계대배양하면서 생육상태가 가장 좋은 균주를 선별하여 에세리키어 코리 RA-2 로 하였다. 에세리키어 코리 RA-2의 2회 계대배양액을 원심분리하여 균체를 수확하고 수확된 균체를 생리식염수로 1회 세척하고 다시 생리식염수 10ml에 현탁하여 에세리키어 코리 RA-2 균체 현탁액을 제조하였다. 상기 에세리키어 코리 RA-2 균체현탁액중 니트로소구아니딘 0.1 mg/ml 이 함유되도록 니트로소구아니딘을 첨가한 후 30℃에서 30분간 반응시키고 원심분리하여 균체를 수확하였다. 수확된 균체를 생리식염수로 2회 세척하여 니트로소구아니딘을 제거한 후 다시 생리식염수 10ml에 현탁하여 균체현탁액을 제조하였다. 상기 균체현탁액을 백금니로 취하여 카나마이신 B 5mg/ml를 함유하는 뉴트리언트 아가 평판에 도말하여 37℃에서 20시간 배양하여 카나마이신 B 5mg/ml의 농도에 내성을 갖는 돌연변이주 5주를 선별하였다. 선별된 5주의 균주들을 카나마이신 B 5mg/ml를 함유하는 10ml 뉴트리언트 브로스에 2회 계대배양하면서 생육상태가 가장 좋은 균주를 선별하여 에세리키어 코리 RA-5로 하였다. 에세리키어 코리 RA-5의 2회 계대 배양액을 원심분리하여 균체를 수확하고 수확된 균체를 생리식염수로 1회 세척하고 다시 생리식염수 10ml 에 현탁하여 에세리키어 코리 RA-5 균체현탁액을 제조하였다. 상기 에세리키어 코리 RA-5 균체현탁액중 니트로소구아니딘 0.1 mg/ml이 함유되도록 니트로소구아니딘을 첨가한 후 30℃에서 30분간 반응시키고 원심분리하여 균체를 수확하였다. 수확된 균체를 생리식염수로 2회 세척하여 니트로소구아니딘를 제거한 후 다시 생리식염수 10ml에 현탁하여 균체현탁액을 제조하였다. 상기 균체현탁액을 백금닐 취하여 카나마이신 B 20mg/ml를 함유하는 뉴트리언트 아가 평판에 도말하여 37℃에서 20시간 배양하여 카나마이신 B 20mg/ml의 농도에 내성을 갖는 돌연변이주 4주를 선별하였다. 선별된 4주의 균주들은 카나마이신 B 20mg/ml를 함유하는 10ml 뉴트리언트 브로스에 2회 계대배양하면서 생육상태가 가장 좋은 균주를 선발하여 에세리키어 코리 RA-20 (KFCC 10690)으로 하였다.

표1은 공지 에세리키어 코리 ATCC 21990 및 본 발명의 신규 에세리키어 코리 RA-20 (KFCC 10690)의 카나마이신 B-3'-포스포트란스훼라제의 생산성을 나타낸 결과이다.

표1 에세리키어 코리 ATCC 21990 및 에세리키어 코리 RA-20 (KFCC 10690)의 카나마이신 B-3'-포스포트란스훼라제 생산성비교.

[실시예 2]

포스포트란스훼라제 고생산성인 에세리키어 코리 RA-20 (KFCC 10690)을 100ml 뉴트리언트 브로스 배지에 접종하고, 37℃에서 12-13시간 진탕 배양한다. 이를 다시 같은 조성의 배지 2ℓ에 접종해서 37℃에서 12-20시간 진탕 배양한 후 이 배양액을 원심분리에 의해 집균하고 습균체 중량 20-30g을 얻는다. 이 균체를 트리톤 X-100(Triton X-100)0.1-2.0%가 함유된 생리식염수 100-200ml에 넣어 30-40℃에서 15-120분간 교반시킨후 원심분리로 집균하여 세척한후 100-200ml의 0.1 M인산완충액에 현탁시킨다. 소듐알지네이트 2-4g을 100-200ml의 인산완충용액에 녹여 상기 균체현탁액과 고루 섞은 후 페리스탈틱펌프(peristaltic pump)를 사용하여 직경 1mm의 고무관을 통하여 600-1200ml의 0.1M 염화칼슘용액에 적하한다. 이를 3-4시간 방치후 25% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 25-50ml를 가하여 처리한 후 직경 1-4mm인 구슬모양 고정화 균체를 모은다. 고정화 균체를 카나마이신 B 0.5-1.5% (W/V), 아데노신3인산 1.0-3.0% (W/V) 인 기질용액 1-2ℓ에 넣어 ph를 6.5-7.5로 유지하면서 30-40℃에서 5-10시간동안 교반하면서 반응시킨다. 이때 반응액내의 카나마이신 B-3'-인산의 생성수율은 99.9% 이상이었으며, 반응 종료후 고정화균체를 회수하여 10회이상 사용하여도 반응수율은 99% 이상을 유지하였다. 제1도는 상기 고정화균체와 생균을 고정화한 고정화균체를 사용하였을 때 반응시간에 따른 카나마이신 B-3'-인산 생성수율을 비교한 결과이다.

[실시예 3]

실시예 2와 동일한 방법으로 얻은 고정화 균체를 직경 2-4 cm, 높이 100-200 cm인 컬럼에 충진한 후 실시예 2의 기질용액을 통액하여 반응을 시킨다. 이때 컬럼 반응기내의 온도는 30-40℃, ph는 6.5-7.5로 유지하고 미반응 카나마이신 B가 함유된 유출액은 재순환시키며, 반응기질 용액의 컬럼반응기내 반응시간은 2-10시간으로 하였을 때 카나마이신 B-3'-인산의 생성수율은 99.9% 이상이었다. 반응 종료후 고정화 균체를 회수하여 10회이상 사용하여도 수율은 99%이상을 유지하였다.

Claims (3)

1. 아미노글리코시드 항생물질 포스포트란스훼라제를 생산하는 미생물인 에세리키어 코리 RA-20 (KFCC 10690)을 배양하여 얻은 균체를 트리톤 X-100으로 처리한 후 칼슘 알지네이트에 고정화하여 아미노글리코시드 항생물질로부터 인산화된 아미노글리코시드 항생물질을 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 트리톤 X-100으로 균체를 처리하면서 트리톤 X-100의 농도를 0.1-2.0% (V/V)로 하고, 30℃-40℃에서 처리시간을 15-120분간으로 하는 것을 특징으로 하는 균체 처리방법.
3. 제1항에 있어서, pH6.5-7.5에서 아미노글리코시드 항생물질 0.5-1.5% (W/V), 아데노신3인산 1.0-3.0% (W/V)인 기질용액을 사용하는 것을 특징으로하는 아미노글리코시드 항생물질의 제조방법.

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