JPWO2022095311A5

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Publication number: JPWO2022095311A5
Application number: JP2022559620A
Authority: JP
Publication date: 2023-04-19
Anticipated expiration: 2041-02-26

Description

一態様において、本出願は、標的抗体を分泌する細胞をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、以下のステップを含む。
ステップ（ａ）：候補細胞を第１蛍光分子で標識するステップ。
ステップ（ｂ）：前記第１蛍光分子で標識された候補細胞と標的抗体に対する標識抗体を捕捉抗原が固定された容器に加え、混合してインキュベートし、細胞液を得るステップであって、前記捕捉抗原は前記標的抗体と特異的に結合することができ、前記標識抗体は第２蛍光分子で標識され、
前記第１蛍光分子は、以下の性質を有する：前記第１蛍光分子が第１励起光で励起されて放出する蛍光と前記第２蛍光分子が前記第１励起光で励起されて放出する蛍光とが異なり、前記第１蛍光分子が第２励起光で励起された後に光活性化または光変換状態となり、光活性化または光変換状態下で、第３励起光で励起された後第１蛍光を放出し、前記第１蛍光分子が第２励起光で励起されることなく直接第３励起光で励起された後第２蛍光を放出し、前記第１蛍光の波長と前記第２蛍光の波長とが異なり、または前記第１蛍光の波長と前記第２蛍光の波長とが同じであるが蛍光強度が異なり、ここで、前記第１励起光の波長と前記第２励起光の波長とが異なり、前記第２励起光の波長と前記第３励起光の波長とが異なり、
前記第２蛍光分子が前記第１励起光で励起されて放出する蛍光の波長と前記第２励起光の波長とが異なる、ステップ。
ステップ（ｃ）：ハイコンテントイメージングシステムを用いて前記細胞液を観察し、前記第１励起光で前記第２蛍光分子を励起して蛍光を放出し、この蛍光に囲まれた候補細胞をスクリーニングして、標的候補細胞とし、次に前記第２励起光で前記標的候補細胞を照射して標識された第１蛍光分子を光活性化または光変換状態とするステップ。
ステップ（ｄ）：フローサイトメーターを用いて前記細胞液中の候補細胞をソーティングし、ソーティング過程中、前記第３励起光でステップ（ｃ）で処理された候補細胞を照射して前記第１蛍光を放出する標的候補細胞を、前記標的抗体を分泌する細胞としてソーティングするステップ。

スクリーニング原理から分かるように、分泌型抗体の細胞スクリーニングにおいて、本出願で提供するスクリーニング方法は、蛍光分子の標識化とハイコンテントイメージングシステムとフローサイトメーターの組み合わせにより、ハイスループットかつ自動で標的候補細胞のソーティングを完了することができ、その後の増幅、その抗体シーケンスの取得、および親和性のある抗体のスクリーニングに十分な数の細胞基盤を提供し、この方法は、スクリーニング効率を大幅に向上させることができる。

前記第１蛍光分子がＰＡ－ＧＦＰタンパク質である場合、ハイコンテントイメージングシステムで前記第２蛍光分子の蛍光に囲まれた候補細胞をソーティングし、強い紫色の光、つまり前記第２励起光（３９０ｎｍ～４１５ｎｍ）で照射し、この変種は１００倍の緑の蛍光を発生させた。フローサイトメーターを通じて、励起光波長範囲が４５０ｎｍ～５５０ｎｍ（最大励起光５０４ｎｍ）の第３励起光で照射し、候補細胞の発光光の波長範囲が４８０ｎｍ～６００ｎｍであり（最大発光光５１７ｎｍ）、このとき、第２励起光で照射されていない非候補細胞は第３励起光で照射されると、弱い緑色の蛍光を放出し、発光光の波長範囲が４８０ｎｍ～６００ｎｍである（最大発光光５１５ｎｍ）。異なる発光光の蛍光強度によって光活性化後のＰＡ－ＧＦＰタンパク質を有する標的抗体を分泌できる候補細胞をソーティングすることができる。

前記第１蛍光分子がＰＳ－ＣＦＰ２タンパク質である場合、ハイコンテントイメージングシステムを用いて、前記第２蛍光分子の蛍光に囲まれた候補細胞をスクリーニングし、強い紫色光である第２励起光（３９０ｎｍ～４１５ｎｍ）で照射し、青緑色蛍光の候補細胞は緑色蛍光への変換を達成する。フローサイトメーターを通じて、第３励起光で励起させ、波長範囲が４２０ｎｍ～５２０ｎｍであり（最大励起光波長４９０ｎｍ）、第２励起光で照射した候補細胞の発光光の波長範囲が４５０ｎｍ～６００ｎｍである（最大発光光波長５１１ｎｍ）。このとき、第２励起光で照射されていない候補細胞が第３励起光で照射される場合、蛍光を放出しない。したがって、標的抗体を分泌する候補細胞をソーティングすることができる。

前記第１蛍光分子がＫａｅｄｅタンパク質である場合、ハイコンテントイメージングシステムを用いて、前記第２蛍光分子の蛍光に囲まれた候補細胞をスクリーニングし、強い紫色光である第２励起光（３５０ｎｍ～４００ｎｍ）で照射し、緑色蛍光を有する候補細胞は赤色蛍光への変換を達成する。フローサイトメーターを通じて、第３励起光で励起させ、波長範囲が５００ｎｍ～６００ｎｍであり（最大励起光波長５７２ｎｍ）、第２励起光で照射した候補細胞の発光光の波長範囲が５５０ｎｍ～６５０ｎｍである（最大発光光５８０ｎｍ）。このとき、第２励起光で照射されていない候補細胞が第３励起光で照射される場合、蛍光を放出しない。したがって、標的抗体を分泌する候補細胞をソーティングすることができる。

前記第１蛍光分子がｋｉｋＧＲタンパク質である場合、ハイコンテントイメージングシステムを用いて、前記第２蛍光分子の蛍光に囲まれた候補細胞をスクリーニングし、強い紫色光である第２励起光（３９０ｎｍ～４１５ｎｍ）で照射し、緑色蛍光を有する候補細胞は赤色蛍光への変換を達成する。フローサイトメーターを通じて、第３励起光で励起させ、波長範囲が５００ｎｍ～６００ｎｍであり（最大励起光波長５８３ｎｍ）、第２励起光で照射した候補細胞の発光光の波長範囲が５５０ｎｍ～６５０ｎｍである（最大発光光波長５９３ｎｍ）。このとき、第２励起光で照射されていない候補細胞が第３励起光で照射される場合、蛍光を放出しない。したがって、標的抗体を分泌する候補細胞をソーティングすることができる。

６．細胞培養ディッシュをハイコンテントイメージングシステムにセットし、検出を行う。
１）ハイコンテントイメージングシステムを用い、５倍顕微鏡下で撮像し、第１励起光（５５０ｎｍ～７００ｎｍ）で励起し、ＡｌａｘＦｌｏｕｒ６４７の発光波長域は６２０ｎｍ～７５０ｎｍであり、特異的抗ＰＤＬ１抗体の分泌を観察することが可能である。Ｂリンパ球の周囲のＰＤＬ１過剰発現ＣＨＯ-Ｋ１細胞は、周囲に赤いハレーションを起こし（図５参照）、その後、Ｂリンパ球の光活性化のために６０倍の高倍率に切り替え、第２励起光の波長（Ｔｈｅｓｅｃｏｎｄｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｌｉｇｈｔ）は３６５ｎｍ（３５０ｎｍ～４００ｎｍも使用可能）、露光時間は５００ｍｓ（５０ｍｓ～５０００ｍｓも使用可能）で光電変換が促され発光はない。

（付記）
（付記１）
ステップ（ａ）：候補細胞を第１蛍光分子で標識するステップと、
ステップ（ｂ）：前記第１蛍光分子で標識された候補細胞と標的抗体に対する標識抗体を捕捉抗原が固定された容器に加え、混合してインキュベートし、細胞液を得るステップであって、前記捕捉抗原は前記標的抗体と特異的に結合することができ、前記標識抗体は第２蛍光分子で標識され、
前記第１蛍光分子は、以下の性質を有する：前記第１蛍光分子が第１励起光で励起されて放出する蛍光と前記第２蛍光分子が前記第１励起光で励起されて放出する蛍光とが異なり、前記第１蛍光分子が第２励起光で励起された後に光活性化または光変換状態となり、光活性化または光変換状態下で、第３励起光で励起された後第１蛍光を放出し、前記第１蛍光分子が第２励起光で励起されることなく直接第３励起光で励起された後第２蛍光を放出し、前記第１蛍光の波長と前記第２蛍光の波長とが異なり、または前記第１蛍光の波長と前記第２蛍光の波長とが同じであるが蛍光強度が異なり、ここで、前記第１励起光の波長と前記第２励起光の波長とが異なり、前記第２励起光の波長と前記第３励起光の波長とが異なり、
前記第２蛍光分子が前記第１励起光で励起されて放出する蛍光の波長と前記第２励起光の波長とが異なる、ステップと、
ステップ（ｃ）：ハイコンテントイメージングシステムを用いて前記細胞液を観察し、前記第１励起光で前記第２蛍光分子を励起して蛍光を放出し、この蛍光に囲まれた候補細胞をスクリーニングして、標的候補細胞とし、次に前記第２励起光で前記標的候補細胞を照射して標識された第１蛍光分子を光活性化または光変換状態とするステップと、
ステップ（ｄ）：フローサイトメーターを用いて前記細胞液中の候補細胞をソーティングし、ソーティング過程中、ステップ（ｃ）で処理された候補細胞を前記第３励起光で照射して、前記第１蛍光を放出する標的候補細胞を、前記標的抗体を分泌する細胞としてソーティングするステップと、
を含むことを特徴とする標的抗体を分泌する細胞をスクリーニングする方法。

Claims

ステップ（ａ）：候補細胞を第１蛍光分子で標識するステップと、
ステップ（ｂ）：前記第１蛍光分子で標識された候補細胞と標的抗体に対する標識抗体を捕捉抗原が固定された容器に加え、混合してインキュベートし、細胞液を得るステップであって、前記捕捉抗原は前記標的抗体と特異的に結合することができ、前記標識抗体は第２蛍光分子で標識され、
前記第１蛍光分子は、以下の性質を有する：前記第１蛍光分子が第１励起光で励起されて放出する蛍光と前記第２蛍光分子が前記第１励起光で励起されて放出する蛍光とが異なり、前記第１蛍光分子が第２励起光で励起された後に光活性化または光変換状態となり、光活性化または光変換状態下で、第３励起光で励起された後第１蛍光を放出し、前記第１蛍光分子が第２励起光で励起されることなく直接第３励起光で励起された後第２蛍光を放出し、前記第１蛍光の波長と前記第２蛍光の波長とが異なり、または前記第１蛍光の波長と前記第２蛍光の波長とが同じであるが蛍光強度が異なり、ここで、前記第１励起光の波長と前記第２励起光の波長とが異なり、前記第２励起光の波長と前記第３励起光の波長とが異なり、
前記第２蛍光分子が前記第１励起光で励起されて放出する蛍光の波長と前記第２励起光の波長とが異なる、ステップと、
ステップ（ｃ）：ハイコンテントイメージングシステムを用いて前記細胞液を観察し、前記第１励起光で前記第２蛍光分子を励起して蛍光を放出し、この蛍光に囲まれた候補細胞をスクリーニングして、標的候補細胞とし、次に前記第２励起光で前記標的候補細胞を照射して標識された第１蛍光分子を光活性化または光変換状態とするステップと、
ステップ（ｄ）：フローサイトメーターを用いて前記細胞液中の候補細胞をソーティングし、ソーティング過程中、ステップ（ｃ）で処理された候補細胞を前記第３励起光で照射して、前記第１蛍光を放出する標的候補細胞を、前記標的抗体を分泌する細胞としてソーティングするステップと、
を含むことを特徴とする標的抗体を分泌する細胞をスクリーニングする方法。