CN101303356B - 一种筛选适用于检测和纯化凝血第八因子的单克隆抗体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筛选适用于检测和纯化凝血第八因子的单克隆抗体的方法。该筛选适用于检测凝血第八因子的单克隆抗体的方法，分别用全长凝血第八因子和B区缺失的凝血第八因子免疫动物，筛选抗凝血第八因子呈阳性的单克隆抗体；从以全长凝血第八因子免疫动物产生的阳性单克隆抗体中筛选出抗B区的抗体，从以B区缺失的凝血第八因子免疫动物产生的阳性单克隆抗体中筛选出抗A1+A2区的抗体；以混合抗体用于ELISA检测，筛选出适合作为ELISA检测的单克隆抗体。以本发明所述的方法可以得到高灵敏度和高特异度的适用于酶联免疫吸附法检测凝血第八因子的单克隆抗体。本发明筛选抗体条件易控制，成本低。

Description

一种筛选适用于检测和纯化凝血第八因子的单克隆抗体的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，本发明是一种筛选适用于检测和纯化凝血第八因子的单克隆抗体的方法。

背景技术

甲型血友病是一种先天性由凝血第八因子缺乏引起的出血性疾病。甲型血友病最有效的治疗方法是输入正常人血浆、血浆来源的浓缩人凝血第八因子制剂或基因重组来源的凝血第八因子制剂。在血浆来源的浓缩人凝血第八因子制剂的生产过程中，凝血第八因子蛋白(即凝血第八因子抗原)是无法被检测的，其原因是没有抗原检测的手段。因此，国内血源凝血第八因子只是以活性标示，没有比活数据，即单位抗原所具有的凝血活性数据。而且，由于不能检测凝血第八因子抗原，在从血浆中分离纯化凝血第八因子的生产过程中只能监测凝血活性而不能监测凝血第八因子抗原的量的变化，以至于生产过程中出现八因子失活情况也无法被发现。目前国外已经有用酶联免疫吸附法检测凝血第八因子的试剂盒，我国还没有此类八因子抗原的检测试剂盒，只能依赖进口。

通过对进口试剂盒的测试发现，虽然进口试剂盒的检测灵敏度非常高，可以达到10ng/ml，但是用试剂盒提供标准品所得到的标准曲线线性区域非常短，以至于影响了样品的检测。另外，在应用过程中还发现对于血浆来源的凝血第八因子检测常常出现偏差较大、重复性差等情况，经分析很可能是由于血浆来源凝血第八因子B区降解产物不均一所引起。图1A显示的是凝血第八因子重链的示意图，最初的重链是由A1+A2+B三部分组成，但随着蛋白分子的成熟，B区逐步被降解，使重链成为一个由A1+A2部分和不同长度的B区所组成的混合物；图1B显示的是凝血第八因子的蛋白印记试验，从图中可以看出凝血第八因子A1+A2呈现一条约90kDa的蛋白条带，而在其上方是一片从100kDa到200kDa大小不等的A1+A2+B条带。用进口试剂检测血液来源的凝血第八因子所发现的偏差较大、重复性差等问题很可能是由于在这些检测试剂盒的抗体中有抗凝血第八因子B区的抗体，由于血液来源的凝血第八因子B区的多样性导致抗体不能与B区充分结合而造成偏差。

凝血第八因子的分离纯化也必须用到抗凝血第八因子的抗体。现在已经有许多国外厂家用抗凝血第八因子的抗体所制成的亲和层析柱来分离纯化血浆来源和基因重组来源的凝血第八因子。我国目前还没有用亲和层析方法生产的高纯度血液来源的凝血第八因子上市，国内基因重组来源的凝血第八因子也是一项空白。这项技术的难点主要在于凝血第八因子的不稳定性使得抗体与凝血第八因子结合后很难通过某种洗脱方式解离并释放出有生物学活性的凝血第八因子。国外厂家筛选到的适用于凝血第八因子的抗体亲和层析柱的抗体应用SPR生物传感器方法将纯化的凝血第八因子固定于生物芯片上，再加入被检测的单克隆抗体与凝血第八因子抗原结合，然后用不同的条件洗脱并记录抗体解离的情况。由于生物芯片价格昂贵，使用这种方法筛选抗体成本比较高，而且由于血液来源的凝血第八因子纯度差，不适于用作结合在生物芯片的抗原，无法用SPR生物传感器方法筛选抗体。

另外，由于凝血第八因子分子稳定性差，非常容易在强酸强碱等不适宜的液体环境下降解而失活。这也是急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种筛选适用于检测凝血第八因子的单克隆抗体的方法。本发明的另一目的在于提供一种筛选适用于分离纯化凝血第八因子的单克隆抗体的方法。

本发明采用以下技术步骤组成的技术方案：一种筛选适用于检测凝血第八因子的单克隆抗体的方法，包含以下步骤：

a.分别用全长凝血第八因子和B区缺失的凝血第八因子免疫动物，用酶联免疫吸附法筛选抗凝血第八因子呈阳性的单克隆抗体；

b.用蛋白印记方法从以全长凝血第八因子免疫动物产生的阳性单克隆抗体中筛选出抗B区的抗体，从以B区缺失的凝血第八因子免疫动物产生的阳性单克隆抗体中筛选出抗A1+A2区的抗体；

c.分别选择抗A1+A2区的单克隆抗体，以及抗A1+A2区的单克隆抗体和抗B区的单克隆抗体的混合抗体用于ELISA检测，对实验中所得到的结果进行比较，筛选出适合作为ELISA检测的抗A1+A2区单克隆抗体。

所述的全长凝血第八因子和B区缺失的凝血第八因子均为基因重组凝血第八因子。

一种检测凝血第八因子的试剂盒，采用上述的方法筛选的抗凝血第八因子的单克隆抗体作为一抗包板。

一种筛选适用于凝血第八因子分离纯化的单克隆抗体的方法，包括如下步骤：

A.用B区缺失的凝血第八因子免疫动物，筛选抗A1+A2区的单克隆抗体；

B.用免疫沉淀方法和凝血第八因子凝血活性检测，以凝血第八因子作为抗原，对步骤A中筛选出的抗A1+A2区的单克隆抗体进行检测，筛选出能在低浓度盐和低浓度乙二醇环境下与凝血第八因子结合的单克隆抗体；

C.对步骤B筛选出的单克隆抗体进行进一步筛选，在免疫沉淀实验过程中提高反应的盐浓度，筛选出在盐浓度提高时与凝血第八因子结合力增强的单克隆抗体；

D.对步骤C筛选出的单克隆抗体进行进一步筛选，在免疫沉淀实验过程中在提高反应的盐浓度的同时提高乙二醇的浓度，并与未提高乙二醇的浓度时的数据相比较，筛选出在提高乙二醇的浓度时结合力降低的单克隆抗体。

其中，步骤A中，所述B区缺失的凝血第八因子为基因重组凝血第八因子。在步骤B中，所述的凝血第八因子是血浆来源凝血第八因子或基因重组凝血第八因子。

步骤B中，所述的低浓度盐为0.5M氯化钠，低浓度乙二醇的浓度为5wt％。步骤C中，所述的盐浓度是1.5M氯化钠。步骤D中，所述的乙二醇的浓度是40wt％。

本发明还请求保护采用上述方法(筛选适用于凝血第八因子分离纯化的单克隆抗体的方法)筛选的抗凝血第八因子A1+A2区的单克隆抗体制备的用于纯化凝血第八因子的抗体亲和层析柱。

本发明实现的技术方案的流程图见图2。图2显示用不同条件的免疫印迹、免疫沉淀、凝血第八因子凝血活性测定等方法，筛选出适合用于凝血第八因子抗原检测和分离纯化的抗体的流程。结合图2筛选出适合用于凝血第八因子抗原检测的单克隆抗体的方案如下：

首先，用全长凝血第八因子和B区缺失的凝血第八因子免疫成年小鼠，检测到小鼠血清中有抗凝血第八因子的抗体活性后进行小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，产生抗凝血第八因子的杂交瘤细胞株；

第2步对分泌不同的抗凝血第八因子抗体的杂交瘤细胞株进行筛选，分别挑选出分泌抗A1+A2区的单克隆抗体和抗B区的单克隆抗体的细胞株；

第3步进一步筛选适用于用双抗体夹心法的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测凝血第八因子抗原的抗体，做成凝血第八因子抗原检测试剂盒。筛选方法为用抗凝血第八因子A1+A2区的抗体作为一抗包酶标板，或者用抗凝血第八因子A1+A2区和抗B区的单克隆抗体的混合抗体作为一抗包酶标板，分别对不同浓度的凝血第八因子标准品进行测定，绘制浓度曲线，计算回归方程式和线性回归系数，挑选出线性回归最好的抗体用于ELISA检测试剂盒的一抗包被酶标板。

结合图2本发明筛选出适合用于凝血第八因子抗原分离纯化的单克隆抗体的方案是将前述筛选的抗凝血第八因子A1+A2抗体进一步筛选，找出与凝血第八因子抗原以疏水键相互作用的单克隆抗体。具体采用免疫沉淀结合凝血第八因子凝血活性检测的方法，通过升高免疫沉淀反应中盐浓度和乙二醇浓度的方法考察不同抗凝血第八因子A1+A2区单克隆抗体与凝血第八因子抗原的结合性质，筛选出与凝血第八因子抗原以疏水键相互作用的单克隆抗体细胞株，将挑选出的单克隆抗体进行大规模制备，制作成免疫亲和层析柱，用于凝血第八因子的分离纯化。

本发明的优点在于：

本发明提供的筛选适用于酶联免疫吸附法检测凝血第八因子的单克隆抗体的方法，可以得到高灵敏度和高特异度的适用于酶联免疫吸附法检测凝血第八因子的单克隆抗体。将本发明的检测结果绘制成的对数曲线，其线性范围为0.078-0.313国际单位/毫升，相当于抗原浓度15.6-62.6纳克/毫升。

本发明提供的筛选适合用于凝血第八因子分离纯化的单克隆抗体的方法，可以得到适合用于凝血第八因子分离纯化的单克隆抗体。该方法筛选得到的单克隆抗体与凝血第八因子结合后，可通过洗脱方式解离并释放出有生物学活性的凝血第八因子。该方法筛选抗体条件易控制，成本低。

附图说明

图1是凝血第八因子重链的示意图及多克隆抗体检测凝血第八因子的蛋白印记图。(A)是凝血第八因子重链的示意图；(B)是凝血第八因子的蛋白印记图。

图2是本发明实现的技术方案的流程图。

图3是不同凝血第八因子为抗原免疫小鼠的血清酶联免疫吸附试验结果图。(A)是以全长凝血第八因子为抗原免疫6周后小鼠血清酶联免疫吸附试验结果图；(B)是以B区缺失凝血第八因子为抗原免疫6周后小鼠血清酶联免疫吸附试验结果图。

图4是酶联免疫吸附试验显色后的酶标板的图像。

图5是以全长凝血第八因子作抗原的杂交瘤细胞中筛选出抗B区的单克隆抗体的蛋白印记图。

图6是以B区缺失凝血第八因子作抗原的杂交瘤细胞中筛选出抗A1+A2区的单克隆抗体的蛋白印记图。

图7是不同抗体作为包板的一抗的ELISA标准曲线图。(A)是抗A1+A2区的单克隆抗体作为包板的一抗的ELISA标准曲线图；(B)是抗A1+A2区的单克隆抗体和抗B区的单克隆抗体的混合抗体作为包板的一抗的ELISA标准曲线图。

图8是免疫沉淀时不同盐浓度和不同乙二醇浓度对凝血第八因子清除率的影响。(A)是免疫沉淀时不同盐浓度对凝血第八因子清除率的影响；图中，星号表示在低盐浓度免疫沉淀时凝血八因子活性清除率大于70％，且提高盐浓度时凝血八因子活性清除率进一步提高的单克隆抗体细胞株。

(B)是免疫沉淀时不同乙二醇浓度对凝血第八因子清除率的影响。

具体实施方式

实施例1免疫小鼠并用酶联免疫吸附法筛选抗凝血第八因子呈阳性的单克隆抗体

分别用基因重组全长凝血第八因子和基因重组B区缺失的凝血第八因子免疫小鼠6周后取血清进行酶联免疫吸附试验，目的是检测小鼠体内是否产生了抗凝血第八因子的抗体。

(1)杂交瘤细胞株培养

用于免疫小鼠的抗原为(1)基因重组全长凝血第八因子，商品名为拜科奇，由美国拜尔公司生产，可以通过科研途径购买，其规格为每瓶250国际单位(IU)，约折合50微克/瓶；(2)基因重组B区缺失的凝血第八因子，商品名为Refacto，由美国惠氏公司生产，可以通过科研途径购买，其规格也为每瓶250国际单位(IU)，约折合15微克/瓶；两种蛋白冻干粉分别溶解于PBS缓冲液中。5-10微克全长凝血第八因子或2-3微克B区缺失凝血第八因子与0.4毫升弗氏完全佐剂(Freunds Adjuvant Complete，美国SIGMA公司产品)充分混合后静脉注射免疫小鼠。首次免疫之后每三周用同样的凝血第八因子制剂进行两次次加强免疫。在进行脾细胞融合的前三天，小鼠最后一次用生理盐水溶解的凝血第八因子进行冲击免疫。进行脾细胞融合时，取出小鼠脾脏后用生理盐水清洗，将脾细胞悬浮于RPMI-1640细胞培养基并在冰水浴中浸泡5分钟后用冷的RPMI-1640细胞培养基清洗2次备用。P3A8653型骨髓瘤细胞用10℃的RPMI-1640细胞培养基清洗两次，然后悬浮于10毫升室温的RPMI-1640细胞培养基中。细胞融合反应以脾细胞比骨髓瘤细胞比例4∶1进行混合，1毫升50％重量比的PEG1500缓缓加入细胞中，混匀后置于37℃水浴1.5分钟，然后在3分钟内逐滴加入5毫升RPMI-1640细胞培养基，在之后的1分钟内再加入14毫升RPMI-1640细胞培养基，最后加入30毫升含有20％胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基。细胞离心后去上清，细胞继续在有HAT培养基和20％胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基中继续培养30天，然后转换到20％胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基。

脾细胞融合后，分别从以两种抗原分别免疫的所得到的杂交瘤细胞挑选出1000株细胞进行培养，待细胞在96孔板中生长达到50％密度时开始收集细胞上清液，并用于酶联免疫吸附试验。

(2)用检测未知抗体的间接酶联免疫吸附法进行杂交瘤细胞的筛选

酶标板包板的方法为用0.05M pH9.0碳酸盐包被缓冲液将凝血第八因子抗原稀释至蛋白质含量为0.2～1.0微克/毫升，在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1毫升放置于4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(0.15M PBS缓冲液，pH7.4)洗3次，每次3分钟。将杂交瘤细胞培养液0.1毫升加入酶标板的反应孔中，置37℃孵育1小时。没有加入抗体的反应孔作为阴性对照孔，加入浓度为1-10微克/毫升阳性抗体的反应孔作为阳性对照孔。然后用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3分钟。加酶标抗体时于各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml，经37℃孵育0.5～1小时后用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3分钟。加底物液显色，于各反应孔中加入新鲜配制的TMB底物溶液0.1ml孵育37℃10～30分钟后用2M硫酸0.05ml加入反应孔内终止反应。可以直接用肉眼判定结果，将酶标板置于白色背景上，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。为得到更精确的结果可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

图3是以全长凝血第八因子为抗原(A)和以B区缺失凝血第八因子为抗原(B)免疫6周后小鼠血清酶联免疫吸附试验结果图。分别以以全长凝血第八因子为抗原(A)和以B区缺失凝血第八因子为抗原(B)包板后用小鼠血清进行对比稀释后加入酶标板中，反应后显色并在450nm波长下检测。可以看出两种抗原免疫小鼠6周后，血清中可以检测到与各自抗原相结合的抗体，表明对小鼠免疫成功，可以进行脾细胞融合。

图4中显示显色后的酶标板的图像，当细胞培养液中含有抗凝血第八因子的抗体时，抗体会与固定在酶标板上的凝血第八因子抗原发生特异性结合，从而出现显色反应。图中颜色较深的孔中说明有抗凝血第八因子抗体存在。酶标板经过酶标仪对其颜色深度进行量化，给出酶联免疫吸附数据。用酶联免疫吸附的方法分别筛选出约50株阳性杂交瘤细胞进行进一步克隆培养。在一周内重复进行筛选，阳性杂交瘤细胞数减小到20多株。

表一是以全长凝血第八因子为抗原(A)和以B区缺失凝血第八因子为抗原(B)免疫6周后小鼠血清酶联免疫吸附试验结果数据。

表一以全长凝血第八因子为抗原(A)和以B区缺失凝血第八因子为抗原(B)免疫6周后小鼠血清酶联免疫吸附试验结果数据

表一(A)	1/1000	1/2000	1/4000	1/8000	1/16000
						1起始	0.063	0.066	0.064	0.067	0.062
1六周	2.14	1.984	1.774	1.54	1.191
						2起始	0.06	0.066	0.063	0.064	0.071
2六周	2.389	2.208	2.033	1.841	1.55
						3起始	0.065	0.075	0.067	0.068	0.069
3六周	2.402	2.158	1.968	1.715	1.362
						4起始	0.08	0.079	0.081	0.081	0.082
4六周	2.351	2.109	1.861	1.548	1.175
						5起始	0.072	0.066	0.074	0.072	0.071
5六周	2.681	2.819	2.46	2.377	2.156

续表一(A)

1/32000	1/64000	1/128000	1/256000	1/512000	1/1024000
						0.057	0.064	0.061	0.061	0.064	0.067
0.871	0.588	0.402	0.24	0.158	0.115
						0.065	0.064	0.072	0.063	0.078	0.062
1.261	0.874	0.584	0.356	0.219	0.146
						0.064	0.065	0.077	0.063	0.064	0.072
1.005	0.668	0.441	0.264	0.171	0.115
						0.081	0.082	0.079	0.082	0.082	0.082
0.816	0.487	0.329	0.193	0.132	0.101
						0.069	0.071	0.068	0.07	0.067	0.067
1.674	1.11	0.637	0.413	0.23	0.141

表一(B)	1/1000	1/2000	1/4000	1/8000	1/16000
						6before	0.074	0.077	0.081	0.074	0.078
6六周	2.952	2.503	2.171	1.758	1.26
						7before	0.077	0.08	0.08	0.086	0.085
7六周	2.427	2.072	1.602	1.132	0.716
						8before	0.084	0.086	0.072	0.082	0.074
8六周	2.297	1.788	1.262	0.841	0.484
						9before	0.11	0.102	0.1	0.105	0.101
9六周	2.616	2.336	2.02	1.548	1.076
						10before	0.087	0.083	0.082	0.095	0.105
10六周	2.601	2.481	1.907	1.437	0.951

续表一(B)

1/32000	1/64000	1/128000	1/256000	1/512000	1/1024000
						0.071	0.074	0.069	0.069	0.069	0.068
0.833	0.527	0.305	0.197	0.133	0.105
						0.077	0.074	0.072	0.074	0.073	0.077
0.431	0.249	0.163	0.114	0.1	0.079
						0.075	0.075	0.076	0.077	0.076	0.075
0.303	0.183	0.13	0.102	0.084	0.083
						0.094	0.091	0.088	0.092	0.088	0.095
0.714	0.405	0.241	0.161	0.119	0.093
						0.084	0.082	0.076	0.076	0.075	0.075
0.537	0.354	0.217	0.156	0.108	0.097

实施例2用蛋白印记方法筛选出抗凝血第八因子B区的抗体和A1+A2区的抗体

(1)杂交瘤细胞培养液中分离纯化单克隆抗体

每一株抗凝血第八因子单克隆抗体杂交瘤细胞以1-2x105密度接种到5个T-75细胞培养方瓶中，每个方瓶中加入20毫升10％胎牛血清的DMEM细胞培养基，细胞在37℃，5％二氧化碳浓度的细胞培养箱中生长到80％，收集全部细胞培养液，加入同样体积的新鲜细胞培养液继续培养到细胞生长到100％，再次收集全部细胞培养液，与第一次收集的细胞培养液混合备用。

金黄色葡萄球菌的胞壁蛋白A，能够特异性结合哺乳动物IgG分子的Fc片段，包括鼠源性抗体。将其固定于亲水性琼脂糖介质，可有效的分离纯化出高纯度的IgG组分。收集培养好的杂交瘤细胞培养液，4℃低温每分钟3000转的转速离心去除细胞碎片和悬浮细胞，再以0.45微米滤膜过滤，得到澄清的细胞培养液用于抗体的分离纯化。小规模制备抗体，采用GE Heathcare公司的1毫升HiTrap protein A预装柱，一次可制备5mg以上的抗体蛋白。柱平衡与洗涤为0.02M磷酸氢二钠，氯化钠0.15M，pH7.2缓冲液，洗脱液为pH3.2，0.1M的柠檬酸钠缓冲液。纯化仪器为GE Heathcare公司的AKTA prime plus。1毫升的蛋白A柱经过10倍柱体积的平衡缓冲液平衡后上样。100～200ml的细胞培养液以每分钟3毫升流速上样，上样结束后再用洗涤缓冲液冲洗，去除残留的细胞培养液以及非特异结合的蛋白杂质，约10倍柱体积至紫外观测值稳定后，用低PH值的洗脱液以每分钟2毫升流速洗脱蛋白A柱。紫外值上升时开始收集洗脱液峰值，至紫外趋缓，共约5～6毫升的抗体洗脱液，浓度约1000微克/毫升以上。用1MTris-HCl(pH3.2)调整收集液的pH至中性。然后4℃低温环境在10倍体积的抗原抗体交联缓冲液(0.1M碳酸氢钠，0.5M氯化钠，pH8.5)中透析4小时，再在相同的环境下透析过夜。在280nm紫外下测量蛋白含量，调节成1.1毫克/毫升，SDS-PAGE检查纯度，分装后在-20℃冰冻保存。

(2)用蛋白印记方法(Western Blot)对每一株抗凝血第八因子单克隆抗体进行验证

分别选取分别以血浆来源凝血第八因子，基因重组全长和B区缺失的凝血第八因子作为蛋白印记的抗原进行电泳上样，电泳电压100V，为了便于观察电泳效果和转膜效果在电泳中添加了预染的分子量标记。电泳结束后选用PVDF膜转膜，PVDF膜在转膜之前，用甲醇浸泡10-15秒，浸泡后用清水漂洗，最后置于转膜缓冲液中，利用BIORAD的湿法转膜设备进行转膜，转膜缓冲液为Tris-base 0.025M，甘氨酸0.19M，20％甲醇。转膜电压100V，转膜时间2个小时。转膜完成后，PVDF膜利用PBST(磷酸二氢钾2mM，磷酸氢二钠10mM，氯化钠137mM，氯化钾2.7mM，吐温20 0.05％)清洗，将膜上的转移液洗掉后，放到封闭液中缓慢孵育，孵育2小时后4℃冰箱静止过夜，其中封闭液配方为PBST中添加2％的脱脂奶粉。封闭完成后，先用PBST清洗膜3次，每次5分钟，清洗干净后，添加1∶1000稀释的小鼠抗凝血第八因子抗体，稀释液为封闭液。添加抗体后，常温下孵育1小时进行一抗结合。一小时后，利用PBST清洗膜3次，每次5分钟，清洗干净后，添加1∶5000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，继续常温下孵育。待孵育一小时后，用PBST清洗膜，洗膜3次，每次5分钟，清洗后进入暗室，膜上添加带有荧光标记的底物(ECL底物)，X胶片曝光后显影定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描，利用胶片上条带曝光的条带位置及强弱。

分别用全长和B区缺失凝血第八因子作抗原进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将在凝胶上分离的蛋白转移到醋酸纤维膜上封闭后用不同的抗凝血第八因子单克隆抗体进行蛋白印记检测。通过这种方法，从以全长凝血第八因子作抗原的杂交瘤细胞中筛选出9株抗凝血第八因子B区的抗体，从以B区缺失凝血第八因子作抗原的杂交瘤细胞中筛选出14株抗凝血第八因子A1+A2区的抗体。

图5显示的是用蛋白印记方法从以全长凝血第八因子作抗原的杂交瘤细胞中筛选出抗B区的单克隆抗体。(A)中显示用代号为KF81-H的抗全长凝血第八因子的单克隆抗体进行免疫印迹试验的结果。泳道1为全长凝血第八因子，泳道2为B区缺失凝血第八因子。可以看出KF81-H不能结合B区缺失凝血第八因子，但与全长凝血第八因子显示出数条分子量高于160kDa的条带。(B)是判断KF81-H单克隆抗体与全长凝血第八因子重链结合位点的示意图。可以推测，KF81-H单克隆抗体的结合位点在距凝血第八因子重链氨基端160kDa处与羧基端之间。当B区从羧基端被降解后KF81-H单克隆抗体失去其结合位点，因此无法显示160kDa分子量以下的条带。

图6显示的是用蛋白印记方法从以B区缺失凝血第八因子作抗原的杂交瘤细胞中筛选出抗A1+A2区的单克隆抗体。(A)中显示用代号为RF81-D3的抗凝血第八因子单克隆抗体进行免疫印迹试验的结果。泳道1为全长凝血第八因子，泳道2为B区缺失凝血第八因子。可以看出RF81-D3能结合B区缺失凝血第八因子。由于B区缺失凝血第八因子只有重链A1+A2区，其分子量约90kDa。可以观察到RF81-D3与B区缺失凝血第八因子结合，显示出在90-95kDa分子量的条带。高于130kDa的条带很可能是重链与轻链复合体的条带。而在90-95kDa分子量的条带上方没有任何条带。RF81-D3与全长凝血第八因子显示出数条分子量高于95kDa的条带。说明RF81-D3可以检测出A1+A2与不同长度的B区的中间体。(B)是判断RF81-D3单克隆抗体与全长凝血第八因子重链结合位点的示意图。可以推测，RF81-D3与全长凝血第八因子重链结合位点在A1+A2区域。

实施例3用实施例2中不同抗体作为一抗用于凝血第八因子的ELISA检测

分别选择(A)抗A1+A2区的单克隆抗体，和(B)抗A1+A2区的单克隆抗体和抗B区的单克隆抗体的混合抗体作为包板的一抗用于ELISA检测。

用辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗时将8毫克辣根过氧化物酶放入1毫升玻璃瓶，加入1毫升水溶解，室温逐渐滴入0.2毫升碘酸钠并搅拌均匀，然后在4℃醋酸钠溶液中透析过夜。抗体在4℃1mM醋酸钠溶液中透析过夜，加入0.2M碳酸钠溶液将pH调整至9.0，混匀后以1∶1比例立即加入透析好的抗体，用0.2M碳酸钠溶液将pH调整至9.0，室温搅拌3小时，再加入新配制的硼氢化钠溶液100微升，4℃放置2小时后保存。

ELISA检测采用用于检测未知抗原的双抗体夹心法。一抗包被使用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10微克/毫升。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1毫升，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔。加酶标抗体于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1毫升。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1毫升，37℃10～30分钟。终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05毫升。在ELISA检测仪上以450nm读取吸光度值，以养性对照的吸光度数值绘制标准曲线，再根据试验样品的吸光度值测算样品浓度。以两种不同一抗所得到的数据绘制标准曲线并计算线性区间和线性回归系数。

表2为不同抗体作为一抗用于凝血第八因子的ELISA检测结果。表二中分别选择(A)抗A1+A2区的单克隆抗体，以及(B)抗A1+A2区的单克隆抗体和抗B区的单克隆抗体的混合抗体作为包板的一抗的ELISA检测结果。

表二不同抗体作为一抗用于凝血第八因子的ELISA检测结果

理论活性	抗原浓度	OD450/630	OD450/630
				(IU/ml)	(ng/ml)	抗A1+A2抗体(A)	抗A1+A2和抗B混合抗体(B)
1052.51.250.6250.3130.1560.078	2000100050025012562.631.215.6	2.16952.122.02651.5180.81750.40650.2330.1375	2.222.18452.0431.691.24650.8270.3830.148

图7为分别选择(A)抗A1+A2区的单克隆抗体，以及(B)抗A1+A2区的单克隆抗体和抗B区的单克隆抗体的混合抗体作为包板的一抗的ELISA标准曲线图。(A)为用抗A1+A2单克隆抗体包板，对10国际单位/毫升凝血第八因子原液进行对比稀释后进行检测的结果绘制成的对数曲线，其线性范围为0.078-2.5国际单位/毫升，相当于抗原浓度15.6-500纳克/毫升。(B)为用抗A1+A2和抗B的混合抗体包板，对10国际单位/毫升凝血第八因子原液进行对比稀释后进行检测的结果绘制成的对数曲线，其线性范围为0.078-0.313国际单位/毫升，相当于抗原浓度15.6-62.6纳克/毫升。

从标准曲线的线性范围可以看出，选用抗A1+A2区的单克隆抗体作为一抗，其线性区域远远大于选用抗A1+A2区的单克隆抗体和抗B区的单克隆抗体的混合抗体作为包板的一抗的ELISA标准曲线。因此，应该选用抗A1+A2区的单克隆抗体作为一抗包板做成Elisa酶标板用于凝血第八因子抗原的检测试剂盒。

实施例4筛选适合用于凝血第八因子抗原检测和分离纯化的抗体

用免疫沉淀(Immuno-precipitation，IP)和凝血第八因子凝血活性检测联合方法，分别以血浆来源凝血第八因子和基因重组凝血第八因子作为抗原，对步骤C中筛选出的A1+A2区的单克隆抗体进行检测。

免疫沉淀方法是利用抗原抗体之间的相互作用而结合，形成抗原抗体复合物，然后用抗体重链与固定在凝胶介质上的蛋白A或蛋白G的结合，使抗原抗体复合物被蛋白A凝胶介质沉淀并与液体分离的一种方法。根据这个实验原理，可以通过检测免疫沉淀反应之后反应体系上清中的凝血第八因子的凝血活性的方法，判断抗原抗体反应中抗体与抗原结合的能力。

凝血第八因子凝血活性检测操作完全参照Diagnostica Stago仪器操作说明手册。其测定的基本原理是在脑磷脂、激活剂，以及除因子VIII外其他所有的因子都稳定且过剩的存在下，通过测定凝固时间来进行分析。部分凝血活酶(APTT)先预热至37℃后保温，然后与凝血因子八缺乏血浆混合备用。测试开始时向反应中加入20-100微升测试样品，37℃保温2分钟，再加入37℃预热的浓度0.001-0.004M氯化钙溶液，记录凝固时间。使用定标血浆，质控血浆来做标准和参照，计算出样品中八因子的含量。

将基因重组凝血第八因子冻干制剂溶解于(1)低盐浓度的免疫沉淀缓冲液中(Tris 0.02M，氯化钙0.0006M，氯化钠0.5M，乙二醇5％，pH 6.2)；(2)高盐浓度的免疫沉淀缓冲液中(Tris 0.02M，氯化钙0.0006M，氯化钠1.5M，乙二醇5％，pH 6.2)分别至终浓度20国际单位/毫升。向2毫升离心管中加入0.5毫升凝血第八因子溶液，然后加入5-20微克纯化的实施例2筛选的抗凝血第八因子A1+A2区的抗体。抗原抗体在4℃温度环境下混合2-20小时后，在免疫沉淀反应中加入20微升蛋白A+G凝胶介质，然后继续在4℃温度环境下混合1-4小时后取出，室温静置10-20分钟，待凝胶介质沉降到试管底部后取上清，立即进行凝血第八因子凝血活性(FVIII:C)的检测。与无抗体添加的免疫沉淀反应上清相比第八因子的凝血活性降低可得出清除率，即(无抗体上清FVIII:C-有抗体上清FVIII:C)/无抗体上清FVIII:C的比值。两种不同免疫沉淀条件下抗体对凝血第八因子的清除率见表三。结果通过上述方法从实施例2筛选的14株抗凝血第八因子A1+A2区的抗体中筛选出8株在盐浓度提高时与凝血第八因子结合力增强的单克隆抗体。

将选出的8株株抗凝血第八因子A1+A2区的抗体进行进一步筛选，把免疫沉淀高盐缓冲液中的乙二醇浓度从5％提高到40％，并用同样的方法进行检测上清中的凝血第八因子凝血活性和清除率。将基因重组凝血第八因子冻干制剂溶解于(1)高盐浓度的免疫沉淀缓冲液中(Tris 0.02M，氯化钙0.0006M，氯化钠1.5M，乙二醇5％，pH 6.2)，(2)高盐和乙二醇浓度的免疫沉淀缓冲液中(Tris 0.02M，氯化钙0.0006M，氯化钠1.5M，乙二醇40％，pH 6.2)分别至终浓度20国际单位/毫升。向2毫升离心管中加入0.5毫升凝血第八因子溶液，然后加入5-20微克纯化的上述8株待筛选的抗凝血第八因子A1+A2区的抗体。抗原抗体在4℃温度环境下混合2小时后，在免疫沉淀反应中加入20微升蛋白A+G凝胶介质，然后继续在4℃温度环境下混合1小时后取出，室温静置10-20分钟，待凝胶介质沉降到试管底部后取上清，立即进行凝血第八因子凝血活性的检测。

结果：(1)在低盐和高盐两种不同缓冲液条件下进行免疫沉淀。将基因重组的凝血第八因子作为抗原分别与不同的单克隆抗体反应后用蛋白A沉淀后，检测上清中的凝血第八因子的凝血活性(FVIII:C)。图8A可以看出14株抗体中8株抗体在低盐时免疫沉淀对凝血第八因子清除率高于70％，说明这些抗体结合凝血第八因子的能力比较强。可以看到在盐浓度升高时，这些抗体对凝血第八因子清除率进一步提高，达到90％以上，提示这些抗体很可能是以疏水键与凝血第八因子抗原结合的抗体。

(2)乙二醇浓度提高后检测上清中的凝血第八因子凝血活性和清除率。图8B可以看出这8株抗体在有高浓度乙二醇的条件下，与凝血第八因子结合的能力都不同程度地有所下降。由于乙二醇可以减低抗原抗体之间疏水性结合的能力，这一发现进一步提高了这8株抗体是以疏水键与凝血第八因子抗原结合的可能性，根据这些数据挑选出1-2株体制作成免疫亲和层析柱用于凝血第八因子的分离纯化。

表三免疫沉淀时不同盐浓度对凝血八因子活性清除率的影响

实施例5亲和层析方法分离纯化血浆来源和基因重组凝血第八因子将实施例4筛选的单克隆抗体纯化后与溴化氢(CNBr)活化的琼脂糖凝胶Sepharose-4B介质偶联制成免疫亲和层析柱。步骤如下：将用等体积的2-4℃去离子水浸泡Sepharose-4B介质，然后加入两倍体积的2.0M碳酸氢钠溶液，加入CNBr至终浓度60克/升混匀并孵育10-30分钟。用2倍体积的抗原抗体交联缓冲液(碳酸氢钠0.1M，氯化钠0.5M，pH8.5)清洗5次后将Sepharose-4B介质转移至烧杯中，立即加入透析处理过的单克隆抗体。加入的抗体量为每毫升Sepharose-4B介质1-10毫克抗体。交联反应4℃过夜，第二天用2体积的抗原抗体交联缓冲液(碳酸氢钠0.1M，氯化钠0.5M，pH8.5)清洗5次后用2倍体积pH8.0的0.2M甘氨酸溶液封闭室温30分钟。然后用2体积pH3.5的醋酸钠0.1M，氯化钠0.5M清洗5次，再用2体积pH3.5的醋酸钠10mM溶液清洗5次后置于2-8℃保存。

将上述凝血第八因子单克隆抗体偶联的Sepharose-4B介质装在5毫升的层析柱体中，在室温环境下用20毫升蒸馏水清洗后用20毫升平衡液(氯化钠0.5M，氯化钙0.05M，1.0％曲纳通TritonX-100，pH7.4)平衡层析柱，将5毫升重组第八因子细胞培养液上柱，收集全部18毫升流穿液后用20毫升清洗缓冲液(咪唑0.05M，氯化钙0.04M，乙二醇5％，1.0％曲纳通TritonX-100，pH6.4)清洗层析柱，然后用10-20毫升洗脱液(咪唑0.05M，氯化钙0.04M，乙二醇40％，1.0％曲纳通TritonX-100，pH6.4)将结合在层析柱上的凝血第八因子洗脱下来，用酶联免疫吸附法和活性法检测凝血第八因子，结果见表四。

从Elisa试验数据可以看出阳性对照样品在稀释64倍后吸光度为0.493，相当于乙二醇试验中流穿液稀释2倍时的吸光度和洗脱液稀释16倍时的吸光度(分别以下划线在表四中标出)。

如果以阳性对照样品1中的0.493为基准估算，

穿透量：18ml/(5ml×2⁵)＝11.25％

洗脱量：13ml/(5ml×2²)＝65％

因此，粗略估算在没有进行上样和洗脱条件优化的情况下，抗体亲和层析柱对凝血第八因子结合率大于80％，回收率大于60％。

表四  亲和层析方法分离纯化血浆来源和基因重组凝血第八因子

试验Elisa结果

以上对本发明所提供的筛选适用于检测和纯化凝血第八因子的单克隆抗体的方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (7)

1.一种筛选适用于检测凝血第八因子的单克隆抗体的方法，其特征在于，包含以下步骤：

a.分别用全长凝血第八因子和B区缺失的凝血第八因子免疫动物，用酶联免疫吸附法筛选抗凝血第八因子呈阳性的单克隆抗体；

b.用蛋白印记方法从以全长凝血第八因子免疫动物产生的阳性单克隆抗体中筛选出抗B区的抗体，从以B区缺失的凝血第八因子免疫动物产生的阳性单克隆抗体中筛选出抗A1+A2区的抗体；

c.分别选择抗A1+A2区的单克隆抗体，以及抗A1+A2区的单克隆抗体和抗B区的单克隆抗体的混合抗体作为一抗包酶标板用于ELISA检测，分别对不同浓度的凝血第八因子标准品进行测定，绘制浓度曲线，计算回归方程式和线性回归系数，挑选出线性回归最好的抗体，即为适用于检测凝血第八因子的单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的筛选适用于检测凝血第八因子的单克隆抗体的方法，其特征在于：所述的全长凝血第八因子和B区缺失的凝血第八因子均为基因重组凝血第八因子。

3.一种检测凝血第八因子的试剂盒，其特征在于：采用权利要求1或2筛选的适用于检测凝血第八因子的单克隆抗体作为一抗包板。

4.一种筛选适用于凝血第八因子分离纯化的单克隆抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A.用B区缺失的凝血第八因子免疫动物，筛选抗A1+A2区的单克隆抗体；

B.用免疫沉淀方法和凝血第八因子凝血活性检测，以凝血第八因子作为抗原，对步骤A中筛选出的抗A1+A2区的单克隆抗体进行检测，筛选出能在低浓度盐和低浓度乙二醇环境下与凝血第八因子结合的单克隆抗体，所述的低浓度盐为0.5M氯化钠，低浓度乙二醇的浓度为5wt％；

C.对步骤B筛选出的单克隆抗体进行进一步筛选，在免疫沉淀实验过程中提高反应的盐浓度，所述的盐浓度是1.5M氯化钠，筛选出在盐浓度提高时与凝血第八因子结合力增强的单克隆抗体；

D.对步骤C筛选出的单克隆抗体进行进一步筛选，在免疫沉淀实验过程中在提高反应的盐浓度的同时提高乙二醇的浓度，所述的乙二醇的浓度是40wt％，并与未提高乙二醇的浓度时的数据相比较，筛选出在提高乙二醇的浓度时结合力降低的单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤A中，所述B区缺失的凝血第八因子为基因重组凝血第八因子。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤B中，所述的凝血第八因子是血浆来源凝血第八因子或基因重组凝血第八因子。

7.采用权利要求4筛选的适用于凝血第八因子分离纯化的单克隆抗体制备的用于纯化凝血第八因子的抗体亲和层析柱。

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