JPWO2020168135A5 - - Google Patents
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Description
本開示は以下の実施形態を含む。
実施形態１
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連する一塩基多型（SNP）を含むアルファ-1アンチトリプシンポリヌクレオチドを編集する方法であって、該ポリヌクレオチドを、1つ以上のガイドRNA、ならびにポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインおよび
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のアミノ酸82位または166位に改変を含むアデノシンデアミナーゼバリアントを含む少なくとも1つの塩基エディタードメインを含む塩基エディターと接触させる工程を含み、前記ガイドRNAが、前記塩基エディターをターゲティングしてアルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPの改変をもたらす、前記方法。
実施形態２
アデノシンデアミナーゼバリアントがアミノ酸82位および166位に改変を含む、実施形態1の方法。
実施形態３
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S改変を含む、実施形態1の方法。
実施形態４
アデノシンデアミナーゼバリアントがT166R改変を含む、実施形態1の方法。
実施形態５
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82SおよびT166R改変を含む、実施形態1の方法。
実施形態６
アデノシンデアミナーゼバリアントが、以下の改変：Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、およびQ154Rの1つ以上をさらに含む、実施形態1～5のいずれか一項の方法。
実施形態７
アデノシンデアミナーゼバリアントが、以下の改変：Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R;およびI76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154Rを含む、実施形態1～6のいずれか一項の方法。
実施形態８
アデノシンデアミナーゼバリアントが、149、150、151、152、153、154、155、156、および157からなる群より選択される残基で始まる、C末端の欠失を含む、実施形態1～6のいずれか一項の方法。
実施形態９
塩基エディタードメインがアデノシンデアミナーゼバリアントモノマーを含み、アデノシンデアミナーゼモノマーがV82SおよびT166R改変を含む、実施形態1～6のいずれか一項の方法。
実施形態１０
塩基エディタードメインが、野生型アデノシンデアミナーゼドメインおよびアデノシンデアミナーゼバリアントを含むアデノシンデアミナーゼヘテロダイマーを含む、実施形態1の方法。
実施形態１１
アデノシンデアミナーゼバリアントが、Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、V82S、T166R、およびQ154Rからなる群より選択される改変をさらに含む、実施形態10の方法。
実施形態１２
塩基エディタードメインが、TadA7.10ドメインおよびアデノシンデアミナーゼバリアントドメインを含むアデノシンデアミナーゼヘテロダイマーを含む、実施形態1の方法。
実施形態１３
アデノシンデアミナーゼバリアントが、Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、V82S、T166R、およびQ154Rからなる群より選択される改変をさらに含む、実施形態12の方法。
実施形態１４
塩基エディターが、TadA7.10ドメイン、ならびに：Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R;およびI76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154Rからなる群より選択される改変を含むアデノシンデアミナーゼバリアントを含む、実施形態1の方法。
実施形態１５
アデノシンデアミナーゼバリアントが、アデノシンデアミナーゼ活性を有する以下の配列またはその断片：
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を含むかまたはこうした配列から本質的になるABE8である、実施形態1の方法。
実施形態１６
アデノシンデアミナーゼバリアントが、全長ABE8に比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19、または20のN末端アミノ酸残基を欠く一部切除ABE8である、実施形態1～15のいずれか一項の方法。
実施形態１７
アデノシンデアミナーゼバリアントが、全長ABE8に比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19、または20のC末端アミノ酸残基を欠く一部切除ABE8である、実施形態1～15のいずれか一項の方法。
実施形態１８
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連する一塩基多型（SNP）を含むアルファ-1アンチトリプシンポリヌクレオチドを編集する方法であって、アルファ-1アンチトリプシンポリヌクレオチドを、1つ以上のガイドRNA、ならびに以下の配列：
（太字配列はCas9由来の配列を示し、斜字配列はリンカー配列を示し、下線配列は、二部分核局在化配列を示す）を含むポリヌクレオチドDNA結合ドメイン、および
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のアミノ酸82位および/または166位で改変を含むアデノシンデアミナーゼバリアントを含む少なくとも1つの塩基エディターを含む融合タンパク質と接触させる工程を含む、前記方法。
実施形態１９
アデノシンデアミナーゼバリアントがアミノ酸82位および166位で改変を含む、実施形態18の方法。
実施形態２０
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S改変を含む、実施形態18の方法。
実施形態２１
アデノシンデアミナーゼバリアントがT166R改変を含む、実施形態18の方法。
実施形態２２
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82SおよびT166R改変を含む、実施形態18の方法。
実施形態２３
アデノシンデアミナーゼバリアントが、以下の改変：Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、およびQ154Rの1つ以上をさらに含む、実施形態18～22のいずれか一項の方法。
実施形態２４
アデノシンデアミナーゼバリアントが、以下の改変：Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; およびI76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154Rを含む、実施形態18の方法。
実施形態２５
細胞がin vivoまたはex vivoである、実施形態1～24のいずれか一項の方法。
実施形態２６
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変が、アミノ酸342位のグルタミン酸をリジンに変化させる、実施形態1～24のいずれか一項の方法。
実施形態２７
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPが、アミノ酸342位でリジンを有するアルファ-1アンチトリプシンポリペプチドの発現を生じる、実施形態1～24のいずれか一項の方法。
実施形態２８
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPが、グルタミン酸をリジンで置換する、実施形態1～24のいずれか一項の方法。
実施形態２９
アデノシンデアミナーゼバリアントがY147R + Q154R +Y123Hを含む、実施形態24の方法。
実施形態３０
アデノシンデアミナーゼバリアントがY147R + Q154R + I76Yを含む、実施形態24の方法。
実施形態３１
アデノシンデアミナーゼバリアントがY147R + Q154R + T166Rを含む、実施形態24の方法。
実施形態３２
アデノシンデアミナーゼバリアントがY147T + Q154Rを含む、実施形態24の方法。
実施形態３３
アデノシンデアミナーゼバリアントがY147T + Q154Sを含む、実施形態24の方法。
実施形態３４
アデノシンデアミナーゼバリアントがY147R + Q154Sを含む、実施形態24の方法。
実施形態３５
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S + Q154Sを含む、実施形態24の方法。
実施形態３６
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S + Y147Rを含む、実施形態24の方法。
実施形態３７
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S + Q154Rを含む、実施形態24の方法。
実施形態３８
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S + Y123Hを含む、実施形態24の方法。
実施形態３９
アデノシンデアミナーゼバリアントがI76Y + V82Sを含む、実施形態24の方法。
実施形態４０
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S + Y123H + Y147Tを含む、実施形態24の方法。
実施形態４１
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S + Y123H + Y147Rを含む、実施形態24の方法。
実施形態４２
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S + Y123H + Q154Rを含む、実施形態24の方法。
実施形態４３
アデノシンデアミナーゼバリアントがY123H + Y147R + Q154R + I76Yを含む、実施形態24の方法。
実施形態４４
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S + Y123H + Y147R + Q154Rを含む、実施形態24の方法。
実施形態４５
アデノシンデアミナーゼバリアントがI76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154Rを含む、実施形態24の方法。
実施形態４６
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9)、Streptococcus thermophilus 1 Cas9 (St1Cas9)、改変Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)、またはそのバリアントである、実施形態1～45のいずれか一項の方法。
実施形態４７
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性または非G PAMに対する特異性を有する、SpCas9のバリアントを含む、実施形態46の方法。
実施形態４８
改変PAMが核酸配列5’-NGC-3’に対する特異性を有する、実施形態47の方法。
実施形態４９
改変SpCas9が、アミノ酸置換D1135M、S1136Q、G1218K、E1219F、A1322R、D1332A、R1335E、およびT1337R、またはその対応するアミノ酸置換を含む、実施形態47または実施形態48の方法。
実施形態５０
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインがヌクレアーゼ不活性またはニッカーゼバリアントである、実施形態1～49のいずれか一項の方法。
実施形態５１
ニッカーゼバリアントが、アミノ酸置換D10Aまたはその対応するアミノ酸置換を含む、実施形態50の方法。
実施形態５２
塩基エディターがジンクフィンガードメインをさらに含む、実施形態1～51のいずれか一項の方法。
実施形態５３
アデノシンデアミナーゼドメインが、デオキシリボ核酸（DNA）中のアデニンを脱アミノ化可能である、実施形態1～52のいずれか一項の方法。
実施形態５４
アデノシンデアミナーゼが、天然には存在しない改変アデノシンデアミナーゼである、実施形態1～53のいずれか一項の方法。
実施形態５５
アデノシンデアミナーゼがTadAデアミナーゼである、実施形態1～54のいずれか一項の方法。
実施形態５６
TadAデアミナーゼがTadA*7.10である、実施形態55の方法。
実施形態５７
1つ以上のガイドRNAがCRISPR RNA（crRNA）およびトランスエンコードされる小分子RNA（tracrRNA）を含み、crRNAが、アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPを含むアルファ-1アンチトリプシン核酸配列に相補的な核酸配列を含む、実施形態1～56のいずれか一項の方法。
実施形態５８
塩基エディターが、アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPを含むアルファ-1アンチトリプシン核酸配列に相補的な核酸配列を含むシングルガイドRNA（sgRNA）と複合体形成している、実施形態1～57のいずれか一項の方法。
実施形態５９
実施形態1～58のいずれか一項の塩基エディター、および：
5′-ACCAUCGACAAGAAAGGGACUGA GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′
5′-CCAUCGACAAGAAAGGGACUGA GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′
5′-CAUCGACAAGAAAGGGACUGA GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′
5′-AUCGACAAGAAAGGGACUGA GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′
5′-UCGACAAGAAAGGGACUGA GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′
5′-CGACAAGAAAGGGACUGA GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′
からなる群より選択される核酸配列を含むガイドRNAを含む、塩基編集システム。
実施形態６０
gRNAが、核酸配列
5′- GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′
をさらに含む、実施形態59の塩基編集システム。
実施形態６１
細胞内に：
前記細胞に対する、塩基エディターまたは前記塩基エディターをコードするポリヌクレオチドであって、前記塩基エディターがポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインおよび実施形態1～60のいずれか一項に記載されるアデノシンデアミナーゼドメインを含む、前記塩基エディターまたはポリヌクレオチド；および
塩基エディターをターゲティングしてアルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす、1つ以上のガイドポリヌクレオチド
を導入することによって産生された細胞、またはその前駆細胞。
実施形態６２
産生された細胞が肝細胞またはその前駆細胞である、実施形態61の細胞。
実施形態６３
細胞がアルファ-1アンチトリプシン不全を有する対象に由来するものである、実施形態61または実施形態62の細胞。
実施形態６４
細胞が哺乳動物細胞またはヒト細胞である、実施形態61～63のいずれか一項の細胞。
実施形態６５
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変が、アルファ-1アンチトリプシンポリペプチドにおいてグルタミン酸をリジンに変化させる、実施形態61～64のいずれか一項の細胞。
実施形態６６
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPが、アミノ酸42位でリジンを有するアルファ-1アンチトリプシンポリペプチドの発現を生じる、実施形態61～65のいずれか一項の細胞。
実施形態６７
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPがグルタミン酸をリジンで置換する、実施形態61～65のいずれか一項の細胞。
実施形態６８
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPのA・TからG・Cへの改変に関して細胞を選択する、実施形態61～67のいずれか一項の細胞。
実施形態６９
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9)、Streptococcus thermophilus 1 Cas9 (St1Cas9)、改変Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)、またはそのバリアントである、実施形態61～68のいずれか一項の細胞。
実施形態７０
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性または非G PAMに対する特異性を有する、SpCas9のバリアントを含む、実施形態69の細胞。
実施形態７１
改変PAMが核酸配列5’-NGC-3’に対する特異性を有する、実施形態70の細胞。
実施形態７２
改変SpCas9が、アミノ酸置換D1135M、S1136Q、G1218K、E1219F、A1322R、D1332A、R1335E、およびT1337R、またはその対応するアミノ酸置換を含む、実施形態70または実施形態71の細胞。
実施形態７３
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインがヌクレアーゼ不活性またはニッカーゼバリアントである、実施形態61～72のいずれか一項の細胞。
実施形態７４
ニッカーゼバリアントが、アミノ酸置換D10Aまたはその対応するアミノ酸置換を含む、実施形態73の細胞。
実施形態７５
塩基エディターがジンクフィンガードメインをさらに含む、実施形態71～74のいずれか一項の細胞。
実施形態７６
アデノシンデアミナーゼドメインが、デオキシリボ核酸（DNA）中のアデニンを脱アミノ化可能である、実施形態71～75のいずれか一項の細胞。
実施形態７７
1つ以上のガイドポリヌクレオチドがCRISPR RNA（crRNA）およびトランスエンコードされる小分子RNA（tracrRNA）を含み、crRNAが、アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPを含むアルファ-1アンチトリプシン核酸配列に相補的な核酸配列を含む、実施形態71～76のいずれか一項の細胞。
実施形態７８
塩基エディターおよび前記の1つ以上のガイドポリヌクレオチドが、細胞中で複合体を形成する、実施形態71～77のいずれか一項の細胞。
実施形態７９
塩基エディターが、アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPを含むアルファ-1アンチトリプシン核酸配列に相補的な核酸配列を含むシングルガイドRNA(sgRNA)と複合体形成している、実施形態78の細胞。
実施形態８０
対象において、アルファ-1アンチトリプシン不全を治療する方法であって、前記対象に実施形態71～79のいずれか一項の細胞を投与する工程を含む、前記方法。
実施形態８１
前記細胞が前記対象に対して自己である、実施形態80の方法。
実施形態８２
前記細胞が前記対象に対して同種である、実施形態80の方法。
実施形態８３
実施形態71～82のいずれか一項の細胞から増殖したかまたは拡張された、単離細胞または細胞集団。
実施形態８４
肝細胞またはその前駆細胞を産生する方法であって：
（a）アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPを含む肝細胞前駆細胞内に、
塩基エディター、または前記塩基エディターをコードするポリヌクレオチドであって、前記塩基エディターがポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインおよび実施形態1～60のいずれか一項記載のアデノシンデアミナーゼバリアントドメインを含む、前記塩基エディターまたはポリヌクレオチド；ならびに
1つ以上のガイドポリヌクレオチドであって、前記塩基エディターをターゲティングしてアルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす、前記ガイドポリヌクレオチド
を導入する工程と；
（b）肝細胞前駆細胞を肝細胞に分化させる工程
とを含む、前記方法。
実施形態８５
肝細胞を産生する方法であって：
（a）アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPを含む肝細胞内に、
塩基エディター、または前記塩基エディターをコードするポリヌクレオチドであって、前記塩基エディターがポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインおよび実施形態1～60のいずれか一項記載のアデノシンデアミナーゼバリアントドメインを含む、前記塩基エディターまたはポリヌクレオチド；ならびに
1つ以上のガイドポリヌクレオチドであって、前記塩基エディターをターゲティングしてアルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPのA・TからG・Cへの改変を達成する、前記ガイドポリヌクレオチド
を導入する工程を含む、前記方法。
実施形態８６
肝細胞または肝細胞前駆細胞が哺乳動物細胞またはヒト細胞である、実施形態85の方法。
実施形態８７
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変が、アルファ-1アンチトリプシンポリペプチドにおいてグルタミン酸をリジンに変化させる、実施形態85または実施形態86の方法。
実施形態８８
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPが、アミノ酸342位でリジンを有するアルファ-1アンチトリプシン不全ポリペプチドの発現を生じる、実施形態85～87のいずれか一項の方法。
実施形態８９
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPがグルタミン酸をリジンで置換する、実施形態85～88のいずれか一項の方法。
実施形態９０
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPのA・TからG・Cへの改変に関して細胞を選択する、実施形態85～89のいずれか一項の方法。
実施形態９１
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9)、Streptococcus thermophilus 1 Cas9 (St1Cas9)、改変Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)、またはそのバリアントを含む、実施形態85～90のいずれか一項の方法。
実施形態９２
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性を有する、改変SpCas9を含む、実施形態85～91のいずれか一項の方法。
実施形態９３
改変PAMが核酸配列5’-NGC-3’に対する特異性を有する、実施形態92の方法。
実施形態９４
改変SpCas9が、アミノ酸置換D1135M、S1136Q、G1218K、E1219F、A1322R、D1332A、R1335E、およびT1337R、またはその対応するアミノ酸置換を含む、実施形態92または実施形態93の方法。
実施形態９５
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインがヌクレアーゼ不活性またはニッカーゼバリアントである、実施形態85～94のいずれか一項の方法。
実施形態９６
ニッカーゼ変異体が、アミノ酸置換D10Aまたはその対応するアミノ酸置換を含む、実施形態95の方法。
実施形態９７
塩基エディターがジンクフィンガードメインをさらに含む、実施形態85～96のいずれか一項の方法。
実施形態９８
1つ以上のガイドRNAがCRISPR RNA（crRNA）およびトランスエンコードされる小分子RNA（tracrRNA）を含み、crRNAが、アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPを含むアルファ-1アンチトリプシン核酸配列に相補的な核酸配列を含む、実施形態85～97のいずれか一項の方法。
実施形態９９
塩基エディターおよび前記の1つ以上のガイドポリヌクレオチドが、細胞中で複合体を形成する、実施形態85～98のいずれか一項の方法。
実施形態１００
塩基エディターが、アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPを含むアルファ-1アンチトリプシン核酸配列に相補的な核酸配列を含むシングルガイドRNA（sgRNA）と複合体形成している、実施形態99の方法。
実施形態１０１
Cas9がStCas9またはSaCas9である、実施形態1～58のいずれか一項の方法。
実施形態１０２
Cas9が改変SaCas9である、実施形態1～58のいずれか一項の方法。
実施形態１０３
改変SaCas9が、置換E782K、N968K、およびR1015H、またはその対応するアミノ酸置換を含む、実施形態102の方法。
実施形態１０４
改変SaCas9がアミノ酸配列：
KRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG
を含む、実施形態102の方法。
実施形態１０５
対象においてアルファ-1アンチトリプシン不全（A1AD）を治療するための方法であって、対象に、Cas9またはCas12ポリペプチド内に挿入されたアデノシンデアミナーゼバリアントを含む融合タンパク質、あるいはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド；およびこの融合タンパク質をターゲティングしてA1ADと関連する一塩基多型（SNP）のA・TからG・Cへの改変をもたらす、1つ以上のガイドポリヌクレオチドを投与し、それによって対象においてA1ADを治療する工程を含む、前記方法。
実施形態１０６
対象においてアルファ-1アンチトリプシン不全（A1AD）を治療する方法であって、アデノシン塩基エディター8（ABE8）または前記塩基エディターをコードするポリヌクレオチドであって、ABE8がCas9またはCas12ポリペプチド内に挿入されたアデノシンデアミナーゼバリアントを含む、前記塩基エディター8またはポリヌクレオチド；およびABE8をターゲティングしてA1ADと関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす、1つ以上のガイドポリヌクレオチドを投与し、それによって対象においてA1ADを治療する工程を含む、前記方法。
実施形態１０７
ABE8が、ABE8.1-m、ABE8.2-m、ABE8.3-m、ABE8.4-m、ABE8.5-m、ABE8.6-m、ABE8.7-m、ABE8.8-m、ABE8.9-m、ABE8.10-m、ABE8.11-m、ABE8.12-m、ABE8.13-m、ABE8.14-m、ABE8.15-m、ABE8.16-m、ABE8.17-m、ABE8.18-m、ABE8.19-m、ABE8.20-m、ABE8.21-m、ABE8.22-m、ABE8.23-m、ABE8.24-m、ABE8.1-d、ABE8.2-d、ABE8.3-d、ABE8.4-d、ABE8.5-d、ABE8.6-d、ABE8.7-d、ABE8.8-d、ABE8.9-d、ABE8.10-d、ABE8.11-d、ABE8.12-d、ABE8.13-d、ABE8.14-d、ABE8.15-d、ABE8.16-d、ABE8.17-d、ABE8.18-d、ABE8.19-d、ABE8.20-d、ABE8.21-d、ABE8.22-d、ABE8.23-d、またはABE8.24-dより選択される、実施形態105または実施形態106の方法。
実施形態１０８
アデノシンデアミナーゼバリアントが：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
のアミノ酸配列を含み；このアミノ酸配列が少なくとも1つの改変を含む、実施形態105～107のいずれか一項の方法。
実施形態１０９
アデノシンデアミナーゼバリアントが、アミノ酸82位および/または166位で改変を含む、実施形態108の方法。
実施形態１１０
少なくとも1つの改変が：V82S、T166R、Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、および/またはQ154Rを含む、実施形態108または実施形態109の方法。
実施形態１１１
アデノシンデアミナーゼバリアントが改変の以下の組み合わせ：Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R;およびI76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154Rの1つを含む、実施形態105～110のいずれか一項の方法。
実施形態１１２
アデノシンデアミナーゼバリアントが、TadA*8.1、TadA*8.2、TadA*8.3、TadA*8.4、TadA*8.5、TadA*8.6、TadA*8.7、TadA*8.8、TadA*8.9、TadA*8.10、TadA*8.11、TadA*8.12、TadA*8.13、TadA*8.14、TadA*8.15、TadA*8.16、TadA*8.17、TadA*8.18、TadA*8.19、TadA*8.20、TadA*8.21、TadA*8.22、TadA*8.23、またはTadA*8.24である、実施形態105～111のいずれか一項の方法。
実施形態１１３
アデノシンデアミナーゼバリアントが、149、150、151、152、153、154、155、156、および157からなる群より選択される残基で始まるC末端の欠失を含む、実施形態105～112のいずれか一項の方法。
実施形態１１４
アデノシンデアミナーゼバリアントが、TadA*8アデノシンデアミナーゼバリアントドメインを含むアデノシンデアミナーゼモノマーである、実施形態105～113のいずれか一項の方法。
実施形態１１５
アデノシンデアミナーゼバリアントが、野生型アデノシンデアミナーゼドメインおよびTadA*8アデノシンデアミナーゼバリアントドメインを含むアデノシンデアミナーゼヘテロダイマーである、実施形態105～113のいずれか一項の方法。
実施形態１１６
アデノシンデアミナーゼバリアントが、TadAドメインおよびTadA*8アデノシンデアミナーゼバリアントドメインを含むアデノシンデアミナーゼヘテロダイマーである、実施形態105～113のいずれか一項の方法。
実施形態１１７
A1ADと関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変が、アミノ酸342位でのグルタミン酸をリジンに変化させる、実施形態105～116のいずれか一項の方法。
実施形態１１８
A1ADと関連するSNPが、アミノ酸342位でリジンを有するアルファ-1アンチトリプシンポリペプチドの発現を生じる、実施形態105～116のいずれか一項の方法。
実施形態１１９
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPが、グルタミン酸をリジンで置換する、実施形態105～116のいずれか一項の方法。
実施形態１２０
アデノシンデアミナーゼバリアントが、Cas9またはCas12ポリペプチドの柔軟なループ、アルファらせん領域、非構造化部分、または溶媒アクセス可能部分内に挿入される、実施形態105～119のいずれか一項の方法。
実施形態１２１
アデノシンデアミナーゼバリアントが、Cas9またはCas12ポリペプチドのN末端断片およびC末端断片に隣接する、実施形態105～119のいずれか一項の方法。
実施形態１２２
融合タンパク質またはABE8が、構造NH 2 -[Cas9またはCas12ポリペプチドのN末端断片]-[アデノシンデアミナーゼバリアント]-[Cas9またはCas12ポリペプチドのC末端断片]-COOHであり、ここで「]-[」の各例は任意のリンカーである、実施形態121の方法。
実施形態１２３
N末端断片のC末端またはC末端断片のN末端が、Cas9またはCas12ポリペプチドの柔軟なループの一部を含む、実施形態121または実施形態122の方法。
実施形態１２４
柔軟なループが、アデノシンデアミナーゼバリアントが標的核酸塩基を脱アミノ化する際、標的核酸塩基の近傍にあるアミノ酸を含む、実施形態120のいずれか一項の方法。
実施形態１２５
A1ADと関連するSNP標的核酸塩基の脱アミノ化を達成するための、ガイド核酸配列を対象に投与する工程をさらに含む、実施形態105～124のいずれか一項の方法。
実施形態１２６
SNP標的核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸塩基を野生型核酸塩基で、または非野生型核酸塩基で置換し、標的核酸塩基の脱アミノ化がA1ADの症状を軽減する、実施形態125の方法。
実施形態１２７
A1ADと関連するSNPの脱アミノ化が、グルタミン酸をリジンで置換する、実施形態126の方法。
実施形態１２８
標的核酸塩基が、標的ポリヌクレオチド配列において、PAM配列から1～20核酸塩基離れている、実施形態105～127のいずれか一項の方法。
実施形態１２９
標的核酸塩基が、PAM配列の2～12核酸塩基上流である、実施形態128の方法。
実施形態１３０
Cas9またはCas12ポリペプチドのN末端断片またはC末端断片が、標的ポリヌクレオチド配列に結合する、実施形態121～129のいずれか一項の方法。
実施形態１３１
N末端断片またはC末端断片が、RuvCドメインを含むか；
N末端断片またはC末端断片が、HNHドメインを含むか；
N末端断片またはC末端断片のいずれも、HNHドメインを含まないか；あるいは
N末端断片またはC末端断片のいずれも、RuvCドメインを含まない、
実施形態130の方法。
実施形態１３２
Cas9またはCas12ポリペプチドが、1つ以上の構造ドメイン中に部分的または完全欠失を含み、デアミナーゼがCas9またはCas12ポリペプチドの部分的または完全欠失の位置に挿入されている、実施形態115～131のいずれか一項の方法。
実施形態１３３
欠失がRuvCドメイン内であるか；または
欠失がHNHドメイン内である
実施形態132の方法。
実施形態１３４
融合タンパク質またはABE8がCas9ポリペプチドを含む、実施形態105～133のいずれか一項の方法。
実施形態１３５
Cas9ポリペプチドが、Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)、Staphylococcus aureus Cas9（SaCas9）、Streptococcus thermophilus1 Cas9（St1Cas9）、またはそのバリアントである、実施形態134の方法。
実施形態１３６
Cas9ポリペプチドが、以下のアミノ酸配列（Cas9参照配列）：
（一重下線：HNHドメイン；二重下線：RuvCドメイン；（Cas9参照配列））、またはその対応する領域を含む、実施形態134または実施形態135の方法。
実施形態１３７
Cas9ポリペプチドが、Cas9ポリペプチド参照配列における番号付けでアミノ酸1017～1069またはその対応するアミノ酸の欠失を含むか；
Cas9ポリペプチドが、Cas9ポリペプチド参照配列における番号付けでアミノ酸792～872またはその対応するアミノ酸の欠失を含むか；あるいは
Cas9ポリペプチドが、Cas9ポリペプチド参照配列における番号付けでアミノ酸792～906またはその対応するアミノ酸の欠失を含む
実施形態136の方法。
実施形態１３８
アデノシンデアミナーゼバリアントが、Cas9ポリペプチドの柔軟なループ内に挿入されている、実施形態134～137のいずれか一項の方法。
実施形態１３９
柔軟なループが、Cas9参照配列における番号付けで530～537、569～579、686～691、768～793、943～947、1002～1040、1052～1077、1232～1248、および1298～1300位のアミノ酸残基、あるいはその対応するアミノ酸位からなる群より選択される領域を含む、実施形態138の方法。
実施形態１４０
デアミナーゼバリアントが、Cas9参照配列における番号付けで、アミノ酸位768～769、791～792、792～793、1015～1016、1022～1023、1026～1027、1029～1030、1040～1041、1052～1053、1054～1055、1067～1068、1068～1069、1247～1248、または1248～1249、あるいはその対応するアミノ酸位の間に挿入されている、実施形態136の方法。
実施形態１４１
デアミナーゼバリアントが、Cas9参照配列における番号付けで、アミノ酸位768～769、792～793、1022～1023、1026～1027、1040～1041、1068～1069、または1247～1248、あるいはその対応するアミノ酸位の間に挿入されている、実施形態136の方法。
実施形態１４２
デアミナーゼバリアントが、Cas9参照配列における番号付けで、アミノ酸位1016～1017、1023～1024、1029～1030、1040～1041、1069～1070、または1247～1248、あるいはその対応するアミノ酸位の間に挿入されている、実施形態136の方法。
実施形態１４３
アデノシンデアミナーゼバリアントが、表13Aに同定される遺伝子座で、Cas9ポリペプチド内に挿入されている、実施形態136の方法。
実施形態１４４
N末端断片が、Cas9参照配列のアミノ酸残基1～529、538～568、580～685、692～942、948～1001、1026～1051、1078～1231、および/または1248～1297、あるいはその対応する残基を含む、実施形態136の方法。
実施形態１４５
C末端断片が、Cas9参照配列のアミノ酸残基1301～1368、1248～1297、1078～1231、1026～1051、948～1001、692～942、580～685、および/または538～568、あるいはその対応する残基を含む、実施形態136の方法。
実施形態１４６
Cas9ポリペプチドが改変Cas9であり、改変PAMまたは非G PAMに対する特異性を有する、実施形態134～145のいずれか一項の方法。
実施形態１４７
Cas9ポリペプチドがニッカーゼであるかまたはCas9ポリペプチドがヌクレアーゼ不活性である、実施形態134～146のいずれか一項の方法。
実施形態１４８
Cas9ポリペプチドが改変SpCas9ポリペプチドである、実施形態134～145のいずれか一項の方法。
実施形態１４９
改変SpCas9ポリペプチドが、アミノ酸置換D1135M、S1136Q、G1218K、E1219F、A1322R、D1332A、R1335E、およびT1337R（SpCas9-MQKFRAER）であり、改変PAM 5’-NGC-3’に対する特異性を有する、実施形態148の方法。
実施形態１５０
融合タンパク質またはABE8がCas12ポリペプチドを含む、実施形態105～133のいずれか一項の方法。
実施形態１５１
アデノシンデアミナーゼバリアントが、Cas12ポリペプチド内に挿入されている、実施形態150の方法。
実施形態１５２
Cas12ポリペプチドが、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12g、Cas12h、またはCas12iである、実施形態150または実施形態151の方法。
実施形態１５３
アデノシンデアミナーゼバリアントが、アミノ酸位:
a) BhCas12bの153～154、255～256、306～307、980～981、1019～1020、534～535、604～605、もしくは344～345、またはCas12a、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12g、Cas12h、もしくはCas12iの対応するアミノ酸残基;
b) BvCas12bの147～148、248～249、299～300、991～992、もしくは1031～1032、またはCas12a、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12g、Cas12h、もしくはCas12iの対応するアミノ酸残基; あるいは
c) AaCas12bの157～158、258～259、310～311、1008～1009、もしくは1044～1045、またはCas12a、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12g、Cas12h、もしくはCas12iの対応するアミノ酸残基の間に挿入されている、実施形態151または実施形態152の方法。
実施形態１５４
アデノシンデアミナーゼバリアントが、表13Bに同定される遺伝子座で、Cas12ポリペプチド内に挿入されている、実施形態151の方法。
実施形態１５５
Cas12ポリペプチドがCas12bである、実施形態154の方法。
実施形態１５６
Cas12ポリペプチドが、BhCas12bドメイン、BvCas12bドメイン、またはAACas12bドメインを含む、実施形態154の方法。
実施形態１５７
ガイドRNAがCRISPR RNA（crRNA）およびトランス活性化crRNA（tracrRNA）を含む、実施形態105～156のいずれか一項の方法。
実施形態１５８
対象が哺乳動物またはヒトである、実施形態105～157のいずれか一項の方法。
実施形態１５９
実施形態59または実施形態60の塩基編集システム、および薬学的に許容され得るキャリアー、ビヒクル、または賦形剤を含む薬学的組成物。
実施形態１６０
実施形態61～79のいずれか一項の細胞、および薬学的に許容され得るキャリアー、ビヒクル、または賦形剤を含む薬学的組成物。
実施形態１６１
実施形態59または実施形態60の塩基編集システムを含むキット。
実施形態１６２
実施形態61～79のいずれか一項の細胞を含むキット。
実施形態１６３
さらに、使用のための説明書を含むパッケージ挿入物を含む、実施形態161または実施形態162のキット。
実施形態１６４
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメイン、および
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
のアミノ酸82位または166位で改変を含むアデノシンデアミナーゼバリアントを含む少なくとも1つの塩基エディタードメイン、ならびにガイドRNAを含む塩基エディターシステムであって、前記ガイドRNAが前記塩基エディターをターゲティングしてアルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPの改変をもたらす、前記塩基エディターシステム。
実施形態１６５
アデノシンデアミナーゼバリアントが、V82S改変および/またはT166R改変を含む、実施形態164の塩基エディターシステム。
実施形態１６６
アデノシンデアミナーゼバリアントが、以下の改変: Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、およびQ154Rの1つ以上をさらに含む、実施形態165の塩基エディターシステム。
実施形態１６７
塩基エディタードメインが、野生型アデノシンデアミナーゼドメインおよびアデノシンデアミナーゼバリアントを含むアデノシンデアミナーゼヘテロダイマーを含む、実施形態165または166の塩基エディターシステム。
実施形態１６８
アデノシンデアミナーゼバリアントが、全長TadA8に比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19、または20のN末端アミノ酸残基が欠けている一部切除TadA8である、実施形態164～167のいずれか一項の塩基エディター。
実施形態１６９
アデノシンデアミナーゼバリアントが、全長TadA8に比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19、または20のC末端アミノ酸残基が欠けている一部切除TadA8である、実施形態164～167のいずれか一項の塩基エディター。
実施形態１７０
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変Staphylococcus aureus Cas9（SaCas9）、Streptococcus thermophilus 1 Cas9（St1Cas9）、改変Streptococcus pyogenes（SpCas9）、またはそのバリアントである、実施形態164～169のいずれか一項の塩基エディターシステム。
実施形態１７１
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性または非G PAMに対する特異性を有するSpCas9のバリアントである、実施形態170の塩基エディターシステム。
実施形態１７２
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインがヌクレアーゼ不活性Cas9である、実施形態170の塩基エディターシステム。
実施形態１７３
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインがCas9ニッカーゼである、実施形態170の塩基エディターシステム。
実施形態１７４
1つ以上のガイドRNA、ならびに以下の配列：
（太字配列はCas9由来の配列を示し、斜字配列はリンカー配列を示し、下線配列は二部分核局在化配列を示す）を含むポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメイン、および
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
のアミノ酸82位および/または166位で改変を含むアデノシンデアミナーゼバリアントを含む少なくとも１つの塩基エディタードメインを含む融合タンパク質を含む、塩基エディターシステム。
実施形態１７５
実施形態164～174のいずれか一項の塩基エディターシステムを含む細胞。
実施形態１７６
細胞がヒト細胞または哺乳動物細胞である、実施形態175の細胞。
実施形態１７７
細胞がex vivo、in vivo、またはin vitroである、実施形態175の細胞。
［他の実施形態］
上記の説明から、多様な用途および条件に取り入れるために、本明細書に記述する本発明に変形および修正を加えることができることが明らかであろう。そのような実施形態もまた、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
実施形態１
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連する一塩基多型（SNP）を含むアルファ-1アンチトリプシンポリヌクレオチドを編集する方法であって、該ポリヌクレオチドを、1つ以上のガイドRNA、ならびにポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインおよび
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
のアミノ酸82位または166位に改変を含むアデノシンデアミナーゼバリアントを含む少なくとも1つの塩基エディタードメインを含む塩基エディターと接触させる工程を含み、前記ガイドRNAが、前記塩基エディターをターゲティングしてアルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPの改変をもたらす、前記方法。
実施形態２
アデノシンデアミナーゼバリアントがアミノ酸82位および166位に改変を含む、実施形態1の方法。
実施形態３
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S改変を含む、実施形態1の方法。
実施形態４
アデノシンデアミナーゼバリアントがT166R改変を含む、実施形態1の方法。
実施形態５
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82SおよびT166R改変を含む、実施形態1の方法。
実施形態６
アデノシンデアミナーゼバリアントが、以下の改変：Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、およびQ154Rの1つ以上をさらに含む、実施形態1～5のいずれか一項の方法。
実施形態７
アデノシンデアミナーゼバリアントが、以下の改変：Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R;およびI76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154Rを含む、実施形態1～6のいずれか一項の方法。
実施形態８
アデノシンデアミナーゼバリアントが、149、150、151、152、153、154、155、156、および157からなる群より選択される残基で始まる、C末端の欠失を含む、実施形態1～6のいずれか一項の方法。
実施形態９
塩基エディタードメインがアデノシンデアミナーゼバリアントモノマーを含み、アデノシンデアミナーゼモノマーがV82SおよびT166R改変を含む、実施形態1～6のいずれか一項の方法。
実施形態１０
塩基エディタードメインが、野生型アデノシンデアミナーゼドメインおよびアデノシンデアミナーゼバリアントを含むアデノシンデアミナーゼヘテロダイマーを含む、実施形態1の方法。
実施形態１１
アデノシンデアミナーゼバリアントが、Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、V82S、T166R、およびQ154Rからなる群より選択される改変をさらに含む、実施形態10の方法。
実施形態１２
塩基エディタードメインが、TadA7.10ドメインおよびアデノシンデアミナーゼバリアントドメインを含むアデノシンデアミナーゼヘテロダイマーを含む、実施形態1の方法。
実施形態１３
アデノシンデアミナーゼバリアントが、Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、V82S、T166R、およびQ154Rからなる群より選択される改変をさらに含む、実施形態12の方法。
実施形態１４
塩基エディターが、TadA7.10ドメイン、ならびに：Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R;およびI76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154Rからなる群より選択される改変を含むアデノシンデアミナーゼバリアントを含む、実施形態1の方法。
実施形態１５
アデノシンデアミナーゼバリアントが、アデノシンデアミナーゼ活性を有する以下の配列またはその断片：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCTFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
を含むかまたはこうした配列から本質的になるABE8である、実施形態1の方法。
実施形態１６
アデノシンデアミナーゼバリアントが、全長ABE8に比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19、または20のN末端アミノ酸残基を欠く一部切除ABE8である、実施形態1～15のいずれか一項の方法。
実施形態１７
アデノシンデアミナーゼバリアントが、全長ABE8に比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19、または20のC末端アミノ酸残基を欠く一部切除ABE8である、実施形態1～15のいずれか一項の方法。
実施形態１８
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連する一塩基多型（SNP）を含むアルファ-1アンチトリプシンポリヌクレオチドを編集する方法であって、アルファ-1アンチトリプシンポリヌクレオチドを、1つ以上のガイドRNA、ならびに以下の配列：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
のアミノ酸82位および/または166位で改変を含むアデノシンデアミナーゼバリアントを含む少なくとも1つの塩基エディターを含む融合タンパク質と接触させる工程を含む、前記方法。
実施形態１９
アデノシンデアミナーゼバリアントがアミノ酸82位および166位で改変を含む、実施形態18の方法。
実施形態２０
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S改変を含む、実施形態18の方法。
実施形態２１
アデノシンデアミナーゼバリアントがT166R改変を含む、実施形態18の方法。
実施形態２２
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82SおよびT166R改変を含む、実施形態18の方法。
実施形態２３
アデノシンデアミナーゼバリアントが、以下の改変：Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、およびQ154Rの1つ以上をさらに含む、実施形態18～22のいずれか一項の方法。
実施形態２４
アデノシンデアミナーゼバリアントが、以下の改変：Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; およびI76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154Rを含む、実施形態18の方法。
実施形態２５
細胞がin vivoまたはex vivoである、実施形態1～24のいずれか一項の方法。
実施形態２６
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変が、アミノ酸342位のグルタミン酸をリジンに変化させる、実施形態1～24のいずれか一項の方法。
実施形態２７
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPが、アミノ酸342位でリジンを有するアルファ-1アンチトリプシンポリペプチドの発現を生じる、実施形態1～24のいずれか一項の方法。
実施形態２８
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPが、グルタミン酸をリジンで置換する、実施形態1～24のいずれか一項の方法。
実施形態２９
アデノシンデアミナーゼバリアントがY147R + Q154R +Y123Hを含む、実施形態24の方法。
実施形態３０
アデノシンデアミナーゼバリアントがY147R + Q154R + I76Yを含む、実施形態24の方法。
実施形態３１
アデノシンデアミナーゼバリアントがY147R + Q154R + T166Rを含む、実施形態24の方法。
実施形態３２
アデノシンデアミナーゼバリアントがY147T + Q154Rを含む、実施形態24の方法。
実施形態３３
アデノシンデアミナーゼバリアントがY147T + Q154Sを含む、実施形態24の方法。
実施形態３４
アデノシンデアミナーゼバリアントがY147R + Q154Sを含む、実施形態24の方法。
実施形態３５
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S + Q154Sを含む、実施形態24の方法。
実施形態３６
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S + Y147Rを含む、実施形態24の方法。
実施形態３７
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S + Q154Rを含む、実施形態24の方法。
実施形態３８
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S + Y123Hを含む、実施形態24の方法。
実施形態３９
アデノシンデアミナーゼバリアントがI76Y + V82Sを含む、実施形態24の方法。
実施形態４０
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S + Y123H + Y147Tを含む、実施形態24の方法。
実施形態４１
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S + Y123H + Y147Rを含む、実施形態24の方法。
実施形態４２
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S + Y123H + Q154Rを含む、実施形態24の方法。
実施形態４３
アデノシンデアミナーゼバリアントがY123H + Y147R + Q154R + I76Yを含む、実施形態24の方法。
実施形態４４
アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S + Y123H + Y147R + Q154Rを含む、実施形態24の方法。
実施形態４５
アデノシンデアミナーゼバリアントがI76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154Rを含む、実施形態24の方法。
実施形態４６
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9)、Streptococcus thermophilus 1 Cas9 (St1Cas9)、改変Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)、またはそのバリアントである、実施形態1～45のいずれか一項の方法。
実施形態４７
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性または非G PAMに対する特異性を有する、SpCas9のバリアントを含む、実施形態46の方法。
実施形態４８
改変PAMが核酸配列5’-NGC-3’に対する特異性を有する、実施形態47の方法。
実施形態４９
改変SpCas9が、アミノ酸置換D1135M、S1136Q、G1218K、E1219F、A1322R、D1332A、R1335E、およびT1337R、またはその対応するアミノ酸置換を含む、実施形態47または実施形態48の方法。
実施形態５０
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインがヌクレアーゼ不活性またはニッカーゼバリアントである、実施形態1～49のいずれか一項の方法。
実施形態５１
ニッカーゼバリアントが、アミノ酸置換D10Aまたはその対応するアミノ酸置換を含む、実施形態50の方法。
実施形態５２
塩基エディターがジンクフィンガードメインをさらに含む、実施形態1～51のいずれか一項の方法。
実施形態５３
アデノシンデアミナーゼドメインが、デオキシリボ核酸（DNA）中のアデニンを脱アミノ化可能である、実施形態1～52のいずれか一項の方法。
実施形態５４
アデノシンデアミナーゼが、天然には存在しない改変アデノシンデアミナーゼである、実施形態1～53のいずれか一項の方法。
実施形態５５
アデノシンデアミナーゼがTadAデアミナーゼである、実施形態1～54のいずれか一項の方法。
実施形態５６
TadAデアミナーゼがTadA*7.10である、実施形態55の方法。
実施形態５７
1つ以上のガイドRNAがCRISPR RNA（crRNA）およびトランスエンコードされる小分子RNA（tracrRNA）を含み、crRNAが、アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPを含むアルファ-1アンチトリプシン核酸配列に相補的な核酸配列を含む、実施形態1～56のいずれか一項の方法。
実施形態５８
塩基エディターが、アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPを含むアルファ-1アンチトリプシン核酸配列に相補的な核酸配列を含むシングルガイドRNA（sgRNA）と複合体形成している、実施形態1～57のいずれか一項の方法。
実施形態５９
実施形態1～58のいずれか一項の塩基エディター、および：
5′-ACCAUCGACAAGAAAGGGACUGA GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′
5′-CCAUCGACAAGAAAGGGACUGA GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′
5′-CAUCGACAAGAAAGGGACUGA GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′
5′-AUCGACAAGAAAGGGACUGA GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′
5′-UCGACAAGAAAGGGACUGA GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′
5′-CGACAAGAAAGGGACUGA GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′
からなる群より選択される核酸配列を含むガイドRNAを含む、塩基編集システム。
実施形態６０
gRNAが、核酸配列
5′- GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′
をさらに含む、実施形態59の塩基編集システム。
実施形態６１
細胞内に：
前記細胞に対する、塩基エディターまたは前記塩基エディターをコードするポリヌクレオチドであって、前記塩基エディターがポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインおよび実施形態1～60のいずれか一項に記載されるアデノシンデアミナーゼドメインを含む、前記塩基エディターまたはポリヌクレオチド；および
塩基エディターをターゲティングしてアルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす、1つ以上のガイドポリヌクレオチド
を導入することによって産生された細胞、またはその前駆細胞。
実施形態６２
産生された細胞が肝細胞またはその前駆細胞である、実施形態61の細胞。
実施形態６３
細胞がアルファ-1アンチトリプシン不全を有する対象に由来するものである、実施形態61または実施形態62の細胞。
実施形態６４
細胞が哺乳動物細胞またはヒト細胞である、実施形態61～63のいずれか一項の細胞。
実施形態６５
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変が、アルファ-1アンチトリプシンポリペプチドにおいてグルタミン酸をリジンに変化させる、実施形態61～64のいずれか一項の細胞。
実施形態６６
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPが、アミノ酸42位でリジンを有するアルファ-1アンチトリプシンポリペプチドの発現を生じる、実施形態61～65のいずれか一項の細胞。
実施形態６７
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPがグルタミン酸をリジンで置換する、実施形態61～65のいずれか一項の細胞。
実施形態６８
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPのA・TからG・Cへの改変に関して細胞を選択する、実施形態61～67のいずれか一項の細胞。
実施形態６９
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9)、Streptococcus thermophilus 1 Cas9 (St1Cas9)、改変Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)、またはそのバリアントである、実施形態61～68のいずれか一項の細胞。
実施形態７０
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性または非G PAMに対する特異性を有する、SpCas9のバリアントを含む、実施形態69の細胞。
実施形態７１
改変PAMが核酸配列5’-NGC-3’に対する特異性を有する、実施形態70の細胞。
実施形態７２
改変SpCas9が、アミノ酸置換D1135M、S1136Q、G1218K、E1219F、A1322R、D1332A、R1335E、およびT1337R、またはその対応するアミノ酸置換を含む、実施形態70または実施形態71の細胞。
実施形態７３
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインがヌクレアーゼ不活性またはニッカーゼバリアントである、実施形態61～72のいずれか一項の細胞。
実施形態７４
ニッカーゼバリアントが、アミノ酸置換D10Aまたはその対応するアミノ酸置換を含む、実施形態73の細胞。
実施形態７５
塩基エディターがジンクフィンガードメインをさらに含む、実施形態71～74のいずれか一項の細胞。
実施形態７６
アデノシンデアミナーゼドメインが、デオキシリボ核酸（DNA）中のアデニンを脱アミノ化可能である、実施形態71～75のいずれか一項の細胞。
実施形態７７
1つ以上のガイドポリヌクレオチドがCRISPR RNA（crRNA）およびトランスエンコードされる小分子RNA（tracrRNA）を含み、crRNAが、アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPを含むアルファ-1アンチトリプシン核酸配列に相補的な核酸配列を含む、実施形態71～76のいずれか一項の細胞。
実施形態７８
塩基エディターおよび前記の1つ以上のガイドポリヌクレオチドが、細胞中で複合体を形成する、実施形態71～77のいずれか一項の細胞。
実施形態７９
塩基エディターが、アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPを含むアルファ-1アンチトリプシン核酸配列に相補的な核酸配列を含むシングルガイドRNA(sgRNA)と複合体形成している、実施形態78の細胞。
実施形態８０
対象において、アルファ-1アンチトリプシン不全を治療する方法であって、前記対象に実施形態71～79のいずれか一項の細胞を投与する工程を含む、前記方法。
実施形態８１
前記細胞が前記対象に対して自己である、実施形態80の方法。
実施形態８２
前記細胞が前記対象に対して同種である、実施形態80の方法。
実施形態８３
実施形態71～82のいずれか一項の細胞から増殖したかまたは拡張された、単離細胞または細胞集団。
実施形態８４
肝細胞またはその前駆細胞を産生する方法であって：
（a）アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPを含む肝細胞前駆細胞内に、
塩基エディター、または前記塩基エディターをコードするポリヌクレオチドであって、前記塩基エディターがポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインおよび実施形態1～60のいずれか一項記載のアデノシンデアミナーゼバリアントドメインを含む、前記塩基エディターまたはポリヌクレオチド；ならびに
1つ以上のガイドポリヌクレオチドであって、前記塩基エディターをターゲティングしてアルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす、前記ガイドポリヌクレオチド
を導入する工程と；
（b）肝細胞前駆細胞を肝細胞に分化させる工程
とを含む、前記方法。
実施形態８５
肝細胞を産生する方法であって：
（a）アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPを含む肝細胞内に、
塩基エディター、または前記塩基エディターをコードするポリヌクレオチドであって、前記塩基エディターがポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインおよび実施形態1～60のいずれか一項記載のアデノシンデアミナーゼバリアントドメインを含む、前記塩基エディターまたはポリヌクレオチド；ならびに
1つ以上のガイドポリヌクレオチドであって、前記塩基エディターをターゲティングしてアルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPのA・TからG・Cへの改変を達成する、前記ガイドポリヌクレオチド
を導入する工程を含む、前記方法。
実施形態８６
肝細胞または肝細胞前駆細胞が哺乳動物細胞またはヒト細胞である、実施形態85の方法。
実施形態８７
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変が、アルファ-1アンチトリプシンポリペプチドにおいてグルタミン酸をリジンに変化させる、実施形態85または実施形態86の方法。
実施形態８８
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPが、アミノ酸342位でリジンを有するアルファ-1アンチトリプシン不全ポリペプチドの発現を生じる、実施形態85～87のいずれか一項の方法。
実施形態８９
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPがグルタミン酸をリジンで置換する、実施形態85～88のいずれか一項の方法。
実施形態９０
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPのA・TからG・Cへの改変に関して細胞を選択する、実施形態85～89のいずれか一項の方法。
実施形態９１
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9)、Streptococcus thermophilus 1 Cas9 (St1Cas9)、改変Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)、またはそのバリアントを含む、実施形態85～90のいずれか一項の方法。
実施形態９２
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性を有する、改変SpCas9を含む、実施形態85～91のいずれか一項の方法。
実施形態９３
改変PAMが核酸配列5’-NGC-3’に対する特異性を有する、実施形態92の方法。
実施形態９４
改変SpCas9が、アミノ酸置換D1135M、S1136Q、G1218K、E1219F、A1322R、D1332A、R1335E、およびT1337R、またはその対応するアミノ酸置換を含む、実施形態92または実施形態93の方法。
実施形態９５
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインがヌクレアーゼ不活性またはニッカーゼバリアントである、実施形態85～94のいずれか一項の方法。
実施形態９６
ニッカーゼ変異体が、アミノ酸置換D10Aまたはその対応するアミノ酸置換を含む、実施形態95の方法。
実施形態９７
塩基エディターがジンクフィンガードメインをさらに含む、実施形態85～96のいずれか一項の方法。
実施形態９８
1つ以上のガイドRNAがCRISPR RNA（crRNA）およびトランスエンコードされる小分子RNA（tracrRNA）を含み、crRNAが、アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPを含むアルファ-1アンチトリプシン核酸配列に相補的な核酸配列を含む、実施形態85～97のいずれか一項の方法。
実施形態９９
塩基エディターおよび前記の1つ以上のガイドポリヌクレオチドが、細胞中で複合体を形成する、実施形態85～98のいずれか一項の方法。
実施形態１００
塩基エディターが、アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPを含むアルファ-1アンチトリプシン核酸配列に相補的な核酸配列を含むシングルガイドRNA（sgRNA）と複合体形成している、実施形態99の方法。
実施形態１０１
Cas9がStCas9またはSaCas9である、実施形態1～58のいずれか一項の方法。
実施形態１０２
Cas9が改変SaCas9である、実施形態1～58のいずれか一項の方法。
実施形態１０３
改変SaCas9が、置換E782K、N968K、およびR1015H、またはその対応するアミノ酸置換を含む、実施形態102の方法。
実施形態１０４
改変SaCas9がアミノ酸配列：
KRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG
を含む、実施形態102の方法。
実施形態１０５
対象においてアルファ-1アンチトリプシン不全（A1AD）を治療するための方法であって、対象に、Cas9またはCas12ポリペプチド内に挿入されたアデノシンデアミナーゼバリアントを含む融合タンパク質、あるいはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド；およびこの融合タンパク質をターゲティングしてA1ADと関連する一塩基多型（SNP）のA・TからG・Cへの改変をもたらす、1つ以上のガイドポリヌクレオチドを投与し、それによって対象においてA1ADを治療する工程を含む、前記方法。
実施形態１０６
対象においてアルファ-1アンチトリプシン不全（A1AD）を治療する方法であって、アデノシン塩基エディター8（ABE8）または前記塩基エディターをコードするポリヌクレオチドであって、ABE8がCas9またはCas12ポリペプチド内に挿入されたアデノシンデアミナーゼバリアントを含む、前記塩基エディター8またはポリヌクレオチド；およびABE8をターゲティングしてA1ADと関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす、1つ以上のガイドポリヌクレオチドを投与し、それによって対象においてA1ADを治療する工程を含む、前記方法。
実施形態１０７
ABE8が、ABE8.1-m、ABE8.2-m、ABE8.3-m、ABE8.4-m、ABE8.5-m、ABE8.6-m、ABE8.7-m、ABE8.8-m、ABE8.9-m、ABE8.10-m、ABE8.11-m、ABE8.12-m、ABE8.13-m、ABE8.14-m、ABE8.15-m、ABE8.16-m、ABE8.17-m、ABE8.18-m、ABE8.19-m、ABE8.20-m、ABE8.21-m、ABE8.22-m、ABE8.23-m、ABE8.24-m、ABE8.1-d、ABE8.2-d、ABE8.3-d、ABE8.4-d、ABE8.5-d、ABE8.6-d、ABE8.7-d、ABE8.8-d、ABE8.9-d、ABE8.10-d、ABE8.11-d、ABE8.12-d、ABE8.13-d、ABE8.14-d、ABE8.15-d、ABE8.16-d、ABE8.17-d、ABE8.18-d、ABE8.19-d、ABE8.20-d、ABE8.21-d、ABE8.22-d、ABE8.23-d、またはABE8.24-dより選択される、実施形態105または実施形態106の方法。
実施形態１０８
アデノシンデアミナーゼバリアントが：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
のアミノ酸配列を含み；このアミノ酸配列が少なくとも1つの改変を含む、実施形態105～107のいずれか一項の方法。
実施形態１０９
アデノシンデアミナーゼバリアントが、アミノ酸82位および/または166位で改変を含む、実施形態108の方法。
実施形態１１０
少なくとも1つの改変が：V82S、T166R、Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、および/またはQ154Rを含む、実施形態108または実施形態109の方法。
実施形態１１１
アデノシンデアミナーゼバリアントが改変の以下の組み合わせ：Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R;およびI76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154Rの1つを含む、実施形態105～110のいずれか一項の方法。
実施形態１１２
アデノシンデアミナーゼバリアントが、TadA*8.1、TadA*8.2、TadA*8.3、TadA*8.4、TadA*8.5、TadA*8.6、TadA*8.7、TadA*8.8、TadA*8.9、TadA*8.10、TadA*8.11、TadA*8.12、TadA*8.13、TadA*8.14、TadA*8.15、TadA*8.16、TadA*8.17、TadA*8.18、TadA*8.19、TadA*8.20、TadA*8.21、TadA*8.22、TadA*8.23、またはTadA*8.24である、実施形態105～111のいずれか一項の方法。
実施形態１１３
アデノシンデアミナーゼバリアントが、149、150、151、152、153、154、155、156、および157からなる群より選択される残基で始まるC末端の欠失を含む、実施形態105～112のいずれか一項の方法。
実施形態１１４
アデノシンデアミナーゼバリアントが、TadA*8アデノシンデアミナーゼバリアントドメインを含むアデノシンデアミナーゼモノマーである、実施形態105～113のいずれか一項の方法。
実施形態１１５
アデノシンデアミナーゼバリアントが、野生型アデノシンデアミナーゼドメインおよびTadA*8アデノシンデアミナーゼバリアントドメインを含むアデノシンデアミナーゼヘテロダイマーである、実施形態105～113のいずれか一項の方法。
実施形態１１６
アデノシンデアミナーゼバリアントが、TadAドメインおよびTadA*8アデノシンデアミナーゼバリアントドメインを含むアデノシンデアミナーゼヘテロダイマーである、実施形態105～113のいずれか一項の方法。
実施形態１１７
A1ADと関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変が、アミノ酸342位でのグルタミン酸をリジンに変化させる、実施形態105～116のいずれか一項の方法。
実施形態１１８
A1ADと関連するSNPが、アミノ酸342位でリジンを有するアルファ-1アンチトリプシンポリペプチドの発現を生じる、実施形態105～116のいずれか一項の方法。
実施形態１１９
アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPが、グルタミン酸をリジンで置換する、実施形態105～116のいずれか一項の方法。
実施形態１２０
アデノシンデアミナーゼバリアントが、Cas9またはCas12ポリペプチドの柔軟なループ、アルファらせん領域、非構造化部分、または溶媒アクセス可能部分内に挿入される、実施形態105～119のいずれか一項の方法。
実施形態１２１
アデノシンデアミナーゼバリアントが、Cas9またはCas12ポリペプチドのN末端断片およびC末端断片に隣接する、実施形態105～119のいずれか一項の方法。
実施形態１２２
融合タンパク質またはABE8が、構造NH 2 -[Cas9またはCas12ポリペプチドのN末端断片]-[アデノシンデアミナーゼバリアント]-[Cas9またはCas12ポリペプチドのC末端断片]-COOHであり、ここで「]-[」の各例は任意のリンカーである、実施形態121の方法。
実施形態１２３
N末端断片のC末端またはC末端断片のN末端が、Cas9またはCas12ポリペプチドの柔軟なループの一部を含む、実施形態121または実施形態122の方法。
実施形態１２４
柔軟なループが、アデノシンデアミナーゼバリアントが標的核酸塩基を脱アミノ化する際、標的核酸塩基の近傍にあるアミノ酸を含む、実施形態120のいずれか一項の方法。
実施形態１２５
A1ADと関連するSNP標的核酸塩基の脱アミノ化を達成するための、ガイド核酸配列を対象に投与する工程をさらに含む、実施形態105～124のいずれか一項の方法。
実施形態１２６
SNP標的核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸塩基を野生型核酸塩基で、または非野生型核酸塩基で置換し、標的核酸塩基の脱アミノ化がA1ADの症状を軽減する、実施形態125の方法。
実施形態１２７
A1ADと関連するSNPの脱アミノ化が、グルタミン酸をリジンで置換する、実施形態126の方法。
実施形態１２８
標的核酸塩基が、標的ポリヌクレオチド配列において、PAM配列から1～20核酸塩基離れている、実施形態105～127のいずれか一項の方法。
実施形態１２９
標的核酸塩基が、PAM配列の2～12核酸塩基上流である、実施形態128の方法。
実施形態１３０
Cas9またはCas12ポリペプチドのN末端断片またはC末端断片が、標的ポリヌクレオチド配列に結合する、実施形態121～129のいずれか一項の方法。
実施形態１３１
N末端断片またはC末端断片が、RuvCドメインを含むか；
N末端断片またはC末端断片が、HNHドメインを含むか；
N末端断片またはC末端断片のいずれも、HNHドメインを含まないか；あるいは
N末端断片またはC末端断片のいずれも、RuvCドメインを含まない、
実施形態130の方法。
実施形態１３２
Cas9またはCas12ポリペプチドが、1つ以上の構造ドメイン中に部分的または完全欠失を含み、デアミナーゼがCas9またはCas12ポリペプチドの部分的または完全欠失の位置に挿入されている、実施形態115～131のいずれか一項の方法。
実施形態１３３
欠失がRuvCドメイン内であるか；または
欠失がHNHドメイン内である
実施形態132の方法。
実施形態１３４
融合タンパク質またはABE8がCas9ポリペプチドを含む、実施形態105～133のいずれか一項の方法。
実施形態１３５
Cas9ポリペプチドが、Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)、Staphylococcus aureus Cas9（SaCas9）、Streptococcus thermophilus1 Cas9（St1Cas9）、またはそのバリアントである、実施形態134の方法。
実施形態１３６
Cas9ポリペプチドが、以下のアミノ酸配列（Cas9参照配列）：
実施形態１３７
Cas9ポリペプチドが、Cas9ポリペプチド参照配列における番号付けでアミノ酸1017～1069またはその対応するアミノ酸の欠失を含むか；
Cas9ポリペプチドが、Cas9ポリペプチド参照配列における番号付けでアミノ酸792～872またはその対応するアミノ酸の欠失を含むか；あるいは
Cas9ポリペプチドが、Cas9ポリペプチド参照配列における番号付けでアミノ酸792～906またはその対応するアミノ酸の欠失を含む
実施形態136の方法。
実施形態１３８
アデノシンデアミナーゼバリアントが、Cas9ポリペプチドの柔軟なループ内に挿入されている、実施形態134～137のいずれか一項の方法。
実施形態１３９
柔軟なループが、Cas9参照配列における番号付けで530～537、569～579、686～691、768～793、943～947、1002～1040、1052～1077、1232～1248、および1298～1300位のアミノ酸残基、あるいはその対応するアミノ酸位からなる群より選択される領域を含む、実施形態138の方法。
実施形態１４０
デアミナーゼバリアントが、Cas9参照配列における番号付けで、アミノ酸位768～769、791～792、792～793、1015～1016、1022～1023、1026～1027、1029～1030、1040～1041、1052～1053、1054～1055、1067～1068、1068～1069、1247～1248、または1248～1249、あるいはその対応するアミノ酸位の間に挿入されている、実施形態136の方法。
実施形態１４１
デアミナーゼバリアントが、Cas9参照配列における番号付けで、アミノ酸位768～769、792～793、1022～1023、1026～1027、1040～1041、1068～1069、または1247～1248、あるいはその対応するアミノ酸位の間に挿入されている、実施形態136の方法。
実施形態１４２
デアミナーゼバリアントが、Cas9参照配列における番号付けで、アミノ酸位1016～1017、1023～1024、1029～1030、1040～1041、1069～1070、または1247～1248、あるいはその対応するアミノ酸位の間に挿入されている、実施形態136の方法。
実施形態１４３
アデノシンデアミナーゼバリアントが、表13Aに同定される遺伝子座で、Cas9ポリペプチド内に挿入されている、実施形態136の方法。
実施形態１４４
N末端断片が、Cas9参照配列のアミノ酸残基1～529、538～568、580～685、692～942、948～1001、1026～1051、1078～1231、および/または1248～1297、あるいはその対応する残基を含む、実施形態136の方法。
実施形態１４５
C末端断片が、Cas9参照配列のアミノ酸残基1301～1368、1248～1297、1078～1231、1026～1051、948～1001、692～942、580～685、および/または538～568、あるいはその対応する残基を含む、実施形態136の方法。
実施形態１４６
Cas9ポリペプチドが改変Cas9であり、改変PAMまたは非G PAMに対する特異性を有する、実施形態134～145のいずれか一項の方法。
実施形態１４７
Cas9ポリペプチドがニッカーゼであるかまたはCas9ポリペプチドがヌクレアーゼ不活性である、実施形態134～146のいずれか一項の方法。
実施形態１４８
Cas9ポリペプチドが改変SpCas9ポリペプチドである、実施形態134～145のいずれか一項の方法。
実施形態１４９
改変SpCas9ポリペプチドが、アミノ酸置換D1135M、S1136Q、G1218K、E1219F、A1322R、D1332A、R1335E、およびT1337R（SpCas9-MQKFRAER）であり、改変PAM 5’-NGC-3’に対する特異性を有する、実施形態148の方法。
実施形態１５０
融合タンパク質またはABE8がCas12ポリペプチドを含む、実施形態105～133のいずれか一項の方法。
実施形態１５１
アデノシンデアミナーゼバリアントが、Cas12ポリペプチド内に挿入されている、実施形態150の方法。
実施形態１５２
Cas12ポリペプチドが、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12g、Cas12h、またはCas12iである、実施形態150または実施形態151の方法。
実施形態１５３
アデノシンデアミナーゼバリアントが、アミノ酸位:
a) BhCas12bの153～154、255～256、306～307、980～981、1019～1020、534～535、604～605、もしくは344～345、またはCas12a、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12g、Cas12h、もしくはCas12iの対応するアミノ酸残基;
b) BvCas12bの147～148、248～249、299～300、991～992、もしくは1031～1032、またはCas12a、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12g、Cas12h、もしくはCas12iの対応するアミノ酸残基; あるいは
c) AaCas12bの157～158、258～259、310～311、1008～1009、もしくは1044～1045、またはCas12a、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12g、Cas12h、もしくはCas12iの対応するアミノ酸残基の間に挿入されている、実施形態151または実施形態152の方法。
実施形態１５４
アデノシンデアミナーゼバリアントが、表13Bに同定される遺伝子座で、Cas12ポリペプチド内に挿入されている、実施形態151の方法。
実施形態１５５
Cas12ポリペプチドがCas12bである、実施形態154の方法。
実施形態１５６
Cas12ポリペプチドが、BhCas12bドメイン、BvCas12bドメイン、またはAACas12bドメインを含む、実施形態154の方法。
実施形態１５７
ガイドRNAがCRISPR RNA（crRNA）およびトランス活性化crRNA（tracrRNA）を含む、実施形態105～156のいずれか一項の方法。
実施形態１５８
対象が哺乳動物またはヒトである、実施形態105～157のいずれか一項の方法。
実施形態１５９
実施形態59または実施形態60の塩基編集システム、および薬学的に許容され得るキャリアー、ビヒクル、または賦形剤を含む薬学的組成物。
実施形態１６０
実施形態61～79のいずれか一項の細胞、および薬学的に許容され得るキャリアー、ビヒクル、または賦形剤を含む薬学的組成物。
実施形態１６１
実施形態59または実施形態60の塩基編集システムを含むキット。
実施形態１６２
実施形態61～79のいずれか一項の細胞を含むキット。
実施形態１６３
さらに、使用のための説明書を含むパッケージ挿入物を含む、実施形態161または実施形態162のキット。
実施形態１６４
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメイン、および
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
のアミノ酸82位または166位で改変を含むアデノシンデアミナーゼバリアントを含む少なくとも1つの塩基エディタードメイン、ならびにガイドRNAを含む塩基エディターシステムであって、前記ガイドRNAが前記塩基エディターをターゲティングしてアルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPの改変をもたらす、前記塩基エディターシステム。
実施形態１６５
アデノシンデアミナーゼバリアントが、V82S改変および/またはT166R改変を含む、実施形態164の塩基エディターシステム。
実施形態１６６
アデノシンデアミナーゼバリアントが、以下の改変: Y147T、Y147R、Q154S、Y123H、およびQ154Rの1つ以上をさらに含む、実施形態165の塩基エディターシステム。
実施形態１６７
塩基エディタードメインが、野生型アデノシンデアミナーゼドメインおよびアデノシンデアミナーゼバリアントを含むアデノシンデアミナーゼヘテロダイマーを含む、実施形態165または166の塩基エディターシステム。
実施形態１６８
アデノシンデアミナーゼバリアントが、全長TadA8に比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19、または20のN末端アミノ酸残基が欠けている一部切除TadA8である、実施形態164～167のいずれか一項の塩基エディター。
実施形態１６９
アデノシンデアミナーゼバリアントが、全長TadA8に比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19、または20のC末端アミノ酸残基が欠けている一部切除TadA8である、実施形態164～167のいずれか一項の塩基エディター。
実施形態１７０
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変Staphylococcus aureus Cas9（SaCas9）、Streptococcus thermophilus 1 Cas9（St1Cas9）、改変Streptococcus pyogenes（SpCas9）、またはそのバリアントである、実施形態164～169のいずれか一項の塩基エディターシステム。
実施形態１７１
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性または非G PAMに対する特異性を有するSpCas9のバリアントである、実施形態170の塩基エディターシステム。
実施形態１７２
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインがヌクレアーゼ不活性Cas9である、実施形態170の塩基エディターシステム。
実施形態１７３
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインがCas9ニッカーゼである、実施形態170の塩基エディターシステム。
実施形態１７４
1つ以上のガイドRNA、ならびに以下の配列：
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
のアミノ酸82位および/または166位で改変を含むアデノシンデアミナーゼバリアントを含む少なくとも１つの塩基エディタードメインを含む融合タンパク質を含む、塩基エディターシステム。
実施形態１７５
実施形態164～174のいずれか一項の塩基エディターシステムを含む細胞。
実施形態１７６
細胞がヒト細胞または哺乳動物細胞である、実施形態175の細胞。
実施形態１７７
細胞がex vivo、in vivo、またはin vitroである、実施形態175の細胞。
［他の実施形態］
上記の説明から、多様な用途および条件に取り入れるために、本明細書に記述する本発明に変形および修正を加えることができることが明らかであろう。そのような実施形態もまた、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
Claims (30)
- アルファ-1アンチトリプシン不全と関連する一塩基多型（SNP）を含むアルファ-1アンチトリプシンポリヌクレオチドを編集するin vitroまたはex vivoの方法であって、
該ポリヌクレオチドを、
1つ以上のガイドRNA、および
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインと、以下のTadA*7.10アミノ酸配列MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列であって前記TadA*7.10アミノ酸配列と比較してさらにアミノ酸147位にアルギニンまたはトレオニンを含有するアミノ酸配列を含むアデノシンデアミナーゼバリアントを含む少なくとも1つの塩基エディタードメインとを含む塩基エディター
に接触させる工程を含み、前記ガイドRNAが、前記塩基エディターをターゲティングしてアルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPの改変をもたらす、前記方法。 - （ｉ）アデノシンデアミナーゼバリアントがアミノ酸82位および166位に改変を含むか、または
（ｉｉ）アデノシンデアミナーゼバリアントがV82S改変を含むか、または
（ｉｉｉ）アデノシンデアミナーゼバリアントがT166R改変を含むか、または
（ｉｖ）アデノシンデアミナーゼバリアントがV82SおよびT166R改変を含む、
請求項１に記載の方法。 - アデノシンデアミナーゼバリアントが、以下の改変：
（ｉ）I76Y、Q154S、Y123H、およびQ154R、もしくは
（ｉｉ）Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; およびI76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154R
の1つ以上をさらに含み、または、
塩基エディタードメインがアデノシンデアミナーゼバリアントモノマーを含み、アデノシンデアミナーゼモノマーがV82SおよびT166R改変を含む、
請求項１または２に記載の方法。 - 塩基エディタードメインが、野生型アデノシンデアミナーゼドメインおよび前記アデノシンデアミナーゼバリアントを含むアデノシンデアミナーゼヘテロダイマーを含む、請求項１に記載の方法。
- アルファ-1アンチトリプシン不全と関連する一塩基多型（SNP）を含むアルファ-1アンチトリプシンポリヌクレオチドを編集するin vitroまたはex vivoの方法であって、アルファ-1アンチトリプシンポリヌクレオチドを、
1つ以上のガイドRNA、および
以下の配列：
（太字配列はCas9由来の配列を示し、斜字配列はリンカー配列を示し、下線配列は、二部分核局在化配列を示す）を含むポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインと、以下のTadA*7.10アミノ酸配列
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列であって前記TadA*7.10アミノ酸配列と比較してさらにアミノ酸147位にアルギニンまたはトレオニンを含有するアミノ酸配列を含むアデノシンデアミナーゼバリアントを含む少なくとも1つの塩基エディタードメインとを含む融合タンパク質
に接触させる工程を含む、前記方法。 - アデノシンデアミナーゼバリアントが、
（ｉ）アミノ酸82位および166位で改変を含むか、または
（ｉｉ）V82S改変を含むか、または
（ｉｉｉ）T166R改変を含むか、または
（ｉｖ）V82SおよびT166R改変を含む、
請求項５に記載の方法。 - アデノシンデアミナーゼバリアントが、以下の改変：I76Y、Q154S、Y123H、およびQ154Rの1つ以上をさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
- アデノシンデアミナーゼバリアントが、以下の改変の組合せ：Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R; またはI76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154Rのうちの１つを含む、請求項５に記載の方法。
- （ｉ）アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPでのA・TからG・Cへの改変が、アミノ酸342位のグルタミン酸をリジンに変化させるか、または
（ｉｉ）アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPが、アミノ酸342位でリジンを有するアルファ-1アンチトリプシンポリペプチドの発現を生じるか、または
（ｉｉｉ）アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPが、グルタミン酸をリジンで置換する、
請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。 - ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインがヌクレアーゼ不活性またはニッカーゼバリアントであるか、または、
ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインがアミノ酸置換D10Aまたはその対応するアミノ酸置換を含むニッカーゼバリアントである、
請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。 - 請求項１～１０のいずれか一項に記載の塩基エディターと、
5′-ACCAUCGACAAGAAAGGGACUGA GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′；
5′-CCAUCGACAAGAAAGGGACUGA GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′；
5′-CAUCGACAAGAAAGGGACUGA GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′；
5′-AUCGACAAGAAAGGGACUGA GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′；
5′-UCGACAAGAAAGGGACUGA GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′；および
5′-CGACAAGAAAGGGACUGA GUUUUAGAGC UAGAAAUAGC AAGUUAAAAU AAGGCUAGUC CGUUAUCAAC UUGAAAAAGU GGCACCGAGU CGGUGCUUUU-3′
からなる群より選択される核酸配列を含むガイドRNAと
を含む、塩基エディターシステム。 - 細胞またはその前駆細胞内に：
塩基エディターまたは前記塩基エディターをコードするポリヌクレオチドであって、前記塩基エディターが、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインと、請求項１～１１のいずれか一項に記載されるアデノシンデアミナーゼバリアントを含む塩基エディタードメインとを含む、前記塩基エディターまたはポリヌクレオチド；および
塩基エディターをターゲティングしてアルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす、1つ以上のガイドポリヌクレオチド
を導入することによって産生された、
細胞。 - （ｉ）産生された細胞が肝細胞またはその前駆細胞であり；および／または
（ｉｉ）細胞がアルファ-1アンチトリプシン不全を有する対象に由来するものであり；および／または
（ｉｉｉ）細胞が哺乳動物細胞またはヒト細胞であり；および／または
（ｖｉ）アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPのA・TからG・Cへの改変が、アルファ-1アンチトリプシンポリペプチドにおいてグルタミン酸をリジンに変化させ；および／または
（ｖ）アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPが、アミノ酸42位でリジンを有するアルファ-1アンチトリプシンポリペプチドの発現を生じるか、もしくはアルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPがグルタミン酸をリジンで置換する、
請求項１２に記載の細胞。 - 対象において、アルファ-1アンチトリプシン不全を治療する方法における使用のための、請求項１２または１３に記載の細胞を含む薬学的組成物であって、前記方法は前記対象に請求項１２または１３に記載の細胞を投与する工程を含む、薬学的組成物。
- 前記細胞が前記対象に対して自己または同種である、請求項１４に記載の薬学的組成物。
- 肝細胞またはその前駆細胞を産生する方法であって：
（a）アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPを含む肝細胞または肝細胞前駆細胞内に、
塩基エディター、または前記塩基エディターをコードするポリヌクレオチドであって、前記塩基エディターが、ポリヌクレオチドプログラム可能ヌクレオチド結合ドメインと、請求項１～１３のいずれか一項に記載のアデノシンデアミナーゼバリアントを含む塩基エディタードメインとを含む、前記塩基エディターまたはポリヌクレオチド；ならびに
1つ以上のガイドポリヌクレオチドであって、前記塩基エディターをターゲティングしてアルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPのA・TからG・Cへの改変をもたらす、前記ガイドポリヌクレオチド
を導入する工程と；
（b）肝細胞前駆細胞に関して、肝細胞前駆細胞を肝細胞に分化させる工程
とを含む、前記方法。 - 対象においてアルファ-1アンチトリプシン不全（A1AD）を治療するための方法における使用のための薬学的組成物であって、Cas9またはCas12ポリペプチド内に挿入されたアデノシンデアミナーゼバリアントを含む塩基エディタードメインを含む融合タンパク質、あるいはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと；この融合タンパク質をターゲティングしてA1ADと関連する一塩基多型（SNP）のA・TからG・Cへの改変をもたらす、1つ以上のガイドポリヌクレオチドとを含み、
前記アデノシンデアミナーゼバリアントは、以下のTadA*7.10アミノ酸配列
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列であって前記TadA*7.10アミノ酸配列と比較してさらにアミノ酸147位にアルギニンまたはトレオニンを含有するアミノ酸配列を含む、
薬学的組成物。 - 前記融合タンパク質がアデノシン塩基エディター8（ABE8）を含む、請求項１７に記載の薬学的組成物。
- （ｉ）ABE8が、ABE8.1-m、ABE8.2-m、ABE8.8-m、ABE8.9-m、ABE8.10-m、ABE8.11-m、ABE8.12-m、ABE8.13-m、ABE8.15-m、ABE8.16-m、ABE8.19-m、ABE8.20-m、ABE8.21-m、ABE8.24-m、ABE8.1-d、ABE8.2-d、ABE8.8-d、ABE8.9-d、ABE8.10-d、ABE8.11-d、ABE8.12-d、ABE8.13-d、ABE8.15-d、ABE8.16-d、ABE8.19-d、ABE8.20-d、ABE8.21-d、またはABE8.24-dより選択され；および／または
（ｉｉ）アデノシンデアミナーゼバリアントが、I76Y、V82S、T166R、Q154S、Y123H、および／またはQ154R改変を含み；および／または
（ｉｉｉ）アデノシンデアミナーゼバリアントが以下の改変の組合せ：Y147T + Q154R; Y147T + Q154S; Y147R + Q154S; V82S + Q154S; V82S + Y147R; V82S + Q154R; V82S + Y123H; I76Y + V82S; V82S + Y123H + Y147T; V82S + Y123H + Y147R; V82S + Y123H + Q154R; Y147R + Q154R +Y123H; Y147R + Q154R + I76Y; Y147R + Q154R + T166R; Y123H + Y147R + Q154R + I76Y; V82S + Y123H + Y147R + Q154R;およびI76Y + V82S + Y123H + Y147R + Q154Rのうちの1つを含む、
請求項１７または１８に記載の薬学的組成物。 - （ｉ）A1ADと関連するSNPのA・TからG・Cへの改変が、アミノ酸342位でのグルタミン酸をリジンに変化させるか、または
（ｉｉ）A1ADと関連するSNPが、アミノ酸342位でリジンを有するアルファ-1アンチトリプシンポリペプチドの発現を生じるか；または
（ｉｉｉ）アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPが、グルタミン酸をリジンで置換するか；または
（ｉｖ）SNP標的核酸塩基の脱アミノ化が、標的核酸塩基を野生型核酸塩基で、または非野生型核酸塩基で置換し、標的核酸塩基の脱アミノ化がA1ADの症状を軽減する、
請求項１７～１９のいずれか一項に記載のの薬学的組成物。 - 請求項１１に記載の塩基エディターシステムを含む薬学的組成物であって、薬学的に許容され得るキャリアー、ビヒクル、または賦形剤をさらに含む、薬学的組成物。
- 請求項１２または１３に記載の細胞を含む薬学的組成物であって、薬学的に許容され得るキャリアー、ビヒクル、または賦形剤をさらに含む、薬学的組成物。
- 請求項１１に記載の塩基エディターシステムを含むキット。
- 請求項１２または１３に記載の細胞を含むキット。
- ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインと、以下のTadA*7.10アミノ酸配列
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列であって前記TadA*7.10アミノ酸配列のアミノ酸147位にアルギニンまたはトレオニンをさらに含有するアミノ酸配列を含むアデノシンデアミナーゼバリアントを含む少なくとも1つの塩基エディタードメイン、
ならびにガイドRNAを含む、塩基エディターシステムであって、前記ガイドRNAが前記塩基エディターをターゲティングしてアルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPの改変をもたらす、前記塩基エディターシステム。 - （ｉ）アデノシンデアミナーゼバリアントが、V82S改変および／またはT166R改変を含むか、または
（ｉｉ）アデノシンデアミナーゼバリアントが、V82S改変および／またはT166R改変を含み、かつ、アデノシンデアミナーゼバリアントが、以下の改変：I76Y、Q154S、Y123H、およびQ154Rのうちの1つ以上をさらに含む、
請求項２５に記載の塩基エディターシステム。 - （ｉ）塩基エディタードメインが、野生型アデノシンデアミナーゼドメインおよび前記アデノシンデアミナーゼバリアントを含むアデノシンデアミナーゼヘテロダイマーを含み；および／または
（ｉｉ）アデノシンデアミナーゼバリアントが、全長TadA8に比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19、または20のN末端アミノ酸残基が欠けている一部切除TadA8であり；および／または
（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変Staphylococcus aureus Cas9（SaCas9）、Streptococcus thermophilus 1 Cas9（St1Cas9）、改変Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）、またはそのバリアントであり；および／または
（ｉｖ）ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変Staphylococcus aureus Cas9（SaCas9）、Streptococcus thermophilus 1 Cas9（St1Cas9）、改変Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）、またはそのバリアントであり、かつ、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインが、改変されたプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性または非G PAMに対する特異性を有するSpCas9のバリアントであるか、または、ポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインがヌクレアーゼ不活性Cas9であるかもしくはCas9ニッカーゼである、
請求項２６に記載の塩基エディターシステム。 - アルファ-1アンチトリプシン不全と関連するSNPを含有するアルファ-1アンチトリプシン核酸配列に相補的な核酸配列を含む1つ以上のガイドRNA、および
以下の配列：
（太字配列はCas9由来の配列を示し、斜字配列はリンカー配列を示し、下線配列は二部分核局在化配列を示す）を含むポリヌクレオチドプログラム可能DNA結合ドメインと、以下のTadA*7.10アミノ酸配列
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD
に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列であって前記TadA*7.10アミノ酸配列のアミノ酸147位にアルギニンまたはトレオニンをさらに含有するアミノ酸配列を含むアデノシンデアミナーゼバリアントを含む少なくとも１つの塩基エディタードメインとを含む融合タンパク質
を含む、塩基エディターシステム。 - 請求項２５～２８のいずれか一項に記載の塩基エディターシステムを含む細胞。
- （ｉ）前記細胞がヒト細胞または哺乳動物細胞であるか、または
（ｉｉ）前記細胞がex vivo、in vivo、またはin vitroである、
請求項２９に記載の細胞。
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