JPH06500322A - 慢性骨髄性白血病の治療剤としての、ソラーレンと結合したメチルりん酸オリゴヌクレオチド - Google Patents

慢性骨髄性白血病の治療剤としての、ソラーレンと結合したメチルりん酸オリゴヌクレオチド

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JPH06500322A
JPH06500322A JP3514157A JP51415791A JPH06500322A JP H06500322 A JPH06500322 A JP H06500322A JP 3514157 A JP3514157 A JP 3514157A JP 51415791 A JP51415791 A JP 51415791A JP H06500322 A JPH06500322 A JP H06500322A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 慢性骨髄性白血病の治療剤としての、ソラージンと結合したメチルりん酸オリゴ ヌクレオチド 技術分野 ソラージンと結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）　Ｌ／たメチルりん酸オリゴマーは１ 本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡと配列特異的な方法でクロスリンキングすることができ ることが報告されている［ミラーら（Ｐ、　Ｓ、　Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、 　）　、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１９８８．　ｖｏｌ、　２７D　ｐ。
３１９７；　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１９８８．　ｖｏｌ、　２７．　ｐ 、　９１１３；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　A　１９８８．　Ｖ Ｏｌ、　１６゜ ｐ、　１０６９７；　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１９ ９０．　ｖｏｌ、　１．　ｐ、　８２］　ｏこれらの化合物■■■ の合成経路は３−［（２−アミノエチル）カルバモイル］ソラージンまたは４゛ −［（Ｎ−（アミノエチル）アミノ）メチル］　−４，５’　、８−トリメチル ソラージンと、５′　−りん酸形のメチルりん酸オリゴマーとを、水および可溶 性カーポジイミドの存在下で反応させることからなる。これによりソラージン部 分とオリゴマーとの間のホスホラミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ） 結合が生じる。ミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ）の方法が採用した化学の性質により、 ソラージンの結合は、オリゴマーの５°−末端にしか報告されていない。
ソラージンー結合メチルりん酸オリゴマーの標的ＤＮＡまたはＲＮＡとのクロス リンキングは３６５ｎｍ照射の間に起きる［総説、キメラら（Ｃ，Ｄ、　Ｃ１ｍ １ｎｏ　ｅｔａｌ、）、＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｓｈｅｍ、　、　１９８５ ．　ｖｏｌ、　５４．　ｐ、　１１５１）。簡単に言えば、ソラージンの４’、 ５’（フラン側）および／または３，４（ピロン側）の炭素２重結合がピリミジ ンと環付加反応することにより／クロブタン結合が形成され得る。これらの結合 は２６０ｎｍ照射の下で可逆的である。
通常のオリゴヌクレオチドのりん酸ジエステルのソラージン複合体も記載されて いる。自動合成法でオリゴマーの５゛末端にカップリングし得る、４゛　−ヒド ロキシメチル−４，５°、８−トリメチルソラージン類似のホスホラミダイト試 薬が開発された［ビールス（Ｕ、　Ｐｉｅｌｅｓ）およびイングリッシュ［（Ｕ 、Ｅｎｇｌｉｓｈ）　。
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１９８９．ｖｏｌ、　１７．ｐ、２ ８５］　ｏ水溶性カーポジイミドを用いて５°　りん酸化オリゴマーと結合させ るため、−級アミン内で終了する、開裂可能なジスルフィド結合をもった４′− （アミノメチル）−４，５°、８−トリメチルソラーリン類似体が合成された［ テアラ（Ｊ、　Ｔｅａｒａ）　およびウオジンツァイン（Ｐ、　ｆｏｌｌｅｎｚ ｅｉｎ）　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　１９９０．　ｖｏ ｌ、　１ｇ、ｐ、８５５］　ｏこれ轤■獅■ は、いずれもそれらがソラージンの、オリゴマーの５゛末端への結合のみを可能 にするという欠点を有する。またデオキシアデノシンのＣ８位にソラージン類似 体を結合させてオリゴヌクレオチドに導入するためのホスホラミダイト試薬に変 換している［ビールスら（Ｕ、　Ｐｉｅｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　１９８９．　ｖａｔA　１７゜ ｐ、　８９６７］。後者の試薬ではアデニン位への結合のみが可能であり、塩基 対形成を妨害する可能性がある。
最初にがんに関連した染色体の特異的な異常として発見されたのは、発見地に由 来してフィラデルフィア染色体（Ｐｈりと命名された異常である。この小さい染 色体は、無制御な骨髄幹細胞の増殖を伴う、不変の致死性かんである慢性骨髄性 白血病（ＣＭＬ）患者の、少なくとも９０％に報告されている。この染色体異常 はＡＮＬＬ　（急性非リンパ性白血病）およびＡＬＬ　（急性リンパ性白血病） 等の他の型の白血病の患者にも見いだされている。ＰｈＩは９番染色体に関連す る２２番染色体の相互転座によって誘発される（染色体２２番のロングアームの 一部が９番染色体に転座し、９番染色体のロングアームの先端の小さい断片が２ ２番染色体に転座している）。かくして２つの異常な染色体（Ｐｈ’および９ｑ ゛）が生成される。Ｐｈ１の生成には２つの染色体の切断が必要である。１つは ２２番染色体の、ｂｃｒ遺伝子内のブレイクポイントクラスター領域（”ｂｃｒ “）と呼ばれる領域で起こる。第２の開裂は９番染色体のａｂｌ遺伝子の５′側 半分で起こる。９番染色体と２２番染色体とが融合してＰｈｌが形成されると、 ｂａｒ遺伝子の５°側半分は、ａｂｌの５°側で終結し、２つの遺伝子は同じ転 写方向性を有する。両遺伝子を含む大きい前駆体ＲＮＡがスプライシングされｂ ｃｒ遺伝子の５′工クソン群がｃ−ａｂｌの中央の特定のエクソンと結合する。
ａｂｌ遺伝子のアミノ酸配列は腫瘍遺伝子のチロシンキナーゼ類と相同性を有す る。正常な原腫瘍遺伝子（プロトオンコゲン）、ｃ−ａｂｌの生成物に含まれる チロシンキナーゼ活性は通常、Ｎ−末端に見いだされるペプチド配列のダウンレ ギュレーションを受けている。このペプチドを除去し、ｂｃｒペプチド片で置き 換えると酵素が活性化形に固定される。ＣＭＬ細胞に見いだされるｂｃｒ−ａｂ ｌ融合タンパク質であるＰ２１０は検出可能なチロシンキナーゼ特異的キナーゼ 活性を有する。ｂｃｒ遺伝子がａｂｌの活性化になんらかの役割を果していると 仮定された。さらに、ｂｃｒのａｂｌへの融合は、過剰生産され得る、正常でな いａｂ１融合タンパク質を惹起し、したがって、そのような細胞のがん化に関与 し得る。
Ｐ２１０””″ｂ１タンパク質をコードするレトロウィルスに感染したマウスは 、ヒトの慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）と極めて類似した骨髄増殖症候群を発現し 、このことはＰ　２１０　ｂｅ””’発現がＣＭＬを誘発し得ることを示唆する ものである［ダレ−ら（Ｄａｌｅｙ、Ｇ、Ｏ，ｅｔ　ａｌ、）　、　５ｃｉｅｎ ｃｅ　２４７：８２４−８３０（１９９０）コ。
発明の要約 １つの側面として、本発明は、４°−アミノメチル、４．　５’　、８−１−リ メチルソラージン類似体を、反応性１級アミノ基を有する第２の分子種と好都合 に力・ツブリングさせるための試薬を目的とする。本発明者らは該試薬が、リン 酸ジエステルオリゴマー、および、とりわけアルキル−およびアリール−りん酸 オリゴマーを含むソラージン結合オリゴマーの製造に適することを見いだした。
好ましいアルキル−およびアリール−りん酸オリゴマーにはメチルりん酸オリゴ マーが含まれる。本発明の好ましい態様では、これらのオリゴマーは、本明細書 ならびに本願出願人による出願中の特許出願「オリゴマーのための改良された非 −ヌクレオチド基盤リンカ−試薬（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｔ ｉｄｅ−ｂａｓｅｄ　Ｌｉｎｋｅｒ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ）Ｊに記載の非ヌクレオ チド試薬を用い、反応性アミンを含むように修飾されている。
１つの側面として、本発明のソラージン標識化剤は４°−アミノメチル−４゜５ °、８−トリメチルｐ−ソラーシンのアミノ基に、側鎖を介して結合したＮ−ヒ ドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化エステル部分を含む。ＮＨ３活性化エ ステルの機能性については１級アミンを含む生物分子に化学部分を結合させるこ とが報告されている。本発明はまた新規な本発明のソラージン試薬の新規な製造 方法をも提供するものである。
本発明はまた、このソラージン試薬と１級アミンリンカ−で修飾したアルキル− およびアリールりん酸オリゴマーとをカップリング反応させる方法をも提供する 。一度カノブリングすると、生成したソラージンー結合オリゴマーは、逆相高速 液体クロマトグラフィーにより、未反応オリゴマーから容易に単離される。
本発明は、縮合剤として、既存のカーポジイミド（不都合にも、ヌクレオチド塩 基との副反応で好ましくない副生成物を与える）を用いる方法に比較して、好都 合な、ソラージンのオリゴマーへの結合法を提供する。ボッシュら（Ｇｈｏｓｈ 　Ｓ。
Ｓ、）　、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５（１３）：５３５３−５ ３７２（１９８７）参照。
従って、本発明では、その１側面として、Ｐ　２１０　ｂｅ”ゝｌの発現を干渉 することを目的とするものであり、すなわち、ソラージンと結合したオリゴマー をｂｃｒ−ａｂｌｍＲＮＡにハイブリダイズさせ、次いでオリゴマーをｍＲＮＡ とクロスリンキングさせることによりＰ２１０ｂｃ””’を介する形質転換およ びＣＭＬ−状態の誘導を妨害し得るものである。正常なａｂｌ遺伝子の領域に相 補的なオリゴマーは、ｂｃｒ／ａｂｌに相補的なオリゴマー、および、特にｂｃ ｒ／ａｂ１連結部位に相補的なオリゴマーと同様、ＣＭＬ細胞内のＰ２１０チロ シンキナーゼ活性のダウンレギュレーションに有用であり得る。フィラデルフィ ア染色体のキメラｂｃｒ／ａｂ１ｍＲＮＡのｂｃｒ／ａｂｌ領域に相補的なこれ らのオリゴマー配列が合成された。ｍＲＮＡのそれと相補的なソラージン標識オ リゴマーの複合体はこれらオリゴヌクレオチドのｍＲＮＡの翻訳への阻害効果、 およびその対応するＰ２１０チロシンキナーゼへの発現の阻害効果を促進する。
この阻害は慢性骨髄性白血病患者の異常な細胞のダウンレギュレーションを目的 とする。
好ましい側面では、ｂｃｒ／ａｂｌ、好ましくはｂｃｒ／ａｂｌ連結部位に相補 的なオリゴマー、そして選択的にキメラｂｃ　ｒ／ａｂ１ｍＲＮＡとハイブリダ イズするオリゴマーを選択する。そのようなオリゴマーはそれがキメラｂｃｒ／ ａｂ１ｍＲＮＡのみとハイブリダイズし正常なａｂ１ｍＲＮＡ配列とはハイブリ ダイズしないよう、十分な長さを有する。
定義 本明細書中、そうでないことが明記されていない限り、下記の語句は以下の意味 を有する。
「ヌクレオシド」という語句はヌクレオシド単位を含み、これらの語句は相互変 換可能に用いる。
「ヌクレオチド」という語句はりん酸基、５炭糖、および窒素含有塩基からなる 核酸のサブユニットを意味する。ＲＮＡにおいては５炭糖はリポースである。
ＤＮＡでは、それは２−デオキシリボースである。この語句はまた、そのような サブユニットの類似体をも含む。
「ヌクレオチドマルチマー（多量体）」という語句はりん酸ジエステル結合によ って結合したヌクレオチド鎖またはその類似体を指す。
「オリゴヌクレオチド」という語句は、通常、長さ約１０〜１００ヌクレオチド 長さのヌクレオチドマルチマーを指すが、長さ１００ヌクレオチド以上であって もよい。それらは通常、ヌクレオチドモノマーから合成されると考えられるが、 酵素的な手段で得られたものであってもよい。
「デオキシリボオリゴヌクレオチド」という語句はデオキシリボヌクレオチドモ ノマーを含むオリゴヌクレオチドである。
「ポリヌクレオチド」とは通常、約１００ヌクレオチドまたはそれ以上の長さの ヌクレオチドマルチマーを指す。これらは一般に、生物学的な起源または酵素的 な手段で得られる。
「ヌクレオチドマルチマープローブ」とは第２のヌクレオチドマルチマーに含ま れる標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列であり、通常、ポリヌク レオチドである。通常、プローブは好ましくは標的配列内の対応する塩基と相補 的であるように選択される。しかしながら、プローブ内の１またはそれ以上のヌ クレオチドは標的配列内の対応する塩基と相補的でないことが適切であるか、む しろ好ましい場合もある。
「非ヌクレオチドモノマーユニット」とはポリマーのハイブリダイゼーションに 重大な関与がないモノマー単位を指す。そのようなモノマー単位は、例えば、ヌ クレオチドとの重要な水素結合に関与してはならず、その成分として５ヌクレオ チド塩基またはその類似体の１つを有するものは除外されるであろう。
「ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマー」とはヌクレオチドおよび非ヌクレオ チドモノマー単位からなるポリマーを指す。
「オリゴヌクレオチド／非ヌクレオチドマルチマー」とは通常、１００ヌクレオ チド以下の合成マルチマーを指すが、２００ヌクレオチド以上を含むもの、およ び１またはそれ以上の非ヌクレオチドモノマー単位を含むものも包含してよい。
「モノマーユニット」とは、ポリマーに寄与する、本発明のヌクレオチド試薬ま たは非ヌクレオチド試薬のいずれかの単位を指す。
「ハイブリッド」とは相補的な塩基間におけるワトノンークリック塩基対形成に よって形成された複合体である。
「オリゴマー」という語句はオリゴヌクレオチド、非イオン性オリゴヌクレオシ ドアルキル−およびアリール−りん酸エステル類似体、オリゴヌクレオチドのホ スホロチオラート類似体、オリゴヌクレオチドのホスホアミダート類似体、中性 りん酸エステルオリゴヌクレオチド類似体、例えば、りん酸トリエステルや他の オリゴヌクレオチド類似体および他のオリゴヌクレオチド類似体および修飾した オリゴヌクレオチド等を指し、ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーも包含す る。この語句はまた、モノマー単位間またはそれ以上のりん酸結合がカルバマー ト結合等の非りん酸結合で置換されている、ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリ マーをも包含する。
「アルキル−またはアリール−りん酸化オリゴマー」という語句は、ホスホジエ ステル結合が少なくとも１つのアルキル−またはアリール−りん酸結合で置換さ れたヌクレオシド間（またはモノマー間）りん酸基結合を有するヌクレオチドオ リゴマー（またはヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマー）を指す。
「メチルりん酸オリゴマー」　（またはＭＰ−オリゴマー）という語句は、ホス ホンエステル結合が、少なくとも１つのメチルりん酸ヌクレオシド間結合で置換 された、ヌクレオシド間（またはモノマー間）りん酸基結合を有するヌクレオチ ドオリゴマー（またはヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマー）を指す。
本明細書に列挙した種々のオリゴマー配列のあるものでは、”ｐ”、例えばＡｐ 人におけるそれはりん酸ンエステル結合を指し、例えばＣ２Ｇにおけるπ”はメ チルりん酸結合を表す。他のあるものは、りん酸ジエステル結合を表すためにｐ または■を用いずに表現されている。そのような場合にはＡＴＣにおけるＡはＡ の３゛炭素とＴの５′炭素とのンエステル結合を表し、他方ＡＴＣまたはＡＴＣ におけるＡはＡの３°炭素とＴまたはＴの５°炭素とのメチルりん酸結合を表す 。
「悪影響を及ぼさない条件」という語句は（反応または合成）条件であって、実 質上、ポリマー骨格およびその糖、塩基、リンカ−アームおよび標識成分にとっ て不利益でなく、またモノマー試薬にとっても不利益でない条件を指す。当業者 はこれらの基準に適合する機能性、カップリング法、脱保護法および開裂条件を 容易に決定できる。
「税ブロッキング条件」という語句はリボースまたはデオキシリボースの５゛− 〇Ｈ基からプロ、キング（または保護）基を除去するために用いられる条件を指 す。
「脱保護条件」という語句はヌクレオシド塩基から保護基を除去するための条件 を指す。
「キメラｍＲＮＡＪという語句は、通常は隣接していないが、染色体転座、組換 え等によって一緒になった２またはそれ以上の遺伝子配列部分の転写物であるメ ッセンシャーＲＮ　Ａを指す。
「タンデムオリゴヌクレオチド」または「タンデムオリゴマー」という語句は標 的核酸配列の５′または３゛配列に対して相補的であり、標的配列に相補的なオ リゴマーと同時にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーを指 す。タンデムオリゴマーは、標的核酸配列の２次構造を減少する等によって、そ のようなオリゴマーが標的配列に接近し易（することにより、そのようなオリゴ マーと標的とのハイブリダイゼーションを向上させることができる。
図面の簡単な説明 図ＩＡ、ＩＢおよびＩＣは本発明のソラーリン試薬と複合体化し得るＦｍｏ　ｃ −保護リンカ−アームを有する非ヌクレオチド試薬を示す。
図２は、図ＩＢの非ヌクレオチド試薬の合成反応式を示す。
図３は、図ＩＣの非ヌクレオチド試薬の合成反応式を示す。
図４は、本発明の好ましいソラーリン試薬の合成反応式を示す。
図５は、好ましいソラーリン試薬と非ヌクレオチド試薬との複合体の合成反応式 を示す。
図６はｂｃｒ／ａｂ１ｍＲＮＡ部分に相補的な、ソラーリンと結合した非ヌクレ オチドモノマー単位を組み込むオリゴマーのヌクレオチド配列を示す。
本発明によれば、オリゴマーにソラーリン類似部分を結合させるための好ましい 試薬は、式： （式中、ｋは０から】２の整数、Ｅｓは核性部分と力・ツブ１）ングすることカ ベできる部分を表す） で示される化合物を含む。例えば、Ｅｓは容易に第２の核性部分で置換される脱 離基を有する活性化エステルを含んでいてもよＬ）。ｋが２〜６である化合物力 く好ましい。好ましいＥｓ基として、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活 性化エステル類、ハロアセチル、イソチオシアナート、マレイミド等力（例示さ れる。
特に好ましい化合物はｋが２である化合物である。特１こ好ましし＼Ｅｓ基の１ ．％Ｉｌま下記で示される。
これらの本発明のソラーリン試薬は実施例１から３に記載の方法で好都合に製造 することができる。１つの好ましい側面では、これらの゛ノラーリン試薬ｊ′！ 、従来の水溶性カーポジイミドの使用と異なり、ヌクレオチド塩基へのｉｌ１反 応カベ最／ＪＸ限にとどまる条件下、求核性の非ヌクレオチド試薬で修飾した第 １ノコ゛マーと好都合にカップリングする。
好ましいオリゴマー 本発明のソラーリン試薬と結合させる上で好ましいオリコ′マー１こ１嘘、実施 ！！Ａｌ４−１１および出願中の特許出願［オリゴマーのための改良されたＤｒ −ヌクレオチドに基づくリンカ−試薬（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅ ｏｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ　Ｌｉｎｋｅｒ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ）Ｊに記載の非ヌク レオチド試薬を用い、１またはそれ以上の非ヌクレオチドモノマー組み込むよう 修飾したオリゴマーが含まれる。特ζこ好ましＬ）オ’）ゴマ−１こ（ま、少な くとも１個のそのような非ヌクレオチドを組み込むアルキル−ルーりん酸ヌクレ オチドモノマーが含まれる。時に好ましＬ％アルキル−リール−りん酸オリゴマ ーにはメチルりん酸第１ノゴマーカく含まれる。
有利なアルキル−およびアリール−りん酸オリゴマーは、細胞によるオリゴマー の取り込みをより良くする非イオン性りん酸バックボーンを有する。また、その ようなアルキル−およびアリール−りん酸オリゴマーのモノマー間のアルキル− およびアリール−りん酸結合はヌクレアーゼに対して好都合に抵抗する。
オリゴマーがアルキル−またはアリール−りん酸オリゴマーを含有すると、それ は修飾したリボシル部分を有するヌクレオシドモノマー単位の導入に役立つ。
これらのアルキル−またはアリール−りん酸オリゴマーに２′−〇ーアルキルー および特に２′　−〇ーメチルー、リボシル部分を有するヌクレオチド単位を用 いることは、オリゴマーとそれに相補的な標的核酸配列とのハイブリダイゼーシ ョンの改良に役立つであろう。
これらのソラーリン試薬と共に用いるのに好ましい非ヌクレオチド試薬は非ヌク レオチドモノマー単位を含み、その骨格（スケルトン）は２から約１０個までの 炭素原子のバックボーンを持ち、該バックボーンは少な（とも１個のヌクレオチ ド／非ヌクレオチドポリマー内にカップリングしたとき純粋なキラル性を保持し 得る不斉炭素を少なくとも１個含有するものである。約３個の炭素原子のバック ボーンを有するスケルトンが好ましく、それは部分的には、そのようなバックボ ーンがデオキシリボース基の３−炭素間隔に類似するからである。
そのような好ましい非ヌクレオチド試薬群の１つは、オリゴマーに導入されたと きキラル的に純粋な、式： （式中、ＳＫＥＬは炭素数的１から約２０個のキラル的に純粋な非ヌクレオチド 骨格を表し、ここにーＮＨＬ，ＹおよびＺはＳＫＥＬの炭素原子と共宵結合的に 結合しており、Ｌはリガンド、Ｙは一ＣＨ２−、−〇−、−Ｓ−または−ＮＨ− 、そしてＺはーＯ−、−Ｓ−または−ＮＨ−を表す）で示される非ヌクレオチド モノマー単位を含む、キラル的に純粋な１１ヌクレオチド試薬を含有している。
好ましくは、ＳＫＥＬはさら１こＹおよびＺを分離する約１から約１０？［１の 炭素原子のバックボーンを含有する。これらの好ましｃ）ｓＫＥＬ群を組み込む 非ヌクレオチドモノマー単位の例には以下のもの力（含まれる。
（式中、Ｘ６基は独立して水素またはアルキルから選択され、同一または異なっ ていてよく、ｑおよびｒは独立してＯから１０までの整数から選択される。）即 ち、１つの態様では、これらの好ましい非ヌクレオチド試薬は一般式。
［式中、−Ｙ−Ｃｐ，は第１カツプリング基、−Ｚ−ＣＩ）２はプロ・ツクされ た第２カツプリング基、ここにり、ＹおよびＺは上記定義に従い、そして（ａ） 第１カツプリング基、　Ｙ　−　Ｃ　ｐ　１は下記の式：（式中、ＸＩはハロゲ ンまたは置換アミノ：Ｘ２は）１０ゲン、アミノまたは１換アミノ、またはＯ− ；Ｒ．はアルキル、所望により置換されていてもよいアルコキシまたは所望によ り置換されていてもよいアリールオキシ；そしてＲ，はアルキル所望により置換 されていてもよいアルコキン、所望により置換されて０てもよ（為アリールオキ シ、またはＸ２がＱ−のとき、所望により水素；Ｕは酸素、硫黄またはイミノ、 Ｗはアルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アリー ルチオ、Ｓ−、Ｏ−、アミンまたは置換アミノ、そしてＶはアルコキン、アルキ ルチす、アミノまたは置換アミノを表す。）から選択される。
（ｂ）第２のブロックされたカップリング基−ＺＣｐｘにおいてＣｐｚは脱プロ ソキング条件下で開裂され第２カップリング基−ＸＨを回収し得るブロッキング 基を表し、Ｚは一〇−１−ＮＨ−または−Ｓ−を表す。］で示される。
好ましいものはアルキル−またはアリール−りん酸、特にメチルりん酸、モノマ ー単位間ジエステル結合を形成し得る非ヌクレオチド試薬なので、特に好ましい 非ヌクレオチド試薬は第１カツプリング基、−ｙｃｐ、ｂ＜、（ここに、Ｘ、は クロロまたは２級アミ人Ｒｓはアルキル：Ｘ２は置換アミノ、ハロゲンまたはＯ −、モしてＲ６はアルキルを表す）から選択される。］ で示される。
゛リガンド部分、Ｌは好ましくは機能的な部分または悪影響のない条件下で脱保 護され、ついで機能的な部分と結合し得る（悪影響のない条件下）、保護された 連結（リンキング）アームから選択される。
本発明の１つの好ましい面では、Ｌは保護基、Ｐｒ、またはソラーリンのような りロスリンキング剤等の、悪影響のない条件下で脱保護され、次いで機能的な部 分と結合し得るリンカ−アーム、または薬物担体分子を含む。好ましいリンカ− アームは以下の式： （式中、ｎおよびｍは独立して１から１５、好ましくは１から５までの整数、Ｐ ｒは悪影響のない条件下で脱保護され得る保護基を表す）で示されるものを１つ 含む。
特に好ましい非ヌクレオチド試薬の１群はアミノ酸スレオニンから導かれた骨格 を有する。これらの好ましい試薬は２個の不斉炭素を含む３−炭素バックボーン を有し、それら不斉炭素の各々はヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマーに導入 されたときキラル純粋性を保持している。加えて、スレオニンから導かれたバ・ ツクボーンを有するこれらの試薬は、１級および２級ヒドロキシル基を有し、そ れらは反応性の相違にもとづいて、次の保護、脱保護、ブロッキング、脱プロ・ ツキング、および誘導体化工程での選択性および高収率を可能にするので好都合 である。本発明の１つの好ましい態様では、第１カツプリング基は２級ヒドロキ シル基と会合し、第２のカップリング基は１級ヒドロキシル基と会合する。
このように、本発明の特に好ましい側面では、スレオニンに基づ（非ヌクレオチ ド試薬は以下の式： ［式中、＊Ｃはキラル的に純粋な不斉炭素であり、Ｒ１およびＲ２のいずれかは 水素であり、他は−ＮＨ−Ｌ、ここにＬは以下に定義するりガント部分である； Ｒ３およびＲ４の１方は水素であり、他は炭素原子数的１から約１０個の低級ア ルキル基であり、−Ｙ−Ｃｐ、は第１カツプリング基、−ＺＣｐ、はブロックさ れた第２カツプリング基を表す。） を有する。ただし、 （ａ）第１カツプリング基、　Ｙ　Ｃｐ＋　（ここにＹは−ＣＨ２−ｌ−５−１ −ＮＨ−または−〇−を表す）は、 （ここに、Ｘ、はハロゲンまたは置換アミン、Ｘ２はハロゲン、アミノまたは置 換アミノ、またはＯ−、Ｒ５はアルキル、所望により置換されていてもよいアル コキシまたは所望により１換されていてもよいアリールオキシ、モしてＲ６はア ルキル、所望により置換されていてもよいアルコキシ、所望により置換されてい てもよいアリールオキジ、またはＸ２がＯ−のとき、所望により水素、Ｔ：は酸 素または硫黄、Ｗはアルキル、アリール、アルコキン、了り−ルオキシ、アルキ ルチオ、アリールチオ、Ｏ＼Ｓ−、アミノまたは置換アミノ、そしてＶはアルコ キン、アルキルチオ、アミンまたは置換アミノを表す。）から選択され （ｂ）第２のブロックされたカップリング基−ＺＣｐ、においてＣＩ）２は脱プ ロ・ノキング条件下で開裂され、第２カップリング基−ＺＨを回収し得る保護基 を表し、Ｚは一〇−１−ＮＨ−または−Ｓ−を表す。］で示される。
リガンド部分、Ｌは好ましくは機能的な部分または悪影響のない条件下で脱保護 され、ついで機能的な部分と結合し得る（悪影響のない条件下）、保護された連 結（リンキング）アームから選択される。
本発明のソラーリン試薬と共に用いるのに好ましい非ヌクレオチド試薬はＣ２お よびＣ４リンカ−アームを有するものを含む。ソラーリンと結合した非ヌクレオ チド試薬がオリゴマーの内部配列に導入されると、リンカ−アームを有するＣ２ およびＣ４非ヌクレオチド試薬はクロスリンキングを光道すると思われる。ソラ ーリンと結合した非ヌクレオチド試薬がオリゴマーの３′末端または３′末端か らモノマー１個程度前に導入されると、Ｃ４リンカ−アームを有する非ヌクレオ チド試薬は相補的な核酸との有効なりロスリンキングに役立つ。
好ましいオリゴマーは、本発明のソラーリン試薬の１つが、非ヌクレオチドモノ マー単位の末端アミンと反応しくアミンの脱保護の後）、ソラーリンと結合した オリゴマーを与えるものである。ソラーリンと結合した非ヌクレオチドモノマー 単位と相補的な標的核酸とのクロスワンキングを促進するという観点から、好ま しいオリゴマーはソラーリンと結合した非ヌクレオチドモノマー単位が相補鎖の チミジン、ウリジンまたはシチジン塩基の側方または近くに導入されているか、 あるいは、相補鎖のチミジンまたはウリジン塩基との反応の便宜上、対応する非 センス鎖のアデニンまたはグアニン塩基の隣または近くに導入されていることが 好ましい。非ヌクレオチドモノマー単位が非センス鎖のアデニンおよびチミジン 塩基（５’　−３’　）の間に位置することがより好ましい。
即ち、好ましいオリゴマーは、上記構造の１つの非ヌクレオチドモノマー単位を 有し、適当なソラーリン試薬との反応の後、Ｌは、ｐｓ。
−Ｐｓ。
−Ｃ−（ＣＨ２１，−ＮＨ−Ｐｇ　、およびｏ　０ −Ｃ−（ＣＨ２）、−ＮＨ−Ｃ−（ＣＭ、）　ｌ、−ＮＨ−Ｐｓ（ここに、ｎお よびｍは独：して約１から約１５、好ましくは１から５までの整数、Ｐｓはソラ ーリン部分を含む） から選択されるものである。好ましくは、ソラーリン部分は式：（式中、ｋは０ から１２の整数を表す）で示される。
好ましくは、オリゴマーは約６から約２５ヌクレオチド、より好ましくは約１２ から約２０ヌクレオチドを含有する。そのようなオリゴマーは約１から約５まで の独立して選択される非ヌクレオチドモノマー単位を有する。約２０ヌクレオチ ド以上を含有するオリゴマーも使用可能であるが、より長い配列に関する相補性 が要求され、溶解性および標的核酸（例えばｍＲＮＡ）の２次構造の形成に抗し て、細胞膜透過を最大にするためには、より短いタンデムオリゴマーを用いるほ うが望ましい。
産業上の利用分野 本発明によれば、ソラーリンと結合した非ヌクレオチドモノマー単位を組み込む 、選択された標的核酸配列、ＲＮＡまたはＤＮＡと相補的なオリゴマーを合成す ることができる。標的核酸にソラーリンと結合したオリゴマーをハイブリダイズ させた後、ソラーリン部分を、環付加反応によって相補的な核酸の標的ピリミジ ン塩基とクロスリンキングさせる。そのようなオリゴマーと標的核酸とのクロス リンキングは核酸の転写または翻訳機能を妨害する。例えば、標的核酸がｍＲＮ Ａであれば、オリゴマーのｍＲＮＡへのクロスリンキングはその翻訳を妨げ、し たがって、それがコードするポリペプチドの発現を阻害する。さらに、そのよう なオリゴマーとｍＲＮＡとのクロスリンキングはアンチセンスオリゴマーの相補 的標的配列へのハイブリダイゼーションの阻害を増強し得る。
このように、本発明は、さらにアンチセンス鎖の、アンチセンスソラーリンー結 合オリゴマーを標的の相補核酸とハイブリダイゼーションさせ、ソラーリン部分 と相補的標的核酸配列とのクロスリンキングを惹起することにより、アンチセン スオリゴマーの核酸機能を干渉および／または阻害する効果を増強する方法を特 徴とする特に、これらのソラーリンー結合オリゴマーは、オリゴマーをｍＲＮＡ にハイブリダイゼーションさせ、次いで、ソラーリンとｍＲＮＡとのクロスリン キングを惹起してその翻訳を妨害することにより、ある種のｍＲＮＡにコードさ れているタンパク質の合成を阻害するために用い得る。
１つの応用では、フィラデルフィア染色体を有する細胞内に存在するキメラｍＲ ，ＮＡのｂｃｒおよびａｂｌ連結部に相補的なソラーリンと結合したオリゴマー を合成する。（異常な）フィラデルフィア染色体を生じる相互転座では、ｂｃｒ 遺伝子（９番染色体から）がｃ−ａｂｌ遺伝子（２２番染色体から）と並置され る。ｂｃｒ／ａｂｌ遺伝子のスプライシングでＰ２１０”’／”Ｉタンパク質を コードするキメラｍＲＮＡが生成する。フィラデルフィア染色体の存在およびそ れによるＰ　２１０　ｂｅ”ｂ＋の発現は、ヒトでは慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ ）　、動物（マウス）ではＣＭＬ様症状をもたらすことが見い出された。ソラー リンと結合したｂｃｒ／ａｂｌ連結部に相補的なオリゴマーは、キメラｍＲＮＡ とのみハイブリダイズするであろう。したがって、もしもソラーリンと結合した オリゴマーをまずｂｃｒ／ａｂｌキメラｍＲＮＡとハイブリダイズさせ、次いで 、ｍＲＮＡとクロスリンキングさせれば、Ｐ２１０ｂＣ””ｂ１タンパク質の発 現を阻害するであろう。
ｂｃｒ／ａｂｌ融合をもたらす転座はチロノンキナーゼをコードするｃ−ａｂｌ の５°末端を切除する。５°　ａｂｌ配列の除去の結果、この転座は、酵素のダ ウンレギュレーションを喪失させる。さらに、ｂｃｒプロモーターの存在のため に、Ｐ２１０タンパク質が過剰生産されるであろう。正常なａｂｌ領域に相補的 なオリゴマーはＰ２１０の過剰発現の防止に使用可能である。
本発明の理解を助けるために、以下に一連の実験の結果を示す実施例を示す。
本発明に関連する以下の実施例は、勿論、本発明を特に制限するものと考えるべ きでなく、現在針かっている、または将来開発される本発明の変法であって、当 業者の予測の範囲内であるものは、後に特許請求する本発明の範囲に含まれるも ４°−クロロメチル−４，５’、８−トリメチルソラーリンをアイサックスら（ Ｉｓｓａｃｓ）　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１６．　（１９７７）、　１ ０５８−１０６４）の方法にしたがって合成した。
この化合物３３０ｍｇを無水アセトニトリル１００ｍ１に溶解し、−１０℃に冷 却した。この溶液に飽和するまで乾燥アンモニアを吹き込んだ。冷浴を取り除き 、反応混合物を室温まで昇温させ、次いで、１夜、撹拌した。溶媒を減圧下に蒸 発させ、残渣をテトラヒドロフラン／アセトン（３：　１）８０＋＋＋１に溶解 し、濾過した。ろ液を乾燥し、上記標題の生成物３００ｍｇ（定量的）を得た。
４゛−アミノメチル−４，５’　、８−トリメチルソラーリン（３００ｍｇ）を 無水ピリジンと共沸させて乾燥し、乾燥ピリジン３０ｍ１に溶解した。この溶液 に無水コハク酸５００ｍｇとジメチルアミノピリジン５０ｍｇとを加え、室温で ３時間撹拌した。反応をＴＬＣで監視した。減圧下、ピリジンを蒸発させ、残渣 をジクロロメタン３０ｍ１に溶解し、メタノール５ｍｌを加えた。生成物はこの 時点で析出し始めた。さらに追加のジクロロメタン３０ｍ１を加え、２時間後に 結晶を収集した、上記生成物３７０ｍｇを得た。
４′−スクシンアミドメチル−４，５’、８−トリメチルソラーリン（１００ｍ ｇ）を無水ピリジンと共沸させて乾燥させた。乾燥した残渣を無水ジメチルホル ミアミド（２０ｍりと無水ジオキサン（２０１→に溶解した。この溶液に乾燥Ｎ −ヒドロキシスクシンイミド７００ｍｇを加え、無水ジオキサン中、２０％ジク ロロヘキシルカーボンイミド（ＤＣＣ）溶液２ｍｌを加えた。反応混合物を室温 で１夜撹拌した。反応混合物をろ過し、ジオキサン３０ｍ１で洗浄した。ろ液を 蒸発乾固し、残渣を酢酸エチル４０ｍ１中で５分間音波処理した。スラリー状の 沈殿をろ過し、上記生成物１１０ｍｇを得た。
実施例４　Ｌ−スレオニンメチルエステルの還元Ｌ−スレオニンメチルエステル （Ｓｉｇｍａから購入）をスタンフィールドら（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ）　（Ｊ、 　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、　（１９８１）、　４６．４７９９）の方法にしたがっ て還元した＋５００ｍ１容の３０フラスコに、Ｌ−スレオニンメチルエステル５ ｇと乾燥ＴＨＦ２０ＱｍＩとを混合し、Ｉ　Ｍ　Ｌ　ｉ　Ａ　Ｉ　Ｈ４溶液５０ ｍ１をアルゴン雰囲気下、撹拌しながら滴下した。次いで、反応混合物をＴＨＦ の沸点まで昇温させ、アルゴン雰囲気下、−夜還流させた。反応の終了は、シリ カゲル上ＴＬＣにがけ、ニンヒドリンで観察するよってモニターした。反応混合 物を５−１０℃に冷却し、０．２５ＭＮａＯＨ（１００１）を滴下して停止させ た。混合物を蒸発させて９０％以上のＴＨＦを除去し、ろ過を容易にするために 残渣をジメチルホルムアミド１００ｍ１で希釈した。混合物をワットマン＃１ろ 紙で真空アスピレータ−用いてろ過した。ろ液を蒸発乾固し、残渣をフラッシュ シリカゲルカラムで精製した。カラムにジクロロメタンをバッキングし、生成物 をジクロロメタ２９５０％メタノールで溶離した。
以下の工程にしたがってＦｍｏｃ−アミノ酪酸（Ｃ４リンカ−アームのため）を 調製した。（注意：他のＦｍｏｃ−アミノカルボン酸は市販品を購入可能である 。例えば、Ｆｍｏｃアミノカプロン酸（Ｃ６リンカ−アームのため）およびＦｍ ｏｃ−グリシン（Ｃ２リンカ−アームのため）はＢａｃｈｅｍ、　Ｉｎｃ、、　 Ｔｏｒｒａｎｃｅ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）から市販品を購入可能である。） ４−アミノ酪酸１．８ｇおよび炭酸水素ナトリウム１２４ｇの水／アセトン（５ ０：５０）３５ｍｌ中混合物を調製し、Ｆｍｏｃ−スクシンイミジルカーボナ− ト（Ｎ−フルオレニルメチルースクシンイミジルカーボナート）　（Ｂａｃｈｅ ｍ）　５ｇを加えた。反応混合物を室温で１夜撹拌した。ＩＮ　ＭＣＩを用いて 反応混合物のｐＨを２に調整し、溶媒を減圧下除去し残渣をエタノール２０ｍ１ に溶解してろ過した。ろ液を蒸発乾固し、残渣をジクロロメタンにとり、ろ過し 、純粋な生成物４．８ｇを得た。
’ＨＮＭＲｉｎ　ＤＭＳＯ−ｄｓ、１゜６１　（ＣＨ２）　、２．２２　（ＣＨ ２）。
３、−０１　（ＣＨｚ　Ｎ）、４．３２　（ＣＨｚ　Ｃ＝Ｏ）、４．２２　（Ｎ Ｈ）、７２５−７．９５（８芳香族プロトン　）実施例６　還元されたＬ−スレ オニンのアミン部分のブロッキング上記Ｆｍｏｃ−アミノ酪酸の製造と票似の方 法で、還元したＬ−スレオニンのアミン部分を９−フルオレニルメトキシカルボ ニル（Ｆｍｏｃ）基とカップリングさせた。１夜反応させた後、ｐＨを調節する 必要はなかった。溶媒を除去し、残渣をジクロロメタン４０ｍ１に溶解し、水で 抽出した（２Ｍ５０ｍｌ）。次いで、有機層を乾燥し、フラッシュシリカゲルク ロマトグラフィーで精製した。生成物をジクロロメタン中２％メタノールで溶離 し生成物３．８５　ｇを得た。
’ＨＮＭＲ，１，２０（ＣＨｓ）　、２．８５　（ＮＨ）　、３．２６　（ＣＨ ）、３゜４−８　（ＣＨ）、３．７２　（ＯＨ）、７．３−７．９　（８芳香族 プ。ト−７）実施例７　Ｆｍｏｃ−ブロックリンカ−アームの製造・Ｆｍｏｃ− グリシルアミド−カプロン酸（Ｃ８）、Ｆｍｏｃ−４−アミノブチリルアミド− カプロン酸（ＣＶＩＯ）およびＦｍｏｃ−カプロイルアミド−カプロン酸（ＣＩ ２） 上記のＣ８、Ｃ１ＯおよびＣ１２リンカ−アームの合成のためにＦｍｏｃ−グリ シン、Ｆｍｏｃ−４−アミノ酪酸およびＦｍｏｃ−アミノカプロン酸をアミノカ プロン酸とカップリングさせた。所望のＦｍｏｃ−アミノ酸（１７ｍｍｏｌ）を 乾燥ピリジン（３Ｍ３０ｍｌ）と共沸蒸留することで乾燥した。次いで、乾燥物 を乾燥ジメチルホルムアミド３０ｍ１に溶解し、乾燥テトラヒドロフラン３０ｍ １を加えた。溶液を０℃に冷却し、１当量（１７ｍｍｏｌ）のＮ、　Ｎ’　−ジ イソプロピルエチルアミンを加えた。撹拌しながら、１当量のトリメチル酢酸ク ロリドをＯ’Ｃで滴下し、４５分間撹拌した。乾燥アミノカプロン酸１．２当量 を加え、反応混合物を室温まで昇温し、１夜撹拌した。反応の進行をＴＬＣで監 視した。完了後、溶媒を減圧下、留去した。残渣を水５０ｍ１で再構築し、ＩＮ 　ＨＣＩでｐＨを２に調節した。混合物を酢酸エチル１００ｍ１で抽出し、有機 層を水２０ｍ１で洗浄し、乾燥した（ＭｇＳＯ３）。次いで、混合物をろ過し、 容量約４０１１１まで、溶媒を減圧下蒸留した。曇りが生じるまで、該溶液にへ 午サンを滴下し、加熱して清澄化した。次いで、生成物を１夜結晶化した。
上記実施例５または７に従って製造した所望のリンカ−アーム（ｌｌｍｍｏｌ） 　［Ｆｍｏｃ−グリシン（Ｃ２）　、Ｆｍｏｃ、−４−アミノ酪酸（Ｃ４）　、 Ｆｍｏｃ−ｔブロン酸（Ｃ６）　、Ｆｍｏ　ｃ−グリシルアミド−カプロン酸（ Ｃ８）　、Ｆｍｏｃ−４−アミノブチリルアミドカプロン酸（Ｃ１０）およびＦ ｍｏｃ−アミノカプロイルアミド−カプロン酸（Ｃ１２）］をピリジン（３Ｍ３ ０ｍｌ）と共沸蒸留することで乾燥した。次いで、乾燥した残渣を無水ジメチル ホルムアミドと無水テトラヒドロフラン（１：　１）　混合物４０ｍ１に溶解し た。溶液を水浴で冷却し１当量のジイソプロピルエチルアミンを加えた。撹拌し ながら、１：１当量のトリメチル酢酸クロリドを滴下し、０℃で４５分間撹拌し た。１，５当量の還元しニスレ万ニン（上記実施例４）溶液を工え、反応混合物 を室温まで昇温し、１時間撹拌した。反応の進行をシリカゲルによるＴＬＣに付 し、ＣＨ２Ｃ１ｚ／　ＣＨｓＯＨ／ＣＨ，Ｃ○○Ｈ（１０：１・０．１）溶媒系 で展開することで監視した。
反応完了後、溶媒を減圧下、留去し、残渣を酢酸エチル５Ｑｍｌと混合した。飽 和炭酸水素アトリウム４０ｍ１で抽出し、水浴性物質を除云した。有機層を水２ ０ｍ１で洗浄し、乾燥した（　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４）。混合物を酢酸エチルから結 晶化した。
二と」す２九二　’ｌ（ＮＭＲｉｎ　ＣＨ５０−ｄ６，１．０コ　（０４，、還 元Ｌ−ｘしｔ二ｙ）、　コ、コ５　（ＯＨ）、３．３−１４５　（２ＣＨ）、３ ．９１　（ＮＨ）、’４．２７（ｏｔｈｅｒ　ＮＨ）、　１．コ１．　（ＯＨ） 、４．３４　（Ｃ１（２）、４．６３　（０Ｍ２　ａｎｄ　ＣＨ２゜Ｆ’ＭＯＣ ）、７ｊ−７，９（８−−ｆｆｌ族）ｅ＋ドア　）−ｃ、　１ノ′カー　’）Ｉ 　掛αｉｎ　ＣＨ５０−ｄ６，１．ｏコ　（Ｃ）！３　還元Ｌ４に／オニン・） 、　１６２　（ＣＭ（２）、　２．１４４Ｃｄ２）、　２．９１　（ＣＢり、　 ２．９７　（ＣＭ、）。
３．３−１５　（２ＣＭ）、コ、６コ　（Ｏｉ（ｌ　、３．８４　（ＯＨ）、４ ．２３　（ＣＨ）、４．３３　（ＣＨおよびｃ：ｑ、、ｒＭＯＣ）、４．６０　 （ＮＨ）、６．コ２　（ＮＴ（）、　７．コー７．９　（８−芳香族プロトンａ 　’Ｈ冶倶ｉｎ　ＤＭＳＯｄ６　ｒ　ｌ　−０’３　（ＣＨｓ　還元し−Ｘ　レ オニア）、　１．３−１．７　（コ　Ｃ）！２’ｓ）、２．５２　（ＣＨ□、、 ）ｌ　コ、１２　（Ｃ：：−Ｃ＝Ｏ）。
３．８−３．９　（２０Ｈ）、４．１−４．２　（２ＣＨ）、４．４１　（ＣＭ 、、　ＦＭＯＣＩ、５．２２（茹）、６．４８　（Ｎ”ｄ）、７．コー７．９　 （Ｅｌ−芳香族プロトン　）。
ｅ二　’ＨＮＭＲｉｎ　ＣＨ５０−ｄ６　主要ジグｆル（冊）、７．３−７．９ 　（８−芳香族プロトン　）。
ｚ四二畳ゴＬ二　’２（冶Ｇｉｎ　ｏ態ｏ−ｄ６．　１．０２　（ＣＭ、　・ｙ １元Ｌ−ｘ　しｔニア、１，１．３−１．５０　（４０Ｍ２’ｓ）、３．６４　 （ＯＨ）、３．８２　（ＯＨ）、４．ｇ４（ＮＨ）、６．ココ　（Ｍｌ（）、６ ．６２　（ＮＭ）、７．３−７．９　（８−芳香族プロトン　）。
Ｃ１２す′カー　’ＨＮＭＲｉｎ　ＤＦＳＯ−ｄ６．　主要ノブナル１．０１　 （Ｏ（３還元し一スレオニン　）、１．コ〇−Ｌ５０　（６Ｃ奪２’ｓ）　、　 ３−Ｃ３（ＯＨ）　、　３−８２　（ＯＨ）　、　４−６２　（ドＨ）、６．コ ｌ　（トＨ）。
６．６３　（Ｎ’ｄ）、７．３−７．９　（８−芳香族プロトン　）。
実施例９　非ヌクレオチド試薬の１級ヒドロキシ部分のジメトキシトリチル化上 記、実施例６および８で調製した所望の非ヌクレオチド試薬（６ｍｍｏｌ）を乾 燥ピリジンと共沸蒸留することで乾燥し、乾燥ピリジン１５ｍ１に溶解した。ジ メトキシトリチルクロリド２．２ｇのＣＨ２Ｃ１ｘ／ピ’）ジン（１：　１）２ ０ｍｌ中溶液２０１１１を撹拌下、滴下した。室温で反応を４５分間続けた。反 応の進行をＴＬＣで監視した。反応完了後、メタノール２＠１を加えてクエンチ し、１０分間撹拌した。溶媒を減圧下、留去し、残渣をジクロロメタン５０ｍ１ に溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム（２Ｘ５０ｍｌ）　、次いで、水（３０ｍｌ ）で抽出した。
有機層を乾燥しくＭｇ５０４）、ろ過した。溶媒の留去後、残渣をフラッシュカ ラムクロマトグラフィーで精製した。生成物を０．　５％トリエチルアミン含有 ジクロロメタン中、２％メタノールで溶離した。
二と！Ｌ乙り二　’ＨＮＸＲ，ＣＤＣ１，、１，１８（ＣＭ、、還元レースレオ ニン）７１．６３　（ＯＨ）、２．８３　（ＮＨ）ｌ　コ、７７　（２ＣＭ、、 　ＤＭＴ）、３．８２（ＣＨ２，ＦＭＯＣ）、５．４８　（ＣＨ２−０−ＤＭＴ ）、６．８２−７．９０　（２１芳香族プｏトン）。
−とニし’ｉ−’Ｈ）ｒＫＲ，ＣＤＣｌ、、Ｌｕ１ｌ　（ＣＢ３，１元＋ｚ−Ｘ しｔニア）／：］、７Ｂ　（２ＣＨ！’ｓ、　ＤＭＴ）、４．３５　（ＣＨ２− ０−ＤＭＴ）、５．９８（）ｒＨ）　６．８０−７．７１１　（２：Ｌ　芳香族 プロトン　）。
ｆｉ　’ＨＮＭＲ，ＣＤＣｌ、（主要ピーク）　１．１８　（ＣＨ３゜還元レー スレオニン　）、１＋８３　（ＣＨ２）、２．２８　（ＣＨ２）、コ、７４　（ ２ＣＨ，。
ＤＭＴ）、４．２１　（ＯＨ）、４．３８　（ＣＨ，、ＦＭＯＣ）、５−２２　 ａｎｄ　６．４２　（２ＭＨＩ、６．８０−７．６５　（２１芳香族フロドア　 ）。
ｆｉ−ニア＃−’ＨＮＭＲ，ＣＤＣｌ３　（主要ビー４）　１１２　（ＣＨｌ。
還元レースレオニン　）、Ｌロー１．６　（コ　ＣＨ２’ｓ）、１７５　（２Ｃ Ｈ３゜ＤＭＴ）、４．３８　（ＣＨ，ＦＭＯＣ）、６．８０−７．９０　（２１ 芳香族プロトン）。
ｑＬコし−４１’ＨＮＫＲ，ＣＤＣｌ、（主ｆｉピーク）１．１２　（ＣＨ，、 ｆｆｉ元レーしレオ’−７’　ｌ、：１．８０　（２ＣＨ３゜ＤＭＴ）、　５． ４２　（Ｃ）１２．　ＦＭＯＣ）、　６．１８　ａｎｄ　６．３２１　（２ＮＨ ）、　６．８２−７．８０（２１芳香族プロトン　）・ Ｑ二ＬＪｊニたユ　′Ｈめ伝、ＣＤＣｌ、、（主要ピーク）１・１２　（ＣＨ， 還元レースレオニン　）、　３．７８　（２ＣＨ，。
Ｄｌｆｒ）、４．５９　（ＣＨ２，ＦＭＯＣ）、６．８−７．８　（２１芳香族 プロトン　）。
９■Ｌニシク笠二’ＨＮＭＲ，ＣＤＣｌ、１．１８　（ＣＨ３７還元レースレを ニア）。
１７Ｂ　（２ＣＨ，、ＤＭＴ）、　４．４０　（ＣＨ２，ＦＭＯＣ）、　６．８ −７．８　（２１芳香族プロトン　） （全ＣＨ２およびＣＨ（非芳香性）も説明されているが、帰属はされていない） 寒礁興１ユ　非ヌクレオチド試薬の２級ヒドロキシ紺盆９！チルホスユこヨと代 上記実施例９記載の方法に従って得られたＤＭＴでブロッキングしたリンカ−ア ーム（４ｗａＩｏｌ）を乾燥ピリジンと共沸蒸留することで乾燥し、残渣を無水 ジクロロメタン２０ｍ１に溶解した。密閉したアルゴン雰囲気下、ジイソプロピ ルエチルアミン１．５当量を加え、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルメチルホスフィンア ミド・塩化物［（ＣＨ３）ｚｃＨ］　ｚＮＰ　（ＣＨ３）Ｃ１１１，２当量を滴 下した。反応は４５分間で終了した。溶媒を減圧下に除去し、残渣をシリカゲル カラムによるフラッシュクロマトグラフィーで精製した。カラムに５％トリエチ ルアミン含有酢酸エチル／ヘキサン（１：）をバッキングし、１％トリエチルア ミン含有酢酸エチル／ヘキサンで洗浄した。次いで、反応混合物をカラムに負荷 し、生成物を１％トリエチルアミン含有酢酸エチル／ヘキサン（１：　１）で溶 離した。
他の非ヌクレオチド試薬は実施例９記載の方法に従って製造したリンカ−アーム で修飾した試薬と、他のリン酸化剤、例えばＮ、　Ｎ−ジイソプロピルメチルホ スホンアミド・塩化物［（ＣＨｚ）ｔｃＨ］　２ＮＰ　（ＯＣＨ３）ＣＩおよび ２−シアノエチル　Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルクロロ−ホスホラミダイト等とのカ ップリングによって製造される。
芳香族プロトン　）。
実施例１１０６−リンカ−アームを有する非ヌクレオチド試薬の２級ヒドロキＣ ６−リンカ−アームを有するジメトキシトリチル（ＤＭＴ）でブロッキングした 非ヌクレオチド試薬（本明細書の実施例９記載の方法で製造）を乾燥ピリジンと 共沸蒸留することで乾燥した。残渣を無水ジクロロメタン２０ｍ１に溶解した。
密閉したアルゴン雰囲気下、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン１．５当量を 加え；次いで、Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホンアミド・塩化物［（Ｃ Ｈ３）ｚｃＨ］　２ＮＰ　（ＣＩ）ＯＣＲ３］の１．２当量を滴下した。次いで 、反応混合物を実施例１０記載の工程で後処理し、上記生成物３　、　２　ｍｍ ｏｌを得た。
’ＨＮＭＲｉｎ　ＣＤＣ］　ｓ、δｐｐｍ：　１−１．　５　（５ｍｅｔｈｙｌ 　ａｎｄ　１　ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ）、　１．４２（ＣＨ２）、１．７３−ａｎ ｄｌ、　７３（２ＧＨｚ）、　２．２１　（ＣＨ２Ｎ）、３．１５　（ＣＨ，− Ｃ＝○）、３．７８　（ＣＨｓ　ｏｆ　ＤＭＴ）、６゜８０−７．８５　（２１ ａｒｏｍａｔｉｃ　ｐｒｏｔｏｎｓ）その他の存在するプロトンシグナルは帰属 されなかった。
５’−ＴＴＴ−ＡＡＧ−ＣＡＧ−ＡＧＴ−ＴＣＡ−ＡＡＡ−ＧＣＣ−ＣＴＴ−Ｃ ＡＧ−ＣＧ−（ＣＢ−リンカ−）を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドりん 酸ジエステルを製造した。
Ｃ８メトキシホスホラミダイト非ヌクレオチド試薬（１−０−ジメトキシトリチ ル−２−Ｎ　［Ｎ’　−（Ｎ”−フルオレニルメトキンカルボニル−６−アミノ ヘキサノイル）−２−アミノアセチル］−３−○−［Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピル メトキノホスフィニル］−２−アミノ−１，２−ジヒドロキシブタン）を濃度１ ００ｍＭで乾燥アセトンに溶解し、Ｂｉｏｓｅｒｃｈ　Ｍｏｄｅｌ　８７５０二 ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用い、業者の指示に従って、標準的なホスホ ラミダイトの化学［カルサーら（Ｍ、　Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　ｅｔ　ａｌ 、）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５４：２８７−３１３（１ ９８５）］によってオリゴヌクレオチド配列にカップリングした。ローら（Ｋ、 　Ｍ、　Ｌｏ）　（１９８４Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、　８１．　ｐｐ、２２８５−２２８９）の記載に従い、５ｅｐ−Ｐａｋ Ｔ′Ｃ１８カートリツジ（Ｍｉｌｌｉｐ。
ｒｅ／Ｗａｔｅｒｓ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）による精製を可能とするため 、合成の最後まテ５゛　ジメトキシトリチル保護基を残しておいた。この工程の 間に、ジメトキシトリチル保護基を除去した。
本発明の非ヌクレオチド試薬が組み込まれたメチルりん酸オリゴマーを、ミラー （Ｐ、　Ｓ、　ＭｉｌｌｅｒＸ１９８３．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ｓ、　、　１１、ｐｐ、　ｄ６２２５−６２４２）、ジャKーおよび イングル（＾、　Ｊａｇｅｒ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｅｎｇｌｅｓ）　（１９８４，Ｔ ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　、　２５．　ｐｐ、　P４３７−１４４０ ） およびドルマン（Ｍ、Ａ、Ｄｏｒｍａｎ）　（１９８４，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ ｎ、４０．　ｐｐ、９５−１０２）が記載した化学的手法により、メチルホスホ ンアミダイトモノマーおよび非ヌクレオチドメチルホスホンアミダイト非ヌクレ オチド試薬を用いて合成した。Ｂｉｏｓｅｒｃｈ　Ｍｏｄｅ１８７５０　ＤＮＡ 　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用い、業者の指示した方法を以下のように改変し、 固相合成を行った。“Ｇ”および“Ｃ”モノマーを濃度１００ｍＭでアセトニト リル／ジクロロメタン（１・１）に溶解した。”Ａ”および“Ｔ”モノマーは、 濃度１００ｍＭでアセトニトリルに溶解した。非ヌクレオチドリンカー試薬を濃 度１２０ｍＭでアセトニトリルに溶解した。ＤＥＢＬＯＣＫ試薬＝ジクロ試薬ク ジクロロメタン中２ロ酢酸。０ＸＩＤＩＺＥＲ試薬＝２．５％水、２５％２．６ −ルチジン、７２．５％テトラヒドロフラン中２５ｇ／Ｌ沃素。ＣＡＰ　Ａ＝ニ アセトニトリル１０％無水酢酸。ＣＡＰ　Ｂ＝ビピリジン中、６２５％Ｎ、　Ｎ −ジメチルアミノピリジン。下記のごとく、オリゴマーの精製を容易にするため に、５゛　ジメトキシトリチル保護基を合成の最後まで残しておいた。
粗製の保護非ヌクレオチド試薬を組み込んでいるメチルりん酸オリゴマーを、室 温で２時間、濃水酸化アンモニウムと混合することで固相支持体から除去した。
Ｅｃｏｎｏ　Ｃｏｌｕｍｎ”（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ） を用いて支持体から溶液を流しくドレイン）、支持体をアセトニトリル／水（１ ：　１）で５回洗浄した。次いで、溶出したオリゴマーを室温で減圧下、蒸発乾 固した。次いで、室温で６時間、エチレンジアミン／アセトニトリル／水（５０ ：２３．５：２．５）溶液を用い、塩基から保護基を除去した。次いで、得られ た溶液を減圧下、蒸発乾固した。
（ｂ）リンカ−で修飾したメチルりん酸オリゴマーの精製５゛　−ジメトキント リチル（トリチル）含有オリゴマーをトリチル化に失敗した配列から、５ｅｐ− ＰａｋＴ＆ＩＣ１８カートリツジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／１ｌａｔｅｒｓ、　Ｂ ｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）により、以下のごとく精製した：カートリッジをアセト ニトリル、１００ｍＭ炭酸水素トリエチルアンモニウム中５０％アセトニトリル （ＴＥＡＢ、ｐＨ７，５）、およびを２５ｍＭ　ＴＥＡＢで洗浄した。次いで、 粗メチルりん酸オリゴマーを少量のアセトニトリル／水（１，：１）に溶解し、 次いで、最終濃度が５％アセトニトリルとなるように２５ｍＭ　ＴＥＡＢで希釈 した。次いで、この溶液をカートリッジに通した。次いで、カートリッジを２５ ｍＭＴＥＡＢ中１５−２０％アセトニトリルで洗浄した。次いで、カートリ７ノ に結合したまま残っているオリゴマー上のトリチルを、２５ｍＭ　ＴＥＡＢ、２ ％トリフルオロ酢酸、および２５ｍＭ　ＴＥＡＢの順番に洗浄することて脱トリ チル化した。最後に、トリチル−選択オリゴマーを５０％アセトニトリル／水で カートリッジがら溶離し、室温で真空乾燥した。
上記工捏で得たリンカ−で修飾したメチルりん酸オリゴマーを下記のごとく逆相 ＨＰＬＣクロマトグラフィーにかけ、さらに精製した。上記実施例で記載したＢ ｅｃｋｍａｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｇｏｌｄ　ＨＰＬＣを、Ｈａｍｉｌｔｏｎ　ＰＲ ＰＩカラム（Ｒｅｎｏ、　ＮＶ、１０１１．７ｍｍ１．ｄ、　ｘ　３　Ｑ　５ｏ ｏ＊長さ）と−緒に用いた。バッフ７　Ａ＝５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウ ム（ｐＨ７）：バッファーＢ＝５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７） 中５０％アセトニトリル。少量の１０−５０％アセトニトリル／水に溶解した試 料を１００％バッフ７−　Ａを２．５−３ｍ１／分で流しながらカラムに負荷し た。次いで、流速２．５−３ｍ１／分でバッファーＢの０−７０％線状グラディ エンドを３０−５０分間かけて流した。完全長さの非ヌクレオチド試薬を組み込 むメチルりん酸オリゴマーを含んでいるフラクションを真空蒸留し、５０％アセ トニトリル／水に再懸濁した。
ｂｃｒ／ａｂｌ連結領域の配列はゴスヴエルト（Ｇ、Ｇｒｏｓｖｅｌｄ）　（１ ９８６，Ｍｏ１ｅｅｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ、、６．　 ｐ９．６０７−６１６）が記載したように、Ｋ５６２細胞系から得た。このｍＲ ＮＡのｂｃｒ／ａｂｌ連結部位に相補的な、下記配列で示される非ヌクレオチド 試薬を組み込むメチルりん酸オリゴマーを実施例１３記載の方法に従って合成し た。
５　’　−匹ｇ＝＝ＧＡＡＣ？ＣＴＧＣ？？　（ｈ　）　−３’下線はａｂｌ遺 伝子由来の配列であることを示す。↓または↓のいずれかに１個のソラーリンと 結合した非ヌクレオチドモノマー単位を組み込んだ。ＣＯ，Ｃ２、Ｃ４、Ｃ６ま たはＣ８非ヌクレオチドモノマー単位のいずれかを↓に導入し、それぞれ、オリ ゴマー１．２．３．４および５を得た。↓にＣ４非ヌクレオチドモノマー単位を 導入してオリゴマー６を得た。（表ＩＩ参照）。注：オリゴマ−６のみが３゛末 端アデニン塩基を有する。
実施例１５３’５°　タンデムオリゴマーの製造ホスホジエステルおよびメチル りん酸オリゴマーを下記配列を用い、上記の方法（実施例１２および１３）に従 って製造した。これらのオリゴマーはＲＮＡＮ玉鎖上ａｒ／ａｂｌ連結部位にお ける２次構造の中断に用いられた。
５“　−タンデムオリゴマー＋　５’　−ＧＣＴ−ＡＣＴ−ＣＣＧ−ＣＧＣ−Ｔ ＧＡ−＾Ｇ３°　−タンデムオリゴマー＋　５’　−ＡＡ人−ＴＣＣ−ＡＧＴ− ＧＧＣ−ＴＧＡ−ＧＴＧ−３゜メチルりん酸オリゴマーは、その溶解性を改善す るために、その５゛末端に単一のホスホンエステル結合を有するよう調製された 。
非ヌクレオチドモノマーを組み込んでいるメチルりん酸オリゴマー（３−５ｍｇ 。
９９−１５５　０．　Ｄ、　２６０単位）を、１．５ｍｌ微量遠心管内で、ｌ、 ｌアセトニトリル／水１００μｍに溶解した。次いで、オリゴマーの沈殿を避け るために１つの試薬を加える度にポルテックスしながら以下の試薬を加えた・ジ メチルスルホキシド（１７０μｍ）、水（１００μｌ）、ＬＭ　ＨＥＰＥＳバッ ファーｐＨ８，０（５０μｌ）およびジメチルスルホキシド（８０μｍ）中５０ ｍＭ　ソラーリンーＮＨ５試薬。総量：５００μｌ０混合物を遮光して室温で２ −４時間反応させた。次いで、エタノール（１１１１）を加え、得られた溶液を 一２０℃で一夜冷却し、ソラーリンで標識したオリゴマー産物を沈殿させた。次 いで、管を５分間微量遠心にかけ、上溝を吸引し、捨てた。得られたペレットを アセトニトリル／水（１：　１）５００μ＋に再懸濁し、１：１．　２２　μＤ ｕｒａｐｏｒｅ”メンブランチろ過し、粒状物を除いた。
ソラーリンー標識メチルりん酸オリゴマーを下記のごとく逆相ＨＰＬＣクロマト グラフィーにかけて精製した。Ｍｏｄｅｌ　１２６５ｏｌｖｅｎｔ　ｍｏｄｕｌ ｅおよびＩＢＭコンパチブルコンピューターに接続したＭｏｄｅｌ　１６７検出 器と共に、Ｈａｍｉｌｔｏｎ　ＰＲＰＩカラム（５μ、４．１ｍｍ１．ｄ、ｘ　 ２５０ｍｍ長さ）を備えたＢｅｃｋｍａｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｇｏｌｄ　ａｎａｌ ｙｔｙｃａｌ　ＨＰＬＣ系を用いた。使用バッファーは以下の通り：バッファー 人＝５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７）：バッファーＢ＝５０ｒｎ Ｍ酢酸ト’Ｊエチルアンモニウム（ｐＨ７）中５０％アセトニトリル。粗製ソラ ーリン標識オリゴマー各１００μｌを、５回、２分間隔、５００μｍサンプルル ープで、カラムを１０％バッファーＢを流速１．　５５１１／分で流しながらカ ラムに負荷した。
次いで、流速１．５ｍｌ／分でバッファーＢの１０−７０％線状グラディエンド を３０分間かけて流した。これらの条件下、ソラーリンで標識されたオリゴマー は対応する標識されていないオリゴマーから約５分開運れて溶出した。ソラーリ ン修飾オリゴマーを含有するフラクシヨンをプールし、室温で、遮光しながら減 圧下、蒸発乾固させた。それらを次いで、最少量のアセトニトリル／水（１：１ ．）に再懸濁し、２６０ｎｍの吸収に基づいて定量した。回収した収率は１６％ がら５５％の範囲であった。
ｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍベクタークローンから４４０虐基のｂ　ｃ　ｒ／ａ　ｂ　Ｉ　Ｒ ＮＡが得られた。
これはｂｃｒ／ａｂｌ結合部位をその配列のほぼ中央に有する生物学的ｂｃｒ／ ａｂｌを表す。
Ｃ４リンカ−アームを有する非ヌクレオチドモノマー単位を組み込む、ソラーリ ン標識メチルりん酸オリゴマー３（“オリゴ３”）（配列については表ＩＩ参照 ）を［７−”Ｐ］　−ＡＴＰ　（１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）およびＴ４ポリヌク レオチドキナーゼを用い、下記のごとく標識した。ソラーリンメチルりん酸オリ ゴマー１０ｐｍｏｌを、５０μＣｉの［７−３２Ｐ］　ＡＴＰを含有する、５　 Ｑｍａ＋ｏｌ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，８）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５ｍＭ　 ＤＴＴ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０゜１ｍＭスペルミンンノン解した。Ｔ４ポリ ヌクレオチドキナーゼ（４単位）を加え、溶液を室温で９０分間インキュベート した。放射能標識した生成物をＮｅｎｓｏｒｂ−２０ＴＭカラム（Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｄｕｐｏｎｔ）により、業者の指示に従い精製 した。
！ｐ標標識ソラーシン修飾メチルん酸オリゴ３　（０，０５μｍｏｌ、約２０． 　００Ｑ　ｃｐｍ）をＲＮＡ　（１，５ｐＩｌｌｏｌ）　、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ 　（ｐＨ７，２）中、タンデムりん酸ジエステルオリゴヌクレオチド（５ｐｍｏ ｌ、実施例１５参照）、領　１ｍＭＥＤＴＡ、０．０３％ンディウム　サルコシ ラードの入った２１容ホウケイ酸ガラス製自動サンプラーバイアルに入れた。Ｒ ＮＡ標的上の同じ結合部位についてその放射能標識した対応物と競合させるよう 、放射能標識されていないソラーリンーオリコ３　（２μｍｏｌ）と上記の試薬 とを用いて対照とした。バイアルを７０℃で５分間加温した後、３５℃で３０分 間、室温で１５分間加温した。次いで、砕水の上で、Ｍｏｄｅｌ　Ｂ−１０ＯＡ 長波長紫外ランプ（ＵＶＰ、　Ｉｎｃ、、Ｓａｎ　Ｇａｂｒｉｅｌ、　ＣＡ）を 用い、１５ｃｍの距離から３０分間、バイアルに３６５ｎｍの光線を照射した。
この距離からの照射の強度は約６０μｗ／１００ｃｍ”であった。照射の最後に 、０．１％ブロモフェノール含有９０％ホルムアミドおよびＯ，１Ｍ）リス−は う酸−ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ８，２）を加え（５μｍ）、思料を６％ポリア クリルアミド／７Ｍ尿素ゲル（０，５ｍｍ）に負荷した。ゲルを９００Ｖで２時 間半電気泳動し、２枚の５ａｒａｎ　Ｗｒａｐ”の間に挟み、ＸＡＲ−５フイル ム（Ｅａｓｔｍａｎ−Ｋｏｄｋ、　Ｒｏｃｈｓｔｅｒ、　ＮＹ）に１５分間暴露 した。オートラジオグラフィーの後、上方バンドの出現はＲＮＡ標的とのクロス リンキングを示唆していた。このバンドは、競合的な非放射活性ソラーリンオリ ゴ３を含有する対照ではほんのかすかにしか認められず、ＲＮＡへのクロスリン キング部位が配列特異的であることを示していた。
これらのオリゴマーを３２ｐで標識し、ハイブリダイズさせ、ＲＮＡ転写物とク ロスリンキングさせて実施例１７記載の方法でゲル電気泳動によって分析した。
（オリゴマーの配列に関しては表ＩＩ参照）。しかしながら、オートラジオグラ フィーの前に、ゲルをプロッティング用紙に移し、ゲル乾燥装置内で８０℃にお いて真空乾燥した。次いで、スケールベルによるバンドの切除を容易にするため に、オートランオグラフを乾燥ケル上の鋳型として用いた。切除したバンドをポ リプロピレンノンチレーショノンバイアル（２０ｍｌ）に入れ、１０ｍ１シンチ レーシヨンカクテルを計数した（ＣｙｔｏｓｃｉｎｔＴｌｌＩＣＮ　Ｒａｄｉｏ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、　Ｃｏ５ｔａ　Ｍｅｓａ、　ＣＡ）。照射か ら１２０分後のクロスリンキングの程度は以下の通りである。
ソラーリンオリゴ１　（ＣＯ−リンカ−）：５．２％ソラーレリンリゴ３　（Ｃ ４−リンカ−）・１４．０％ソラーレリンリゴ５　（Ｃ８−リンカ−）・　４． ５％この観察に基づき、ＲＮＡ標的にハイブリダイズしたとき、効果的なりロス リンキングのためには、ＣＯ−およびＣ８−リンカ−はそれぞれ短かすぎ、また は長すぎると結論した。
するソラーリンオリゴ２．３および４および６の比較これらのオリゴマーを上記 のごとく３２Ｐで標識した。（配列に関しては表ＩＩ参照）。放射性標識オリゴ マー（０，０５ｐｍｏｌ、２０−４５．　ＯＯＯｃｐｍ）を、５ｍＭりん酸カリ ウム１０μｍ、ｐＨ７，４，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡＳｏ、０３％ポタシウムサル コシラート中、標的ＲＮＡ　（ｌｐｍｏｌ）およびタンデムメチルりん酸オリゴ マー（５ｐｍｏｌ、上記）の入った２ｍｌｍ水容ケイ酸ガラス製自動サンプラー バイアルに入れた。（メチルりん酸タンデムオリゴマーは、これらの条件下、ソ ラーリンと結合したオリゴマーのＲＮＡ標的とのハイブリダイゼーションおよび クロスリンキングをより高度に促進することを見いだした）。管を７０’Ｃで５ 分間加熱した後３５℃で３０分間加熱した。次いで、実施例１７に記載のごと（ 、氷の上で管を６０分間、３６５ｎｍ照射処理した。
ゲル分析、オートラジオグラフィー、およびバンドの放射能の測定によるクロス リンキングの定量は上記の箇所で述べたと同様にして行った。ＲＮＡ標的へのク ロスリンキングの程度は以下の通りである。
ソラーリンオリゴ２　（Ｃ２−リンカ−）：６４．９％ソラーレリンリゴ３　（ Ｃ４−リンカ−）：６０．７％ソラーレリンリゴ４　（Ｃ６−リンカ−）：３４ ．５％ソラーレリンリゴ６　（Ｃ４−リンカ−）ニア１．６％このデータは、オ リゴマーの内部位置へのリンカ−の挿入には、結合したソラーリン部分のＲＮＡ 標的鎖へのクロスリンキングに関して、Ｃ４リンカ−よりもＣ２リンカ−の方が 僅かに好ましく：この位置についてはｃｏ−１ｃ６−およびＣ８−リンカ−はあ まり好ましくないことを示している。Ｃ４−リンカ−がオリゴマーの３“末端位 置にあるとクロスリンキングがさらに向上される。
実施例２０　ソウレーン−ＮＨ３試薬とアミン−修飾メチルりん酸オリゴマーと メチルりん酸オリゴマーは、別の特許出願明細書に記載の方法で、２個のデオキ シアデノシン塩基の間に挿入されたＣ４−アミノリンカ一部分を用いて調製され た。ｂｃｒ／ａｂｌＲＮＡに相補的なこのオリゴマーの配列は以下の式で示され る。
５　’　−ＧＧＣ−Ｔ？？−ＴＧＡ−（Ｌ）−ｋｃＴ−ＣＴＧ−ＣＴＴ−３’太 字体の塩基はメチルりん酸ジエステル結合を有するが、５゛−末端前項基はりん 酸ジエステル結合で結合している。”Ｌ”は、本明細書記載のＣ４アミノリンカ −を有する非ヌクレオチドモノマー単位を表す。
続＜ＮＨ３−ソラーリン試薬と非ヌクレオチドモノマー単位（オリゴマー内に存 在）のリンカ−アームとのカップリング反応は１．５ｍｌのポリプロピレン微量 遠心管内で行った。オリゴマー約３．　４１！ｇ　（９８０Ｄｈｇ。単位）をア セトニトリル／水（１：　１）１００μｌに溶解した。次いで、オリゴマーの沈 殿を避けるために１つの試薬を加える度にポルテックスしながら以下の試薬を加 えたニジメチルスルホキシド（１７０μｍ）、水（１００μＩ）　、ＩＭ　ＨＥ ＰＥＳバッファーｐＨ８，０（５０μ＋）およびジメチルスルホキシド（８０μ ｌ）中５０ｍＭソラーレンーリンＳ試薬。総量：５００μｍ。混合物を遮光して 室温で２．５時間反応させた。次いで、エタノール（１ｍｌ）を加え、得られた 溶液を一２０℃で一夜冷却した。次いで、管を５分間微量遠心にかけ、上清を吸 引し、捨てた。
得られたベレットをアセトニトリル／水（１：　１）５００μｌに再懸濁し、０ ゜２２μＤｕｒａｐｏｒｅＴＭメンプランでろ過し、粒状物質を除いた。
上記の粗製のソラーリンーオリゴマー複合体のＨＰＬＣによる精製は下記のごと （行った。Ｈａｍｉｌｔｏｎ　ＰＲＰ−１カラム（４，１ｘ　２５０ｍｍ＋長） を備えたＢｅｃｋｍａｎＳｙｓｔｅｍ　Ｇｏｌｄ　ａｎａｌｙｔｙｃａｌ　ＨＰ ＬＣ系を用いた。溶離に用いた使用パンファーは以下の通り：バッファーＡ−５ ０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７）；バッファーＢ−５０ｍＭ酢酸ト リエチルアンモニウム（ｐＨ７）中５０％アセトニトリル。試料を各１００μｌ づつ、５回、２分間隔、５００μｍサンプルループで、カラムを１０％バッファ ーＢを流速１．５ｍｌ／分で流しながら、カラムに負荷した。次いで、流速１． ５ｍｌ／分でバッファーＢの１０−７０％線状グラディエンドを３０分間かけて 流した。０．５分間隔でフラクションを集めた。これらの条件下、ソラーリンで 修飾されていないオリゴマー、および修飾されたオリゴマーは、それぞれ１７． ９分および２１．７分に溶出した。ソラーリン修飾オリゴマーを含有するフラク ションをプールし、蒸発させた。総数率は１６％であった。
ｐＧＥＭベクタークローンから４４０塩基のｂｃｒ／ａｂｌＲＮＡ転写物を得た 。このキメラｍＲＮＡはａｂｌ遺伝子のある領域が染色体のｂｃｒ遺伝子を含有 する他の領域に転座した結果生成したキメラ遺伝子生成物である。このＲＮＡ転 写物は配列のほぼ中央にｂｃｒ／ａｂｌ連結部位を含有する生物学的ｂｃｒ／ａ ｂ１ｍＲＮＡの一部を表している。さらに、ソラーリンメチルりん酸オリゴマー のいずれかの側に隣接した領域に相補的な配列をもった２個のメチルりん酸オリ ゴマーを合成した。それぞれ塩基長さが１７および１８であるこれらタンデムオ リゴマーを、ＲＮＡＮ玉鎖上ｃｒ／ａｂｌ連結部位の領域内の２次構造の破壊に 用いた。
ソラーリンメチルりん酸オリゴマー複合体を［γ−３２Ｐ］　−ＡＴＰ　（３０ ００Ｃｉ　／ｍｍｏｌ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い、下記のご とく標識した。ソラーリンメチルりん酸オリゴヌクレオチドｌＱｐｍｏｌを、５ ０μＣｉの［γ−３”Ｐ］　ＡＴＰを含有する、５０ｍｍｏｌ　Ｔｒｉｓ　（ｐ Ｈ７，８）１（ｂｚＬ　１０ｍＭＭｇＣ１２，５ｍＭ　ＤＴＴ、０．１ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ、Ｑ、１ｍＭスペルミジンに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（４ 単位）を加え、溶液を室温で９０分間インキュベートした。放射性標識した生成 物をＮｅｎ５ｏｒｂ　−２０”カラム（Ｎｅｗ　ＥｎｇＬａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａ ｒ／Ｄｕｐｏｎｔ）により、業者の指示に従い精製した。
クロスリンキング実験の１例として、３２ｐ標識ソラ一レンオリゴマー複合体（ ５０，０００ＣＰＭ）を、ＲＮＡ　（ｌｐｍｏｌ）　、および５ｍＭ　りん酸カ リウム（ｐＨ７，４）　、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．０３％３％ボタンラ ムルコシルからなるバッファー１０μｌ中のタンデムメチルりん酸オリゴマー（ ５ｐｍｏｌ）と−緒に２ｍｌ容ホウケイ酸ガラス製自動サンプラーバイアルに入 れた。バイアルを７０℃で３分間加温した後、３０℃で３０分間インキュベート した。次いで、バイアルを砕氷の上に置きＭｏｄｅｌ　Ｂ−１００Ａ長波長紫外 ランプ（ＵＶＰ、　Ｉｎｃ、、Ｓａｎ　Ｇａｂｒｉｅｌ、　ＣＡ）を用い、１５ ｃｍの距離から３６５ｎｍの光線を照射した。照射の強度は平均６０μＷ／１０ ０ｃｍ２であった。これらの条件下、クロスリンキングは、３０分後、８０−９ ０％完了した。次いで、０゜１％ブロモフェノールブルーを含有する９０％ホル ムアミド（５μｌ）を加え、試料を７Ｍ尿素ゲル（０゜５ｍｍ）含有６％ポリア クリルアミドゲルに付加した。ゲルを９００ボルトで２時間電気泳動じた後、プ ロッティングペーパーに移し、乾かした。５−１２時間、ＸＡＲ−５フイルム（ Ｅａｓｔｍａｎ−Ｋｏｄａｋ、　Ｉｎｃ、）を用いてオートラジオグラフィーを 行った。ゲルを切除し、ＣｙｔｏｓｃｉｎｔＴｌ″シンチレーションカクテル（ ＩＣＮ　Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｃｏ５ｔ ａ　Ｍｅｓａ、　ＣＡ）の存在下、シンチレーションカウンターで計数してバン ドの定量を行った。上方のバンドはＲＮＡ標的にクロスリンキングしたソラーリ ンオリゴヌクレオチドと対応していた。
Ｆ／Ｇ、４ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／１０ Ｃ１２Ｑ　１／６８　Ａ　７８２３−４Ｂ（７２）発明者　アーノルド、ライル ・ジエイ、ジュニアアメリカ合衆国９２１１７カリフオルニア、サノ・アイエコ 、ノア・ウェイ５４３９番Ｉ

Claims (83)

    【特許請求の範囲】
  1. １．オリゴマーにソラーレン部分を結合させるための試薬であって、式：▲数式 、化学式、表等があります▼ （式中、ｋは０から１２の整数、Ｅｓは求核部分とカップリングすることができ る部分を表す） で示される化合物を含んでいる試薬。
  2. ２．Ｅｓが、容易に求核部分で置換される脱離基を有する活性化エステルを含ん でいる請求項１の試薬。
  3. ３．Ｅｓが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルである請求項１の試 薬。
  4. ４．ｋが２である請求項１の試薬。
  5. ５．Ｅｓが、 ▲数式、化学式、表等があります▼ を含んでいる請求項４の試薬。
  6. ６．フイラデルフィア染色体のキメラｍＲＮＡ転写物のｂｃｒ／ａｂ１に相補的 であり、少なくとも１個のそれに結合したソラーレン部分を有する非ヌクレオチ ドモノマー単位を組み込んでいるオリゴマー。
  7. ７．アルキル−またはアリール−りん酸オリゴマーを含んでいる請求項６のオリ ゴマー。
  8. ８．該非ヌクレオチドモノマー単位が、▲数式、化学式、表等があります▼ （ここに、ＳＫＥＬは炭素数約１から約２０個のキラル的に純粋な非ヌクレオチ ド骨格を表し、ここに−ＮＨＬ、ＹおよびＺはＳＫＥＬの炭素原子と共有結合的 に結合しており、Ｌはリガンド、Ｙは−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ −、そしてＺは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−を表す）で示される請求項６のオ リゴマー。
  9. ９．ＳＫＥＬが、ＹおよびＺ間に約１から約１０個の炭素原子のバックボーンを 含んでいる請求項８のオリゴマー。
  10. １０．Ｌが、−Ｐｓ、 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼ （ここに、ｎおよびｍは独立して約１から約１５、好ましくは約１から約５まで の整数、Ｐｓはソラーレン部分を表す）から選択される請求項９のオリゴマー。
  11. １１．アルキル−またはアリール−りん酸オリゴマーを含んでいる請求項１０の オリゴマー。
  12. １２．２′−Ｏ−アルキルリボシル部分を含むヌクレオチドモノマー単位を有す る請求項１１のオリゴマー。
  13. １３．該非−ヌクレオチドモノマー単位が、▲数式、化学式、表等があります▼ （ここに、Ｒ１およびＲ２の１方が水素であって他は−ＮＨ−Ｌ、ここにＬはソ ラーレン部分と結合したリンカーアーム；Ｒ３およびＲ４の１方が水素であって 他が炭素原子数約１から約１０個の低級アルキル基；Ｚが−Ｏ−、−Ｓ−または −ＮＨ−：そしてＹが−ＣＨ２−、−Ｓ−、−ＮＨ−または−Ｏ−である）で示 される請求項７のオリゴマー。
  14. １４．Ｌが−Ｐｓまたは、 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼ （ここに、ｎおよびｍは独立して１から１５の整数、Ｐｓはソラーレン部分を表 す） から選択されるソラーレン部分と結合しているリンカーアームを含む請求項１３ のオリゴマー。
  15. １５．Ｌが、 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される請求項１４のオリゴマー。
  16. １６．ｎが１または３である請求項１５のオリゴマー。
  17. １７．−Ｐｓが４′−アミドメチル−４，５′，８−トリメチルソラーレン部分 を含む請求項１４のオリゴマー。
  18. １８．該オリゴマーがＰ２１０ｂｃｒ／ａｂ１をコードする領域部分とハイブリ ダイズし得る請求項６のオリゴマー。
  19. １９．少なくとも１個の、それに結合しているソラーレン部分を有し、キメラｍ ＲＮＡのｂｃｒ／ａｂ１とハイブリダイズすることができる非ヌクレオチドモノ マー単位を組み込んでいるオリゴマー。
  20. ２０．Ｐ２１０の発現を干渉し得る請求項１９のオリゴマー。
  21. ２１．Ｐ２１０ｂｃｒ／ａｂ１の発現を阻害するために、慢性骨髄性白血病を有 する生物またはそれから単離された細胞を処置する方法であって、該生物または それから単離された細胞に治療上有効な、Ｐ２１０ｂｃｒ／ａｂ１の発現を阻害 するに効果的な量のｂｃｒ／ａｂ１領域と相補的なオリゴマーを与えることから なる方法。
  22. ２２．該細胞が、骨髄細胞を含む、請求項２１の方法。
  23. ２３．慢性骨髄性白血病細胞におけるＰ２１０ｂｃｒ／ａｂ１の発現を阻害する 方法であって、該細胞またはそれらの増殖環境を、治療上有効な量のソラーレン と結合したオリゴマーであって、選択的にｂｃｒ／ａｂ１ｍＲＮＡとハイブリダ イズするものと接触させ、次いで該ソラーレンと該ｍＲＮＡとを反応させて該オ リゴマーと該ｍＲＮＡとをクロスリンキングさせることからなる方法。
  24. ２４．該細胞が骨髄細胞を含んでいる請求項２３の方法。
  25. ２５．該ｂｃｒ／ａｂ１ｍＲＮＡがｂｃｒ／ａｂ１連結部位を含んでいる請求項 ２３の方法。
  26. ２６．該オリゴマーが少なくとも１個の非ヌクレオチドモノマー単位を含んでい る請求項２３の方法。
  27. ２７．該ソラーレンが該オリゴマーの非ヌクレオチドモノマー単位に共有結合的 に結合している請求項２３の方法。
  28. ２８．該オリゴマーがメチルりん酸オリゴマーを含有する請求項２７の方法。
  29. ２９．該オリゴマーが約６から約２５個のヌクレオチドモノマー単位を含んでい る請求項２７の方法。
  30. ３０．該オリゴマーが約１から約５個の独立に選択された非ヌクレオチドモノマ ー単位を含んでいる請求項２９の方法。
  31. ３１．さらに少なくとも１つの、該ｍＲＮＡ上の、該ソラーレンと結合したオリ ゴマーに相補的な配列の５′または３′側配列に相補的な、タンデムオリゴマー をハイブリダイズさせることを含む請求項３１の方法。
  32. ３２．該タンデムオリゴマーがアルキル−またはアリール−りん酸オリゴマーを 含んでいる請求項３１の方法。
  33. ３３．該タンデムオリゴマーがメチルりん酸オリゴマーを含んでいる請求項３１ の方法。
  34. ３４．Ｐ２１０ｂｃｒ／ａｂ１の合成を干渉する方法であって、チロシンキナー ゼ活性を有するｍＲＮＡのｂｃｒ／ａｂ１と相補的な、ソラーレン部分と結合し た非ヌクレオチドモノマー単位を少なくとも１個含有しているオリゴマーをハイ プリダイズさせ、該ソラーレン部分と該ｍＲＮＡのピリミジン塩基とをクロスリ ンキングさせることからなる方法。
  35. ３５．慢性骨髄性白血病を有する生物またはそれから単離された細胞のチロシン キナーゼ活性の発現をダウンレギュレーションする方法であって、該生物または 単離細胞に、治療上有効な、チロシンキナーゼの発現の減少に効果的な量の、ａ ｂ１遺伝子またはｍＲＮＡのタンパク質をコードする核酸と相補的なオリゴマー を与えることからなる方法。
  36. ３６．該オリゴマーが少なくとも１個のソラーレンと結合した非ヌクレオチドモ ノマー単位を含有する請求項３５の方法。
  37. ３７．さらに該ソラーレン部分と該ｍＲＮＡのピリミジン塩基とのクロスリンキ ング反応を行わせることを含む請求項３６の方法。
  38. ３８．該オリゴマーがメチルりん酸オリゴマーを含む請求項３６の方法。
  39. ３９．相補的核酸配列に対するアンチセンスオリゴマーの阻害効果を増大する方 法であって、該相補的核酸配列に、少なくとも１個のソラーレン部分が結合した 非ヌクレオチドモノマー単位を有するアンチセンスオリゴマーをハイブリダイズ させ、該ソラーレン部分と該相補的配列のピリミジン塩基とをクロスリンキング させることからなる方法。
  40. ４０．該オリゴマーがメチルりん酸オリゴマーを含む請求項３９の方法。
  41. ４１．アンチセンスオリゴマーの、相補的核酸配列のタンパク合成阻害効果を増 強する方法であって、該オリゴマーに少なくとも１個のソラーレンと結合した非 ヌクレオチドモノマー単位を導入することからなる方法。
  42. ４２．該オリゴマーが該相補的核酸とハイブリダイズし、クロスリンキング反応 が該ソラーレンと該相補的核酸のピリミジン塩基との間で起きるものである請求 項４１の方法。
  43. ４３．該相補的核酸がｍＲＮＡを含む請求項４２の方法。
  44. ４４．該オリゴマーがメチルりん酸オリゴマーを含む請求項４３の方法。
  45. ４５．遺伝子転座の生成物である核酸配列の発現を阻害または干渉する方法であ って、該核酸配列に、少なくとも１個の、ソラーレン部分と結合しており、該核 酸配列に相補的であって選択的にハイブリダイゼーションする非ヌクレオチドモ ノマー単位を含むオリゴマーをハイブリダイズさせ、次いで該ソラーレン部分と 該核酸のピリミジン塩基とをクロスリンキングさせることからなる方法。
  46. ４６．該核酸配列がｍＲＮＡを含む、請求項４５の方法。
  47. ４７．該非ヌクレオチドモノマー単位が、ＺＮＨＬ ＳＫＥＬ Ｙ （ここに、ＳＫＥＬは炭素原子約１から約２０個のキラル的に純粋な非ヌクレオ チド骨格を表し、ここに−ＮＨＬ、ＹおよびＺは共有結合的にＳＫＥＬの炭素原 子に結合しており、Ｌはリガンド、Ｙは−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｎ Ｈ−：そしてＺは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−を表す。）で示される、請求項 ４５の方法。
  48. ４８．ＳＫＥＬがＹおよびＺの間に炭素原子約１から約１０個のバックボーンを 有する請求項４７の方法。
  49. ４９．Ｌが−Ｐｓ、 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼ （ここに、ｎおよびｍは独立して約１から約１５の整数であり、Ｐｓはソラーレ ン部分を表す） から選択される請求項４８の方法。
  50. ５０．該オリゴマーがアルキル−またはアリール−りん酸オリゴマーを含む請求 項４９の方法。
  51. ５１．該オリゴマーがメチルりん酸オリゴマーを含む請求項４９の方法。
  52. ５２．該オリゴマーが２′−Ｏ−メチルリボシル部分を含むヌクレオチドモノマ ー単位を有する、請求項５１の方法。
  53. ５３．さらに、少なくとも１個の、該ｍＲＮＡ上の該ソラーレンと結合した配列 に相補的な配列の３′または５′側配列に相補的な、タンデムオリゴマーを該ｍ ＲＮＡにハイブリダイズさせることを含む請求項５１の方法。
  54. ５４．該タンデムオリゴマーがメチルりん酸オリゴマーを含んでいる請求項５３ の方法。
  55. ５５．該オリゴマーが２′−Ｏ−メチル−リボシル部分を含んでいる請求項５４ の方法。
  56. ５６．該非ヌクレオチドモノマー単位が、▲数式、化学式、表等があります▼ （ここに、Ｒ１およびＲ２の１方は水素であって他は−ＮＨ−Ｌ、ここにしはソ ラーレン部分との直接結合またはソラーレン部分と結合したリンカーアーム；Ｒ ３およびＲ４の１方は水素であって他は炭素原子数的１から約１０個の低級アル キル基；ＹおよびＺは独立して−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ２−を 表す）で示される請求項４５の方法。
  57. ５７．Ｌが式−Ｐｓ、 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼ （ここに、ｎおよびｍは独立して約１から約１５の整数であり、Ｐｓはソラーレ ン部分を含む） から選択される請求項５６の方法。
  58. ５８．該オリゴマーがメチルりん酸オリゴマーを含有する請求項５７の方法。
  59. ５９．Ｌが、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここに、ｎは１から５の整数である）を含む請求項５８の方法。
  60. ６０．該非ヌクレオチドモノマー単位がキラル的に純粋である、請求項５９の方 法。
  61. ６１．さらに、少なくとも１個の、該ソラーレンと結合したオリゴマーに相補的 な配列に相補的であるタンデムオリゴマーを該核酸配列にハイブリダイズさせる ことを含む請求項５９の方法。
  62. ６２．該タンデムオリゴマーがメチルりん酸オリゴマーを含んでいる請求項６１ の方法。
  63. ６３．少なくとも１個のソラーレン部分が結合している非ヌクレオチドモノマー 単位を有する、遺伝子転座の生産物である核酸配列に相補的なオリゴマー。
  64. ６４．該非ヌクレオチドモノマー単位が、ＺＮＨＬ ＳＫＥＬ Ｙ （ここに、ＳＫＥＬは炭素原子数的１から約２０のキラル的に純粋な非ヌクレオ チド骨格を有し、ここに−ＮＨＬ、ＹおよびＺはＳＫＥＬの炭素原子と共有結合 的に結合しており、Ｌはリガンド、Ｙは−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−または−Ｎ Ｈ−；そしてＺは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ−を表す）を含んでいる請求項６ ３のオリゴマー。
  65. ６５．該ＳＫＥＬがＹおよびＺの間に炭素原子数約１から約１０個のバックボー ンを有している請求項６４の方法。
  66. ６６．Ｌが、−Ｐｓ、 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼ （ここに、ｎおよびｍは独立して約１から約１５の整数、Ｐｓはソラーレン部分 を表す） から選択される請求項６５のオリゴマー。
  67. ６７．アルキル−またはアリール−りん酸オリゴマーを含んでいる請求項６６の オリゴマー。
  68. ６８．メチルりん酸オリゴマーを含んでいる請求項６６のオリゴマー。
  69. ６９．２′−Ｏ−アルキルリボシル部分を含むヌクレオシドモノマー単位を含ん でいる請求項６８のオリゴマー。
  70. ７０．約６から約３１モノマー単位を含有する請求項６８のオリゴマー。
  71. ７１．約１から約５個の独立に選択された非−ヌクレオチドモノマー単位を含ん でいる請求項７０のオリゴマー。
  72. ７２．約６から約３１個のモノマー単位を含む請求項６６のオリゴマー。
  73. ７３．約１から約５個の独立に選択された非ヌクレオチド単位を含んでいる請求 項７２のオリゴマー。
  74. ７４．Ｐｓが式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｋは０から１２の整数である）で示される請求項７３のオリゴマー。
  75. ７５．ｋが２から６である請求項７４のオリゴマー。
  76. ７６．ｋが２である請求項７５のオリゴマー。
  77. ７７．該非ヌクレオチドモノマー単位が、▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ１およびＲ２の１方は水素であって他は−ＮＨ−Ｌ、ここにＬはソラ ーレン部分との直接結合またはソラレーン部分と結合したリンカーアーム；Ｒ３ およびＲ４の１方が水素であって他が炭素原子数約１から約１０個の低級アルキ ル基；ＹおよびＺは独立して−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＨ２−を表 す）を含んでいる請求項６３のオリゴマー。
  78. ７８．Ｌが−Ｐｓ、 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼ （ここに、ｎおよびｍは独立して約１から約１５の整数、Ｐｓはソラーレン部分 を含有する） から選択される請求項７７のオリゴマー。
  79. ７９．メチルりん酸オリゴマーを含有する請求項７８のオリゴマー。
  80. ８０．Ｌが、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここにｎは１から５の整数を表す） で示される請求項７９のオリゴマー。
  81. ８１．約６から約３１個のモノマー単位を含有する請求項８０のオリゴマー。
  82. ８２．約１から約５個の独立して選択された非ヌクレオチドモノマー単位を含ん でいる請求項８１のオリゴマー。
  83. ８３．該非ヌクレオチドモノマー単位がキラル的に純粋な請求項８２のオリゴマ ー。
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