JPWO2020128870A5 - - Google Patents
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Description
本発明はまた、以下の工程を含む、ヘテロダイマー抗体を作製する方法を提供する：
第1のCH3領域を含む免疫グロブリンの第1のFc領域を含む第1のホモダイマー抗体と、第2のCH3領域を含む免疫グロブリンの第2のFc領域を含む第2のホモダイマー抗体とを提供する工程であって、第1のCH3領域と第2のCH3領域のアミノ酸配列は異なっており、かつ第1のCH3領域と第2のCH3領域のアミノ酸配列は、第1のCH3領域と第2のCH3領域の間のヘテロダイマー相互作用が第1のCH3領域間のホモダイマー相互作用または第2のCH3領域間のホモダイマー相互作用よりも強いようなものである、工程；
第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体を組み合わせて混合物にする工程；
該混合物を還元剤の存在下でインキュベートする工程；および
該還元剤を除去してヘテロダイマー抗体を作製する工程であって、該混合物を該還元剤の存在下でインキュベートする工程、該還元剤を除去してヘテロダイマー抗体を作製する工程、または該混合物を該還元剤の存在下でインキュベートしかつ該還元剤を除去してヘテロダイマー抗体を作製する工程の間、溶存酸素（DO2）のパーセント（％）が、約30％以下となるように制御される、工程。
[本発明1001]
以下の工程を含む、ヘテロダイマー抗体を作製する方法：
a）第1のCH3領域を含む免疫グロブリンの第1のFc領域を含む第1のホモダイマー抗体と、第2のCH3領域を含む免疫グロブリンの第2のFc領域を含む第2のホモダイマー抗体とを提供する工程であって、第1のCH3領域と第2のCH3領域のアミノ酸配列は異なっており、かつ第1のCH3領域と第2のCH3領域のアミノ酸配列は、第1のCH3領域と第2のCH3領域の間のヘテロダイマー相互作用が第1のCH3領域間のホモダイマー相互作用または第2のCH3領域間のホモダイマー相互作用よりも強いようなものである、工程；
b）第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体を組み合わせて混合物にする工程；ならびに
c）該混合物を還元剤および周囲の溶存酸素（DO 2 ）の存在下でインキュベートしてヘテロダイマー抗体を作製する工程であって、該方法が、ヘテロダイマー抗体を作製している間の、該混合物中のパーセント（％）DO 2 を測定する工程、該混合物中の％DO 2 を制御する工程、または該混合物に酸素を添加する工程のうちの1つまたは複数を欠いている、工程。
[本発明1002]
前記混合物中の％DO 2 が、工程1b）で約30％以上である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
ヘテロダイマー抗体を作製している間、％DO 2 が約10％～約90％である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
工程1b）において、約1：1～約1：2のモル比で第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体が組み合わされて混合物になる、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
工程1b）において、約1.05：1のモル比で第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体が組み合わされて混合物になる、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記混合物中の免疫グロブリンの総濃度が、約8g/L～約13g/L、例えば約10.5g/Lである、本発明1001～1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記混合物が、前記還元剤の存在下で約10分以上インキュベートされる、本発明1001～1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記混合物が、前記還元剤の存在下で約10分～約24時間インキュベートされる、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記還元剤が、2-メルカプトエチルアミン（2-MEA）、2-MEAの化学的誘導体、L-システインまたはD-システインである、本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記混合物中の2-MEAの濃度が、約20mM～40mM、例えば約35mMである、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記混合物がバッファーを含む、本発明1001～1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記バッファーが酢酸ナトリウムバッファーを含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記バッファーがNaClをさらに含む、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記バッファーが約100mM酢酸ナトリウムおよび約30mM NaClを含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記バッファーのpHが約7.3である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記混合物から前記還元剤を除去する工程を含む、本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記還元剤がろ過によって除去される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
ろ過が透析ろ過である、本発明1017の方法。
[本発明1019]
第1のホモダイマー抗体および第2のホモダイマー抗体が、IgG1、IgG2またはIgG4アイソタイプである、本発明1001～1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
SEQ ID NO: 1の野生型IgG1、SEQ ID NO: 2の野生型IgG2、またはSEQ ID NO: 3の野生型IgG4と比較すると、第1のCH3ドメインおよび第2のCH3ドメインが以下の変異を含む、本発明1019の方法：
F405L/K409R、野生型/F405L_R409K、T350I_K370T_F405L/K409R、K370W/K409R、D399AFGHILMNRSTVWY/K409R、T366ADEFGHILMQVY/K409R、L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH、D399FHKRQ/K409AGRH、F405IKLSTVW/K409AGRH、Y407LWQ/K409AGRH、T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S、T366W/T366S_L368A_Y407V、L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W、K409D/D399K、K409E/D399R、K409D_K360D/D399K_E356K、K409D_K360D/D399E_E356K、K409D_K370D/D399K_E357K、K409D_K370D/D399E_E357K、K409D_K392D/D399K_E356K_E357K、またはK409D_K392D/D399E_E356K_E357K。
[本発明1021]
SEQ ID NO: 1の野生型IgG1、SEQ ID NO: 2の野生型IgG2、またはSEQ ID NO: 3の野生型IgG4と比較すると、第1のFc領域および/または第2のFc領域が、Fcγ受容体（FcγR）、FcRn、またはプロテインAへの第1のFc領域および/または第2のFc領域の結合を調節する1つまたは複数の変異を含む、本発明1020の方法。
[本発明1022]
FcγRがFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIbまたはFcγRIIIである、本発明1021の方法。
[本発明1023]
Fcγへの第1のFc領域および/または第2のFc領域の結合を調節する1つまたは複数の置換が、L234A_L235A、F234A_L235A、S228P_F234A_L235A、S228P_L234A_L235A、V234A_G237A_P238S_H268A_V309L_A330S_P331S、V234A_G237A、H268Q_V309L_A330S_P331S、S267E_L328F、L234F_L235E_D265A、L234A_L235A_G237A_P238S_H268A_A330S_P331S、またはS228P_F234A_L235A_G237A_P238Sである、本発明1021の方法。
[本発明1024]
FcRnへの第1のFc領域および/または第2のFc領域の結合を調節する1つまたは複数の置換が、M428L_N434S、M252Y_S254T_T256E、T250Q_M428L、N434AおよびT307A_E380A_N434A、H435A、P257I_N434H、D376V_N434H、M252Y_S254T_T256E_H433K_N434F、T308P_N434A、またはH435Rである、本発明1021の方法。
[本発明1025]
プロテインAへの第1のFc領域および/または第2のFc領域の結合を調節する1つまたは複数の置換が、Q311R、Q311K、T307P_L309Q、T307P_V309Q、T307P_L309Q_Q311R、T307P_V309Q_Q311R、H435R、またはH435R_Y436Fである、本発明1021の方法。
[本発明1026]
ヘテロダイマー抗体を作製する工程がGMPに準拠した条件下で行われる、本発明1001～1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
ヘテロダイマー抗体を作製する工程が、ヘテロダイマー抗体を含む原薬の製造中に行われる、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記ヘテロダイマー抗体が二重特異性抗体である、本発明1001～1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
前記二重特異性抗体がCD3、CD123、BCMA、EGFR、もしくはc-Met、またはそれらの任意の組み合わせと結合する、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記混合物中の総免疫グロブリンに対する前記還元剤の質量比が、約1.0～約5.0である、本発明1001～1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記質量比が約1.4～約3.8である、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記質量比が約3.3～約4.4である、本発明1030の方法。
[本発明1033]
以下の工程を含む、ヘテロダイマー抗体を作製する方法：
a）第1のCH3領域を含む免疫グロブリンの第1のFc領域を含む第1のホモダイマー抗体と、第2のCH3領域を含む免疫グロブリンの第2のFc領域を含む第2のホモダイマー抗体とを提供する工程であって、第1のCH3領域と第2のCH3領域のアミノ酸配列は異なっており、かつ第1のCH3領域と第2のCH3領域のアミノ酸配列は、第1のCH3領域と第2のCH3領域の間のヘテロダイマー相互作用が第1のCH3領域間のホモダイマー相互作用または第2のCH3領域間のホモダイマー相互作用よりも強いようなものである、工程；
b）第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体を組み合わせて混合物にする工程；
c）該混合物を還元剤の存在下でインキュベートする工程；および
d）該還元剤を除去してヘテロダイマー抗体を作製する工程であって、工程c）、工程d）、または工程c）と工程d）の両方において、溶存酸素（DO 2 ）のパーセント（％）が、約30％以下となるように制御される、工程。
[本発明1034]
前記混合物の％DO 2 が、約25％以下、20％以下、約15％以下、約10％以下、約9％以下、約8％以下、約7％以下、約6％以下、約5％以下、約4％以下、約3％以下、約2％以下、または約1％以下である、本発明1033の方法。
[本発明1035]
％DO 2 が窒素のオーバーレイによって制御される、本発明1034の方法。
[本発明1036]
工程b）において、約1：1～約1：2のモル比で第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体が組み合わされて混合物になる、本発明1034または1035の方法。
[本発明1037]
工程b）において、約1.05：1のモル比で第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体が組み合わされて混合物になる、本発明1034または1035の方法。
[本発明1038]
前記混合物中の免疫グロブリンの総濃度が約10.5g/Lである、本発明1033～1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記混合物が前記還元剤の存在下で約10分以上インキュベートされる、本発明1033～1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
前記混合物が前記還元剤の存在下で約10分～約24時間インキュベートされる、本発明1033～1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
前記還元剤が、2-メルカプトエチルアミン（2-MEA）、2-MEAの化学的誘導体、L-システインまたはD-システインである、本発明1033～1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
前記混合物中の2-MEAの濃度が約35mMである、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記混合物がバッファーを含む、本発明1033～1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記バッファーが酢酸ナトリウムバッファーを含む、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記バッファーがNaClをさらに含む、本発明1044の方法。
[本発明1046]
前記バッファーが約100mM酢酸ナトリウムおよび約30mM NaClを含む、本発明1045の方法。
[本発明1047]
前記バッファーのpHが約7.3である、本発明1046の方法。
[本発明1048]
前記混合物から前記還元剤を除去する工程を含む、本発明1033～1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
前記還元剤がろ過によって除去される、本発明1048の方法。
[本発明1050]
ろ過が透析ろ過である、本発明1049の方法。
[本発明1051]
第1のホモダイマー抗体および第2のホモダイマー抗体が、IgG1、IgG2またはIgG4アイソタイプである、本発明1033～1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
SEQ ID NO: 1の野生型IgG1、SEQ ID NO: 2の野生型IgG2、またはSEQ ID NO: 3の野生型IgG4と比較すると、第1のCH3ドメインおよび第2のCH3ドメインが以下の変異を含む、本発明1051の方法：
F405L/K409R、野生型/F405L_R409K、T350I_K370T_F405L/K409R、K370W/K409R、D399AFGHILMNRSTVWY/K409R、T366ADEFGHILMQVY/K409R、L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH、D399FHKRQ/K409AGRH、F405IKLSTVW/K409AGRH、Y407LWQ/K409AGRH、T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S、T366W/T366S_L368A_Y407V、L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W、K409D/D399K、K409E/D399R、K409D_K360D/D399K_E356K、K409D_K360D/D399E_E356K、K409D_K370D/D399K_E357K、K409D_K370D/D399E_E357K、K409D_K392D/D399K_E356K_E357K、またはK409D_K392D/D399E_E356K_E357K。
[本発明1053]
SEQ ID NO: 1の野生型IgG1、SEQ ID NO: 2の野生型IgG2、またはSEQ ID NO: 3の野生型IgG4と比較すると、第1のFc領域および/または第2のFc領域が、Fcγ受容体（FcγR）、FcRn、またはプロテインAへの第1のFc領域および/または第2のFc領域の結合を調節する1つまたは複数の変異を含む、本発明1052の方法。
[本発明1054]
FcγRがFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIbまたはFcγRIIIである、本発明1053の方法。
[本発明1055]
Fcγへの第1のFc領域および/または第2のFc領域の結合を調節する1つまたは複数の置換が、L234A_L235A、F234A_L235A、S228P_F234A_L235A、S228P_L234A_L235A、V234A_G237A_P238S_H268A_V309L_A330S_P331S、V234A_G237A、H268Q_V309L_A330S_P331S、S267E_L328F、L234F_L235E_D265A、L234A_L235A_G237A_P238S_H268A_A330S_P331S、またはS228P_F234A_L235A_G237A_P238Sである、本発明1053の方法。
[本発明1056]
FcRnへの第1のFc領域および/または第2のFc領域の結合を調節する1つまたは複数の置換が、M428L_N434S、M252Y_S254T_T256E、T250Q_M428L、N434AおよびT307A_E380A_N434A、H435A、P257I_N434H、D376V_N434H、M252Y_S254T_T256E_H433K_N434F、T308P_N434A、またはH435Rである、本発明1053の方法。
[本発明1057]
プロテインAへの第1のFc領域および/または第2のFc領域の結合を調節する1つまたは複数の置換が、Q311R、Q311K、T307P_L309Q、T307P_V309Q、T307P_L309Q_Q311R、T307P_V309Q_Q311R、H435R、またはH435R_Y436Fである、本発明1053の方法。
[本発明1058]
ヘテロダイマー抗体を作製する工程がGMPに準拠した条件下で行われる、本発明1033～1057のいずれかの方法。
[本発明1059]
ヘテロダイマー抗体を作製する工程が、ヘテロダイマー抗体を含む原薬の製造中に行われる、本発明1033～1057のいずれかの方法。
[本発明1060]
前記ヘテロダイマー抗体が二重特異性抗体である、本発明1033～1059のいずれかの方法。
[本発明1061]
前記二重特異性抗体がCD3、CD123、BCMA、EGFR、もしくはc-Met、またはそれらの任意の組み合わせと結合する、本発明1060の方法。
[本発明1062]
前記混合物中の総免疫グロブリンに対する前記還元剤の質量比が、約1.0～約5.0である、本発明1033～1061のいずれかの方法。
[本発明1063]
前記質量比が約1.4～約3.8である、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記質量比が約3.3～約4.4である、本発明1062の方法。
[本発明1065]
本発明1001の方法により作製される、単離された二重特異性抗体。
[本発明1066]
EGFRおよびc-Metと結合する、本発明1065の二重特異性抗体。
[本発明1067]
SEQ ID NO: 4の第1の重鎖（HC1）、SEQ ID NO: 5の第1の軽鎖（LC1）、SEQ ID NO: 6の第2の重鎖（HC2）、およびSEQ ID NO: 7の第2の軽鎖（LC2）を含む、本発明1065または1066の二重特異性抗体。
[本発明1068]
CD3と結合する、本発明1065の二重特異性抗体。
[本発明1069]
本発明1033の方法により作製される、単離された二重特異性抗体。
[本発明1070]
EGFRおよびc-Metと結合する、本発明1069の二重特異性抗体。
[本発明1071]
SEQ ID NO: 4の第1の重鎖（HC1）、SEQ ID NO: 5の第1の軽鎖（LC1）、SEQ ID NO: 6の第2の重鎖（HC2）、およびSEQ ID NO: 7の第2の軽鎖（LC2）を含む、本発明1069または1070の二重特異性抗体。
[本発明1072]
CD3と結合する、本発明1069の二重特異性抗体。
第1のCH3領域を含む免疫グロブリンの第1のFc領域を含む第1のホモダイマー抗体と、第2のCH3領域を含む免疫グロブリンの第2のFc領域を含む第2のホモダイマー抗体とを提供する工程であって、第1のCH3領域と第2のCH3領域のアミノ酸配列は異なっており、かつ第1のCH3領域と第2のCH3領域のアミノ酸配列は、第1のCH3領域と第2のCH3領域の間のヘテロダイマー相互作用が第1のCH3領域間のホモダイマー相互作用または第2のCH3領域間のホモダイマー相互作用よりも強いようなものである、工程；
第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体を組み合わせて混合物にする工程；
該混合物を還元剤の存在下でインキュベートする工程；および
該還元剤を除去してヘテロダイマー抗体を作製する工程であって、該混合物を該還元剤の存在下でインキュベートする工程、該還元剤を除去してヘテロダイマー抗体を作製する工程、または該混合物を該還元剤の存在下でインキュベートしかつ該還元剤を除去してヘテロダイマー抗体を作製する工程の間、溶存酸素（DO2）のパーセント（％）が、約30％以下となるように制御される、工程。
[本発明1001]
以下の工程を含む、ヘテロダイマー抗体を作製する方法：
a）第1のCH3領域を含む免疫グロブリンの第1のFc領域を含む第1のホモダイマー抗体と、第2のCH3領域を含む免疫グロブリンの第2のFc領域を含む第2のホモダイマー抗体とを提供する工程であって、第1のCH3領域と第2のCH3領域のアミノ酸配列は異なっており、かつ第1のCH3領域と第2のCH3領域のアミノ酸配列は、第1のCH3領域と第2のCH3領域の間のヘテロダイマー相互作用が第1のCH3領域間のホモダイマー相互作用または第2のCH3領域間のホモダイマー相互作用よりも強いようなものである、工程；
b）第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体を組み合わせて混合物にする工程；ならびに
c）該混合物を還元剤および周囲の溶存酸素（DO 2 ）の存在下でインキュベートしてヘテロダイマー抗体を作製する工程であって、該方法が、ヘテロダイマー抗体を作製している間の、該混合物中のパーセント（％）DO 2 を測定する工程、該混合物中の％DO 2 を制御する工程、または該混合物に酸素を添加する工程のうちの1つまたは複数を欠いている、工程。
[本発明1002]
前記混合物中の％DO 2 が、工程1b）で約30％以上である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
ヘテロダイマー抗体を作製している間、％DO 2 が約10％～約90％である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
工程1b）において、約1：1～約1：2のモル比で第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体が組み合わされて混合物になる、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
工程1b）において、約1.05：1のモル比で第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体が組み合わされて混合物になる、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記混合物中の免疫グロブリンの総濃度が、約8g/L～約13g/L、例えば約10.5g/Lである、本発明1001～1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記混合物が、前記還元剤の存在下で約10分以上インキュベートされる、本発明1001～1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記混合物が、前記還元剤の存在下で約10分～約24時間インキュベートされる、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記還元剤が、2-メルカプトエチルアミン（2-MEA）、2-MEAの化学的誘導体、L-システインまたはD-システインである、本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記混合物中の2-MEAの濃度が、約20mM～40mM、例えば約35mMである、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記混合物がバッファーを含む、本発明1001～1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記バッファーが酢酸ナトリウムバッファーを含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記バッファーがNaClをさらに含む、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記バッファーが約100mM酢酸ナトリウムおよび約30mM NaClを含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記バッファーのpHが約7.3である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記混合物から前記還元剤を除去する工程を含む、本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記還元剤がろ過によって除去される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
ろ過が透析ろ過である、本発明1017の方法。
[本発明1019]
第1のホモダイマー抗体および第2のホモダイマー抗体が、IgG1、IgG2またはIgG4アイソタイプである、本発明1001～1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
SEQ ID NO: 1の野生型IgG1、SEQ ID NO: 2の野生型IgG2、またはSEQ ID NO: 3の野生型IgG4と比較すると、第1のCH3ドメインおよび第2のCH3ドメインが以下の変異を含む、本発明1019の方法：
F405L/K409R、野生型/F405L_R409K、T350I_K370T_F405L/K409R、K370W/K409R、D399AFGHILMNRSTVWY/K409R、T366ADEFGHILMQVY/K409R、L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH、D399FHKRQ/K409AGRH、F405IKLSTVW/K409AGRH、Y407LWQ/K409AGRH、T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S、T366W/T366S_L368A_Y407V、L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W、K409D/D399K、K409E/D399R、K409D_K360D/D399K_E356K、K409D_K360D/D399E_E356K、K409D_K370D/D399K_E357K、K409D_K370D/D399E_E357K、K409D_K392D/D399K_E356K_E357K、またはK409D_K392D/D399E_E356K_E357K。
[本発明1021]
SEQ ID NO: 1の野生型IgG1、SEQ ID NO: 2の野生型IgG2、またはSEQ ID NO: 3の野生型IgG4と比較すると、第1のFc領域および/または第2のFc領域が、Fcγ受容体（FcγR）、FcRn、またはプロテインAへの第1のFc領域および/または第2のFc領域の結合を調節する1つまたは複数の変異を含む、本発明1020の方法。
[本発明1022]
FcγRがFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIbまたはFcγRIIIである、本発明1021の方法。
[本発明1023]
Fcγへの第1のFc領域および/または第2のFc領域の結合を調節する1つまたは複数の置換が、L234A_L235A、F234A_L235A、S228P_F234A_L235A、S228P_L234A_L235A、V234A_G237A_P238S_H268A_V309L_A330S_P331S、V234A_G237A、H268Q_V309L_A330S_P331S、S267E_L328F、L234F_L235E_D265A、L234A_L235A_G237A_P238S_H268A_A330S_P331S、またはS228P_F234A_L235A_G237A_P238Sである、本発明1021の方法。
[本発明1024]
FcRnへの第1のFc領域および/または第2のFc領域の結合を調節する1つまたは複数の置換が、M428L_N434S、M252Y_S254T_T256E、T250Q_M428L、N434AおよびT307A_E380A_N434A、H435A、P257I_N434H、D376V_N434H、M252Y_S254T_T256E_H433K_N434F、T308P_N434A、またはH435Rである、本発明1021の方法。
[本発明1025]
プロテインAへの第1のFc領域および/または第2のFc領域の結合を調節する1つまたは複数の置換が、Q311R、Q311K、T307P_L309Q、T307P_V309Q、T307P_L309Q_Q311R、T307P_V309Q_Q311R、H435R、またはH435R_Y436Fである、本発明1021の方法。
[本発明1026]
ヘテロダイマー抗体を作製する工程がGMPに準拠した条件下で行われる、本発明1001～1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
ヘテロダイマー抗体を作製する工程が、ヘテロダイマー抗体を含む原薬の製造中に行われる、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記ヘテロダイマー抗体が二重特異性抗体である、本発明1001～1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
前記二重特異性抗体がCD3、CD123、BCMA、EGFR、もしくはc-Met、またはそれらの任意の組み合わせと結合する、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記混合物中の総免疫グロブリンに対する前記還元剤の質量比が、約1.0～約5.0である、本発明1001～1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記質量比が約1.4～約3.8である、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記質量比が約3.3～約4.4である、本発明1030の方法。
[本発明1033]
以下の工程を含む、ヘテロダイマー抗体を作製する方法：
a）第1のCH3領域を含む免疫グロブリンの第1のFc領域を含む第1のホモダイマー抗体と、第2のCH3領域を含む免疫グロブリンの第2のFc領域を含む第2のホモダイマー抗体とを提供する工程であって、第1のCH3領域と第2のCH3領域のアミノ酸配列は異なっており、かつ第1のCH3領域と第2のCH3領域のアミノ酸配列は、第1のCH3領域と第2のCH3領域の間のヘテロダイマー相互作用が第1のCH3領域間のホモダイマー相互作用または第2のCH3領域間のホモダイマー相互作用よりも強いようなものである、工程；
b）第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体を組み合わせて混合物にする工程；
c）該混合物を還元剤の存在下でインキュベートする工程；および
d）該還元剤を除去してヘテロダイマー抗体を作製する工程であって、工程c）、工程d）、または工程c）と工程d）の両方において、溶存酸素（DO 2 ）のパーセント（％）が、約30％以下となるように制御される、工程。
[本発明1034]
前記混合物の％DO 2 が、約25％以下、20％以下、約15％以下、約10％以下、約9％以下、約8％以下、約7％以下、約6％以下、約5％以下、約4％以下、約3％以下、約2％以下、または約1％以下である、本発明1033の方法。
[本発明1035]
％DO 2 が窒素のオーバーレイによって制御される、本発明1034の方法。
[本発明1036]
工程b）において、約1：1～約1：2のモル比で第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体が組み合わされて混合物になる、本発明1034または1035の方法。
[本発明1037]
工程b）において、約1.05：1のモル比で第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体が組み合わされて混合物になる、本発明1034または1035の方法。
[本発明1038]
前記混合物中の免疫グロブリンの総濃度が約10.5g/Lである、本発明1033～1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記混合物が前記還元剤の存在下で約10分以上インキュベートされる、本発明1033～1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
前記混合物が前記還元剤の存在下で約10分～約24時間インキュベートされる、本発明1033～1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
前記還元剤が、2-メルカプトエチルアミン（2-MEA）、2-MEAの化学的誘導体、L-システインまたはD-システインである、本発明1033～1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
前記混合物中の2-MEAの濃度が約35mMである、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記混合物がバッファーを含む、本発明1033～1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記バッファーが酢酸ナトリウムバッファーを含む、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記バッファーがNaClをさらに含む、本発明1044の方法。
[本発明1046]
前記バッファーが約100mM酢酸ナトリウムおよび約30mM NaClを含む、本発明1045の方法。
[本発明1047]
前記バッファーのpHが約7.3である、本発明1046の方法。
[本発明1048]
前記混合物から前記還元剤を除去する工程を含む、本発明1033～1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
前記還元剤がろ過によって除去される、本発明1048の方法。
[本発明1050]
ろ過が透析ろ過である、本発明1049の方法。
[本発明1051]
第1のホモダイマー抗体および第2のホモダイマー抗体が、IgG1、IgG2またはIgG4アイソタイプである、本発明1033～1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
SEQ ID NO: 1の野生型IgG1、SEQ ID NO: 2の野生型IgG2、またはSEQ ID NO: 3の野生型IgG4と比較すると、第1のCH3ドメインおよび第2のCH3ドメインが以下の変異を含む、本発明1051の方法：
F405L/K409R、野生型/F405L_R409K、T350I_K370T_F405L/K409R、K370W/K409R、D399AFGHILMNRSTVWY/K409R、T366ADEFGHILMQVY/K409R、L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH、D399FHKRQ/K409AGRH、F405IKLSTVW/K409AGRH、Y407LWQ/K409AGRH、T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S、T366W/T366S_L368A_Y407V、L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W、K409D/D399K、K409E/D399R、K409D_K360D/D399K_E356K、K409D_K360D/D399E_E356K、K409D_K370D/D399K_E357K、K409D_K370D/D399E_E357K、K409D_K392D/D399K_E356K_E357K、またはK409D_K392D/D399E_E356K_E357K。
[本発明1053]
SEQ ID NO: 1の野生型IgG1、SEQ ID NO: 2の野生型IgG2、またはSEQ ID NO: 3の野生型IgG4と比較すると、第1のFc領域および/または第2のFc領域が、Fcγ受容体（FcγR）、FcRn、またはプロテインAへの第1のFc領域および/または第2のFc領域の結合を調節する1つまたは複数の変異を含む、本発明1052の方法。
[本発明1054]
FcγRがFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIbまたはFcγRIIIである、本発明1053の方法。
[本発明1055]
Fcγへの第1のFc領域および/または第2のFc領域の結合を調節する1つまたは複数の置換が、L234A_L235A、F234A_L235A、S228P_F234A_L235A、S228P_L234A_L235A、V234A_G237A_P238S_H268A_V309L_A330S_P331S、V234A_G237A、H268Q_V309L_A330S_P331S、S267E_L328F、L234F_L235E_D265A、L234A_L235A_G237A_P238S_H268A_A330S_P331S、またはS228P_F234A_L235A_G237A_P238Sである、本発明1053の方法。
[本発明1056]
FcRnへの第1のFc領域および/または第2のFc領域の結合を調節する1つまたは複数の置換が、M428L_N434S、M252Y_S254T_T256E、T250Q_M428L、N434AおよびT307A_E380A_N434A、H435A、P257I_N434H、D376V_N434H、M252Y_S254T_T256E_H433K_N434F、T308P_N434A、またはH435Rである、本発明1053の方法。
[本発明1057]
プロテインAへの第1のFc領域および/または第2のFc領域の結合を調節する1つまたは複数の置換が、Q311R、Q311K、T307P_L309Q、T307P_V309Q、T307P_L309Q_Q311R、T307P_V309Q_Q311R、H435R、またはH435R_Y436Fである、本発明1053の方法。
[本発明1058]
ヘテロダイマー抗体を作製する工程がGMPに準拠した条件下で行われる、本発明1033～1057のいずれかの方法。
[本発明1059]
ヘテロダイマー抗体を作製する工程が、ヘテロダイマー抗体を含む原薬の製造中に行われる、本発明1033～1057のいずれかの方法。
[本発明1060]
前記ヘテロダイマー抗体が二重特異性抗体である、本発明1033～1059のいずれかの方法。
[本発明1061]
前記二重特異性抗体がCD3、CD123、BCMA、EGFR、もしくはc-Met、またはそれらの任意の組み合わせと結合する、本発明1060の方法。
[本発明1062]
前記混合物中の総免疫グロブリンに対する前記還元剤の質量比が、約1.0～約5.0である、本発明1033～1061のいずれかの方法。
[本発明1063]
前記質量比が約1.4～約3.8である、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記質量比が約3.3～約4.4である、本発明1062の方法。
[本発明1065]
本発明1001の方法により作製される、単離された二重特異性抗体。
[本発明1066]
EGFRおよびc-Metと結合する、本発明1065の二重特異性抗体。
[本発明1067]
SEQ ID NO: 4の第1の重鎖（HC1）、SEQ ID NO: 5の第1の軽鎖（LC1）、SEQ ID NO: 6の第2の重鎖（HC2）、およびSEQ ID NO: 7の第2の軽鎖（LC2）を含む、本発明1065または1066の二重特異性抗体。
[本発明1068]
CD3と結合する、本発明1065の二重特異性抗体。
[本発明1069]
本発明1033の方法により作製される、単離された二重特異性抗体。
[本発明1070]
EGFRおよびc-Metと結合する、本発明1069の二重特異性抗体。
[本発明1071]
SEQ ID NO: 4の第1の重鎖（HC1）、SEQ ID NO: 5の第1の軽鎖（LC1）、SEQ ID NO: 6の第2の重鎖（HC2）、およびSEQ ID NO: 7の第2の軽鎖（LC2）を含む、本発明1069または1070の二重特異性抗体。
[本発明1072]
CD3と結合する、本発明1069の二重特異性抗体。
Claims (50)
- 以下の工程を含む、ヘテロダイマー抗体を作製する方法：
a）第1のCH3領域を含む免疫グロブリンの第1のFc領域を含む第1のホモダイマー抗体と、第2のCH3領域を含む免疫グロブリンの第2のFc領域を含む第2のホモダイマー抗体とを提供する工程であって、第1のCH3領域と第2のCH3領域のアミノ酸配列は異なっており、かつ第1のCH3領域と第2のCH3領域のアミノ酸配列は、第1のCH3領域と第2のCH3領域の間のヘテロダイマー相互作用が第1のCH3領域間のホモダイマー相互作用または第2のCH3領域間のホモダイマー相互作用よりも強いようなものである、工程；
b）第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体を組み合わせて混合物にする工程；
c）該混合物を還元剤の存在下でインキュベートする工程；および
d）該還元剤を除去してヘテロダイマー抗体を作製する工程であって、工程c）、工程d）、または工程c）と工程d）の両方において、溶存酸素（DO2）のパーセント（％）が、約30％以下となるように制御される、工程。 - 工程d）において、%DO 2 が約30%以下となるように制御される、請求項1に記載の方法。
- 前記混合物の％DO2が、約25％以下、20％以下、約15％以下、約10％以下、約9％以下、約8％以下、約7％以下、約6％以下、約5％以下、約4％以下、約3％以下、約2％以下、または約1％以下である、請求項1または2に記載の方法。
- 工程d）において、前記混合物の％DO 2 が、約25％以下、20％以下、約15％以下、約10％以下、約9％以下、約8％以下、約7％以下、約6％以下、約5％以下、約4％以下、約3％以下、約2％以下、または約1％以下である、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
- ％DO2が窒素のオーバーレイによって制御される、請求項1～4のいずれか一項に記載の方法。
- 工程b）において、約1：1～約1：2のモル比で第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体が組み合わされて混合物になる、請求項1～5のいずれか一項に記載の方法。
- 工程b）において、約1.05：1のモル比で第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体が組み合わされて混合物になる、請求項1～5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合物中の免疫グロブリンの総濃度が約10.5g/Lである、請求項1～7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合物が前記還元剤の存在下で約10分以上、例えば、約10分～約24時間インキュベートされる、請求項1～8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記還元剤が、2-メルカプトエチルアミン（2-MEA）、2-MEAの化学的誘導体、L-システインまたはD-システインである、請求項1～9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合物中の2-MEAの濃度が約35mMである、請求項10に記載の方法。
- 前記混合物がバッファー、例えば酢酸ナトリウムバッファーを含むバッファーを含み、かつ、任意で、該バッファーがNaClをさらに含む、請求項1～11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バッファーが約100mM酢酸ナトリウムおよび約30mM NaClを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記バッファーのpHが約7.3である、請求項12または13に記載の方法。
- 前記混合物から前記還元剤を除去する工程であって、任意で、前記還元剤が、ろ過、例えば透析ろ過によって除去される、工程
を含む、請求項1～14のいずれか一項に記載の方法。 - 第1のホモダイマー抗体および第2のホモダイマー抗体が、IgG1、IgG2またはIgG4アイソタイプである、請求項1～15のいずれか一項に記載の方法。
- SEQ ID NO: 1の野生型IgG1、SEQ ID NO: 2の野生型IgG2、またはSEQ ID NO: 3の野生型IgG4と比較すると、第1のCH3ドメインおよび第2のCH3ドメインが以下の変異を含む、請求項16に記載の方法：
F405L/K409R、野生型/F405L_R409K、T350I_K370T_F405L/K409R、K370W/K409R、D399AFGHILMNRSTVWY/K409R、T366ADEFGHILMQVY/K409R、L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH、D399FHKRQ/K409AGRH、F405IKLSTVW/K409AGRH、Y407LWQ/K409AGRH、T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S、T366W/T366S_L368A_Y407V、L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W、K409D/D399K、K409E/D399R、K409D_K360D/D399K_E356K、K409D_K360D/D399E_E356K、K409D_K370D/D399K_E357K、K409D_K370D/D399E_E357K、K409D_K392D/D399K_E356K_E357K、またはK409D_K392D/D399E_E356K_E357K。 - SEQ ID NO: 1の野生型IgG1、SEQ ID NO: 2の野生型IgG2、またはSEQ ID NO: 3の野生型IgG4と比較すると、第1のFc領域および/または第2のFc領域が、Fcγ受容体（FcγR）、FcRn、またはプロテインAへの第1のFc領域および/または第2のFc領域の結合を調節する1つまたは複数の変異を含み、任意で、FcγRがFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIbまたはFcγRIIIである、請求項16または17に記載の方法。
- Fcγへの第1のFc領域および/もしくは第2のFc領域の結合を調節する1つもしくは複数の置換が、L234A_L235A、F234A_L235A、S228P_F234A_L235A、S228P_L234A_L235A、V234A_G237A_P238S_H268A_V309L_A330S_P331S、V234A_G237A、H268Q_V309L_A330S_P331S、S267E_L328F、L234F_L235E_D265A、L234A_L235A_G237A_P238S_H268A_A330S_P331S、もしくはS228P_F234A_L235A_G237A_P238Sであるか、または
FcRnへの第1のFc領域および/もしくは第2のFc領域の結合を調節する1つもしくは複数の置換が、M428L_N434S、M252Y_S254T_T256E、T250Q_M428L、N434AおよびT307A_E380A_N434A、H435A、P257I_N434H、D376V_N434H、M252Y_S254T_T256E_H433K_N434F、T308P_N434A、もしくはH435Rであるか、または
プロテインAへの第1のFc領域および/もしくは第2のFc領域の結合を調節する1つもしくは複数の置換が、Q311R、Q311K、T307P_L309Q、T307P_V309Q、T307P_L309Q_Q311R、T307P_V309Q_Q311R、H435R、もしくはH435R_Y436Fである、
請求項18に記載の方法。 - ヘテロダイマー抗体を作製する工程がGMPに準拠した条件下で行われる、請求項1～19のいずれか一項に記載の方法。
- ヘテロダイマー抗体を作製する工程が、ヘテロダイマー抗体を含む原薬の製造中に行われる、請求項1～19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヘテロダイマー抗体が二重特異性抗体である、請求項1～21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体がCD3、CD123、BCMA、EGFR、もしくはc-Met、またはそれらの任意の組み合わせと結合する、請求項22に記載の方法。
- 前記混合物中の総免疫グロブリンに対する前記還元剤の質量比が、約1.0～約5.0である、請求項1～23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記質量比が約1.4～約3.8である、請求項24に記載の方法。
- 前記質量比が約3.3～約4.4である、請求項24に記載の方法。
- 以下の工程を含む、ヘテロダイマー抗体を作製する方法：
a）第1のCH3領域を含む免疫グロブリンの第1のFc領域を含む第1のホモダイマー抗体と、第2のCH3領域を含む免疫グロブリンの第2のFc領域を含む第2のホモダイマー抗体とを提供する工程であって、第1のCH3領域と第2のCH3領域のアミノ酸配列は異なっており、かつ第1のCH3領域と第2のCH3領域のアミノ酸配列は、第1のCH3領域と第2のCH3領域の間のヘテロダイマー相互作用が第1のCH3領域間のホモダイマー相互作用または第2のCH3領域間のホモダイマー相互作用よりも強いようなものである、工程；
b）第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体を組み合わせて混合物にする工程；ならびに
c）該混合物を還元剤および周囲の溶存酸素（DO2）の存在下でインキュベートしてヘテロダイマー抗体を作製する工程であって、該方法が、ヘテロダイマー抗体を作製している間の、該混合物中のパーセント（％）DO2を測定する工程、該混合物中の％DO2を制御する工程、または該混合物に酸素を添加する工程のうちの1つまたは複数を欠いている、工程。 - ヘテロダイマー抗体を作製している間の、前記混合物中のパーセント（%）DO2を測定する工程を欠いており、かつ、ヘテロダイマー抗体を作製している間の、前記混合物に酸素を添加する工程を欠いている、請求項27に記載の方法。
- 前記混合物中の％DO2が、工程1b）で約30％以上である、請求項27または28に記載の方法。
- ヘテロダイマー抗体を作製している間、％DO2が約10％～約90％である、請求項27～29のいずれか一項に記載の方法。
- 工程1b）において、約1：1～約1：2のモル比で第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体が組み合わされて混合物になるか、または、工程1b）において、約1.05：1のモル比で第1のホモダイマー抗体と第2のホモダイマー抗体が組み合わされて混合物になる、請求項27～30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合物中の免疫グロブリンの総濃度が、約8g/L～約13g/L、例えば約10.5g/Lである、請求項27～31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合物が、前記還元剤の存在下で約10分以上、例えば、約10分～約24時間インキュベートされる、請求項27～32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記還元剤が、2-メルカプトエチルアミン（2-MEA）、2-MEAの化学的誘導体、L-システインまたはD-システインである、請求項27～33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合物中の2-MEAの濃度が、約20mM～40mM、例えば約35mMである、請求項34に記載の方法。
- 前記混合物がバッファー、例えば酢酸ナトリウムバッファーを含むバッファーを含み、かつ、任意で、該バッファーがNaClをさらに含む、請求項27～35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バッファーが約100mM酢酸ナトリウムおよび約30mM NaClを含む、請求項36に記載の方法。
- 前記バッファーのpHが約7.3である、請求項36または37に記載の方法。
- 前記混合物から前記還元剤を除去する工程を含み、任意で、前記還元剤が、ろ過、例えば透析ろ過によって除去される、請求項27～38のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のホモダイマー抗体および第2のホモダイマー抗体が、IgG1、IgG2またはIgG4アイソタイプである、請求項27～39のいずれか一項に記載の方法。
- SEQ ID NO: 1の野生型IgG1、SEQ ID NO: 2の野生型IgG2、またはSEQ ID NO: 3の野生型IgG4と比較すると、第1のCH3ドメインおよび第2のCH3ドメインが以下の変異を含む、請求項40に記載の方法：
F405L/K409R、野生型/F405L_R409K、T350I_K370T_F405L/K409R、K370W/K409R、D399AFGHILMNRSTVWY/K409R、T366ADEFGHILMQVY/K409R、L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH、D399FHKRQ/K409AGRH、F405IKLSTVW/K409AGRH、Y407LWQ/K409AGRH、T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S、T366W/T366S_L368A_Y407V、L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W、K409D/D399K、K409E/D399R、K409D_K360D/D399K_E356K、K409D_K360D/D399E_E356K、K409D_K370D/D399K_E357K、K409D_K370D/D399E_E357K、K409D_K392D/D399K_E356K_E357K、またはK409D_K392D/D399E_E356K_E357K。 - SEQ ID NO: 1の野生型IgG1、SEQ ID NO: 2の野生型IgG2、またはSEQ ID NO: 3の野生型IgG4と比較すると、第1のFc領域および/または第2のFc領域が、Fcγ受容体（FcγR）、FcRn、またはプロテインAへの第1のFc領域および/または第2のFc領域の結合を調節する1つまたは複数の変異を含み、任意で、FcγRがFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIbまたはFcγRIIIである、請求項40または41に記載の方法。
- Fcγへの第1のFc領域および/もしくは第2のFc領域の結合を調節する1つもしくは複数の置換が、L234A_L235A、F234A_L235A、S228P_F234A_L235A、S228P_L234A_L235A、V234A_G237A_P238S_H268A_V309L_A330S_P331S、V234A_G237A、H268Q_V309L_A330S_P331S、S267E_L328F、L234F_L235E_D265A、L234A_L235A_G237A_P238S_H268A_A330S_P331S、もしくはS228P_F234A_L235A_G237A_P238Sであるか、または、
FcRnへの第1のFc領域および/もしくは第2のFc領域の結合を調節する1つもしくは複数の置換が、M428L_N434S、M252Y_S254T_T256E、T250Q_M428L、N434AおよびT307A_E380A_N434A、H435A、P257I_N434H、D376V_N434H、M252Y_S254T_T256E_H433K_N434F、T308P_N434A、もしくはH435Rであるか、または
プロテインAへの第1のFc領域および/もしくは第2のFc領域の結合を調節する1つもしくは複数の置換が、Q311R、Q311K、T307P_L309Q、T307P_V309Q、T307P_L309Q_Q311R、T307P_V309Q_Q311R、H435R、もしくはH435R_Y436Fである、
請求項42に記載の方法。 - ヘテロダイマー抗体を作製する工程がGMPに準拠した条件下で行われる、および/または、ヘテロダイマー抗体を作製する工程が、ヘテロダイマー抗体を含む原薬の製造中に行われる、請求項27～43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヘテロダイマー抗体が、二重特異性抗体、任意で、CD3、CD123、BCMA、EGFR、もしくはc-Met、またはそれらの任意の組み合わせと結合する二重特異性抗体である、請求項27～44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合物中の総免疫グロブリンに対する前記還元剤の質量比が、約1.0～約5.0、例えば、約1.4～約3.8または約3.3～約4.4である、請求項27～45のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1～46のいずれか一項に記載の方法により作製される、単離された二重特異性抗体。
- EGFRおよびc-Metと結合する、請求項47に記載の二重特異性抗体。
- SEQ ID NO: 4の第1の重鎖（HC1）、SEQ ID NO: 5の第1の軽鎖（LC1）、SEQ ID NO: 6の第2の重鎖（HC2）、およびSEQ ID NO: 7の第2の軽鎖（LC2）を含む、請求項47または48に記載の二重特異性抗体。
- CD3と結合する、請求項47に記載の二重特異性抗体。
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