KR20210105391A - 이종이량체 항체를 생산하는 방법 - Google Patents

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마이클 티. 카팔디
제프리 코헨
앤드류 데첼
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Abstract

본 발명은 이종이량체 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

이종이량체 항체를 생산하는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 12월 18일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/781,180의 이익을 주장하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 기술분야
본 발명은 이종이량체 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2019년 12월 10일에 생성된 ASCII 텍스트 파일은 파일명이 JBI6029WOPCT1_ST25.txt이고 크기가 21 킬로바이트이다.
모노클로날 항체는 특히 암 치료에서 치료용 분자로서의 성공을 입증하였다. 이중특이적 항체는 약물 또는 독성 화합물을 표적 세포로 지정하거나, 이펙터 메커니즘을 질환-연관 부위로 재지정하거나, 종양 세포에 대한 특이성을 (예를 들어, 종양 세포에서 발현되는 하나 이상의 표적 분자에 대한 결합에 의해) 증가시키는데 사용될 수 있으므로 모노클로날 항체 요법의 효력 및 효능을 증가시킬 것으로 예상된다. 또한, 2개의 모노클로날 항체의 특이성을 하나로 합함으로써, 이중특이적 항체는 잠재적으로 더 많은 작용 메커니즘 어레이에 관여할 수 있다.
상이한 형식의 이중특이적 항체 및 이를 생산하는 방법이 설명되었지만, 제조 공정을 최적화함으로써 대규모로 이중특이적 항체를 생산하는데 어려움이 존재한다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 이종이량체 항체를 생산하는 방법을 제공한다:
제1 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린의 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 동종이량체 항체 및 제2 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린의 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 동종이량체 항체를 제공하는 단계이며, 여기서 제1 CH3 영역 및 제2 CH3 영역의 아미노산 서열은 상이하여, 제1 CH3 영역 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 제1 CH3 영역 사이의 동종이량체 상호작용 또는 제2 CH3 영역 사이의 동종이량체 상호작용보다 강하도록 하는 것인 단계;
제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체를 혼합물로 합하는 단계; 및
환원제 및 주위 용존 산소 (DO2)의 존재하에 혼합물을 인큐베이션하여 이종이량체 항체를 생산하는 단계 - 여기서 방법은 혼합물 중 DO2 백분율 (%)을 측정하는 단계, 혼합물 중 % DO2를 제어하는 단계, 또는 이종이량체 항체를 생산하는 동안 혼합물에 산소를 첨가하는 단계 중 하나 이상의 단계가 결여된다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 이종이량체 항체를 생산하는 방법을 제공한다:
제1 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린의 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 동종이량체 항체 및 제2 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린의 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 동종이량체 항체를 제공하는 단계이며, 여기서 제1 CH3 영역 및 제2 CH3 영역의 아미노산 서열은 상이하여, 제1 CH3 영역 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 제1 CH3 영역 사이의 동종이량체 상호작용 또는 제2 CH3 영역 사이의 동종이량체 상호작용보다 강하도록 하는 것인 단계;
제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체를 혼합물로 합하는 단계; 및
환원제의 존재하에 혼합물을 인큐베이션하는 단계; 및
환원제를 제거하여 이종이량체 항체를 생산하는 단계 - 여기서 용존 산소 (DO2)의 백분율 (%)은 환원제의 존재하에 혼합물을 인큐베이션하는 단계 동안, 이종이량체 항체를 생산하기 위해 환원제를 제거하는 단계 동안, 또는 환원제의 존재하에 혼합물을 인큐베이션하는 단계 및 이종이량체 항체를 생산하기 위해 환원제를 제거하는 단계 동안 약 30% 이하로 제어된다.
도 1은 Fab-아암 교환의 요약을 보여준다.
도 2는 Fab-아암 교환을 사용하여 이중특이적 항체를 제조하는 동안 환원 및 한외여과/투석여과 (UF/DF) 동안의 공정 단계를 보여준다.
도 3은 티올-디술피드 교환 반응의 분자 세부사항을 보여준다.
도 4는 2-MEA의 존재하에 Fab-아암 교환 동안 발생할 수 있는 반응의 요약을 보여준다.
도 5는 UF/DF 셋업의 카툰 및 DO2 및 pH 센서의 위치를 보여준다 (여기서, RmV = 상대 밀리볼트).
도 6은 UF/DF 동안 낮은 DO2 조건에서 이중특이적 항체 A의 제조 동안 보유물, 투과물 및 주입구 라인에서 측정된 UF/DF 동안 DO2 백분율 (%)을 보여준다. a.s.: 공기 포화.
도 7은 UF/DF 동안 낮은 DO2 조건에서 이중특이적 항체 B의 제조 동안 보유물, 투과물 및 주입구 라인에서 측정된 UF/DF 동안 DO2 백분율 (%)을 보여준다. a.s.: 공기 포화.
도 8은 낮은 DO2 조건 (낮은 DO 환원) 또는 주위 DO2 (표적 환원)에서 환원 동안 시간이 지남에 따른 DO2 백분율 (%)을 보여준다. a.s.: 공기 포화.
발명의 상세한 설명
정의
본 명세서에 인용된 특허 및 특허 출원을 포함하나 이에 제한되지는 않는 모든 간행물은 마치 완전히 제시된 것처럼 본원에 참조로 포함된다.
본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험을 위한 실시에 사용될 수 있지만, 예시적인 재료 및 방법이 본원에 기재되어 있다. 본 발명을 설명하고 청구함에 있어서, 하기 용어가 사용될 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같은 단수 형태 "하나"는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 그러므로, 예를 들어 "세포"에 대한 언급은 둘 이상의 세포의 조합 등을 포함한다.
전환 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진", 및 "이루어진"은 특허 언어에서 일반적으로 허용되는 의미를 내포하도록 의도되며; 즉, (i) "포함하는(including)", "함유하는" 또는 "특징화된"과 동의어인 "포함하는(comprising)"은 포괄적이거나 개방형이며, 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않고; (ii) "이루어진"은 청구범위에 특정되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제하고; (iii) "본질적으로 이루어진"은 청구항의 범위를 청구된 발명의 특정된 물질 또는 단계 "및 기본 및 신규 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들"로 제한한다. 문구 "포함하는" (또는 그의 등가물)의 면에서 기재된 실시양태는 또한 "이루어진" 및 "본질적으로 이루어진"의 면에서 독립적으로 기재된 것을 실시양태로서 제공한다.
"항체"는 디술피드 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄 (HC) 및 2개의 경쇄 (LC)를 갖는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역으로 구성되며, 중쇄 불변 영역은 영역 CH1, 힌지, CH2 및 CH3으로 나뉜다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. VH 및 VL은 프레임워크 영역 (FR)이 산재된 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 하는 초가변 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR 세그먼트로 구성되며, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 배열된다. 항체는 뮤린, 인간, 인간화 및 키메라 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 포함하는 모노클로날 항체를 포함한다.
"상보성 결정 영역 (CDR)"은 항원에 결합하는 항체 영역이다. VH에는 3개의 CDR (HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 VL에는 3개의 CDR (LCDR1, LCDR2, LCDR3)이 있다. CDR은 다양한 묘사, 예컨대 카바트(Kabat) (Wu et al. (1970) J Exp Med 132: 211-50) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991), 코티아(Chothia) (Chothia et al. (1987) J Mol Biol 196: 901-17), IMGT (Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77) 및 AbM (Martin and Thornton (1996) J Bmol Biol 263: 800-15)을 사용하여 정의될 수 있다. 다양한 묘사 및 가변 영역 넘버링 사이의 대응이 설명되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77]; [Honegger and Pluckthun, J Mol Biol (2001) 309:657-70]; 인터내셔날 이뮤노제네틱스(International ImMunoGeneTics) (IMGT) 데이터베이스; 웹 리소시스(Web resources), http://www_imgt_org 참조). 이용가능한 프로그램, 예컨대 UCL 비즈니스 PLC(UCL Business PLC)의 abYsis가 CDR을 묘사하는데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "CDR", "HCDR1", "HCDR2", "HCDR3", "LCDR1", "LCDR2" 및 "LCDR3"은 본 명세서에 달리 명시적으로 언급되지 않는 한 상기 기재된 임의의 방법, 카바트, 코티아, IMGT 또는 AbM에 의해 정의된 CDR을 포함한다.
면역글로불린은 중쇄 불변 영역 아미노산 서열에 따라 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 다섯 가지 주요 클래스로 할당될 수 있다. IgA 및 IgG는 이소타입 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 하위 분류된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 두 가지 명확하게 별개의 타입, 즉 카파 (κ) 및 람다 (λ) 중 하나에 할당될 수 있다.
"항원-결합 단편"은 모 전장 항체의 항원 결합 특성을 보유하는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 예시적인 항원-결합 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR) 1, 2 및/또는 3, 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR) 1, 2 및/또는 3, VH, VL, VH 및 VL, Fab, F(ab')2, Fd 및 Fv 단편 뿐만 아니라 1개의 VH 도메인 또는 1개의 VL 도메인으로 이루어진 도메인 항체 (dAb)이다. VH 및 VL 도메인은 합성 링커를 통해 함께 연결되어, VH/VL 도메인이 분자내에서 쌍형성하거나 VH 및 VL 도메인이 별도의 쇄에 의해 발현되는 경우 분자간에 쌍형성하는 다양한 타입의 단일 쇄 항체 설계를 형성하며, 1가 항원 결합 부위, 예컨대 단일 쇄 Fv (scFv) 또는 디아바디를 형성할 수 있다 (예를 들어 국제 특허 공개 번호 WO1998/44001, 국제 특허 공개 번호 WO1988/01649; 국제 특허 공개 번호 WO1994/13804; 국제 특허 공개 번호 WO1992/01047에 기재됨).
"모노클로날 항체"는 항체 분자의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는 가능한 널리 공지된 변경, 예컨대 항체 중쇄로부터 C-말단 리신의 제거 또는 번역후 변형, 예컨대 아미노산 이성질체화 또는 탈아미드화, 메티오닌 산화 또는 아스파라긴 또는 글루타민 탈아미드화를 제외하고 동일하다. 모노클로날 항체는 전형적으로 하나의 항원성 에피토프에 결합한다. 이중특이적 모노클로날 항체는 2개의 별개의 항원성 에피토프에 결합한다. 모노클로날 항체는 항체 집단 내에서 이종 글리코실화를 가질 수 있다. 모노클로날 항체는 단일특이적 또는 다중특이적, 예컨대 이중특이적, 1가, 2가 또는 다가일 수 있다.
"Fab-아암"은 항체의 하나의 중쇄-경쇄 쌍을 지칭한다.
"동종이량체화"는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄의 상호작용을 지칭한다.
"동종이량체"는 동일한 CH3 영역 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"이종이량체화"는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄의 상호작용을 지칭한다.
"이종이량체"는 CH3 영역의 이들의 아미노산 서열이 하나 이상의 아미노산에 의해 상이한 2개의 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"은 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 항체 영역을 지칭한다. Fc 영역은 파파인에 의한 항체의 소화, 또는 Fc 영역이 이에 의해 수득된 단편인 펩신작용에 의해 생성될 수 있으며, 이는 면역글로불린의 하나 또는 둘 모두의 CH2-CH3 영역 및 힌지 영역의 일부를 포함한다. 항체 중쇄의 불변 도메인은 항체 이소타입, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE를 정의한다. Fc-영역은 세포 표면 Fc 수용체 및 보체 시스템의 단백질과 함께 항체의 이펙터 기능을 매개한다.
"CH1 영역" 또는 "CH1 도메인"은 면역글로불린의 CH1 영역을 지칭한다. 인간 IgG1 항체의 CH1 영역은 아미노산 잔기 118-215에 상응한다. 그러나, CH1 영역은 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다른 항체 이소타입일 수 있다.
"CH2 영역" 또는 "CH2 도메인"은 면역글로불린의 CH2 영역을 지칭한다. 인간 IgG1 항체의 CH2 영역은 아미노산 잔기 231-340에 상응한다. 그러나, CH2 영역은 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다른 항체 이소타입일 수 있다.
"CH3 영역" 또는 "CH3 도메인"은 면역글로불린의 CH3 영역을 지칭한다. 인간 IgG1 항체의 CH3 영역은 아미노산 잔기 341-446에 상응한다. 그러나, CH3 영역은 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다른 항체 이소타입일 수 있다.
"힌지" 또는 "힌지 영역"은 면역글로불린의 힌지 영역을 지칭한다. 인간 IgG1 항체의 힌지 영역은 일반적으로 EU 넘버링 시스템에 따라 아미노산 216-230에 상응한다. "힌지"는 또한 상부 및 하부 힌지 영역으로 지칭되는 추가 잔기, 예컨대 아미노산 잔기 216 내지 239를 포함하는 것으로 간주될 수 있다.
"혼합물"은 둘 이상의 항체의 수용액을 지칭한다.
"환원제"는 항체의 힌지 영역에서 쇄간 디술피드 결합을 환원시킬 수 있는 작용제를 지칭한다.
"GMP-준수 조건"은 FDA에서 시행하는 우수 제조 관리기준 (CGMP) 규정에 따른 제조를 지칭한다. CGMP는 제조 공정 및 설비의 적절한 설계, 모니터링 및 제어를 보장하는 시스템을 제공한다. CGMP 규정을 준수하는 것은 약제 제조업체가 제조 작업을 적절히 제어하도록 요구함으로써 약물 제품의 동일성, 강도, 품질 및 순도를 보장한다. 이는 강한 품질 관리 시스템의 확립, 적절한 품질 원료의 수득, 견고한 운영 절차의 확립, 제품 품질 편차의 검출 및 조사, 및 신뢰가능한 시험 실험실의 유지를 포함한다. 제약 회사의 이 공식적인 제어 시스템은 적절히 실행되면 오염, 혼동, 편차, 실패 및 오류의 사례를 방지하는데 도움이 된다. 이는 약물 제품이 이들의 품질 표준을 충족함을 보장한다.
"약물 물질" 또는 "DS"는 약물 (약제) 제품의 제조에 사용되도록 의도된 임의의 물질 또는 물질들의 혼합물을 지칭하며, 약물 생산에 사용될 때 약물 제품의 활성 성분이 된다. 이러한 물질은 질환의 진단, 치유, 경감, 치료 또는 예방에 약리학적 활성 또는 다른 직접적인 효과를 제공하거나 신체의 구조 또는 기능에 영향을 주도록 의도된다.
"약물 제품" 또는 "DP"는 활성 제약 성분 (예를 들어, 약물 물질)을 일반적으로 함유하지만 반드시 비활성 성분과 함께 함유하는 것은 아닌 최종 투여 형태, 예를 들어 정제, 캡슐 또는 용액을 지칭한다.
"참조 제품"은 바이오시밀러 제품과 비교되는 승인된 생물학적 제품을 지칭한다. 참조 제품은 무엇보다도 안전성 및 유효성 데이터의 완전한 보완에 기초하여 승인되고, 미국, 유럽 또는 일본 중 적어도 하나에서 승인된다.
"바이오시밀러" (승인된 참조 제품/생물학적 약물의)는 (a) 임상적으로 비활성 구성성분의 사소한 차이에도 불구하고 생물학적 제품이 참조 제품과 고도로 유사하다는 것을 입증하는 분석적 연구; (b) 동물 연구 (독성 평가 포함); 및/또는 (c) 참조 제품이 허가되고 사용되도록 의도되고 바이오시밀러에 대한 허가가 필요한 하나 이상의 적절한 사용 조건에서 안전성, 순도 및 효력을 입증하기에 충분한 임상 연구 또는 연구들 (면역원성 및 약동학 또는 약역학 평가 포함)에서 파생된 데이터에 기초하여, 안전성, 순도 및 효력의 면에서 바이오시밀러 및 참조 제품 사이에 임상적으로 의미있는 차이가 없는 임상적으로 비활성 구성성분의 사소한 차이에도 불구하고 참조 제품과 고도로 유사한 생물학적 제품을 지칭한다. 바이오시밀러는 처방 의료 전문가의 개입 없이 약국에서 참조 제품으로 치환될 수 있는 상호교환가능한 제품일 수 있다. "상호교환가능성"의 추가 표준을 충족하기 위해, 바이오시밀러는 임의의 주어진 환자에서 참조 제품과 동일한 임상 결과를 생성할 것으로 예상되며, 바이오시밀러가 개체에게 1회 초과 투여되는 경우, 바이오시밀러 및 참조 제품의 사용 간의 교대 또는 스위치의 안전성 또는 감쇠된 효능의 면에서 위험은 이러한 교대 또는 스위치 없이 참조 제품을 사용할 위험보다 크지 않다. 바이오시밀러는 참조 제품에 대한 메커니즘이 공지된 범위까지 제안된 사용 조건에 대해 동일한 작용 메커니즘을 사용한다. 바이오시밀러에 대해 제안된 라벨링에서 처방, 추천 또는 제안된 사용 조건 또는 조건들은 참조 제품에 대해 이전에 승인된 것이어야 한다. 바이오시밀러의 투여 경로, 투여 형태 및/또는 강도는 참조 제품의 것과 동일해야 하며, 바이오시밀러는 바이오시밀러가 안전성, 순도 및 효력을 계속 유지함을 보장하도록 설계된 표준을 충족하는 설비에서 제조, 가공, 포장 또는 보관되어야 한다. 바이오시밀러는 바이오시밀러 성능을 변화시킬 것으로 예상되지 않는 N- 또는 C-말단 말단절단과 같이 참조 제품과 비교할 때 아미노산 서열의 사소한 변형을 포함할 수 있다. 참조 제품은 미국, 유럽 또는 일본 중 적어도 하나에서 승인될 수 있다.
"단리된"은 분자가 생산되는 시스템의 다른 구성성분 (예컨대 재조합 세포)으로부터 실질적으로 분리 및/또는 정제된 균질한 분자 집단 (예컨대, 합성 폴리뉴클레오티드 또는 단백질, 예컨대 항체), 뿐만 아니라 적어도 하나의 정제 또는 단리 단계를 거친 단백질을 지칭한다. "단리된 항체"는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없는 항체를 지칭하며, 더 높은 순도, 예컨대 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순도로 단리된 항체를 포함한다.
"인간화 항체"는 적어도 하나의 CDR이 비인간 종으로부터 유래되고 적어도 하나의 프레임워크가 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 프레임워크가 발현된 인간 면역글로불린 또는 인간 면역글로불린 생식계열 유전자 서열의 정확한 카피가 아닐 수 있도록 프레임워크에 치환을 포함할 수 있다.
"인간 항체"는 인간 대상체에게 투여될 때 최소 면역 반응을 갖도록 최적화된 항체를 지칭한다. 인간 항체의 가변 영역은 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 인간 항체가 불변 영역 또는 불변 영역의 일부를 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 인간 항체는 인간 항체의 가변 영역이 인간 생식계열 면역글로불린 또는 재배열된 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 수득되는 경우 인간 기원의 서열로부터 "유래"된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이러한 예시적인 시스템은 파지에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리, 및 인간 면역글로불린 유전자좌를 운반하는 트랜스제닉 비인간 동물, 예컨대 마우스 또는 래트이다. "인간 항체"는 전형적으로 인간 항체 및 인간 면역글로불린 유전자좌를 수득하기 위해 사용된 시스템 간의 차이, 체세포 돌연변이의 도입 또는 프레임워크 또는 CDR로의 치환의 의도적인 도입, 또는 둘 모두로 인해 인간에서 발현된 면역글로불린과 비교할 때 아미노산 차이를 함유한다. 전형적으로, "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 또는 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 아미노산 서열이 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 일부 경우에, "인간 항체"는 예를 들어 문헌 [Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86]에 기재된 바와 같은 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래된 컨센서스 프레임워크 서열, 또는 예를 들어 문헌 [Shi et al., (2010) J Mol Biol 397:385-96] 및 WO2009/085462에 기재된 바와 같이 파지에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리로 혼입된 합성 HCDR3을 함유할 수 있다. 적어도 하나의 CDR이 비인간 종으로부터 유래된 항체는 "인간 항체"의 정의에 포함되지 않는다.
"재조합"은 상이한 공급원으로부터의 세그먼트가 재조합 DNA, 항체 또는 단백질을 생산하기 위해 연결될 때 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 DNA, 항체 및 다른 단백질을 지칭한다. "재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 모든 항체, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모솜인 동물 (예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체 또는 그로부터 제조된 하이브리도마 (아래 추가로 설명됨), 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, 재조합, 조합적 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 다른 DNA 서열에 인간 면역글로불린 유전자 서열을 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 항체, 또는 Fab 아암 교환을 사용하여 시험관내에서 생성된 항체, 예컨대 이중특이적 항체를 포함한다.
"이중특이적"은 동일한 항원 내의 2개의 별개의 항원 또는 2개의 별개의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 이중특이적 항체는 다른 관련 항원에 대한 교차-반응성을 가질 수 있거나, 2개 이상의 별개의 항원 간에 공유되는 에피토프에 결합할 수 있다.
"다중특이적"은 동일한 항원 내의 적어도 2개의 별개의 항원 또는 적어도 2개의 별개의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 다중특이적 항체는 예를 들어 동일한 항원 내의 2, 3, 4 또는 5개의 별개의 항원 또는 별개의 에피토프에 결합할 수 있다.
"약"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 이내를 의미하며, 이는 값이 측정 또는 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존할 것이다. 특정 검정, 결과 또는 실시양태의 문맥에서 실시예 또는 명세서의 다른 곳에서 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, "약"은 관련 기술분야에서 실행 당 1 표준 편차 이내 또는 최대 5%의 범위 중 더 큰 범위를 의미한다.
"변이체"는 하나 이상의 변형, 예를 들어 치환, 삽입 또는 결실에 의해 참조 폴리펩티드 또는 참조 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
"돌연변이"는 참조 서열과 비교할 때 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 조작된 또는 자연 발생 변경을 지칭한다. 변경은 하나 이상의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실일 수 있다.
명세서 전반에 걸쳐 항체 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 명시적으로 달리 언급되지 않는 한 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에 기재된 바와 같은 EU 인덱스에 따른다. 항체 불변 쇄 넘버링은 예를 들어 이뮤노제네틱스 웹사이트, IMGT 웹 리소시스, IMGT 사이언티픽 차트(IMGT Scientific charts)에서 찾을 수 있다.
본원에 기재된 CH3 영역의 돌연변이는 제1 중쇄의 제1 CH3 도메인에서 변형된 위치(들) / 제2 중쇄의 제2 CH3 도메인에서 변형된 위치(들)로 표현된다. 예를 들어, F405L/K409R은 제1 CH3 영역의 F405L 돌연변이 및 제2 CH3 영역의 K09R 돌연변이를 지칭한다. L351Y_F405A_Y407V/T394W는 제1 CH3 영역의 L351Y, F40FA 및 Y407V 돌연변이 및 제2 CH3 영역의 T394W 돌연변이를 지칭한다. D399FHKRQ/K409AGRH는 D399가 F, H, K R 또는 Q에 의해 대체될 수 있고, K409가 A, G, R 또는 H에 의해 대체될 수 있는 돌연변이를 지칭한다.
표 1에 나타낸 바와 같이 통상적인 1 및 3-글자 아미노산 코드가 본원에서 사용된다.
<표 1>
Figure pct00001
본 발명의 방법
본 발명은 Fab-아암 교환을 사용하여 이종이량체 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 문헌 (예를 들어 US2014/0303356 참조)에 개시된 것과는 달리 Fab-아암 교환 동안 안정한 이종이량체 항체를 형성하기 위해 이들의 환원 후 디술피드 결합의 재형성에 산소가 필요하지 않다는 확인에 적어도 부분적으로 기초하여, 이종이량체 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)의 대규모 생산 동안 공정 제어를 위한 대안적 접근법을 제공한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 이종이량체 항체를 생산하는 방법을 제공한다:
제1 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린의 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 동종이량체 항체 및 제2 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린의 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 동종이량체 항체를 제공하는 단계이며, 여기서 제1 CH3 영역 및 제2 CH3 영역의 아미노산 서열은 상이하여, 제1 CH3 영역 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 제1 CH3 영역 사이의 동종이량체 상호작용 또는 제2 CH3 영역 사이의 동종이량체 상호작용보다 강하도록 하는 것인 단계;
제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체를 혼합물로 합하는 단계; 및
환원제 및 주위 용존 산소 (DO2)의 존재하에 혼합물을 인큐베이션하여 이종이량체 항체를 생산하는 단계 - 여기서 방법은 혼합물 중 DO2 백분율 (%)을 측정하는 단계, 혼합물 중 % DO2를 제어하는 단계, 또는 이종이량체 항체를 생산하는 동안 혼합물에 산소를 첨가하는 단계 중 하나 이상의 단계가 결여된다.
일부 실시양태에서, 혼합물 중 % DO2는 이종이량체 항체를 생산하는 동안 약 10% 내지 약 90%이다.
일부 실시양태에서, 혼합물 중 % DO2는 변성제의 첨가 전에 혼합물 중 약 30% 이상이다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 이종이량체 항체를 생산하는 방법을 제공한다:
제1 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린의 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 동종이량체 항체 및 제2 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린의 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 동종이량체 항체를 제공하는 단계이며, 여기서 제1 CH3 영역 및 제2 CH3 영역의 아미노산 서열은 상이하여, 제1 CH3 영역 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 제1 CH3 영역 사이의 동종이량체 상호작용 또는 제2 CH3 영역 사이의 동종이량체 상호작용보다 강하도록 하는 것인 단계;
제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체를 혼합물로 합하는 단계; 및
환원제의 존재하에 혼합물을 인큐베이션하는 단계; 및
환원제를 제거하여 이종이량체 항체를 생산하는 단계 - 여기서 용존 산소 (DO2)의 백분율 (%)은 단계 c), 단계 d), 또는 단계 c) 및 단계 d) 모두에서 약 30% 이하로 제어된다.
일부 실시양태에서, 혼합물 중 % DO2는 약 25% 이하, 20% 이하, 약 15% 이하, 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하 또는 약 1% 이하이다.
일부 실시양태에서, % DO2는 혼합물을 불활성 가스, 예컨대 질소로 오버레이함으로써 혼합물로부터 산소를 대체함으로써 제어된다. 용존 산소의 농도는 용존 산소 프로브를 사용하는 것과 같은 공지된 방법에 의해 모니터링될 수 있다.
제1 CH3 영역 및 제2 CH3 영역 영역의 이종이량체 상호작용의 면에서 "더 강한"은 제1 CH3 영역 사이의 동종이량체 상호작용 또는 제2 CH3 영역 사이의 동종이량체 상호작용 중 가장 강한 것보다 2배 초과 더 강한, 예를 들어 3배 초과 더 강한, 4배 초과 더 강한, 또는 5배 초과 더 강할 수 있다. CH3 도메인의 상호작용의 강도는 질량 분광분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 예시적인 검정에서, 제1 CH3 영역 및 제2 CH3 영역을 포함하는 구축물 또는 대안적으로 CH2 영역 둘 모두를 포함하는 구축물은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 제조된다. 제1 CH3 도메인, 제2 CH3 도메인 또는 제1 CH3 도메인 및 제2 CH3 도메인을 함유하는 샘플을 제조하고, 10 kDa MWCO 스핀-필터 컬럼을 사용하여 100 mM 아세트산암모늄 pH 7로 완충제-교환한다. 연속 희석된 샘플 (20 μM-25 nM; 단량체 등가물)의 분취액 (약 1 μL)을 LCT 질량 분광분석기 (워터스(Waters))에서 분석하기 위해 골드-플레이팅된 보로실리케이트 모세관에 부하한다. 단량체 신호 Ms는 스펙트럼에 있는 모든 피크 면적의 분수로 단량체 피크 면적으로 정의된다 (Ms/(Ms+Ds), 여기서 Ds=이량체 신호). 평형에서 단량체의 농도 [M]eq는 Ms·[M]0 (여기서, [M]0은 단량체의 면에서 전체 단백질 농도임)으로 정의된다. 평형에서 이량체 농도 [D]eq는 ([M]0-[M]eq)/2로 정의된다. 그 후, 동종이량체 CH3 상호작용 및 이종이량체 CH3 상호작용에 대한 KD는 [D]eq 대 [M]eq 2의 플롯의 기울기로부터 추출된다.
일부 실시양태에서, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체는 약 1:1의 몰비로 혼합물로 합한다.
일부 실시양태에서, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체는 약 1.05:1의 몰비로 혼합물로 합한다.
일부 실시양태에서, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체는 약 1:1.03 내지 약 1:2의 몰비로 혼합물로 합한다. 일부 실시양태에서, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체는 약 1:1.05 내지 1:1.5의 몰비로 혼합물로 합한다. 일부 실시양태에서, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체는 약 1:1.1 내지 1:1.5의 몰비로 혼합물로 합한다. 일부 실시양태에서, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체는 약 1:1.1 내지 1:1.4의 몰비로 혼합물로 합한다. 일부 실시양태에서, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체는 약 1:1.15 내지 1:1.35의 몰비로 혼합물로 합한다. 일부 실시양태에서, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체는 약 1:1.2 내지 1:1.3의 몰비로 혼합물로 합한다.
일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 1 g/L 내지 70 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 8 g/L 내지 약 50 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 8 g/L 내지 약 13 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 9.0 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 9.5 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 10 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 10.5 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 11.0 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 11.5 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 12.0 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 12.5 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 13.0 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 13.5 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 14.0 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 14.5 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 15.0 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 20.0 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 25.0 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 30.0 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 35.0 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 40.0 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 45.0 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 50.0 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 55.0 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 60.0 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 65.0 g/L이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도는 약 70.0 g/L이다.
일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 10분 이상 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 10분 내지 약 30시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 10분 내지 약 24시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 15분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 20분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 30분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 40분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 50분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 1시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 2시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 3시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 4시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 4시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 5시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 6시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 7시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 8시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 9시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 10시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 11시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 12시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 13시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 14시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 15시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 16시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 17시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 18시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 19시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 20시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 21시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 22시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 23시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 24시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 25시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 26시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 27시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 28시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 29시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 환원제의 존재하에 약 30시간 동안 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 환원제는 2-머캅토에틸아민 (2-MEA)이다. 일부 실시양태에서, 환원제는 2-MEA의 화학적 유도체이다. 일부 실시양태에서, 환원제는 L-시스테인이다. 일부 실시양태에서, 환원제는 D-시스테인이다. 일부 실시양태에서, 환원제는 글루타티온이다. 일부 실시양태에서, 환원제는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀이다.
일부 실시양태에서, 혼합물 중 환원제의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 1 M이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 환원제의 농도는 약 1.0 mM 내지 약 500 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 환원제의 농도는 약 5.0 mM 내지 약 100 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 환원제의 농도는 약 10 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 환원제의 농도는 약 15 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 환원제의 농도는 약 20 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 환원제의 농도는 약 25 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 환원제의 농도는 약 30 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 환원제의 농도는 약 35 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 환원제의 농도는 약 40 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 환원제의 농도는 약 50 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 환원제의 농도는 약 60 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 환원제의 농도는 약 70 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 환원제의 농도는 약 80 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 환원제의 농도는 약 90 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 환원제의 농도는 약 100 mM이다.
일부 실시양태에서, 혼합물 중 2-MEA의 농도는 약 10 mM 내지 약 100 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 2-MEA의 농도는 약 20 mM 내지 약 90 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 2-MEA의 농도는 약 20 mM 내지 약 80 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 2-MEA의 농도는 약 20 mM 내지 약 70 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 2-MEA의 농도는 약 20 mM 내지 약 60 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 2-MEA의 농도는 약 20 mM 내지 약 50 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 2-MEA의 농도는 약 20 mM 내지 약 40 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 2-MEA의 농도는 약 20 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 2-MEA의 농도는 약 25 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 2-MEA의 농도는 약 30 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 2-MEA의 농도는 약 35 mM이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중 2-MEA의 농도는 약 40 mM이다.
일부 실시양태에서 혼합물 중 총 면역글로불린 대 총 환원제의 질량비는 약 1.0 내지 약 5.0이다. 일부 실시양태에서 혼합물 중 총 면역글로불린 대 총 환원제의 질량비는 약 1.4 내지 약 3.8이다. 일부 실시양태에서 혼합물 중 총 면역글로불린 대 총 환원제의 질량비는 약 1.4 내지 약 3.5이다. 일부 실시양태에서, 질량비는 약 1.8 내지 약 3.8이다. 일부 실시양태에서, 질량비는 약 2.3 내지 약 3.0이다. 일부 실시양태에서, 질량비는 약 1.6 내지 약 2.1이다. 일부 실시양태에서, 질량비는 약 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0. 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0. 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 5.0이다. "질량비"는 총 면역글로불린 (리터 당 그램) 대 총 환원제 (리터 당 그램)를 지칭한다. "총 면역글로불린"은 환원 단계 시작시 혼합물 중 2개의 모 항체의 양을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 혼합물은 완충제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 아세트산나트륨 완충제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 NaCl을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 약 100 mM 아세트산나트륨 및 약 30 mM NaCl을 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충제의 pH는 약 7.3이다. 다른 완충제, 예컨대 1 x 둘베코 포스페이트-완충 염수 (DPBS), 인산나트륨 완충제, 인산칼륨 완충제, 트리스 완충제, 히스티딘 완충제 또는 시트레이트 완충제가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 혼합물로부터 환원제를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 환원제는 여과에 의해 제거된다.
일부 실시양태에서, 여과는 투석여과이다.
일부 실시양태에서, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 이소타입이다.
일부 실시양태에서, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체는 IgG1 이소타입이다. 일부 실시양태에서, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체는 IgG2 이소타입이다. 일부 실시양태에서, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체는 IgG4 이소타입이다.
일부 실시양태에서, 제1 CH3 도메인 및 제2 CH3 도메인은 서열식별번호: 1의 야생형 IgG1과 비교할 때 하기 돌연변이를 포함한다: F405L/K409R, T350I_K370T_F405L/K409R, K370W/K409R, D399AFGHILMNRSTVWY/K409R, T366ADEFGHILMQVY/K409R, L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH, D399FHKRQ/K409AGRH, F405IKLSTVW/K409AGRH, Y407LWQ/K409AGRH, T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S, T366W/T366S_L368A_Y407V, L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F, T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W, K409D/D399K, K409E/D399R, K409D_K360D/D399K_E356K, K409D_K360D/D399E_E356K, K409D_K370D/D399K_E357K, K409D_K370D/D399E_E357K, K409D_K392D/D399K_E356K_E357K 또는 K409D_K392D/D399E_E356K_E357K. 돌연변이는 또한 서열식별번호: 2의 야생형 IgG2 또는 서열식별번호: 3의 야생형 IgG4에 도입될 수 있으며, 이 경우 널리 공지된 바와 같이, 특정 돌연변이 부위의 야생형 잔기는 야생형 IgG1, IgG2 및 IgG4 사이의 서열 차이로 인해 IgG1의 것에 상응하지 않을 수 있다. 예를 들어, IgG4 돌연변이 야생형/F405L_R409K는 IgG1 돌연변이 F405L/K409R에 상응하고, IgG4 돌연변이 R409D/D399K는 IgG1 돌연변이 K409D/D399K에 상응한다. 돌연변이는 서열식별번호: 1의 참조 야생형 IgG1, 서열식별번호: 2의 IgG2 및 서열식별번호: 3의 IgG4와 비교된다.
일부 실시양태에서, 제1 Fc 영역 및/또는 제2 Fc 영역은 서열식별번호: 1의 야생형 IgG1, 서열식별번호: 2의 야생형 IgG2, 서열식별번호: 3의 야생형 IgG4와 비교할 때 Fcγ 수용체 (FcγR), FcRn 또는 단백질 A에 대한 제1 Fc 영역 및/또는 제2 Fc 영역의 결합을 조정하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
Figure pct00002
일부 실시양태에서, FcγR은 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb 또는 FcγRIII이다.
일부 실시양태에서, Fcγ에 대한 제1 Fc 영역 및/또는 제2 Fc 영역의 결합을 조정하는 하나 이상의 치환은 L234A_L235A, F234A_L235A, S228P_F234A_L235A, S228P_L234A_L235A, V234A_G237A_P238S_H268A_V309L_A330S_P331S, V234A_G237A, H268Q_V309L_A330S_P331S, S267E_L328F, L234F_L235E_D265A, L234A_L235A_G237A_P238S_H268A_A330S_P331S 또는 S228P_F234A_L235A_G237A_P238S이다.
일부 실시양태에서, FcRn에 대한 제1 Fc 영역 및/또는 제2 Fc 영역의 결합을 조정하는 하나 이상의 치환은 M428L_N434S, M252Y_S254T_T256E, T250Q_M428L, N434A 및 T307A_E380A_N434A, H435A, P257I_N434H, D376V_N434H, M252Y_S254T_T256E_H433K_N434F, T308P_N434A 또는 H435R이다.
일부 실시양태에서, 단백질 A에 대한 제1 Fc 영역 및/또는 제2 Fc 영역의 결합을 조정하는 하나 이상의 치환은 Q311R, Q311K, T307P_L309Q, T307P_V309Q, T307P_L309Q_Q311R, T307P_V309Q_Q311R, H435R 또는 H435R_Y436F이다.
일부 실시양태에서, 이종이량체 항체를 생산하는 단계는 GMP-준수 조건하에 수행된다.
일부 실시양태에서 이종이량체 항체를 생산하는 단계는 이종이량체 항체를 포함하는 약물 물질의 제조 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, 이종이량체 항체는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 CD3, BCMA 또는 CD123에 결합한다.
일부 실시양태에서, 이종이량체 항체를 생산하는 단계는 혁신 약물 제품의 제조 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, 이종이량체 항체를 생산하는 단계는 제네릭 약물 제품의 제조 동안 수행된다.
이종이량체화를 촉진하는 Fab-아암 교환 및 Fc 영역 돌연변이
이종이량체 항체는 Fab-아암 교환을 사용하여 생산될 수 있으며, 여기서 하나의 모 동종이량체 항체의 하나의 중쇄 및 그의 부착된 경쇄 (절반-아암)는 또 다른 모 동종이량체 항체의 하나의 중쇄 및 그의 부착된 경쇄와 교환되어 2개의 중쇄 및 2개의 부착된 경쇄로 구성된 이종이량체 항체를 형성한다 (van der Neut Kolfschoten et al., (2007) Science 317:1554-1557).
2개의 동종이량체 모 항체는 항체의 힌지 영역에서 디술피드 브릿지의 환원 및 재형성시 Fab-아암 교환 및 이종이량체 항체 형성을 선호하는 이들의 CH3 영역의 비대칭 돌연변이를 갖도록 조작된다. Fab-아암 교환 반응의 예시는 도 1에 나타낸다. 2개의 모 동종이량체 항체의 혼합물에 환원제를 도입시, 절반-아암은 해리하고, 비대칭 CH3 돌연변이는 이종이량체 항체의 재형성을 선호한다. 절반-아암 사이의 디술피드 브릿지의 후속 재형성은 형성된 이종이량체 항체를 안정화시킨다 (Gramer et al. (2013) MAbs 5:962-973).
본 발명의 방법에서, CH3 이종이량체 형성을 촉진하는 임의의 CH3 영역 돌연변이, 예컨대 본원에 기재된 것들이 사용될 수 있다. 이종이량체화를 촉진하기 위해 CH3 영역의 변형을 위한 여러 접근법이 공지되어 있다. 전형적으로, 모든 이러한 접근법에서, 제1 CH3 영역 및 제2 CH3 영역은 각 CH3 영역 (또는 이를 포함하는 중쇄)이 더 이상 그 자체와 동종이량체화할 수 없지만 상보적으로 조작된 다른 CH3 영역과 이종이량체화하도록 강제되는 상보적 방식으로 조작된다 (제1 및 제2 CH3 영역이 이종이량체화하고 2개의 제1 또는 2개의 제2 CH3 영역 사이에 동종이량체가 형성되지 않도록).
Fab-아암 교환을 선호하는 CH3 돌연변이는 듀오바디® 돌연변이 (젠맵(Genmab)), 놉-인-홀(Knob-in-Hole) 돌연변이 (제넨텍(Genentech)), 정전기적으로-매칭된 돌연변이 (추가이(Chugai), 암젠(Amgen), 노보 노디스크(NovoNordisk), 온코메드(Oncomed)), 가닥 교환 조작된 도메인 바디 (시드바디(SEEDbody)) (EMD 세로노(EMD Serono)), 및 다른 비대칭 돌연변이 (예를 들어, 자임웍스(Zymeworks))를 포함한다.
듀오바디® 돌연변이 (젠맵)는 예를 들어 US9,150,663 및 US2014/0303356에 개시되어 있으며, 돌연변이 F405L/K409R, 야생형/F405L_R409K, T350I_K370T_F405L/K409R, K370W/K409R, D399AFGHILMNRSTVWY/K409R, T366ADEFGHILMQVY/K409R, L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH, D399FHKRQ/K409AGRH, F405IKLSTVW/K409AGRH 및 Y407LWQ/K409AGRH를 포함한다.
놉-인-홀 돌연변이는 예를 들어 WO1996/027011에 개시되어 있으며, 작은 측쇄 (홀)를 갖는 아미노산이 제1 CH3 영역에 도입되고 큰 측쇄 (놉)를 갖는 아미노산이 제2 CH3 영역에 도입되어 제1 CH3 영역 및 제2 CH3 영역 사이의 우선적 상호작용이 발생하는 CH3 영역의 계면에 돌연변이를 포함한다. 놉 및 홀을 형성하는 예시적인 CH3 영역 돌연변이는 T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S 및 T366W/T366S_L368A_Y407V이다.
중쇄 이종이량체 형성은 US2010/0015133, US2009/0182127, US2010/028637 또는 US2011/0123532에 기재된 바와 같이 제1 CH3 영역의 양으로 하전된 잔기 및 제2 CH3 영역의 음으로 하전된 잔기를 치환함으로써 정전기적 상호작용을 사용하여 촉진될 수 있다.
중쇄 이종이량체화를 촉진하기 위해 사용될 수 있는 다른 비대칭 돌연변이는 US2012/0149876 또는 US2013/0195849에 기재된 바와 같은 L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F, 또는 T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W이다.
시드바디 돌연변이는 US20070287170에 기재된 바와 같이 중쇄 이종이량체화를 촉진하기 위해 선택된 IgG 잔기를 IgA 잔기로 치환하는 것을 포함한다.
사용될 수 있는 다른 예시적인 돌연변이는 WO2007/147901, WO 2011/143545, WO2013157954, WO2013096291 및 US2018/0118849에 기재된 바와 같은 R409D_K370E/D399K_E357K, S354C_T366W/Y349C_ T366S_L368A_Y407V, Y349C_T366W/S354C_T366S_L368A_Y407V, T366K/L351D, L351K/Y349E, L351K/Y349D, L351K/L368E, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, K392D/D399K, K392D/ E356K, K253E_D282K_K322D/D239K_E240K_K292D, K392D_K409D/D356K_D399K이다.
Fab-아암 교환을 위한 이들 상이한 접근법은 WO98050431에 기재된 바와 같은 공통 경쇄를 사용하거나 US9062120에 기재된 바와 같은 인사이드-아웃 테터링된 경쇄를 포함하는 테터링된 경쇄를 사용하는, 다양한 이중특이적 항체 형식, 예컨대 VH/VL 조작을 포함하는 것, 예컨대 VH/VL 도메인 스왑, CH1/CL 도메인 스왑과 조합될 수 있다.
이종이량체 항체의 추가 조작
Fc 조작
이종이량체화를 촉진하는 CH3 영역 돌연변이에 더하여, 본 발명의 방법에 사용되는 항체는 항체 이펙터 기능 또는 반감기를 조정하는 Fc 영역의 돌연변이를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 사용되는 항체는 단백질 A에 대한 항체의 결합을 조정하여 항체의 정제를 용이하게 하는 Fc 돌연변이를 포함할 수 있다.
항체 반감기를 조정하도록 돌연변이될 수 있는 Fc 위치 (예를 들어, FcRn에 대한 결합)는 위치 250, 252, 253, 254, 256, 257, 307, 376, 380, 428, 434 및 435를 포함한다. 단수로 또는 조합으로 만들어질 수 있는 예시적인 돌연변이는 돌연변이 T250Q, M252Y, I253A, S254T, T256E, P257I, T307A, D376V, E380A, M428L, H433K, N434S, N434A, N434H, N434F, H435A 및 H435R이다. 항체의 반감기를 증가시키기 위해 제조될 수 있는 예시적인 단수 또는 조합 돌연변이는 돌연변이 M428L/N434S, M252Y/S254T/T256E, T250Q/M428L, N434A 및 T307A/E380A/N434A이다. 항체의 반감기를 감소시키기 위해 제조될 수 있는 예시적인 단수 또는 조합 돌연변이는 돌연변이 H435A, P257I/N434H, D376V/N434H, M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, T308P/N434A 및 H435R이다.
활성화 Fcγ 수용체 (FcγR)에 대한 항체의 결합을 감소시키고 Fc 이펙터 기능, 예컨대 C1q 결합, 보체 의존적 세포독성 (CDC), 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 또는 식세포작용 (ADCP)을 감소시키는 돌연변이가 Fc 영역에 도입될 수 있다.
활성화 FcγR에 대한 항체의 결합을 감소시키고 후속적으로 이펙터 기능을 감소시키도록 돌연변이될 수 있는 Fc 위치는 위치 214, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 265, 267, 268, 270, 295, 297, 309, 327, 328, 329, 330, 331 및 365를 포함한다. 단수로 또는 조합으로 만들어질 수 있는 예시적인 돌연변이는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 돌연변이 K214T, E233P, L234V, L234A, G236의 결실, V234A, F234A, L235A, G237A, P238A, P238S, D265A, S267E, H268A, H268Q, Q268A, N297A, A327Q, P329A, D270A, Q295A, V309L, A327S, L328F, A330S 및 P331S이다. 감소된 ADCC를 갖는 항체를 초래하는 예시적인 조합 돌연변이는 IgG1 상의 돌연변이 L234A/L235A, IgG2 상의 V234A/G237A/ P238S/H268A/V309L/A330S/P331S, IgG4 상의 F234A/L235A, IgG4 상의 S228P/F234A/ L235A, 모든 Ig 이소타입 상의 N297A, IgG2 상의 V234A/G237A, IgG1 상의 K214T/E233P/ L234V/L235A/G236-결실/A327G/P331A/D365E/L358M, IgG2 상의 H268Q/V309L/A330S/P331S, IgG1 상의 S267E/L328F, IgG1 상의 L234F/L235E/D265A, IgG1 상의 L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S, IgG4 상의 S228P/F234A/L235A/G237A/P238S, 및 IgG4 상의 S228P/F234A/L235A/G236-결실/G237A/P238S이다. 하이브리드 IgG2/4 Fc 도메인, 예컨대 IgG2로부터의 잔기 117-260 및 IgG4로부터의 잔기 261-447을 갖는 Fc가 또한 사용될 수 있다.
감소된 CDC를 갖는 항체를 초래하는 예시적인 돌연변이는 K322A 돌연변이이다.
IgG4 안정성을 향상시키기 위해 IgG4 항체에서 널리 공지된 S228P 돌연변이가 만들어질 수 있다.
Fcγ 수용체 (FcγR)에 대한 항체의 결합을 향상시키고 Fc 이펙터 기능, 예컨대 C1q 결합, 보체 의존적 세포독성 (CDC), 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 식세포작용 (ADCP)을 향상시키는 돌연변이가 Fc 영역에 도입될 수 있다.
활성화 FcγR에 대한 항체의 결합을 증가시키고 항체 이펙터 기능을 향상시키도록 돌연변이될 수 있는 Fc 위치는 위치 236, 239, 243, 256, 290, 292, 298, 300, 305, 312, 326, 330, 332, 333, 334, 345, 360, 339, 378, 396 또는 430 (EU 인덱스에 따른 잔기 넘버링)을 포함한다. 단수로 또는 조합으로 만들어질 수 있는 예시적인 돌연변이는 G236A, S239D, F243L, T256A, K290A, R292P, S298A, Y300L, V305L, K326A, A330K, I332E, E333A, K334A, A339T 및 P396L이다. 증가된 ADCC 또는 ADCP를 갖는 항체를 초래하는 예시적인 조합은 IgG1 상의 S239D/I332E, S298A/E333A/K334A, F243L/R292P/Y300L, F243L/R292P/Y300L/P396L, F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L 및 G236A/S239D/I332E이다.
항체의 CDC를 향상시키도록 돌연변이될 수 있는 Fc 위치는 위치 267, 268, 324, 326, 333, 345 및 430을 포함한다. 단수로 또는 조합으로 만들어질 수 있는 예시적인 돌연변이는 S267E, F1268F, S324T, K326A, K326W, E333A, E345K, E345Q, E345R, E345Y, E430S, E430F 및 E430T이다. 증가된 CDC를 갖는 항체를 초래하는 예시적인 조합 돌연변이는 IgG1 상의 K326A/E333A, K326W/E333A, H268F/S324T, S267E/H268F, S267E/S324T 및 S267E/H268F/S324T이다.
"항체-의존적 세포 세포독성", "항체-의존적 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 이펙터 세포에서 발현되는 Fc 감마 수용체 (FcγR)를 통한 자연 살해 세포 (NK), 단핵구, 대식세포 및 호중구와 같은 용해 활성을 갖는 이펙터 세포와 항체-코팅된 표적 세포의 상호작용에 의존하는 세포 사멸을 유도하기 위한 메커니즘이다. 예를 들어, NK 세포는 FcγRIIIa를 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIIIa를 발현한다. 항체의 ADCC 활성은 항체가 결합하는 단백질을 발현하는 세포를 표적 세포로 및 NK 세포를 이펙터 세포로 사용하는 시험관내 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 세포용해는 용해된 세포로부터 라벨 (예를 들어, 방사성 기질, 형광 염료 또는 천연 세포내 단백질)의 방출에 의해 검출될 수 있다. 예시적인 검정에서, 표적 세포는 1개의 표적 세포 대 4개의 이펙터 세포의 비율로 사용된다. 표적 세포는 BATDA로 미리 라벨링되고, 이펙터 세포 및 시험 항체와 조합된다. 샘플을 2시간 동안 인큐베이션하고, 상청액으로 방출된 BATDA를 측정함으로써 세포 용해를 측정한다. 데이터는 0.67% 트리톤 X-100 (시그마 알드리치)을 사용하여 최대 세포독성 및 임의의 항체의 부재하에 표적 세포로부터 BATDA의 자발적인 방출에 의해 결정되는 최소 제어로 정규화된다.
"항체-의존적 세포 식세포작용" ("ADCP")은 식세포, 예컨대 대식세포 또는 수지상 세포에 의한 내재화에 의해 항체-코팅된 표적 세포를 제거하는 메커니즘을 지칭한다. ADCP는 단핵구-유래 대식세포를 이펙터 세포로 사용하고 항체가 결합하는 단백질을 발현하는 세포를 GFP 또는 또 다른 라벨링된 분자를 발현하도록 또한 조작된 표적 세포로 사용함으로써 평가될 수 있다. 예시적인 검정에서, 이펙터:표적 세포 비율은 예를 들어 4:1일 수 있다. 이펙터 세포는 본 발명의 항체와 함께 또는 없이 4시간 동안 표적 세포와 함께 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 후, 세포는 아큐타제를 사용하여 분리될 수 있다. 대식세포는 형광 라벨에 커플링된 항-CD11b 및 항-CD14 항체로 식별될 수 있으며, 식세포작용 백분율은 표준 방법을 사용하여 CD11+CD14+ 대식세포에서 % GFP 형광에 기초하여 결정될 수 있다.
"보체-의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 표적-결합 항체의 Fc 이펙터 도메인이 보체 구성성분 C1q에 결합하고 활성화시켜 결과적으로 보체 캐스케이드를 활성화시켜 표적 세포 사멸을 유도하는 세포 사멸 유도 메커니즘을 지칭한다. 보체의 활성화는 또한 백혈구 상의 보체 수용체 (예를 들어, CR3)에 결합함으로써 CDC를 촉진하는 표적 세포 표면 상의 보체 구성성분의 침착을 초래할 수 있다. 세포의 CDC는 예를 들어 RPMI-B (1% BSA로 보충된 RPMI)에서 1×105개 세포/웰 (50 μL/웰)로 다우디(Daudi) 세포를 플레이팅하고, 50 μL의 시험 항체를 0-100 μg/mL의 최종 농도로 웰에 첨가하고, 반응물을 15분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 11 μL의 풀링된 인간 혈청을 웰에 첨가하고, 반응물을 45분 동안 37℃에서 인큐베이션함으로써 측정될 수 있다. 용해된 세포 백분율 (%)은 표준 방법을 사용하여 FACS 검정에서 프로피듐 아이오다이드 염색된 세포 %로서 검출될 수 있다.
FcγR 또는 FcRn에 대한 항체의 결합은 유동 세포계측법을 사용하여 각 수용체를 발현하도록 조작된 세포에서 평가될 수 있다. 예시적인 결합 검정에서, 웰 당 2x105개 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고, BSA 염색 완충제 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences), 미국 산호세)에서 30분 동안 4℃에서 차단한다. 세포를 1.5시간 동안 4℃에서 얼음 위에서 시험 항체와 함께 인큐베이션한다. BSA 염색 완충제로 2회 세척한 후, 세포를 45분 동안 4℃에서 R-PE 라벨링된 항-인간 IgG 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈(Jackson Immunoresearch Laboratories))와 함께 인큐베이션한다. 세포를 염색 완충제에서 2회 세척한 후, 1:200 희석된 DRAQ7 라이브/데드 염색 (셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology), 미국 댄버스)을 함유하는 150 μL의 염색 완충제에 재현탁한다. 염색된 세포의 PE 및 DRAQ7 신호는 각각 B2 및 B4 채널을 사용하여 밀테니(Miltenyi) MACSQuant 유동 세포계측기 (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), 미국 오번)에 의해 검출된다. 라이브 세포는 DRAQ7 배제시 게이트되고, 기하 평균 형광 신호는 수집된 적어도 10,000개의 라이브 사건에 대해 결정된다. 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 (트리 스타(Tree Star))가 분석에 사용된다. 데이터는 평균 형광 신호에 대한 항체 농도의 로그로 플로팅된다. 비선형 회귀 분석이 수행된다.
"향상시키다" 또는 "향상된"은 돌연변이가 없는 모 항체와 비교할 때 Fc 영역의 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 본 발명의 항체의 Fcγ 수용체 (FcγR) 또는 FcRn에 대한 향상된 결합 또는 향상된 이펙터 기능 (예를 들어, ADCC, CDC 및/또는 ADCP)을 지칭한다. "향상된"은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상의 향상, 또는 통계적으로 유의한 향상일 수 있다.
"감소시키다" 또는 "감소된"은 돌연변이가 없는 모 항체와 비교할 때 Fc 영역의 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 본 발명의 항체의 Fcγ 수용체 (FcγR) 또는 FcRn에 대한 감소된 결합 또는 감소된 이펙터 기능 (예를 들어, ADCC, CDC 및/또는 ADCP)을 지칭한다. "감소된"은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상의 감소, 또는 통계적으로 유의한 감소일 수 있다.
"조정하다"는 돌연변이가 없는 모 항체와 비교할 때 Fc 영역의 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 본 발명의 항체의 Fcγ 수용체 (FcγR) 또는 FcRn에 대한 향상된 또는 감소된 결합 또는 향상된 또는 감소된 이펙터 기능 (예를 들어, ADCC, CDC 및/또는 ADCP)을 지칭한다.
돌연변이는 단백질 A에 대한 항체의 결합을 조정하는 본 발명의 방법에 사용되는 항체에 도입될 수 있다. 전장 이중특이적 치료용 항체의 생산 및 정제는 과량의 모 및/또는 중간체 분자로부터 이중특이적 항체의 효율적인 분리를 필요로 한다. 따라서 비대칭 방식으로 (예를 들어, 하나의 중쇄에서만) 단백질 A 결합-조정 Fc 돌연변이를 갖는 이중특이적 항체는 단백질 A 친화성 컬럼으로부터 이들의 차등 용출 프로파일에 기초하여 모 항체로부터 정제될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 항체에 단백질 A 결합을 조정하기 위해 도입될 수 있는 예시적인 돌연변이는 Q311R, Q311K, T307P_L309Q, T307P_V309Q, T307P_L309Q_Q311R, T307P_V309Q_Q311R, H435R 또는 H435R_Y436F이다.
당조작
ADCC를 유도하는 본 발명의 방법에 사용되는 항체의 능력은 이들의 올리고당 구성성분을 조작함으로써 향상될 수 있다. 인간 IgG1은 널리 공지된 이중안테나 G0, G0F, G1, G1F, G2 또는 G2F 형태의 대부분의 글리칸으로 Asn297에서 N-글리코실화된다. 조작되지 않은 CHO 세포에 의해 생산된 항체는 전형적으로 적어도 약 85%의 글리칸 푸코스 함량을 갖는다. Fc 영역에 부착된 이중안테나 복합체-타입 올리고당으로부터 코어 푸코스의 제거는 항원 결합 또는 CDC 활성을 변경하지 않고 개선된 FcγRIIIa 결합을 통해 항체의 ADCC를 향상시킨다. 이러한 mAb는 Fc 올리고당의 이중안테나 복합체-타입을 보유하는 상대적으로 높은 탈푸코실화된 항체의 성공적인 발현을 유도하는 것으로 보고된 상이한 방법, 예컨대 배양 삼투몰랄농도의 제어, 숙주 세포주로서 변이체 CHO 라인 Lec13의 적용, 숙주 세포주로서 변이체 CHO 라인 EB66의 적용, 숙주 세포주로서 래트 하이브리도마 세포주 YB2/0의 적용, α 1,6-푸코실트랜스퍼라제 (FUT8) 유전자에 특이적으로 작은 간섭 RNA의 도입, 또는 β-1,4-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III 및 골지 α-만노시다제 II 또는 강력한 알파-만노시다제 I 억제제, 키푸넨신의 공동발현을 사용하여 달성될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 이종이량체 항체는 약 0% 내지 약 15%, 예를 들어 15%, 14%, 13%, 12%, 11% 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0%의 푸코스 함량을 갖는 이중안테나 글리칸 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 이종이량체 항체는 약 50%, 40%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11% 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0%의 푸코스 함량을 갖는 이중안테나 글리칸 구조를 가질 수 있다.
"푸코스 함량"은 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스 단당류의 양을 의미한다. 푸코스의 상대적인 양은 모든 당구조와 관련된 푸코스-함유 구조의 백분율이다. 이들은 예를 들어 여러 방법에 의해 특징화 및 정량화될 수 있다: 1) N-글리코시다제 F 처리된 샘플의 MALDI-TOF 사용 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 올리고- 및 고-만노스 구조); 2) 형광 검출을 사용한 HPLC (UPLC) 및/또는 HPLC-MS (UPLC-MS)에 의한 후속 유도체화 및 검출/ 정량과 함께 Asn297 글리칸의 효소적 방출에 의해; 3) Asn297 글리칸을 엔도 S 또는 제1 및 제2 GlcNAc 단당류 사이를 절단하여 제1 GlcNAc에 부착된 푸코스를 남기는 다른 효소로 처리하거나 처리하지 않는, 천연 또는 환원된 mAb의 무손상 단백질 분석; 4) 효소적 소화 (예를 들어, 트립신 또는 엔도펩티다제 Lys-C)에 의한 mAb의 구성요소 펩티드로의 소화, 및 HPLC-MS (UPLC-MS)에 의한 후속 분리, 검출 및 정량; 또는 5) Asn 297에서 PNGase F를 사용한 특이적 효소적 탈글리코실화에 의한 mAb 단백질로부터 mAb 올리고당의 분리. 방출된 올리고당은 형광단으로 라벨링되고, 이론적 질량과 실험 질량의 비교에 의한 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI) 질량 분광분석법에 의한 글리칸 구조의 정밀 특징화, 이온 교환 HPLC (글리코셉(GlycoSep) C)에 의한 시알화 정도의 결정, 순상 HPLC (글리코셉 N)에 의한 친수성 기준에 따른 올리고당 형태의 분리 및 정량화, 및 고성능 모세관 전기영동-레이저 유도 형광 (HPCE-LIF)에 의한 올리고당의 분리 및 정량화를 허용하는 다양한 상보적 기술에 의해 분리 및 식별될 수 있다.
"낮은 푸코스" 또는 "낮은 푸코스 함량"은 약 0% - 15%의 푸코스 함량을 갖는 항체를 지칭한다.
"정상 푸코스" 또는 "정상 푸코스 함량"은 약 50% 초과, 전형적으로 약 60%, 70%, 80% 초과 또는 85% 초과의 푸코스 함량을 갖는 항체를 지칭한다.
본 발명의 방법에 사용되는 이종이량체 항체는 프로세스, 예컨대 글리코실화, 이성질체화, 탈글리코실화 또는 비자연 발생 공유결합 변형, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 첨가 (페길화) 및 지질화에 의해 번역후 변형될 수 있다. 이러한 변형은 생체내에서 또는 시험관내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 사용되는 이종이량체 항체는 폴리에틸렌 글리콜 (페길화)에 접합되어 이들의 약동학 프로파일을 개선시킬 수 있다. 접합은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. PEG와 치료용 항체의 접합은 기능을 방해하지 않으면서 약역학을 향상시키는 것으로 나타났다.
C-말단 리신
본 발명의 방법에 사용되는 이종이량체 항체는 제조 동안 부분적으로 제거된 이들의 C-말단 리신 (CTL)을 가질 수 있다. 제조 동안, CTL 제거는 미국 특허 공개 번호 US20140273092에 기재된 바와 같이 세포외 Zn2+, EDTA 또는 EDTA - Fe3+의 농도의 제어에 의해 최대 수준 미만으로 제어될 수 있다. 항체 중 CTL 함량은 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 이종이량체 항체는 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 70%, 약 55% 내지 약 70%, 또는 약 60%의 C-말단 리신 함량을 가질 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 이종이량체 항체는 약 0%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 C-말단 리신 함량을 가질 수 있다.
항체 동종이형
본 발명의 방법에 사용되는 이종이량체 항체는 임의의 동종이형일 수 있다. 동종이형은 Fab-아암 교환에 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다. 치료용 항체의 면역원성은 주입 반응의 위험 증가 및 치료적 반응의 지속시간 감소와 연관된다 (Baert et al., (2003) N Engl J Med 348:602-08). 치료용 항체가 숙주에서 면역 반응을 유도하는 정도는 부분적으로 항체의 동종이형에 의해 결정될 수 있다 (Stickler et al., (2011) Genes and Immunity 12:213-21). 항체 동종이형은 항체의 불변 영역 서열의 특이적 위치에서 아미노산 서열 변이와 관련된다. 표 2는 선택된 IgG1, IgG2 및 IgG4 동종이형을 보여준다.
<표 2>
Figure pct00003
표적 항원
본 발명의 방법은 또한 본원에서 입증된 바와 같이 제조 동안 디술피드 결합의 환원 및 재형성이 항체의 VH/VL 영역에 의해 영향을 받지 않을 것으로 예상되기 때문에 Fab-아암 교환을 사용하여 임의의 특이성을 갖는 이종이량체 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 이종이량체 항체는 각 VH/VL 쌍의 특이성에 따라 2개의 별개의 에피토프에서 하나의 표적 항원에 결합할 수 있거나 2개 이상의 표적 항원에 결합할 수 있다. 이종이량체 항체가 2개의 표적 항원에 결합하는 경우, 표적 항원은 동일한 세포에 또는 2개의 상이한 세포에 위치될 수 있다. 표적 항원은 종양-연관 항원, 염증, T 또는 B 세포 활성의 조절에 역할을 하는 항원, 또는 일반적으로 생물학적 활성이 조정되기를 원하거나 표적을 발현하는 세포의 수가 감소되기를 원하는 임의의 표적일 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 이종이량체 항체가 결합할 수 있는 예시적인 항원은 하기 중 하나 이상이다: ABCF1, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, ADORA2A, 아그레칸, AGR2, AICDA, AIF1, AIG1, AKAP1, AKAP2, 알부민, AMH, AMHR2, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL3, ANGPTL4, ANPEP, APC, APOC1, APOE, AR, AZGP1 (아연-a-당단백질), B7.1, B7.2, BAD, BAFF, BAG1, BAI1, BCL2, BCL6, BCMA, BDNF, BLNK, BLR1 (MDR15), BlyS, BMP1, BMP2, BMP3B (GDF10), BMP4, BMP6, BMP8, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, BPAG1 (플렉틴), BRCA1, BTLA, C19orf10 (IL27w), C3, C4A, C5, C5R1, CANT1, CASP1, CASP4, CAV1, CCBP2 (D6/JAB61), CCL1 (1-309), CCL11 (에오탁신), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-1d), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MIP-3b), CCL2 (MCP-1), MCAF, CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), SLC, 엑소더스-2, CCL22 (MDC/STC-1), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2/에오탁신-2), CCL25 (TECK), CCL26 (에오탁신-3), CCL27 (CTACK/ILC), CCL28, CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CCR1 (CKR1/HM145), CCR2 (mcp-1RB/RA), CCR3 (CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7 (CKR7/EBI1), CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR-L1), CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR), CD123, CD137, CD164, CD16a, CD16b, CD19, CD1C, CD20, CD200, CD-22, CD24, CD28, CD3, CD3ε, CD30, CD32a, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD39, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45RB, CD47, CD52, CD69, CD72, CD73, CD74, CD79A, CD79B, CD8, CD80, CD81, CD83, CD86, CD89, CD96, CDH1 (E-카드헤린), CDH10, CDH12, CDH13, CDH18, CDH19, CDH20, CDH5, CDH7, CDH8, CDH9, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, CDKN1A (p21Wap1/Cip1), CDKN1B (p27Kip1), CDKN1C, CDKN2A (p16INK4a), CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, CEBPB, CER1, CHGA, CHGB, 키티나제, CHST10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, CLDN3, CLDN7 (클라우딘-7), CLN3, CLU (클러스테린), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CNR1, COL18A1, COL1A1, COL4A3, COL6A1, CR2, CRP, CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), CTLA4, CTNNB1 (b-카테닌), CTSB (카텝신 B), CX3CL1 (SCYD1), CX3CR1 (V28), CXCL1 (GRO1), CXCL10(IP-10), CXCL11 (I-TAC/IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL2 (GRO2), CXCL3 (GRO3), CXCL5 (ENA-78/LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR4, CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo), CYB5, CYC1, CYSLTR1, DAB2IP, DES, DKFZp451J0118, DNAM-1, DNCL1, DPP4, E2F1, ECGF1, EDG1, EFNA1, EFNA3, EFNB2, EGF, EGFR, ELAC2, ENG, ENO1, ENO2, ENO3, EPHB4, EPO, ERBB2 (Her-2), EREG, ERK8, ESR1, ESR2, F3 (TF), FADD, FasL, FASN, FCER1A, FCER2, FCGR3A, FGF, FGF1 (aFGF), FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2 (bFGF), FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF8, FGF9, FGFR, FGFR3, FIGF (VEGFD), FIL1 (EPSILON), FIL1 (ZETA), FLJ12584, FLJ25530, FLRT1 (피브로넥틴), FLT1, FOS, FOSL1 (FRA-1), FY (DARC), GABRP (GABAa), GAGEB1, GAGEC1, GALNAC4S-6ST, GATA3, GDF5, GFI1, GGT1, GITR, GITRL, GM-CSF, GNAS1, GNRH1, GPR2 (CCR10), GPR31, GPR44, GPR81 (FKSG80), GRCC10 (C10), GRP, GSN (겔솔린), GSTP1, HAVCR2, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, HGF, HIF1A, HIP1, 히스타민 및 히스타민 수용체, HLA, HLA-A, HLA-DRA, HM74, HMOX1, HUMCYT2A, HVEM, ICEBERG, ICOS, ICOSL, IDO, ID2, IFN-a, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNB1, IFN감마, IFNW1, IGBP1, IGF1, IGF1R, IGF2, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP6, IL-1, IL10, IL10RA, IL10RB, IL11, IL11RA, IL-12, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, IL14, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17B, IL17C, IL17R, IL18, IL18BP, IL18R1, IL18RAP, IL19, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9, IL1HY1, IL1R1, IL1R2, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RL1, IL1RL2, IL1RN, IL2, IL20, IL20RA, IL21R, IL22, IL22R, IL22RA2, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL30, IL3RA, IL4, IL4R, IL5, IL5RA, IL6, IL6R, IL6ST (당단백질 130), IL7, IL7R, IL8, IL8RA, IL8RB, IL8RB, IL9, IL9R, ILK, INHA, INHBA, INSL3, INSL4, 인슐린, 인슐린 수용체, IRAK1, IRAK2, ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA6 (a6 인테그린), ITGAV, ITGB3, ITGB4 (b 4 인테그린), JAG1, JAK1, JAK3, JUN, K6HF, KAI1, KDR, KITLG, KIR, KLF5 (GC 박스 BP), KLF6, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, KRT1, KRT19 (케라틴 19), KRT2A, KRTHB6 (모발-특이적 타입 II 케라틴), LAG-3, LAMA5, LDL, LEP (렙틴), LFA, 링고-p75, 링고-트로이, LPS, LTA (TNF-b), LTB, LTB4R (GPR16), LTB4R2, LTBR, MACMARCKS, MAG 또는 Omgp, MAP2K7 (c-Jun), MDK, 메소텔린, c-Met, MIB1, 미드카인, MIF, MIP-2, MKI67 (Ki-67), MMP2, MMP9, MS4A1, MSMB, MT3 (메탈로티오넥틴-III), MTSS1, MUC1 (뮤신), c-MYC, MYD88, NCK2, 뉴로칸, NFKB1, NFKB2, NGFB (NGF), NGFR, NgR-링고, NgR-Nogo66 (Nogo), NgR-p75, NgR-트로이, NKG2D, NKp46, NME1 (NM23A), NOX5, NPPB, NR0B1, NR0B2, NR1D1, NR1D2, NR1H2, NR1H3, NR1H4, NRII2, NRII3, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR2F6, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR4A3, NR5A1, NR5A2, NR6A1, NRP1, NRP2, NT5E, NTN4, ODZ1, OPRD1, OX-40, OX-40L, P2RX7, PAP, PART1, PATE, PAWR, PCA3, PCNA, PD-1, PD-L1, PDGFA, PDGFB, PECAM1, PF4 (CXCL4), PGF, PGR, 포스파칸, PIAS2, PIK3CG, PLAU (uPA), PLG, PLXDC1, PPBP (CXCL7), PPID, PR1, PRKCQ, PRKD1, PRL, PROC, PROK2, PSAP, PSCA, PSMA, PTAFR, PTEN, PTGS2 (COX-2), PTN, RAC2 (p21Rac2), RARB, RGS1, RGS13, RGS3, RNF110 (ZNF144), ROBO2, ROR1, SI00A2, SCGB1D2 (리포필린 B), SCGB2A1 (맘마글로빈 2), SCGB2A2 (맘마글로빈 1), SCYE1 (내피 단핵구-활성화 시토카인), SDF2, SERPINA1, SERPINA3, SERPINB5 (마스핀), SERPINE1 (PAI-1), SERPINF1, SHBG, SLA2, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, SLIT2, SPP1, SPRR1B (Spr1), ST6GAL1, STAB1, STAT6, STEAP, STEAP2, TB4R2, TBX21, TCP10, TDGF1, TEK, TF (트랜스페린 수용체), TGFA, TGFB1, TGFB111, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, THBS1 (트롬보스폰딘-1), THBS2, THBS4, THPO, TIE (Tie-1), TIGIT, TIM-3, TIMP3, 조직 인자, TLR10, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TNF, TNF-a, TNFAIP2 (B94), TNFAIP3, TNFRSF11A, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF21, TNFRSF5, TNFRSF6 (Fas), TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (에이프릴), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, TNFSF4 (OX40 리간드), TNFSF5 (CD40 리간드), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27 리간드), TNFSF8 (CD30 리간드), TNFSF9 (4-1BB 리간드), TOLLIP, Toll-유사 수용체, TOP2A (토포이소머라제 Iia), TP53, TPM1, TPM2, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, TREM1, TREM2, TRPC6, TSLP, TWEAK, VEGF, VEGFB, VEGFC, 베르시칸, VHL C5, VISTA, VLA-4, XCL1 (림포탁틴), XCL2 (SCM-1b), XCR1 (GPR5/CCXCR1), YY1, 및 ZFPM2.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 이종이량체 항체는 CD3에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 이종이량체 항체는 CD3 및 종양-연관 항원 (TAA)에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 이종이량체 항체는 CD123 및 CD3 및 BCMA 및 CD3에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 이종이량체 항체는 EGFR 및 c-Met에 결합한다.
일부 실시양태에서, EGFR 및 c-Met에 결합하는 이종이량체 항체는 서열식별번호: 4의 제1 중쇄 (HC1), 서열식별번호: 5의 제1 경쇄 (LC1), 서열식별번호: 6의 제2 중쇄 (HC2) 및 서열식별번호: 7의 제2 경쇄 (LC2)를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생산되는 이중특이적 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생산되는, EGFR 및 c-Met에 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생산되는, 서열식별번호: 4의 제1 중쇄 (HC1), 서열식별번호: 5의 제1 경쇄 (LC1), 서열식별번호: 6의 제2 중쇄 (HC2) 및 서열식별번호: 7의 제2 경쇄 (LC2)를 포함하는, EGFR 및 c-Met에 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다.
동종이량체 및 이종이량체 항체의 생산
제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체는 배양 용기, 예컨대 바이오리액터에서 함께 또는 별도로 생산될 수 있다. 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체는 공동발현에 의해 숙주 세포에서 발현에 의해 또는 별도의 숙주 세포를 사용하여 각 동종이량체 항체를 생산함으로써 생산될 수 있다. 후자의 경우, 숙주 세포는 동일하거나 상이한 기원일 수 있다.
"숙주 세포"는 적어도 하나의 항체 중쇄 및 하나의 항체 경쇄를 발현하는 하나 이상의 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. "숙주 세포"는 특정 대상 세포, 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손, 및 또한 특정 대상 세포로부터 생성된 안정한 세포주를 지칭한다. 특정 변형은 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 여전히 포함된다.
이러한 숙주 세포는 진핵생물 세포, 원핵생물 세포, 식물 세포 또는 고세균 세포일 수 있다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 간균, 예컨대 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 장내세균과, 예컨대 살모넬라, 세라티아, 및 다양한 슈도모나스 종은 원핵생물 숙주 세포의 예이다. 다른 미생물, 예컨대 효모가 또한 발현에 유용하다. 사카로미세스 (예를 들어, 에스. 세레비시아에(S. cerevisiae)) 및 피치아는 적합한 효모 숙주 세포의 예이다. 예시적인 진핵생물 세포는 포유동물, 곤충, 조류 또는 다른 동물 기원일 수 있다. 포유동물 진핵생물 세포는 불멸화된 세포주, 예컨대 하이브리도마 또는 골수종 세포주, 예컨대 SP2/0 (아메리칸 타입 컬처 컬렉션 (American Type Culture Collection; ATCC), 미국 버지니아주 머내서스, CRL-1581), NS0 (유러피언 컬렉션 어브 셀 컬처스 (European Collection of Cell Cultures; ECACC), 영국 윌트셔주 솔즈베리, ECACC No. 85110503), FO (ATCC CRL-1646) 및 Ag653 (ATCC CRL-1580) 뮤린 세포주를 포함한다. 예시적인 인간 골수종 세포주는 U266 (ATTC CRL-TIB-196)이다. 다른 유용한 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포로부터 유래된 세포주, 예컨대 CHOK1SV (론자 바이올로직스(Lonza Biologics), 미국 메릴랜드주 워커스빌), 포텔리전트(Potelligent)® CHOK2SV (론자), CHO-K1 (ATCC CRL-61) 또는 DG44를 포함한다.
하나 이상의 항체 중쇄 및 경쇄를 발현하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 벡터는 pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (스트라타진(Stratagene)) pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL (파마시아(Pharmacia)), pEE6.4 (론자) 및 pEE12.4 (론자), 뿐만 아니라 론자 엑시드(Xceed) 시스템에서 사용되는 벡터를 포함한다.
제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체는 이들을 별도의 숙주 세포에서 발현시킴으로써 생산될 수 있다. 이 경우, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체는 Fab-아암 교환을 개시하기 위해 환원제의 존재하에 이들을 혼합하기 전에 정제될 수 있다. 정제는 공지된 방법, 예컨대 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 성취될 수 있다. 대안적으로, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체를 함유하는 배양 배지를 합할 수 있으며, Fab-아암 교환을 개시하기 위해 여기에 환원제를 첨가할 수 있다. 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체가 공동발현에 의해 생산되는 경우, 항체는 또한 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다.
이종이량체 항체를 생성하기 위한 Fab-아암 교환이 본원에 기재되어 있다. 공정 조건, 예컨대 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체의 농도, 환원제, 환원제의 농도, 환원 시간, 용존 산소의 농도, 반응이 수행되는 온도 및 사용된 완충제는 본원에 기재된 바와 같은 높은 수율 및 순도로 이종이량체 항체를 생산하기 위해 최적화된다.
Fab-아암 교환 후, 생산된 이종이량체 항체는 추가로 정제될 수 있다. 정제 방법은 단백질 A, 단백질 G 크로마토그래피의 조합, 친화성 크로마토그래피의 다른 방법, 예컨대 항원 결합 또는 항-이디오타입 항체에 대한 결합, 티오친화성, 이온 교환, 소수성 상호작용, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 및 다른 혼합 모드 수지에 기초한 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 추가 방법은 예를 들어 염 또는 폴리에틸렌 글리콜을 사용한 침전을 사용하여 정제된 이종이량체 항체를 수득할 수 있다.
본 발명의 방법의 공정에 적합한 장비는 공지되어 있다. 숙주 세포에 의한 동종이량체 항체의 발현은 예를 들어 전형적으로 반응 용기, 예컨대 바이오리액터에서 수행될 수 있다. 환원 및 산화 단계는 제1 동종이량체 항체 및/또는 제2 동종이량체 항체의 발현과 동일한 바이오리액터에서 수행될 수 있거나 별도의 반응기 용기에서 수행될 수 있다. 반응 용기 및 지지 공정 배관은 일회용이거나 재사용가능할 수 있고, 표준 물질 (플라스틱, 유리, 스테인리스 강 등)로 제조될 수 있다. 반응 용기는 혼합, 살포, 헤드스페이스 가스처리, 온도 제어가 장착될 수 있고/거나, 온도, 중량/부피, pH, 용존 산소 (DO), 및 산화 환원 전위의 측정을 위한 프로브로 모니터링될 수 있다. 모든 이러한 기술은 제조 공장의 표준 단위 작업 내에서 일반적이며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명을 일반적인 용어로 설명하였지만, 본 발명의 실시양태는 청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안되는 하기 실시예에서 추가로 개시될 것이다.
실시예 1. 일반적인 방법
cSDS
모세관 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 분자량을 기준으로 단백질을 분리한다. 분석은 온도-제어 카트리지에 융합된 실리카 모세관을 갖는 상업용 모세관 전기영동 시스템을 사용하였다. 시험 물품을 내부 표준 및 알킬화 시약과 혼합하고, 정의된 시간 동안 및 온도로 가열하여 단백질을 변성시켰다. 그 후, 샘플을 전압에 의해 전기-운동학적으로 주입한 다음, 미리 정의된 지속시간 동안 더 큰 전기장의 적용에 의해 분석하였다. 검출을 220 nm에서의 흡광도에 의해 성취하고, 내부 표준 후 전기영동도에서 모든 다른 피크에 대한 주요 피크의 수정된 피크 면적을 계산함으로써 순도를 결정하였다.
IEX-HPLC
잔류 모 동종이량체 항체와 관련된 이중특이적 항체 백분율을 이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피 (IEX-HPLC)에 의해 결정하였다. 이온 교환 크로마토그래피는 분자 상의 표면 전하의 차이를 사용하여 분리를 달성한다. 써모 사이언티픽(Thermo Scientific), Propac WCX-10, (4 mm ID x 150 mm, 패킹된 10 um 입자)을 사용하여 IEX-HPLC를 수행하였다. 염 구배 및/또는 pH 구배를 사용하여 종의 분리를 해결하였다. 구배 농도가 증가함에 따라, 컬럼과 각 항체의 전체 표면 상호작용을 중화하고, 280 nm에서 용출을 검출하였다. 피크 면적 카운트를 비교함으로써 각 IgG의 상대적인 양을 측정하였다.
HIC-HPLC
단백질을 이들의 소수성 성질에 기초하여 분리하기 위한 소수성 상호작용 크로마토그래피 방법. 단백질은 높은 염 조건하에서 컬럼에 유지되고, 염 농도를 감소시킴으로써 용출된다. 높은 염 완충제 조건은 단백질의 감소된 용매화로 인해 소수성 영역을 노출시키고, HIC 고정상에 대한 결합을 촉진한다. 샘플을 토소 TSKgel 부틸-NPR (4.6 mm x 10 cm, 2.5 um 비-다공성 수지 기반 비드) 컬럼에 주입하고, 황산암모늄 구배로 용출하였다. 흡광도를 280 nm에서 모니터링하고, 참조 표준 주입과 비교하여 피크를 식별하였다.
RP-HPLC (시스타민 검출용)
역상 고성능 크로마토그래피는 고정상 매질에 대한 소수성 결합 상호작용에 기초하여 이동상에서 용질 분자를 분리한다. 2-MEA 및 산화된 이량체 형태 시스타민의 소수성 차이를 이용하여, 측정된 값을 표준 곡선과 비교함으로써 RP-HPLC에 의해 분해 및 정량하였다. 헥산 술포네이트/아세토니트릴 이동상 시스템을 사용하는 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) 18 (4.6 mm x 150 mm, 3um) 컬럼을 사용하여, 증가하는 유기 용매의 단계 구배로 2개의 종을 분리하였다. 220 nm (2-MEA) 및 255 nm (시스타민)에서 흡광도를 모니터링함으로써 종을 검출하고, 피크 면적을 이들의 상대 표준 곡선과 비교하였다.
단일 및 이중특이적 (200 ml 규모에서 수행되는 것) 및 규모에 대한 일반적인 항체 생산 계획
각 단일특이적 항체를 개별 포유동물 세포 은행으로부터 해동하고 확장하고 바이오리액터에서 별도로 발현시켰다. 생산 바이오리액터를 농축된 배지로 보충하고, 상당한 세포 사멸 전에 수확하였다. 바이오리액터를 원심분리 및/또는 여과에 의해 수확하고, 단일특이적 항체를 친화성 단백질 A 크로마토그래피에 의해 별도로 포획하였다. 그 후, 생성된 포획된 단일특이적 항체를 FAE 단계에서 합할 때까지 동결 저장하였다.
실시예 2. Fab-아암 교환을 사용한 이중특이적 항체의 제조 동안 공정 개선
2개의 동종이량체 모 항체의 CH3 도메인에 비대칭 돌연변이를 도입한 후 분자간 디술피드 결합의 환원 및 재형성에 의해 Fab-아암 교환을 사용하여 이중특이적 항체를 생성하였다. 비대칭 CH3 도메인 돌연변이는 동종이량체 모 항체보다 이종이량체 이중특이적 항체의 우선적 형성을 유도한다.
제조 동안 공정 견고성을 보장하기 위해, 제조 동안 다양한 파라미터에 대한 가능한 역치 및 범위를 이해하도록 실험을 설계하였다. EDTA 및 무산소 조건이 디술피드 결합에 대한 항체의 시스테인의 재산화를 억제하였기 때문에, 항체 디술피드 결합 재형성은 산소 및 유리 금속의 존재에 의존적인 것으로 나타났다 (US2014/0303356). 따라서, Fab-아암 교환을 사용한 이중특이적 항체의 제조 동안 용존 산소 (DO2) 및 금속의 양을 제어해야 하는 필요성을 조사하기 위한 연구를 개시하였다.
도 2는 Fab-아암 교환에 의한 이중특이적 항체의 제조 동안 디술피드 결합의 환원 및 재형성 동안 제조 단계를 보여준다.
이론적으로, 환원제, 예컨대 2-머캅토에틸아민 (2-MEA)을 사용한 환원 후 항체 디술피드 결합 재형성은 다양한 경로를 통해 발생할 수 있다. 예를 들어, 티올-디술피드 교환은 디술피드 결합의 환원 및 재형성을 설명할 수 있다. 티올-디술피드 교환을 진행하기 위해, 환원제, 예컨대 2-MEA는 티올-디술피드 교환을 진행하기 위한 그의 티올레이트 (RS-) 형태이어야 한다. 도 3은 티올-디술피드 교환 반응의 분자 세부사항을 보여준다. 모 항체에서 디술피드 결합을 환원시키기 위해, 티올레이트 음이온 (도 3에서 원으로 표시)은 디술피드 결합의 황 원자를 공격하여, 황 원자 중 하나를 대체하고, 2-MEA 티올레이트와 새로운 디술피드 결합을 형성한다.
아래 표시된 헨더슨-하셀바흐 식을 사용하여, 2-MEA 티올 (SH) 및 티올레이트 음이온 (S-)의 비율은 pH 및 2-MEA 티올 pKa에 고도로 의존적이다.
Figure pct00004
따라서, 디술피드 결합의 환원 및 전체 Fab-아암 교환은 낮은 pH에서 억제되며, 여기서 2-MEA의 양성자화된 티올 형태는 그의 탈양성자화된 티올레이트 음이온 형태에 비해 선호된다. 더 높은 pH에서, 평형은 티올레이트를 향해 이동하여, 디술피드 결합의 환원 및 티올-디술피드 교환을 가능하게 한다.
Fab-아암 교환 동안 2-MEA의 존재하에 발생할 수 있는 반응의 요약이 도 4에 제시된다. Fab-아암 교환 동안, 완충제 교환 (UF/DF 동안)에 의한 환원제, 예컨대 2-MEA의 제거는 이종이량체 이중특이적 항체에서 디술피드 결합의 재형성을 가능하게 하지만, 다중 반응 경로는 디술피드 재형성 공정이 발생하도록 허용한다. 산소의 존재하에, 산소는 도 4의 반응 2에 의해 예시된 바와 같이 이종이량체 이중특이적 항체에서 디술피드 결합의 재형성을 용이하게 하는 양성자화된 티올레이트와 반응할 수 있다. 산소의 존재는 또한 도 4의 반응 4에 의해 표시된 바와 같이 시스타민 이량체 및 물을 형성하는 용액에서 잔류 2-MEA 티올을 고갈시킬 수 있다. 그러므로, 이중특이적 항체의 효율 및 수율을 개선시키기 위해 Fab-아암 교환 동안 충분히 높은 2-MEA의 농도를 사용해야 한다.
그러나, 티올레이트 디술피드 교환 및 디술피드 결합의 재형성은 산소의 부재하에서 여전히 가능할 수 있다. 산소 부족 조건하에, 2-MEA의 농도가 완충제 교환 공정 동안 감소함에 따라, 항체 티올 기 및 2-아미노에틸 디술피드 Fab 중간체는 2-MEA 티올레이트의 수반되는 생산과 함께 이중특이적 이종이량체 항체에서 디술피드 결합을 재형성하는 역방향으로 도 4의 반응 1을 유도할 수 있다. 이 반응은 완충제 교환 공정 동안 더 많은 2-MEA가 제거됨에 따라 역방향으로 계속 밀려날 것이다.
실시예 3. UF/DF 동안 낮은 DO2 조건에서 이중특이적 항체 A 제조
실험 방법
이 실험에서, 주위 DO2 수준은 환원 동안 및 2-MEA 첨가 후 23시간까지 존재하였으며, 그 후 질소 오버레이를 포함시켜 UF/DF 동안 % DO2를 최소화하였다. 접근법은 산소가 환원 단계 동안 존재하고 디술피드 결합의 재형성 동안 부재하는 조건을 반영하였다.
이중특이적 항체 A는 BCMA 및 CD3에 결합하고, 두 중쇄 모두에서 S228P, F234A, L235A 치환 ("PAA 치환")을 갖는 IgG4 이소타입으로, 하나의 중쇄의 위치 405에 F 및 위치 409에 R 및 제2 중쇄의 위치 405에 L 및 위치 409에 K를 가지므로 이종이량체 형성을 유도한다. 모 항체는 p1A-IgG4PAAF405R409 및 p2A-IgG4PAAL405K409로 명명되었다.
모 항체 p1A-IgG4PAAF405R409 및 p2A-IgG4PAAL405K409를 세포 배양 바이오리액터로부터 수확하고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
모 항체 중 하나를 의도적으로 제한하기 위해 p1A-IgG4PAAF405R409 및 p2A-IgG4PAAL405K409를 조정된 몰비 또는 1:1.06로 사용하여 용액을 제조하였다. 그 후, 혼합물을 pH 7.3으로 조정하고, 101 mM 아세트산나트륨, 105 mM 트리스 염기, pH 7.3을 사용하여 10.5 g/L의 총 IgG 농도로 희석하였다. 50 mM 아세트산나트륨, 800 mM 2-MEA pH 5.0 스톡 용액을 모 mAb 혼합물에 첨가하였다. UF/DF 전에 최종 환원 완충제 조성물은 약 100 mM 아세트산나트륨, 약 35 mM 2-MEA, 약 30 mM NaCl, pH 7.3이었다. 환원된 모 mAb 용액을 23시간 동안 24℃에서 인큐베이션하고, 후속적으로 UF/DF 보유물 용기로 옮겼다. 한외여과 (UF) 및 투석여과 (DF)의 시작 전에, 질소의 오버레이를 용기의 헤드스페이스를 통해 보유물 용기로 전달하여, 디술피드 브릿지의 재형성 동안 DO2를 고갈시키고, UF 및 DF 공정 전체에 걸쳐 유지하였다. 투석여과 완충제를 통한 DO2의 첨가를 방지하기 위해, 투석여과 완충제 (100 mM 트리스-아세테이트 30 mM NaCl pH 7.5)를 공정 전체에 걸쳐 질소와 살포하였다. 인라인 DO2 센서를 사용하여, UF 및 DF 단계의 시작 전에 보유물 DO2가 5% DO2 미만의 수준에 도달하고 투석여과 완충제가 1% DO2 미만의 수준에 도달하였음을 입증하였다.
UF 및 DF 공정 전체에 걸쳐, DO2 수준을 UF/DF 동안 공급물 주입구, 보유물 및 투과물 라인에서 측정하였고, 모두 < 4 % DO2로 유지되었다. 투석여과 완충제는 < 1% DO2 수준으로 유지되었다. UF/DF 시스템은 11 투석여과 부피 (DV)에 대해 14.5 psi의 막횡단 압력을 표적화하는 54 mL/분 교차 유속으로 유지되었다. 인큐베이션 후 모든 공정을 실온 (18 - 22℃)에서 수행하였다. UF/DF의 완료시, 회수된 보유물을 1.0 M 아세트산으로 켄칭하고, pH 5.0으로 조정하여 추가 디술피드 결합 형성을 최소화하고, 후속적으로 2 - 8℃에서 저장하였다. 추가 투석여과 완충제의 도입으로 인한 물질의 임의의 가능한 산화를 방지하기 위해 UF/DF의 완료 후 추가 완충제 회수 플러시를 수행하지 않았다.
공정 동안 3개 위치에서 DO2를 측정하기 위해 UF/DF 셋업을 장착하였다. 공급물 주입구, 보유물 및 투과물 라인에서 % DO2의 인라인 모니터링은 도 5에 나타낸다. DO2의 저하시, 수준은 투과물에서 5% 미만 및 주입구/보유물에서 3% 미만으로 유지되었다. 표 3은 UF/DF 공정 파라미터 및 성능의 요약을 보여준다.
<표 3>
Figure pct00005
표 4는 2-MEA 첨가전 및 첨가후 동안 오프라인 %DO2, pH 및 전도성 측정의 요약을 보여준다. 도 6은 보유물, 투과물 및 주입구 라인에서 측정된 UF/DF 동안 DO2 백분율 (%)을 보여준다. % DO2는 재순환에서 보유물에 질소 오버레이 후 시간이 지남에 따라 투과물에서 3.2%, 보유물에서 1.5% 및 공급물에서 1.4%로 안정화되었다.
비환원된 cSDS 분석을 사용하여 형성된 이종이량체 이중특이적 항체의 디술피드 결합 무결성을 측정하였다 (비환원된 cSDS에서 이종이량체 항체의 % 순도로 측정됨). 항체 A의 순도는 97.59%로 측정되었다.
이 연구는 환원 동안 주위 % DO2 (89 - 13%의 범위) 및 낮은 % DO2 환경 (UF/DF 동안 < 4% DO2)에서 이중특이적 항체 A가 높은 수준의 디술피드 결합 형성으로 형성되었음을 입증하였다 (비환원된 cSDS에서 % 순도에 의해 반영됨). 이전에, 이중특이적 항체를 안정화시키기 위해 티올을 디술피드 결합으로 산화시키는데 DO2가 필요하다고 믿었다.
<표 4>
Figure pct00006
이 연구 동안 존재하는 산소 수준은 UF/DF 동안 티올의 산화에 기여하기에 충분하지 않은 것으로 계산되었다. 아래의 계산은 용액 중 30% 이상의 DO2 농도가 도 4의 반응 2로 표시된 반응을 사용하여 발생하는 티올의 산화에 필요하였음을 입증하였다.
이 연구를 위해, 존재하는 항체의 양에서 모든 티올을 산화시키기 위해 이론적 백분율의 DO2 포화 용액을 계산하기 위해 아래와 같이 가정하였다:
· IgG 용액: 10 g/L
· 몰 S-S (환원 및 산화될 디술피드 결합) / 몰 mAb
· ½ 몰 O2 / 몰 S-S (티올로부터 디술피드 결합을 생성하기 위해 산소가 필요한 경우, 도 4의 반응 2를 참조한다)
· 공기 포화 물에서 산소 용해도 = 7 ppm (g O2 / 106 g 용액) = 100% 포화
· mAb MW: 150 kDa
4 디술피드/몰 mAb가 모든 티올을 산화시키는데 필요한 산화물 및 O2인 경우 10 mg/mL 항체 용액을 산화시키기 위해 용해된 DO2 농도 %를 계산하기 위해:
1. (10 mg mAb / mL 용액) * (몰 mAb / 150000 g mAb) * (2 몰 S-S / 몰 mAb) * (½ 몰 O2 / 몰 S-S) * (1000 mL / 1 L) (1 g / 1000 mg) = 6.67 x 10-4 몰 O2 / L 용액
2. (6.67 x 10-5 몰 O2 / L 용액) * (31.998 g O2 / 1 몰 O2) * (1 L / 1000 g) = 2.13 x 10-6 g O2 / g 용액
3. (2.13 x 10-6 g O2 / g 용액) * (106 g 용액) = 2.13 g O2 / 106 g 용액 = 2.13 ppm
4. 공기 포화 물 약 7 g O2 / 106 g 용액 = 7 ppm
5. 2.13 ppm / 7 ppm = 30% O2 포화 용액 필요
작동 온도에서 2% DO2는 0.192 mg/mL 또는 6.00 μM와 동등하고, 3% DO2는 0.288 mg/L 또는 8.99 μM와 동등하고, 4% DO2는 0.384 mg/L 또는 11.29 μM와 동등하고, 5% DO2는 0.480 mg/mL 또는 14.99 μM와 동등하였다. 30% DO2는 2.88 mg/mL 또는 90 μM와 동등하였다.
이는 UF/DF 단계 동안 산소의 부재하에 디술피드 결합의 재형성을 허용한 산소 독립적 화학 반응 경로가 존재하였음을 나타낸다. 2-MEA가 용액으로부터 제거됨에 따라 도 4의 반응 1의 역반응이 이종이량체 이중특이적 항체에서 디술피드 브릿지의 재형성을 유도하는 것이 가능하다.
결론: UF/DF 동안 < 4%에서 DO2 수준을 유지하는 것은 디술피드 결합 형성에 유의한 영향을 미치지 않았다. UF/DF의 완료시, 이중특이적 항체의 순도는 > 97%였다.
실시예 4. UF/DF 동안 낮은 DO2에서 이중특이적 항체 B 제조
이 실험에서, 주위 DO2 수준은 환원 동안 및 2-MEA 첨가 후 23시간까지 존재하였으며, 그 후 질소 오버레이를 포함시켜 UF/DF 동안 % DO2를 최소화하였다. 접근법은 산소가 환원 단계 동안 존재하고 디술피드 결합의 재형성 동안 부재하는 조건을 반영하였다.
이중특이적 항체 B는 CD123 및 CD3에 결합하고, 두 중쇄 모두에서 S228P, F234A, L235A 치환 ("PAA 치환")을 갖는 IgG4 이소타입으로, 하나의 중쇄의 위치 405에 F 및 위치 409에 R 및 제2 중쇄의 위치 405에 L 및 위치 409에 K를 가지므로 이종이량체 형성을 유도한다. 모 항체는 p1B-IgG4PAAF405R409 및 p2B-IgG4PAAL405K409로 명명되었다.
모 항체 p1B-IgG4PAAF405R409 및 p2B-IgG4PAAL405K409를 세포 배양 바이오리액터로부터 수확하고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
p1B-IgG4PAAF405R409 및 p2B-IgG4PAAL405K409의 용액을 제조하고, pH 7.3으로 조정하고, 101 mM 아세트산나트륨, 105 mM 트리스 염기, pH 7.3을 사용하여 10.5 g/L 의 총 IgG 농도로 희석하였다. 50 mM 아세트산나트륨, 800 mM 2-MEA pH 5.0 스톡 용액을 모 혼합물에 첨가하였다. UF/DF 전에 최종 환원 완충제 조성물은 약 100 mM 아세트산나트륨, 약 35 mM 2-MEA, 약 30 mM NaCl, pH 7.3이었다. 환원된 모 용액을 23시간 동안 24℃에서 인큐베이션하고, 후속적으로 UF/DF 보유물 용기로 옮겼다. 한외여과 (UF) 및 투석여과 (DF)의 시작 전에, 질소의 오버레이를 용기의 헤드스페이스를 통해 보유물 용기로 전달하여, 디술피드 브릿지의 재형성 동안 DO2를 고갈시키고, UF 및 DF 공정 전체에 걸쳐 유지하였다. 투석여과 완충제로부터 DO2의 첨가를 방지하기 위해, 투석여과 완충제 (100 mM 트리스-아세테이트 30mM NaCl pH 7.5)를 공정 전체에 걸쳐 질소와 살포하였다. 인라인 DO2 센서를 사용하여, UF 및 DF 단계의 시작 전에 보유물이 5% DO2 미만의 수준에 도달하고 투석여과 완충제가 1% 미만의 수준에 도달하였음을 입증하였다.
UF 및 DF 공정 전체에 걸쳐, DO2 수준을 UF/DF 동안 공급물 주입구, 보유물 및 투과물 라인에서 측정하였고, 모두 < 4 % DO2로 유지되었다. 투석여과 완충제는 < 1% DO2 수준으로 유지되었다. UF/DF 시스템은 11 투석여과 부피 (DV)에 대해 15.0 psi의 막횡단 압력을 표적화하는 42 mL/분 교차 유속으로 유지되었다. 인큐베이션 후 모든 공정을 실온 (18 - 22℃)에서 수행하였다. UF/DF의 완료시, 3 mL 샘플을 취하고, pH 7.5에서 비조정된 상태로 유지하고, 추가 산화를 방지하기 위해 -70℃에서 즉시 저장하였다. 회수된 보유물의 나머지 벌크를 1.0 M 아세트산으로 켄칭하고, pH 5.0으로 조정하여 추가 디술피드 결합 형성을 최소화하였다. 벌크 물질을 후속적으로 -70℃에서 저장하였다. 추가 투석여과 완충제의 도입으로 인한 물질의 임의의 가능한 산화를 방지하기 위해 UF/DF의 완료 후 추가 완충제 회수 플러시를 수행하지 않았지만, 수율은 전형적으로 관찰되는 것보다 낮았다.
공정 동안 3개 위치에서 DO2를 측정하기 위해 UF/DF 셋업을 장착하였다. 공급물 주입구, 보유물 및 투과물 라인에서 % DO2의 인라인 모니터링은 도 5에 나타낸다. DO2의 저하시, 수준은 투과물에서 5% 미만 및 주입구/보유물에서 3% 미만으로 유지되었다.
표 5는 UF/DF 공정 파라미터의 요약을 보여준다. 도 7은 UF/DF 동안 보유물, 투과물 및 주입구에서 측정된 % DO2를 보여준다. 표 6은 오프라인 % DO2, pH 및 전도성 측정의 요약을 보여준다.
<표 5>
Figure pct00007
<표 6>
Figure pct00008
비환원된 cSDS 분석을 사용하여 pH 7.5에서 동결된 샘플 및 pH 5.0에서 벌크 물질 모두에 대해 형성된 이중특이적 항체에서 디술피드 결합 무결성을 측정하였다. pH 7.5 이중특이적 항체 제제의 순도는 97.16%로 측정되었고, pH 5.0에서 항체 제제의 순도는 97.27%로 측정되었다.
이 연구는 환원 동안 주위 % DO2 (83 - 24%의 범위) 및 UF/DF 동안 낮은 % DO2 환경 (< 4 %DO2)에서 이중특이적 항체 B가 높은 수준의 디술피드 결합 형성으로 형성되었음을 입증하였다.
이 연구 및 실시예 2에 기재된 연구는 모두 Fab-아암 교환 동안 디술피드 브릿지의 재형성을 위해 UF/DF 단계 동안 산소가 필요하지 않았음을 입증하였다.
결론: Fab-아암 교환을 사용하여 이중특이적 항체 B를 제조하는 UF/DF 단계 동안 DO2 수준을 < 4%로 유지하는 것은 디술피드 결합 형성에 유의한 영향을 미치지 않았다. UF/DF의 완료시, 비환원된 cSDS는 % 순도 > 97%를 나타내었다.
실시예 5. UF/DF 동안 EDTA의 존재하에 낮은 DO2에서 이중특이적 항체 A 제조
이중특이적 항체의 제조 동안 유리 금속 이온이 제조 공정에 도입될 기회가 있었다. 원료를 통한 완충제의 제조 및 금속성 구성성분으로부터의 침출 동안, 이들 유리 금속 이온은 Fab-아암 교환의 산화 환원 반응에 관여할 수 있다. Fab-아암 교환에서 미량 금속의 가능한 효과를 조사하기 위해, Fab-아암 교환 동안 EDTA의 첨가를 연구하였다. EDTA 첨가는 디술피드 결합의 재형성을 위한 산화 반응을 촉매할 수 있는 용액에서 가능한 유리 금속 이온을 격리시켰다.
p1A-IgG4PAAF405R409 및 p2A-IgG4PAAL405K409를 1.05:1.00의 몰비로 사용하여 용액을 제조하였다. 그 후, 혼합물을 pH 7.3으로 조정하고, 101 mM 아세트산나트륨, 105 mM 트리스 염기, pH 7.3을 사용하여 10.5 g/L의 총 IgG 농도로 희석하였다. 50 mM 아세트산나트륨, 800 mM 2-MEA pH 5.0 스톡 용액을 모 mAb 혼합물에 첨가하였다. UF/DF 전에 최종 환원 완충제 조성물은 약 100 mM 아세트산나트륨, 약 35 mM 2-MEA, 약 30 mM NaCl, pH 7.3이었다. 환원된 모 용액을 23.5시간 동안 24℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션의 완료시, 500 mM EDTA, pH 8.0 스톡 용액을 환원된 모 혼합물에 첨가하여, 2 mM EDTA의 표적이 UF/DF의 시작 전에 용액에 존재하는 유리 금속 이온을 킬레이트하였다. EDTA를 또한 100 mM 트리스-아세테이트, 30 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 7.5의 표적화를 위해 투석여과 완충제에 첨가하였다. UF/DF 완충제 교환 동안 추가 유리 금속 이온이 도입될 수 없었음을 보장하기 위해 이를 수행하였다. 단계 동안 자발적으로 발생할 수 있는 디술피드의 임의의 가능한 산화 및 시스타민 형성을 허용하기 위해 환원 단계 동안 EDTA를 첨가하지 않았다.
EDTA를 함유하는 환원된 모 용액을 후속적으로 UF/DF 보유물 용기로 옮기고, UF의 시작 전에, 질소의 오버레이를 용기의 헤드스페이스를 통해 보유물 용기로 전달하여 보유물로부터 DO2를 고갈시키고, UF 및 DF 공정 전체에 걸쳐 유지하였다. 투석여과 완충제를 통한 DO2의 첨가를 방지하기 위해, 투석여과 완충제를 공정 전체에 걸쳐 질소와 살포하였다. 인라인 DO2 센서는 UF 및 DF 단계의 시작 전에 보유물 DO2 수준이 2% DO2 미만의 수준에 도달하고 투석여과 완충제가 1% DO2 미만의 DO2 수준에 도달하였음을 입증하였다.
UF 및 DF 공정 전체에 걸쳐, DO2 수준을 UF/DF 동안 공급물 주입구, 보유물 및 투과물 라인에서 측정하였고, 모두 < 4 % DO2로 유지되었다. 투석여과 완충제는 < 1% DO2 수준으로 유지되었다. UF/DF 시스템은 11 투석여과 부피 (DV)에 대해 14.5 psi의 막횡단 압력을 표적화하는 58 mL/분 교차 유속으로 유지되었다. 인큐베이션 후 모든 공정을 실온 (18 - 22℃)에서 수행하였다. UF/DF의 완료시, 9 mL 샘플을 취하고, pH 7.5에서 비조정된 상태로 유지하고, 추가 산화를 방지하기 위해 -70℃에서 즉시 저장하였다. 회수된 보유물의 나머지 벌크를 1.0 M 아세트산으로 켄칭하고, pH 5.0으로 조정하여 추가 디술피드 결합 형성을 최소화하였다. pH 5.0의 벌크 이중특이적 항체 샘플을 후속적으로 -70℃에서 저장하였다. 추가 투석여과 완충제의 도입으로부터 물질의 가능한 산화를 방지하기 위해 UF/DF의 완료 후 완충제 회수 플러시를 수행하지 않았다. 표 7은 UF/DF 공정 파라미터 및 성능을 요약한다.
<표 7>
Figure pct00009
비환원된 cSDS 분석을 사용하여 pH 7.5에서 동결된 샘플 및 pH 5.0에서 벌크 물질 모두에 대해 형성된 이중특이적 항체에서 디술피드 결합 무결성을 측정하였다. pH 7.5 이중특이적 항체 제제의 순도는 97.44%였고, pH 5.0에서 이중특이적 항체 제제의 순도는 97.39%로 측정되었다.
이 연구는 UF/DF 동안 낮은 % DO2 환경 및 최소 이용가능한 유리 금속 이온에서 이중특이적 항체 A가 높은 수준의 디술피드 결합 형성으로 형성되었음을 입증하였다. 연구는 산화 반응을 촉매하기 위한 유리 금속 이온이 Fab-아암 교환의 UF/DF 동안 필요하지 않았음을 입증하였다.
결론: 실험 결과는 Fab-아암 교환에서 UF/DF 전에 환원된 모 혼합물에 EDTA를 첨가하는 것이 디술피드 결합 형성에 영향을 미치지 않았음을 입증하였다. UF/DF의 완료시, 비환원된 cSDS는 % 순도 > 97%를 초래하였다.
실시예 6. 환원 및 UF/DF 동안 주위 및 낮은 DO2 조건에서 Fab-아암 교환의 비교
2-MEA 환원 동안 일부 DO2 매개된 산화가 발생할 수 있다는 가설을 평가하기 위해 이 연구를 설계하였다.
연구를 위해, 모 항체 p1B-IgG4PAAF405R409 및 p2B-IgG4PAAL405K409를 사용하여 Fab-아암 교환을 수행하였다. 용액 중 p1B-IgG4PAAF405R409 및 p2B-IgG4PAAL405K409의 혼합물을 제조하고, pH 7.3으로 조정하고, 101 mM 아세트산나트륨, 105 mM 트리스 염기, pH 7.3을 사용하여 10.5 g/L의 총 IgG 농도로 희석하였다. 모 항체를 함유하는 혼합물을 2개의 별도의 용기로 나누었다. 한 용기에서, % DO2 < 5%가 달성될 때까지 모 혼합물로부터 DO2를 고갈시키기 위해 헤드스페이스를 통해 질소의 오버레이를 용기로 전달하였다. 다른 모 혼합물 용기를 환원에 대한 대조군으로서 주위 공기 조건하에 유지하였다. 50 mM 아세트산나트륨, 800 mM 2-MEA pH 5.0 스톡 용액을 각 모 혼합물에 첨가하였다. UF/DF 전에 최종 환원 완충제 조성물은 약 100 mM 아세트산나트륨, 약 35 mM 2-MEA, 약 30 mM NaCl, pH 7.3이었다. 환원된 모 용액 모두를 24시간 동안 24℃에서 인큐베이션하고, % DO2를 두 용기 모두에 대해 측정하였으며, 그 결과는 도 8에 나타낸다. 낮은 % DO2 환원 용기를 인큐베이션 전체에 걸쳐 질소의 오버레이 하에 유지하였고, 24시간 동안 < 2% DO2로 유지하였다. 2-MEA 스파이크 후 용기에서 대략 40% DO2로 % DO2의 초기 강하가 있었으며, 주위 공기하에 유지되었고, 그 후 % DO2가 점차 선형적으로 증가하여 다시 > 90% DO2로 증가하였다. UF/DF 공정 파라미터 및 성능의 요약은 표 8에 나타낸다.
<표 8>
Figure pct00010
환원 동안, 용기의 샘플링 포트를 통해 두 용기 모두로부터 샘플을 수득하였다. 각 샘플 채취 전에 포트를 플러시하고, 10% v/v의 시스타민 RP-HPLC 이동상, 20 mM 헥산 술포네이트, pH 2.0, 완충제의 첨가에 의해 샘플을 즉시 켄칭하고, 각 샘플은 분석 전에 pH < 5로 환원된 것으로 확인되었다. 비환원된 cSDS에 의한 디술피드 결합 무결성 및 RP-HPLC에 의한 잔류 2-MEA/시스타민 농도에 대해 모든 시점을 검정하였다.
5 kDa 분자량 체류 필터에 의한 항체의 제거를 포함하는 잔류 2-MEA/시스타민 분석을 위해 추가 샘플 제조가 필요하였다. 비환원된 cSDS % 순도 및 잔류 2-MEA/시스타민 결과는 표 9에 보고되어 있다.
24시간 환원 인큐베이션의 완료시, 낮은 % DO2 용기를 UF/DF 시스템으로 옮겼다. 질소의 오버레이는 보유물로부터 DO2를 계속 고갈시키기 위해 용기의 헤드스페이스를 통해 보유물 용기로 계속 전달되었고, UF 및 DF 공정 전체에 걸쳐 유지되었다. 완충제를 통한 DO2의 첨가를 방지하기 위해, 투석여과 완충제를 또한 공정 전체에 걸쳐 질소와 살포하였다. 인라인 DO2 센서를 사용하여 UF 및 DF 단계의 시작 전에 보유물이 5% DO2 미만의 수준에 도달하고 투석여과 완충제가 1% DO2 미만의 수준에 도달하였음을 입증하였다.
UF 및 DF 공정 전체에 걸쳐, DO2 수준을 UF/DF 동안 공급물 주입구, 보유물 및 투과물 라인에서 측정하였고, 모두 < 4 % DO2로 유지되었다. 투석여과 완충제는 < 1% DO2 수준으로 유지되었다. UF/DF 시스템은 100 mM 트리스-아세테이트, 30 mM NaCl, pH 7.5 완충제를 사용하여 12 투석여과 부피 (DV)에 대해 14.5 psi의 막횡단 압력을 표적화하는 55 mL/분 교차 유속으로 유지되었다. 인큐베이션 후 모든 공정을 실온 (18 - 22℃)에서 수행하였다. UF/DF의 완료시, 회수된 보유물을 1.0 M 아세트산으로 켄칭하고, pH 5.0으로 조정하여 추가 디술피드 결합 형성을 최소화하였다. 벌크 물질을 후속적으로 -70℃에서 저장하였다. 추가 투석여과 완충제의 도입으로부터 물질의 임의의 가능한 산화를 방지하기 위해 UF/DF의 완료 후 추가 완충제 회수 플러시를 수행하지 않았다.
비환원된 cSDS에 의한 디술피드 무결성 및 RP-HPLC에 의한 잔류 2-MEA/시스타민을, 낮은 DO2 % 용기 및 주위 DO2를 갖는 대조군 용기 모두에 대해 환원 및 UF/DF 전반에 걸쳐 다양한 시점에서 측정하였다.
데이터의 요약은 표 9에 나타낸다. 산소 부족 조건하에 Fab-아암 교환 반응만이 이 실험에서 UF/DF를 통해 계속되었다. 잔류 2-MEA 및 시스타민은 두 Fab-아암 교환 조건에 대한 환원을 통해서만 측정하였지만, 산소 부족 조건에 대한 UF/DF 동안 측정하였고, 샘플을 수득하여 비환원된 cSDS에 의한 가능한 디술피드 결합의 재형성을 측정하였다.
<표 9>
Figure pct00011
결론: 이 데이터는 환원 및 UF/DF 동안 산소의 부재하에 산소 독립 경로가 디술피드 결합 형성을 매개한다는 가설을 뒷받침한다.
Fab-아암 교환을 산소 부족 조건하에 수행한 경우, 환원 과정에 걸쳐 최소 시스타민 형성 및 디술피드 결합 재형성이 관찰되었다. 2-MEA의 존재하에 24시간 인큐베이션의 완료에 의해, 오직 1.6 mM 시스타민 및 14.74 % 무손상 항체가 관찰되었다. 그럼에도 불구하고, 항체 샘플이 UF/DF를 통해 가공되면, 2-MEA가 제거됨에 따라 디술피드 결합 재형성 수준이 증가하는 것이 분명하였다. DV (DV12)의 종료시, pH 5.0에서 형성된 이중특이적 항체 제제는 90.59 %의 % 순도로 측정되었다.
주위 DO2에서, 디술피드 결합 환원이 빠르게 발생하였고, 환원 시작 30분 후, 모 항체의 약 86%가 환원되었다. 디술피드 결합의 재형성은 용액에 잔류 2-MEA가 계속 존재하는 경우에도 나머지 환원 동안 관찰되었다. 환원 단계의 완료시, 항체의 71%는 무손상 디술피드 결합을 가졌다. 환원 인큐베이션 동안 이중특이적 항체의 형성 수준이 증가할 뿐만 아니라 시스타민 이량체 형성은 산소가 도 4에 예시된 반응 4 및 2에 의해 각각 소비되고 있음을 나타내었다. 이는 2-MEA의 상당한 고갈 및 이량체 화합물 시스타민으로의 전환을 보여주는 RP-HPLC 데이터에 의해 뒷받침되었다 (도 4의 반응 4).
이 연구는 환원 단계 동안 DO2가 IgG HC-HC 및 LC-HC 쇄간 디술피드 결합의 형성을 촉매하였지만, 디술피드 결합이 산소 부족 조건에서도 재형성되었기 때문에 무손상 이중특이적 항체의 형성에 필수적이지 않았음을 입증하였다. 투석여과 동안 산소의 부재하에서도 2-MEA의 제거는 도 4의 반응 1에서 역반응에 의해 유도된 디술피드 결합 재형성을 설명하였다.
실시예 7. 고농도의 모 항체를 사용하여 주위 DO2에서 Fab-아암 교환을 사용하는 이중특이적 EGFR/c-Met 항체의 생성
더 높은 동종이량체 혼합물 단백질 농도 및 단백질 질량에 대한 환원제의 다양한 비율이 산화된 이종이량체 항체를 생산한다는 가설을 평가하기 위해 이 연구를 설계하였다.
이중특이적 EGFR/cMet 항체를 연구에 사용하였다. EGFR/cMet 항체는 서열식별번호: 4의 제1 중쇄 (HC1), 서열식별번호: 5의 제1 경쇄 (LC), 서열식별번호: 6의 제2 HC (HC2) 및 서열식별번호: 7의 제2 LC (LC2)를 포함한다.
연구를 위해, 모 EGFR 및 c-Met 항체 (둘 모두 IgG1 이소타입임)를 사용하여 Fab-아암 교환을 수행하였다. 용액 중 모 항체 여과된 중화된 단백질 A 용출액의 혼합물을 제조하고, pH 7.9로 조정하고, 209.5 mM 아세트산나트륨, 300 mM NaCl, pH 7.9를 사용하여 10 - 35 g/L의 총 IgG 농도로 희석하였다. 50 mM 아세트산나트륨, 800 mM 2-MEA pH 5.0 스톡 용액을 35, 50 또는 100 mM의 표적 환원제 농도로 각 모 혼합물에 첨가하였다. 환원된 모 용액 모두를 3시간 동안 인큐베이션하였으며, 21.5℃, 24℃에서 제어하거나 주위 실온에서 비제어된 상태로 두었다. 3시간 후, 인큐베이션된 혼합물을 10 mM 트리스, 7.8 mM 아세트산, pH 7.5에 대해 한외여과 및 투석여과하였다. 작동 조건 및 분석 결과의 요약은 표 10에 나타낸다. 이 연구는 21.5 - 24℃의 온도 범위, 35 - 100 mM의 환원제 농도, 및 10-35 g/L의 동종이량체 혼합물 단백질 농도에서 이들 조건 하에 산화된 이종이량체를 입증하였다. 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 NR-cSDS 및 IHC-HPLC 모두에 의해 이중특이적 항체 무결성 및 순도를 평가하였다.
<표 10>
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
SEQUENCE LISTING <110> Janssen Biotech, Inc. Alfonso Martin, Pedro Jose Capaldi, Michael Cohen, Jeffrey Detzel, Andrew Sakyiama, Joseph <120> Methods of producing heterodimeric antibodies <130> JBI6029WOPCT1 <140> To be assigned <141> 2019-12-xx <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 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Claims (72)

  1. a) 제1 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린의 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 동종이량체 항체 및 제2 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린의 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 동종이량체 항체를 제공하는 단계이며, 여기서 제1 CH3 영역 및 제2 CH3 영역의 아미노산 서열은 상이하여, 제1 CH3 영역 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 제1 CH3 영역 사이의 동종이량체 상호작용 또는 제2 CH3 영역 사이의 동종이량체 상호작용보다 강하도록 하는 것인 단계;
    b) 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체를 혼합물로 합하는 단계; 및
    c) 환원제 및 주위 용존 산소 (DO2)의 존재하에 혼합물을 인큐베이션하여 이종이량체 항체를 생산하는 단계
    를 포함하는, 이종이량체 항체를 생산하는 방법이며, 혼합물 중 DO2 백분율 (%)을 측정하는 단계, 혼합물 중 % DO2를 제어하는 단계, 또는 이종이량체 항체를 생산하는 동안 혼합물에 산소를 첨가하는 단계 중 하나 이상의 단계가 결여된 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 혼합물 중 % DO2가 단계 1b)에서 약 30% 이상인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, % DO2가 이종이량체 항체를 생산하는 동안 약 10% 내지 약 90%인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체를 약 1:1 내지 약 1:2의 몰비로 단계 1b)에서 혼합물로 합하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체를 약 1.05:1의 몰비로 단계 1b)에서 혼합물로 합하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도가 약 8 g/L 내지 약 13 g/L, 예컨대 약 10.5 g/L인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물을 환원제의 존재하에 약 10분 이상 동안 인큐베이션하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 혼합물을 환원제의 존재하에 약 10분 내지 약 24시간 동안 인큐베이션하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 환원제가 2-머캅토에틸아민 (2-MEA), 2-MEA의 화학적 유도체, L-시스테인 또는 D-시스테인인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 혼합물 중 2-MEA의 농도가 약 20 mM 내지 40 mM, 예컨대 약 35 mM인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물이 완충제를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 완충제가 아세트산나트륨 완충제를 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 완충제가 NaCl을 추가로 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 완충제가 약 100 mM 아세트산나트륨 및 약 30 mM NaCl을 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 완충제의 pH가 약 7.3인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물로부터 환원제를 제거하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 환원제가 여과에 의해 제거되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 여과가 투석여과인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체가 IgG1, IgG2 또는 IgG4 이소타입인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 제1 CH3 도메인 및 제2 CH3 도메인이 서열식별번호: 1의 야생형 IgG1, 서열식별번호: 2의 야생형 IgG2 또는 서열식별번호: 3의 야생형 IgG4와 비교할 때 하기 돌연변이를 포함하는 것인 방법: F405L/K409R, 야생형/F405L_R409K, T350I_K370T_F405L/K409R, K370W/K409R, D399AFGHILMNRSTVWY/K409R, T366ADEFGHILMQVY/K409R, L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH, D399FHKRQ/K409AGRH, F405IKLSTVW/K409AGRH, Y407LWQ/K409AGRH, T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S, T366W/T366S_L368A_Y407V, L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F, T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W, K409D/D399K, K409E/D399R, K409D_K360D/D399K_E356K, K409D_K360D/D399E_E356K, K409D_K370D/D399K_E357K, K409D_K370D/D399E_E357K, K409D_K392D/D399K_E356K_E357K 또는 K409D_K392D/D399E_E356K_E357K.
  21. 제20항에 있어서, 제1 Fc 영역 및/또는 제2 Fc 영역이 서열식별번호: 1의 야생형 IgG1, 서열식별번호: 2의 야생형 IgG2 또는 서열식별번호: 3의 야생형 IgG4와 비교할 때 Fcγ 수용체 (FcγR), FcRn 또는 단백질 A에 대한 제1 Fc 영역 및/또는 제2 Fc 영역의 결합을 조정하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, FcγR이 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb 또는 FcγRIII인 방법.
  23. 제21항에 있어서, Fcγ에 대한 제1 Fc 영역 및/또는 제2 Fc 영역의 결합을 조정하는 하나 이상의 치환이 L234A_L235A, F234A_L235A, S228P_F234A_L235A, S228P_L234A_L235A, V234A_G237A_P238S_H268A_V309L_A330S_P331S, V234A_G237A, H268Q_V309L_A330S_P331S, S267E_L328F, L234F_L235E_D265A, L234A_L235A_G237A_P238S_H268A_A330S_P331S 또는 S228P_F234A_L235A_G237A_P238S인 방법.
  24. 제21항에 있어서, FcRn에 대한 제1 Fc 영역 및/또는 제2 Fc 영역의 결합을 조정하는 하나 이상의 치환이 M428L_N434S, M252Y_S254T_T256E, T250Q_M428L, N434A 및 T307A_E380A_N434A, H435A, P257I_N434H, D376V_N434H, M252Y_S254T_T256E_H433K_N434F, T308P_N434A 또는 H435R인 방법.
  25. 제21항에 있어서, 단백질 A에 대한 제1 Fc 영역 및/또는 제2 Fc 영역의 결합을 조정하는 하나 이상의 치환이 Q311R, Q311K, T307P_L309Q, T307P_V309Q, T307P_L309Q_Q311R, T307P_V309Q_Q311R, H435R 또는 H435R_Y436F인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 이종이량체 항체를 생산하는 단계가 GMP-준수 조건하에 수행되는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 이종이량체 항체를 생산하는 단계가 이종이량체 항체를 포함하는 약물 물질의 제조 동안 수행되는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 이종이량체 항체가 이중특이적 항체인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 이중특이적 항체가 CD3, CD123, BCMA, EGFR 또는 c-Met, 또는 이들의 임의의 조합에 결합하는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물 중 총 면역글로불린에 대한 환원제의 질량비가 약 1.0 내지 약 5.0인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 질량비가 약 1.4 내지 약 3.8인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 질량비가 약 3.3 내지 약 4.4인 방법.
  33. a) 제1 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린의 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 동종이량체 항체 및 제2 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린의 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 동종이량체 항체를 제공하는 단계이며, 여기서 제1 CH3 영역 및 제2 CH3 영역의 아미노산 서열은 상이하여, 제1 CH3 영역 및 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용이 제1 CH3 영역 사이의 동종이량체 상호작용 또는 제2 CH3 영역 사이의 동종이량체 상호작용보다 강하도록 하는 것인 단계;
    b) 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체를 혼합물로 합하는 단계; 및
    c) 환원제의 존재하에 혼합물을 인큐베이션하는 단계; 및
    d) 환원제를 제거하여 이종이량체 항체를 생산하는 단계
    를 포함하는, 이종이량체 항체를 생산하는 방법이며, 여기서 용존 산소 (DO2)의 백분율 (%)은 단계 c), 단계 d), 또는 단계 c) 및 단계 d) 모두에서 약 30% 이하로 제어되는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 혼합물 중 % DO2가 약 25% 이하, 20% 이하, 약 15% 이하, 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하 또는 약 1% 이하인 방법.
  35. 제34항에 있어서, % DO2가 질소의 오버레이에 의해 제어되는 것인 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체를 약 1:1 내지 약 1:2의 몰비로 단계 b)에서 혼합물로 합하는 것인 방법.
  37. 제34항 또는 제35항에 있어서, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체를 약 1.05:1의 몰비로 단계 b)에서 혼합물로 합하는 것인 방법.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물 중 면역글로불린의 총 농도가 약 10.5 g/L인 방법.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물을 환원제의 존재하에 약 10분 이상 동안 인큐베이션하는 것인 방법.
  40. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물을 환원제의 존재하에 약 10분 내지 약 24시간 동안 인큐베이션하는 것인 방법.
  41. 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 환원제가 2-머캅토에틸아민 (2-MEA), 2-MEA의 화학적 유도체, L-시스테인 또는 D-시스테인인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 혼합물 중 2-MEA의 농도가 약 35 mM인 방법.
  43. 제33항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물이 완충제를 포함하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 완충제가 아세트산나트륨 완충제를 포함하는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 완충제가 NaCl을 추가로 포함하는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 완충제가 약 100 mM 아세트산나트륨 및 약 30 mM NaCl을 포함하는 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 완충제의 pH가 약 7.3인 방법.
  48. 제33항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물로부터 환원제를 제거하는 단계를 포함하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 환원제가 여과에 의해 제거되는 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 여과가 투석여과인 방법.
  51. 제33항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 동종이량체 항체 및 제2 동종이량체 항체가 IgG1, IgG2 또는 IgG4 이소타입인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 제1 CH3 도메인 및 제2 CH3 도메인이 서열식별번호: 1의 야생형 IgG1, 서열식별번호: 2의 야생형 IgG2 또는 서열식별번호: 3의 야생형 IgG4와 비교할 때 하기 돌연변이를 포함하는 것인 방법: F405L/K409R, 야생형/F405L_R409K, T350I_K370T_F405L/K409R, K370W/K409R, D399AFGHILMNRSTVWY/K409R, T366ADEFGHILMQVY/K409R, L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH, D399FHKRQ/K409AGRH, F405IKLSTVW/K409AGRH, Y407LWQ/K409AGRH, T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S, T366W/T366S_L368A_Y407V, L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F, T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W, K409D/D399K, K409E/D399R, K409D_K360D/D399K_E356K, K409D_K360D/D399E_E356K, K409D_K370D/D399K_E357K, K409D_K370D/D399E_E357K, K409D_K392D/D399K_E356K_E357K 또는 K409D_K392D/D399E_E356K_E357K.
  53. 제52항에 있어서, 제1 Fc 영역 및/또는 제2 Fc 영역이 서열식별번호: 1의 야생형 IgG1, 서열식별번호: 2의 야생형 IgG2 또는 서열식별번호: 3의 야생형 IgG4와 비교할 때 Fcγ 수용체 (FcγR), FcRn 또는 단백질 A에 대한 제1 Fc 영역 및/또는 제2 Fc 영역의 결합을 조정하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, FcγR이 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb 또는 FcγRIII인 방법.
  55. 제53항에 있어서, Fcγ에 대한 제1 Fc 영역 및/또는 제2 Fc 영역의 결합을 조정하는 하나 이상의 치환이 L234A_L235A, F234A_L235A, S228P_F234A_L235A, S228P_L234A_L235A, V234A_G237A_P238S_H268A_V309L_A330S_P331S, V234A_G237A, H268Q_V309L_A330S_P331S, S267E_L328F, L234F_L235E_D265A, L234A_L235A_G237A_P238S_H268A_A330S_P331S 또는 S228P_F234A_L235A_G237A_P238S인 방법.
  56. 제53항에 있어서, FcRn에 대한 제1 Fc 영역 및/또는 제2 Fc 영역의 결합을 조정하는 하나 이상의 치환이 M428L_N434S, M252Y_S254T_T256E, T250Q_M428L, N434A 및 T307A_E380A_N434A, H435A, P257I_N434H, D376V_N434H, M252Y_S254T_T256E_H433K_N434F, T308P_N434A 또는 H435R인 방법.
  57. 제53항에 있어서, 단백질 A에 대한 제1 Fc 영역 및/또는 제2 Fc 영역의 결합을 조정하는 하나 이상의 치환이 Q311R, Q311K, T307P_L309Q, T307P_V309Q, T307P_L309Q_Q311R, T307P_V309Q_Q311R, H435R 또는 H435R_Y436F인 방법.
  58. 제33항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 이종이량체 항체를 생산하는 단계가 GMP-준수 조건하에 수행되는 것인 방법.
  59. 제33항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 이종이량체 항체를 생산하는 단계가 이종이량체 항체를 포함하는 약물 물질의 제조 동안 수행되는 것인 방법.
  60. 제33항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 이종이량체 항체가 이중특이적 항체인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 이중특이적 항체가 CD3, CD123, BCMA, EGFR 또는 c-Met, 또는 이들의 임의의 조합에 결합하는 것인 방법.
  62. 제33항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물 중 총 면역글로불린에 대한 환원제의 질량비가 약 1.0 내지 약 5.0인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 질량비가 약 1.4 내지 약 3.8인 방법.
  64. 제62항에 있어서, 질량비가 약 3.3 내지 약 4.4인 방법.
  65. 제1항의 방법에 의해 생산되는 단리된 이중특이적 항체.
  66. 제65항에 있어서, EGFR 및 c-Met에 결합하는 이중특이적 항체.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 서열식별번호: 4의 제1 중쇄 (HC1), 서열식별번호: 5의 제1 경쇄 (LC1), 서열식별번호: 6의 제2 중쇄 (HC2) 및 서열식별번호: 7의 제2 경쇄 (LC2)를 포함하는 이중특이적 항체.
  68. 제65항에 있어서, CD3에 결합하는 이중특이적 항체.
  69. 제33항의 방법에 의해 생산되는 단리된 이중특이적 항체.
  70. 제69항에 있어서, EGFR 및 c-Met에 결합하는 이중특이적 항체.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 서열식별번호: 4의 제1 중쇄 (HC1), 서열식별번호: 5의 제1 경쇄 (LC1), 서열식별번호: 6의 제2 중쇄 (HC2) 및 서열식별번호: 7의 제2 경쇄 (LC2)를 포함하는 이중특이적 항체.
  72. 제69항에 있어서, CD3에 결합하는 이중특이적 항체.
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