JPWO2020114918A5

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Publication number: JPWO2020114918A5
Application number: JP2020572458A
Authority: JP
Publication date: 2022-11-10

Claims

以下を含む組成物：
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼと、
エンドヌクレアーゼと、
３’→５’一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性を含むエキソヌクレアーゼ。
前記エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩである、請求項１に記載の組成物。
前記エンドヌクレアーゼが、ＤＮＡグリコシラーゼリアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである、請求項１または２に記載の組成物。
ｉ）ウラシル切断部位を含む二本鎖ＤＮＡ基質；および／または
ｉｉ）脱塩基部位を含む二本鎖ＤＮＡ基質
をさらに含み；
任意で、前記二本鎖ＤＮＡ基質が、一本鎖領域を含み、前記ウラシル切断部位および前記脱塩基部位が、二本鎖領域に存在する、
請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
複数の増幅部位を含むアレイをさらに含み、各増幅部位が、前記増幅部位に付着した複数の前記二本鎖ＤＮＡ基質を含む、請求項４に記載の組成物。
以下の工程を含む、配列決定反応のための核酸を調製する方法：
（ａ）複数の増幅部位を含むアレイを用意する工程であって、前記増幅部位が、
（ｉ）前記増幅部位に付着した複数の捕捉核酸であって、
その第１集団が切断部位を含む捕捉核酸と、
（ｉｉ）複数のクローン二本鎖修飾標的核酸であって、
各二本鎖標的核酸の両鎖がそれらの５’末端で捕捉核酸に付着しており、
一方の鎖が前記切断部位を含む捕捉核酸に付着しており、
前記切断部位が各二本鎖分子の二本鎖領域に位置するクローン二本鎖修飾標的核酸とを含む、工程；
（ｂ）前記切断部位に脱塩基部位を作り出すための少なくとも１つの酵素と、３’→５’一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ活性を含むエキソヌクレアーゼとを含む組成物を前記アレイに接触させる工程であって、
切断が前記切断部位で起こり、
切断が、二本鎖標的核酸の一方の鎖を、前記増幅部位に付着している第１鎖と、前記増幅部位に付着していない第２鎖とに変え；
遊離３’末端を含む一本鎖捕捉核酸の長さがエキソヌクレアーゼによって短縮している、工程。
ｉ）前記切断部位に脱塩基部位を作り出すための少なくとも１つの酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼとエンドヌクレアーゼとを含み；および／または
ｉｉ）前記エンドヌクレアーゼがＤＮＡグリコシラーゼリアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである、
請求項６に記載の方法。
前記切断部位に脱塩基部位を作り出すための少なくとも１つの酵素と、前記エキソヌクレアーゼとを前記アレイから除去する工程をさらに含む、請求項６または７のいずれか一項に記載の方法。
前記切断された二本鎖標的核酸を、前記増幅部位に付着していない第２鎖を除去する条件にさらす工程をさらに含み；
任意で、前記第２鎖を除去する条件が、変性剤を含み、前記変性剤が、捕捉核酸の第２集団に共有結合している標的核酸を含む固定化された一本鎖核酸をもたらし、前記捕捉核酸の第２集団が前記増幅部位に付着し、
任意で、前記変性剤が、ホルムアミドを含む、
請求項７または８に記載の方法。
前記固定化された一本鎖核酸を捕捉核酸の第１集団のメンバーに再アニーリングし、固定化された部分的に一本鎖の核酸を生成する工程をさらに含む、請求項８または９に記載の方法。
ｉ）前記切断部位が、各二本鎖標的核酸の二本鎖領域の捕捉核酸領域に位置し；および／または
ｉｉ）前記切断部位が、ウラシルを含み、前記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼにより脱塩基部位が生成され、前記脱塩基部位が前記エンドヌクレアーゼにより切断される、
請求項６～１０のいずれか一項に記載の方法。
前記エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩである、請求項６～１１のいずれか一項に記載の方法。
請求項９に記載の固定化された一本鎖核酸または請求項１０に記載の固定化された部分的に一本鎖の核酸の一本鎖領域にシーケンシングプライマーをハイブリダイズさせる工程をさらに含み、それにより配列決定反応のための一本鎖核酸を調製し；
任意で、前記方法が、配列決定反応を行い、前記固定化された一本鎖核酸または前記固定化された部分的に一本鎖の核酸の少なくとも１つの領域の配列を決定する工程をさらに含む、
請求項９または１０に記載の方法。
前記配列決定反応が、合成による配列決定を含む、請求項１３に記載の方法。
前記捕捉核酸を増幅プライマーとして使用し、複数の標的核酸を増幅することにより前記アレイが作製され；
任意で、増幅することが、排除増幅を含む、
請求項６～１４のいずれか一項に記載の方法。