JPWO2019230543A1 - ジピコリルアミン構造を有するポリマー、その製造方法、抗微生物剤および抗菌方法 - Google Patents
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Abstract
簡易な手順で合成することができ、かつ、抗微生物活性を有する新規のポリマー、当該ポリマーの製造方法、並びにその利用技術を提供するために、アミノ基を有するポリマーにおいて、当該アミノ基にα−ピコリル基２分子を修飾してなる、ジピコリルアミン構造を有するポリマーを用いる。
Description
本発明は、ジピコリルアミン構造を有するポリマー、その製造方法、抗微生物剤および抗菌方法に関する。
抗生物質は、細菌の感染症に対する強力なツールである。従来、細菌が合成するタンパク質を標的とした様々な抗生物質が開発されてきた。しかしながら、標的とされたタンパク質の構造を変えるなどの方法により、従来の抗生物質に対して薬剤耐性を獲得する細菌が報告されている。そのため、タンパク質を標的とした従来の抗生物質では、感染症への対応としては十分ではなかった。
このような理由から、近年、タンパク質以外の物質を標的とした抗生物質の開発が求められている。
本発明者らは、これまでに、細菌の細胞膜を標的とした、抗微生物活性を有するポリマーを開発している。例えば、非特許文献１において、ジピコリルアミン（Dipicolylamine：ＤＰＡ）構造を有するメタクリレートモノマーを重合して、抗微生物活性を有するポリマーを製造する技術を報告している。
Kazuma Yasuahara et. al.，Polymer Preprints 2012, 53(1), 554
しかしながら、上述した非特許文献１では、抗微生物活性を有するポリマーを製造するにあたり、多くの工程が必要であった。このため、目的のポリマーを簡易な合成方法によって得るという観点からは、十分なものでなく、さらなる改善の余地があった。
本発明の一実施形態は、上記問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、簡易な手順で合成することができ、かつ、抗微生物活性を有する新規のポリマー、当該ポリマーの製造方法、並びにその利用技術を提供することである。
＜１＞アミノ基を有するポリマーにおいて、当該アミノ基にα−ピコリル基２分子を修飾してなる、下記式（１）で表されるジピコリルアミン構造を有するポリマー：
＜２＞＜１＞に記載のポリマーを含む、抗微生物剤。
＜３＞末端および／または側鎖にアミノ基を有するポリマーに、α−ピコリル基を反応させる反応工程を含む、下記式（６）で表されるジピコリルアミン構造を有するポリマーの製造方法：
＜４＞＜２＞に記載の抗微生物剤を用いて対象物を処理する処理工程を含む、抗菌方法。
本発明の一実施形態によれば、優れた抗微生物活性を有する新規なポリマーを、簡易な手順で取得し得るという効果を奏する。
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能である。また、異なる実施形態または実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態または実施例についても、本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。なお、本明細書中に記載された学術文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。
〔１．ポリマー〕
本発明の一実施形態に係るポリマーは、アミノ基を有するポリマーにおいて、当該アミノ基にα−ピコリル基２分子を修飾してなる、上記式（１）で表されるＤＰＡ構造を有するものである。なお、式（１）のＤＰＡ構造は、金属Ｍと錯体を形成している構造であってもよい。
本発明の一実施形態に係るポリマーは、アミノ基を有するポリマーにおいて、当該アミノ基にα−ピコリル基２分子を修飾してなる、上記式（１）で表されるＤＰＡ構造を有するものである。なお、式（１）のＤＰＡ構造は、金属Ｍと錯体を形成している構造であってもよい。
本発明の一実施形態に係るポリマーは、上記構成を有することにより、簡易な手順で合成することができ、かつ、優れた抗微生物活性を有する。抗微生物活性についてより詳細に説明すると次のとおりである。微生物の表面、すなわち微生物の細胞膜（脂質膜）の外側表面は、負に帯電している。本発明の一実施形態に係るポリマーは水中でポリカチオンとして存在し得る。このため、本ポリマーは微生物の表面の細胞膜を選択的に認識し、負電荷脂質に対して選択的に結合することで、微生物の細胞膜の構造が撹乱される。その結果、微生物の生物活性が抑制されるものと考えられる。
式（１）のＲは、水素原子であることが好ましいが、これに限られず、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、炭素数１〜６のアルキル基、および炭素数１〜６のアルコキシ基からなる群からそれぞれ独立して選択され得る。
式（１）のＲとなり得るハロゲン原子は、特に限定されない。当該ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
式（１）のＲとなり得る炭素数１〜６のアルキル基は、特に限定されない。当該炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、３−メチルペンチル基等が挙げられる。
式（１）のＲとなり得る炭素数１〜６のアルコキシ基は、特に限定されない。当該炭素数１〜６のアルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ネオペントキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ、３−メチルペントキシ基等が挙げられる。
本発明の一実施形態に係るポリマーにおいて、式（１）で表されるＤＰＡ構造は、金属Ｍと錯体を形成していることが好ましい。上記構成であれば、ポリマーの正電荷が増加するため、ポリマーの微生物への選択的な認識・結合性が増加し得る。そのため、ポリマーが優れた抗微生物活性を発揮し得るという利点を有する。金属Ｍは、ジピコリルアミン構造と錯体を形成し得る限り特に限定されない。金属Ｍとしては、例えば、２価金属を挙げることができ、より具体的に、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｍｎ等を挙げることができる。これらの中でも、Ｚｎであることがより好ましい。Ｚｎは生物の生体内に豊富に存在し得る。そのため、金属ＭがＺｎである場合には、ポリマーの適用を意図しない生物にポリマーが取り込まれた場合であっても、当該生物に対するポリマーの毒性を抑えることが可能となる。
本発明の一実施形態に係るポリマーの原料となるポリマー（以下、原料ポリマーとも称する）、すなわちアミノ基を有するポリマーとしては、−ＮＨ２および／または−ＮＨ３ ＋を有するものであればよく、特に限定されない。アミノ基を有する原料ポリマーは、換言すれば、第１級アミンを有する原料ポリマーともいえる。原料ポリマーとしては、例えば、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリリジン、側鎖型アミノ変性シリコーンオイル、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリノルボルネン、ポリシラン、およびそれらの共重合体、等が挙げられる。また、ポリアミドアミン（polyamidamin；ＰＡＭＭ）などのデンドリマーを原料ポリマーとして用いることも可能である。これらのポリマーおよびデンドリマーは、原料ポリマーとして１種を用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。また、これらポリマーおよびデンドリマーの中でも、原料ポリマーとしては、ポリエチレンイミンまたはポリアリルアミンが好ましい。
原料ポリマーとして使用可能なポリエチレンイミンは、直鎖高分子でなく、第１級、第２級、および／または第３級アミンを含む分岐構造を有するポリマーであり得る。
原料ポリマーは水溶性ポリマーであることが好ましい。上記構成によれば、得られるポリマーが水溶性となるため、抗微生物剤としての利用が容易となり、用途が広がるという利点を有する。
本発明の一実施形態に係るポリマーは、上記式（２）または上記式（３）で示される繰り返し単位を有することが好ましい。
上記式（２）中、ｍおよびｎは、それぞれ独立して任意に選択される整数である。例えば、ｍは１〜１０００であることが好ましく、１〜５００であることがより好ましく、１〜５０であることが更に好ましく、１〜１０であることが特に好ましい。また、ｎは、１〜１０００であることが好ましく、５〜５００であることがより好ましく、７〜１００であることが更に好ましく、１０〜３９であることが特に好ましい。
また、上記式（２）において、繰り返し回数がｍである繰り返し単位は、第３級アミンを有している。このような繰り返し単位を有するポリマーを原料ポリマーとして用いた場合、第３級アミンのＨにα−ピコリル基が導入される場合がある。第３級アミンに導入されたα−ピコリル基は、ＤＰＡ構造を形成できない。故に、原料ポリマーが有する当該繰り返し単位（上記式（２）において繰り返し回数がｍである繰り返し単位）の数は、少ない方が好ましい。
上記式（３）中、ｎは任意に選択される整数である。例えば、ｎは、１〜５００であることが好ましく、５〜３００であることがより好ましく、１０〜１００であることが更に好ましく、２０〜４０であることが特に好ましい。
上記式（２）および（３）中、ＸはポリマーとＤＰＡ構造とをつなぐスペーサーを意図している。Ｘは炭素数１〜５の直鎖アルキル基である。またＸは、炭素数１〜４の直鎖アルキル基であることが好ましく、炭素数１〜３の直鎖アルキル基であることがより好ましく、炭素数１または２の直鎖アルキル基であることがさらに好ましく、炭素数１の直鎖アルキル基であることが特に好ましい。
上記式（２）で示される繰り返し単位を有するポリマーは、ポリエチレンイミンを原料ポリマーとして用いることにより得ることができる。また、上記式（３）で示される繰り返し単位を有するポリマーは、ポリアリルアミンを原料ポリマーとして用いることにより得ることができる。
本発明の一実施形態に係るポリマーは、上記式（４）または上記式（５）であることが好ましい。上記式（４）は、ポリエチレンイミンを原料ポリマーとして用いることにより得ることができる。また、上記式（５）は、ポリアリルアミンを原料ポリマーとして用いることにより得ることができる。
上記式（５）中、ｎは任意に選択される整数である。例えば、ｎは、１〜５００であることが好ましく、５〜３００であることがより好ましく、１０〜１００であることが更に好ましく、２０〜４０であることが特に好ましい。
本発明の一実施形態に係るポリマーの分子量は、特に限定されず、適宜設定され得る。例えば、２５０〜１０万であることが好ましく、３００〜１万であることがより好ましく、５００〜５０００であることが更に好ましく、７５０〜３０００であることが特に好ましい。例えば、本発明の一実施形態に係るポリマーが、ポリエチレンイミンを原料ポリマーとして得られるものである場合、本発明の一実施形態に係るポリマーの分子量は、数平均分子量であることが好ましい。一方、本発明の一実施形態に係るポリマーが、ポリアリルアミンを原料ポリマーとして得られるものである場合、本発明の一実施形態に係るポリマーの分子量は、重量平均分子量であることが好ましい。上記数平均分子量は、粘度法によって算出される数平均分子量であってもよいし、沸点上昇に基づいて算出される数平均分子量であってもよい。
〔２．ポリマーの製造方法〕
本発明の一実施形態に係る、上記式（６）で表されるジピコリルアミン構造を有するポリマーの製造方法は、末端および／または側鎖にアミノ基を有するポリマーに、α−ピコリル基を反応させる、反応工程を含むものである。
本発明の一実施形態に係る、上記式（６）で表されるジピコリルアミン構造を有するポリマーの製造方法は、末端および／または側鎖にアミノ基を有するポリマーに、α−ピコリル基を反応させる、反応工程を含むものである。
反応工程に用いられる、末端および／または側鎖にアミノ基を有するポリマーは、上記〔１．ポリマー〕の項で説明した原料ポリマーを好適に用いることができる。
上記反応工程は、原料ポリマーとα−ピコリル基を有する化合物とを混合して接触させることによって、上記〔１．ポリマー〕を製造する工程である。
反応工程に用いられ得る、α−ピコリル基を有する化合物（以下、ピコリル基含有化合物とも称する）としては、α−ピコリル基を有する限り、特に限定されない。例えば、２−ピコリルクロリド塩酸塩（2-picolylchloridehydrochloride）等が挙げられる。
本発明の一実施形態に係るポリマーは、以下の（ｉ）および（ｉｉ）の方法により製造することも可能である：（ｉ）原料ポリマーと２−ピリジンカルボキシアルデヒド（2-pyridinecarboxyaldehyde）とを反応させてイミンを形成させる；（ｉｉ）還元剤を使用してイミンをアミンとすることにより、ジピコリルアミン構造を形成させる。
反応工程における、温度、ｐＨ、時間などの反応条件は、特に限定されず、原料ポリマーおよびピコリル基含有化合物の種類並びに量に依存して、かつ、ポリマーの合成効率および収量に依存して、適宜設定され得る。例えば、後述する実施例の条件を例示し得る。
反応工程では、反応を促進させるために、原料ポリマーとピコリル基含有化合物との混合物を、加温することが好ましい。反応工程では、当該混合物を加温して、３０℃〜１００℃にすることが好ましく、３５℃〜９０℃にすることがより好ましく、４０℃〜８０℃にすることがさらに好ましく、５０℃〜７０℃にすることが特に好ましい。
反応工程では、反応を促進させるために、原料ポリマーとピコリル基含有化合物との混合物のｐＨを調製することが好ましい。反応工程では、当該混合物のｐＨを調製して、ｐＨを１０〜１８にすることが好ましく、１１〜１６にすることがより好ましく、１２〜１４にすることがさらに好ましい。
反応工程の時間、換言すれば、原料ポリマーとピコリル基含有化合物とを接触させる時間は、本発明の一実施形態に係るポリマーを十分量得るために、８時間〜１６時間であることが好ましく、９時間〜１５時間であることがより好ましく、１０時間〜１４時間であることがさらに好ましく、１１時間〜１３時間であることが特に好ましい。
反応工程では、反応を促進させるために、原料ポリマーとピコリル基含有化合物との混合物を撹拌することが好ましい。
反応工程では、原料ポリマーに対して反応させるピコリル基含有化合物の量を変化させることにより、原料ポリマーに対するα−ピコリル基の導入量を調整することができる。原料ポリマーに対するα−ピコリル基の導入量および製造費用の観点からは、原料ポリマーに対して、ピコリル基含有化合物を２当量反応させることが好ましい。ピコリル基含有化合物は、原料ポリマーのアミノ基（−ＮＨ２および／または−ＮＨ３ ＋）と反応する。従って、原料ポリマーに対して、ピコリル基含有化合物を１当量反応させるということは、原料ポリマーが有する１級アミンのモル量に対して、同じモル量のピコリル基含有化合物を反応させることを意味する。
原料ポリマーは無色であることが多く、ピコリル基含有化合物は茶色であることが多い。一方、製造により得られたポリマーは、赤色を示す。故に、反応工程の前後で、溶液の色は無色および茶色から赤茶色（茶褐色）に変化し得る。また、原料ポリマーと比較して、製造により得られたポリマーは、水に対する溶解度が低下する。故に、反応工程前の溶液は透明であり、反応工程後の溶液は懸濁液となり得る。従って、ＤＰＡ構造を有するポリマーが合成されたか否か、またはどのくらいの量のＤＰＡ構造がポリマーに導入されたかについて、反応工程後の、溶液の色および溶液の懸濁度から推測することができる場合もあり得る。
本明細書において、原料ポリマーにおけるアミノ基（−ＮＨ２または−ＮＨ３ ＋）が有する水素原子（Ｈ）のうち、α−ピコリル基により置換された水素原子の割合を、変換率（％）で表す。変換率は、原料ポリマーのアミノ基が有する水素原子の数、および、製造後に得られたポリマーに導入されたα-ピコリル基の数、から求めることができる。原料ポリマーとして市販のポリマーを用いる場合には、販売元のカタログなどから当該ポリマーのアミノ基が有する水素原子の数が分かる。製造後に得られたポリマーに導入されたα-ピコリル基の数は、１Ｈ−ＮＭＲを用いることにより求めることができる。
本発明の一実施形態に係るポリマーの製造方法では、変換率は、１０％以上であることが好ましく、１５％以上であることがより好ましく、２０％以上であることがより好ましい。上記構成によれば、得られるポリマーは、十分な抗微生物活性を有する。
本発明の一実施形態に係るポリマーの製造方法では、変換率は３０％以上、４０％以上、５０％以上、６５％以上、８０％以上、９０％以上、または、１００％であってもよいが、変換率の上限値を低く設定することも可能である。後述する実施例にも示すように、変換率を上昇させると本発明の一実施形態に係るポリマーの抗微生物活性が、微生物、真菌類、腐敗菌および腐朽菌などの、増殖を抑制するに十分、または、これらを死滅させるに十分な程度にまで向上する。変換率が特定の値Ａに達すると、それ以上変換率を上昇させたとしても、本発明の一実施形態に係るポリマーの抗微生物活性が大きく向上することはない。それ故に、変換率の上限値を例えば値Ａに設定すれば、ポリマーに十分な抗微生物活性を付与した上で、ポリマーの製造に用いる原料（ピコリル基含有化合物）の量を抑制でき、その結果、ポリマーの製造コストを低減できるという利点が得られる。変換率の上限値は、特に限定されないが、例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％または２０％であってもよい。当該上限値は、対象とする微生物の種類、および／または、金属Ｍの有無などに応じて、適宜、設定され得る。
本発明の一実施形態に係るポリマーの製造方法は、反応工程の後に、さらに抽出工程を含んでいてもよい。反応工程で合成されたポリマーは、溶液中に存在し得る。本発明の一実施形態に係るポリマーの製造方法が抽出工程を含むことにより、合成されたポリマーを、固形物として得ることが可能となる。
上記抽出工程は、従来公知の方法を用いることができ、特に限定されない。抽出工程は、例えば、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）を用いた、抽出操作を行う工程であってもよい。当該抽出操作によって、溶液中から、ポリマーを有機層中に得ることができる。その後、例えば、ポリマーを含む有機層から、有機溶媒を減圧留去することにより、ポリマーを、固形物として得ることができる。ここで、ポリマーを含む有機層は、有機溶媒の減圧留去前に、（ａ）例えば飽和重曹水を用いて、洗浄されてもよく、さらに（ｂ）液相分離濾紙を用いて濾過されてもよい。ポリマーを含む有機層を、液相分離濾紙を用いて濾過する場合には、得られた濾液から有機溶媒を減圧留去することにより、ポリマーを、固形物として得ることができる。
本発明の一実施形態に係るポリマーの製造方法は、反応工程の後に、反応工程にて得られたポリマーと、金属Ｍとを混合する、混合工程をさらに含んでいてもよい。当該混合工程は、上述した抽出工程の前または後に行うことも可能である。当該構成によれば、式（１）で表されるジピコリルアミン構造が金属Ｍと錯体を形成している構造を有するポリマーを製造することができる。
本発明の一実施形態に係るポリマーは、金属Ｍと錯体を形成していなくても、所望の効果を得ることができる。また、本発明の一実施形態に係るポリマーを使用する環境に金属Ｍが存在すれば、本発明の一実施形態に係るポリマーは、当該金属Ｍと錯体を形成することも可能である。それ故に、本発明の一実施形態に係るポリマーの製造方法は、混合工程を含んでいなくてもよい。
本発明の一実施形態に係るポリマーの製造方法が抽出工程および混合工程を含む場合、抽出工程および混合工程の順番は特に限定されない。
〔３．抗微生物剤〕
本発明の一実施形態に係る抗微生物剤は、上記〔１．ポリマー〕の項で説明したポリマーを含むものである。
本発明の一実施形態に係る抗微生物剤は、上記〔１．ポリマー〕の項で説明したポリマーを含むものである。
本発明の一実施形態に係る抗微生物剤とは、細菌、真菌、藻類などの微生物の増殖を抑制またはこれら微生物を死滅させる効果を有する薬剤を意味する。抗真菌剤とは、真菌類の増殖を抑制またはこれらを死滅させる効果を有する薬剤を意味する。また、防腐・防かび剤とは、腐敗菌および腐朽菌の増殖を抑制またはこれらを死滅させる効果を有する薬剤を意図する。
本発明の一実施形態に係る抗微生物剤は、様々な用途に利用可能である。例えば、（ａ）金属加工油用防腐剤および水処理膜用抗菌処理剤等の業務用品としての利用、（ｂ）抗菌石鹸、抗菌塗装、化粧品、防腐剤および衛生用品等の民生品としての利用、（ｃ）医療用カテーテルの抗菌性表面加工等の医療機器への利用、並びに（ｄ）抗生物質および消毒剤等の医薬品としての利用、が挙げられる。
本発明の一実施形態に係る抗微生物剤は、ポリマー以外の成分（例えば、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、高分子量重合体、賦形剤、担体、希釈剤、溶媒、可溶化剤、安定剤、充填剤、結合剤、界面活性剤、安定化剤等）を含んでいてもよい。
本発明の一実施形態に係る抗微生物剤に含有されているポリマーの量は、特に限定されず、例えば、抗微生物剤を１００重量％とした場合に、０．００１重量％〜１００重量％であってもよく、０．０１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜９５重量％であってもよく、０．１重量％〜９０重量％であってもよく、０．１重量％〜８０重量％であってもよく、０．１重量％〜７０重量％であってもよく、０．１重量％〜６０重量％であってもよく、０．１重量％〜５０重量％であってもよく、０．１重量％〜４０重量％であってもよく、０．１重量％〜３０重量％であってもよく、０．１重量％〜２０重量％であってもよく、０．１重量％〜１０重量％であってもよい。
本発明の一実施形態に係る抗微生物剤に含有されているポリマー以外の成分の量は、特に限定されず、例えば、抗微生物剤を１００重量％とした場合に、０重量％〜９９．９９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５重量％〜９９．９重量％であってもよく、１０重量％〜９９．９重量％であってもよく、２０重量％〜９９．９重量％であってもよく、３０重量％〜９９．９重量％であってもよく、４０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５０重量％〜９９．９重量％であってもよく、６０重量％〜９９．９重量％であってもよく、７０重量％〜９９．９重量％であってもよく、８０重量％〜９９．９重量％であってもよく、９０重量％〜９９．９重量％であってもよい。
〔４．抗菌方法〕
本発明の一実施形態に係る抗菌方法は、上記〔３．抗微生物剤〕の項で説明した抗微生物剤を用いて対象物を処理する処理工程を含む。当該構成であれば、所望の対象物に対して、抗微生物剤に由来する抗微生物活性を付与することができる。例えば、抗微生物剤を溶液として調製し、当該溶液を用いて対象物を処理（例えば、コーティング等）すれば、あらゆる対象物に対して抗微生物活性を付与することができる。それ故に、本発明において、抗微生物活性が付与される対象物は限定さない。
本発明の一実施形態に係る抗菌方法は、上記〔３．抗微生物剤〕の項で説明した抗微生物剤を用いて対象物を処理する処理工程を含む。当該構成であれば、所望の対象物に対して、抗微生物剤に由来する抗微生物活性を付与することができる。例えば、抗微生物剤を溶液として調製し、当該溶液を用いて対象物を処理（例えば、コーティング等）すれば、あらゆる対象物に対して抗微生物活性を付与することができる。それ故に、本発明において、抗微生物活性が付与される対象物は限定さない。
上記対象物としては、特に限定されず、例えば、（ａ）金属加工油および水処理膜等の業務用品、（ｂ）石鹸、塗装および化粧品等の民生品、（ｃ）医療用カテーテル等の医療機器、並びに（ｄ）医薬品、が挙げられる。
上記処理工程にて行われる処理は、例えば、（ｉ）対象物と抗微生物剤とを混合する処理、または（ｉｉ）対象物に抗微生物剤を塗布する処理であってもよい。
〔その他の態様〕
本発明の一実施形態には、以下の発明が包含され得る：
（ｉ）抗微生物剤を製造するための、上記〔１．ポリマー〕の項で説明したポリマーの使用。
本発明の一実施形態には、以下の発明が包含され得る：
（ｉ）抗微生物剤を製造するための、上記〔１．ポリマー〕の項で説明したポリマーの使用。
（ｉｉ）上記〔１．ポリマー〕の項で説明したポリマーを用いて、抗微生物剤を製造する抗微生物剤の製造方法。
本発明の一実施形態は、以下のように構成することができる。
〔１〕アミノ基を有するポリマーにおいて、当該アミノ基にα−ピコリル基２分子を修飾してなる、下記式（１）で表されるジピコリルアミン構造を有するポリマー：
〔２〕
または、
で示される繰り返し単位を有する〔１〕に記載のポリマー。
〔３〕
または、
である、〔１〕または〔２〕に記載のポリマー。
〔４〕上記ジピコリルアミン構造を有するポリマーは、原料ポリマーのアミノ基が有する水素原子のうちα−ピコリル基に置換された水素原子の割合として示される変換率が、１０％以上のものである、〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載のポリマー。
〔５〕上記金属Ｍは、二価金属である、〔１〕〜〔４〕のいずれか１つに記載のポリマー。
〔６〕上記ジピコリルアミン構造を有するポリマーは、重量平均分子量または数平均分子量が２５０以上１０００００以下のものである、〔１〕〜〔５〕のいずれか１つに記載のポリマー。
〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載のポリマーを含む、抗微生物剤。
〔８〕末端および／または側鎖にアミノ基を有するポリマーに、α−ピコリル基を反応させる反応工程を含む、下記式（６）で表されるジピコリルアミン構造を有するポリマーの製造方法：
〔９〕〔７〕に記載の抗微生物剤を用いて対象物を処理する処理工程を含む、抗菌方法。
本発明の一実施例について以下に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
（装置）
以下の実施例および比較例において、使用した装置は以下の通りである。
○核磁気共鳴スペクトル装置(以下、1Ｈ-ＮＭＲと略記する)；ＥＣＸ−４００Ｐ（４００ＭＨｚ）、日本電子社製
○マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（以下、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳと略記する）；Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩ、Ｂｒｕｋｅｒ社製。
以下の実施例および比較例において、使用した装置は以下の通りである。
○核磁気共鳴スペクトル装置(以下、1Ｈ-ＮＭＲと略記する)；ＥＣＸ−４００Ｐ（４００ＭＨｚ）、日本電子社製
○マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（以下、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳと略記する）；Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩ、Ｂｒｕｋｅｒ社製。
（化合物）
以下の実施例および比較例において、使用した主な化合物は以下の通りである。
以下の実施例および比較例において、使用した主な化合物は以下の通りである。
（ｉ）原料ポリマー
○ポリエチレンイミン；日本触媒株式会社製のエポミンＳＰ−００３（分子量３００（沸点上昇による数平均分子量））、および、エポミンＳＰ−０１８（分子量１，８００（沸点上昇による数平均分子量））
○ポリアリルアミン；日東紡株式会社製のＰＡＡ−ＨＣＬ−０１（分子量１，６００（重量平均分子量））、ＰＡＡ−ＨＣＬ−０５（分子量５，０００（重量平均分子量））、およびＰＡＡ−ＨＣＬ−３Ｌ（分子量１５，０００（重量平均分子量））。
○ポリエチレンイミン；日本触媒株式会社製のエポミンＳＰ−００３（分子量３００（沸点上昇による数平均分子量））、および、エポミンＳＰ−０１８（分子量１，８００（沸点上昇による数平均分子量））
○ポリアリルアミン；日東紡株式会社製のＰＡＡ−ＨＣＬ−０１（分子量１，６００（重量平均分子量））、ＰＡＡ−ＨＣＬ−０５（分子量５，０００（重量平均分子量））、およびＰＡＡ−ＨＣＬ−３Ｌ（分子量１５，０００（重量平均分子量））。
（ｉｉ）ペプチド
○Ｍａｇａｉｎｉｎ−２。
○Ｍａｇａｉｎｉｎ−２。
（ｉｉｉ）細菌
○Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）；ＡＴＣＣ２５９２２
○Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）；ＡＴＣＣ２５９２３。
○Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）；ＡＴＣＣ２５９２２
○Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）；ＡＴＣＣ２５９２３。
（測定方法）
＜１Ｈ−ＮＭＲ＞
合成したポリマーについて、下記方法によって１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。
＜１Ｈ−ＮＭＲ＞
合成したポリマーについて、下記方法によって１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定は、装置の説明書に基づき行った。具体的な測定条件は以下の通りである。溶媒は、合成例１〜４についてはＣＤ３ＯＤを使用し、合成例５〜７についてはＣＤＣｌ３を使用した。スキャン回数は８回とした。基準物質は、ＴＭＳ（０．０３体積％）を用いた。
＜ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ＞
合成したポリマーについて、下記方法によってマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析を行った。
合成したポリマーについて、下記方法によってマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析を行った。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの測定は、装置の説明書に基づき行った。具体的な測定条件は以下の通りである。マトリックスは、合成例１〜４についてはシナピン酸を使用し、合成例５〜７についてはα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を使用した。測定は、リフレクターモードにて行った。
（合成例）
（合成例１：ＳＰ−００３−Ａ）
以下の手順に基づく反応工程により、本発明の一実施形態に係るポリマーであるＳＰ−００３−Ａを合成した：（１）ポリエチレンイミン（エポミン、ＳＰ−００３）５．２９６ｇ（１級アミン量として５０ｍｍｏｌ）を蒸留水６０ｍＬに溶解させ、ポリエチレンイミン溶液を作製した。また、２−ピコリルクロリド塩酸塩１６．３ｇ（１００ｍｍｏｌ、ポリエチレンイミンに対して２当量）を蒸留水６０ｍＬに溶解させ、２−ピコリルクロリド塩酸塩溶液を作製した。；（２）２−ピコリルクロリド塩酸塩溶液に、ポリエチレンイミン溶液の全量をゆっくり滴下することで添加し、第１の混合溶液を作製した；（３）第１の混合溶液を６０℃に温めながら撹拌した；（４）ＮａＯＨ（２００ｍｍｏｌ）を蒸留水４０ｍＬに溶解させて作製したＮａＯＨ溶液を、第１の混合溶液にゆっくり滴下することで添加し、第２の混合溶液を作製した；（５）第２の混合溶液を６０℃で一晩（１２時間）、攪拌することにより、ＳＰ−００３−Ａを合成した。
（合成例１：ＳＰ−００３−Ａ）
以下の手順に基づく反応工程により、本発明の一実施形態に係るポリマーであるＳＰ−００３−Ａを合成した：（１）ポリエチレンイミン（エポミン、ＳＰ−００３）５．２９６ｇ（１級アミン量として５０ｍｍｏｌ）を蒸留水６０ｍＬに溶解させ、ポリエチレンイミン溶液を作製した。また、２−ピコリルクロリド塩酸塩１６．３ｇ（１００ｍｍｏｌ、ポリエチレンイミンに対して２当量）を蒸留水６０ｍＬに溶解させ、２−ピコリルクロリド塩酸塩溶液を作製した。；（２）２−ピコリルクロリド塩酸塩溶液に、ポリエチレンイミン溶液の全量をゆっくり滴下することで添加し、第１の混合溶液を作製した；（３）第１の混合溶液を６０℃に温めながら撹拌した；（４）ＮａＯＨ（２００ｍｍｏｌ）を蒸留水４０ｍＬに溶解させて作製したＮａＯＨ溶液を、第１の混合溶液にゆっくり滴下することで添加し、第２の混合溶液を作製した；（５）第２の混合溶液を６０℃で一晩（１２時間）、攪拌することにより、ＳＰ−００３−Ａを合成した。
次に、以下の手順に基づく抽出工程により、ＳＰ−００３−Ａを得た：（１）第２の混合溶液の温度を室温にした後、ＣＨＣｌ３で３回抽出し、有機層を得た；（２）飽和重曹水を用いて得られた有機層を洗浄した；（３）液相分離濾紙を用いて、洗浄後の有機層を濾過し、濾液を得た；（４）得られた濾液において、濾液中の溶媒を減圧留去することにより、ＳＰ−００３−Ａとして、茶褐色の油状物質を得た。
得られたＳＰ−００３−Ａについて、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。結果を図１の（ａ）に示す。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果において、各ピーク近傍に記載した数字は、各ピークの積分比を示しており、上部に記載した数字は、各ピークの位置（ｐｐｍ）を示しており、各ピーク近傍に記載したアルファベット（ａ〜ｇ）は、構造式のアルファベットの位置の水素に対応している。ピーク近傍に記載したアルファベットのうち、ｘは溶媒中の水に対応し、ｙは溶媒中のメタノールに対応する。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果に関する説明は、以降も同様である。図１の（ａ）に示した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果から、合成例１における変換率を求めた。具体的には次の通りである。ａ＋ｂのピーク（４Ｈに相当）１つあたり、１つのＮが存在する。当該Ｎ１つに関して、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミンがそれぞれ存在することが想定され、それらアミンの比率は、製品カタログに記載の通りとする。ここで、１級アミノ基は２つの水素原子（活性点）を、２級アミノ基は１つの水素原子（活性点）を有するものであり、これらの水素原子の和を求める。一方、ｄ〜ｇの何れか１つのピークを用いて、末端に存在するピリジンの個数を決定し、これを、導入されたα-ピコリル基の数とする。得られた導入されたα-ピコリル基の数を分子、水素原子の和を分母として、変換率を求める。このようにして変換率を求めたところ、合成例１における変換率は、９２．３％であった。
得られたＳＰ−００３−Ａについて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを行った。結果を表１に示す。なお、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの結果は、ピークが観察されたもののみ示している（以下も同様）。
以下の手順に基づく反応工程により、本発明の一実施形態に係るポリマーであるＳＰ−００３−Ｂを合成した：（１）ポリエチレンイミン（エポミン、ＳＰ−００３）２．６４５ｇ（１級アミン量として２５ｍｍｏｌ）を蒸留水２０ｍＬに溶解させ、ポリエチレンイミン溶液を作製した。また、２−ピコリルクロリド塩酸塩４．１０ｇ（２５ｍｍｏｌ、ポリエチレンイミンに対して１当量）を蒸留水２０ｍＬに溶解させ、２−ピコリルクロリド塩酸塩溶液を作製した；（２）２−ピコリルクロリド塩酸塩溶液に、ポリエチレンイミン溶液の全量をゆっくり滴下することで添加し、第１の混合溶液を作製した；（３）第１の混合溶液を６０℃に温めながら撹拌した；（４）ＮａＯＨ（５０ｍｍｏｌ）を蒸留水４０ｍＬに溶解させて作製したＮａＯＨ溶液を、第１の混合溶液にゆっくり滴下することで添加し、第２の混合溶液を作製した；（５）第２の混合溶液を６０℃で一晩（１２時間）、攪拌することにより、ＳＰ−００３−Ｂを合成した。
次に、以下の手順に基づく抽出工程により、ＳＰ−００３−Ｂを得た：（１）第２の混合溶液の温度を室温にした後、ＣＨＣｌ３で抽出した。ここで、薄層クロマトグラフィー（thin layer chromatography；ＴＬＣ）により、ＳＰ−００３−Ｂが水層にあることを確認したため、水層を採取した；（２）水層にＮａＯＨを加えて、水層のｐＨを１３以上とした。ここで、目視により、油状物質が分離したことを確認した；（３）水層にＣＨＣｌ３を加えて、ＣＨＣｌ３で抽出し、有機層を得た；（４）液相分離濾紙を用いて、有機層を濾過し、濾液を得た；（５）得られた濾液において、濾液中の溶媒を減圧留去することにより、ＳＰ−００３−Ｂとして、茶褐色の油状物質を得た。
得られたＳＰ−００３−Ｂについて、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。結果を図１の（ｂ）に示す。図１の（ｂ）に示した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果から、合成例１と同様に、合成例２における変換率を求めた。合成例２における変換率は、２３．６７％であった。
（合成例３：ＳＰ−００３−Ｃ）
以下の手順に基づく反応工程により、本発明の一実施形態に係るポリマーであるＳＰ−００３−Ｃを合成した：（１）ポリエチレンイミン（エポミン、ＳＰ−００３）２．６４５ｇ（１級アミン量として２５ｍｍｏｌ）を蒸留水２０ｍＬに溶解させ、ポリエチレンイミン溶液を作製した。また、２−ピコリルクロリド塩酸塩２．０５ｇ（１２．５ｍｍｏｌ、ポリエチレンイミンに対して０．５当量）を蒸留水２０ｍＬに溶解させ、２−ピコリルクロリド塩酸塩溶液を作製した；（２）２−ピコリルクロリド塩酸塩溶液に、ポリエチレンイミン溶液の全量をゆっくり滴下することで添加し、第１の混合溶液を作製した；（３）第１の混合溶液を６０℃に温めながら撹拌した；（４）ＮａＯＨ（２５ｍｍｏｌ）を蒸留水４０ｍＬに溶解させて作製したＮａＯＨ溶液を、第１の混合溶液にゆっくり滴下することで添加し、第２の混合溶液を作製した；（５）第２の混合溶液を６０℃で一晩（１２時間）、攪拌することにより、ＳＰ−００３−Ｃを合成した。
以下の手順に基づく反応工程により、本発明の一実施形態に係るポリマーであるＳＰ−００３−Ｃを合成した：（１）ポリエチレンイミン（エポミン、ＳＰ−００３）２．６４５ｇ（１級アミン量として２５ｍｍｏｌ）を蒸留水２０ｍＬに溶解させ、ポリエチレンイミン溶液を作製した。また、２−ピコリルクロリド塩酸塩２．０５ｇ（１２．５ｍｍｏｌ、ポリエチレンイミンに対して０．５当量）を蒸留水２０ｍＬに溶解させ、２−ピコリルクロリド塩酸塩溶液を作製した；（２）２−ピコリルクロリド塩酸塩溶液に、ポリエチレンイミン溶液の全量をゆっくり滴下することで添加し、第１の混合溶液を作製した；（３）第１の混合溶液を６０℃に温めながら撹拌した；（４）ＮａＯＨ（２５ｍｍｏｌ）を蒸留水４０ｍＬに溶解させて作製したＮａＯＨ溶液を、第１の混合溶液にゆっくり滴下することで添加し、第２の混合溶液を作製した；（５）第２の混合溶液を６０℃で一晩（１２時間）、攪拌することにより、ＳＰ−００３−Ｃを合成した。
次に、以下の手順に基づく抽出工程により、ＳＰ−００３−Ｃを得た：（１）第２の混合溶液の温度を室温にした後、ＣＨＣｌ３で抽出した。ここで、ＴＬＣにより、ＳＰ−００３−Ｂが水層にあることを確認したため、水層を採取した；（２）水層にＮａＯＨを加えて、水層のｐＨを１３以上とした。ここで、目視により、油状物質が分離したことを確認した；（３）水層にＣＨＣｌ３を加えて、ＣＨＣｌ３で抽出し、有機層を得た；（４）液相分離濾紙を用いて、有機層を濾過し、濾液を得た；（５）得られた濾液において、濾液中の溶媒を減圧留去することにより、ＳＰ−００３−Ｃとして、茶褐色の油状物質を得た。
得られたＳＰ−００３−Ｃについて、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。結果を図２の（ａ）に示す。図２の（ａ）に示した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果から、合成例１と同様に、合成例３における変換率を求めた。合成例３における変換率は、１７．９７％であった。
（合成例４：ＳＰ−０１８）
以下の手順に基づく反応工程により、本発明の一実施形態に係るポリマーであるＳＰ−０１８を合成した：（１）ポリエチレンイミン（エポミン、ＳＰ−０１８）７．５２０ｇ（１級アミン量として５０ｍｍｏｌ）を蒸留水２０ｍＬに溶解させ、ポリエチレンイミン溶液を作製した。また、２−ピコリルクロリド塩酸塩１６．３ｇ（１００ｍｍｏｌ、ポリエチレンイミンに対して２当量）を蒸留水６０ｍＬに溶解させ、２−ピコリルクロリド塩酸塩溶液を作製した；（２）２−ピコリルクロリド塩酸塩溶液に、ポリエチレンイミン溶液の全量をゆっくり滴下することで添加し、第１の混合溶液を作製した；（３）第１の混合溶液を６０℃に温めながら撹拌した；（４）ＮａＯＨ（２５ｍｍｏｌ）を蒸留水４０ｍＬに溶解させて作製したＮａＯＨ溶液を、第１の混合溶液にゆっくり滴下することで添加し、第２の混合溶液を作製した；（５）第２の混合溶液を６０℃で一晩（１２時間）、攪拌することにより、ＳＰ−０１８を合成した。
以下の手順に基づく反応工程により、本発明の一実施形態に係るポリマーであるＳＰ−０１８を合成した：（１）ポリエチレンイミン（エポミン、ＳＰ−０１８）７．５２０ｇ（１級アミン量として５０ｍｍｏｌ）を蒸留水２０ｍＬに溶解させ、ポリエチレンイミン溶液を作製した。また、２−ピコリルクロリド塩酸塩１６．３ｇ（１００ｍｍｏｌ、ポリエチレンイミンに対して２当量）を蒸留水６０ｍＬに溶解させ、２−ピコリルクロリド塩酸塩溶液を作製した；（２）２−ピコリルクロリド塩酸塩溶液に、ポリエチレンイミン溶液の全量をゆっくり滴下することで添加し、第１の混合溶液を作製した；（３）第１の混合溶液を６０℃に温めながら撹拌した；（４）ＮａＯＨ（２５ｍｍｏｌ）を蒸留水４０ｍＬに溶解させて作製したＮａＯＨ溶液を、第１の混合溶液にゆっくり滴下することで添加し、第２の混合溶液を作製した；（５）第２の混合溶液を６０℃で一晩（１２時間）、攪拌することにより、ＳＰ−０１８を合成した。
次に、以下の手順に基づく抽出工程により、ＳＰ−０１８を得た：（１）第２の混合溶液の温度を室温にした後、ＣＨＣｌ３を加えた。ここで、ＣＨＣｌ３を添加後に、第２の混合溶液が乳化したことを目視で確認した；（２）乳化した第２の混合溶液を一定量採取し、採取した第２の混合溶液を２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した；（３）遠心分離後に、有機層を採取した（４）液相分離濾紙を用いて、有機層を濾過し、濾液を得た；（５）得られた濾液において、濾液中の溶媒を減圧留去することにより、ＳＰ−００３−Ｃとして、茶褐色の油状物質を得た。
得られたＳＰ−０１８について、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。結果を図２の（ｂ）に示す。図２の（ｂ）において、ピーク近傍に記載したアルファベットのうち、ｚは、抽出工程の減圧留去後に残ったＣＨＣｌ３に対応する。図２の（ｂ）に示した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果から、合成例１と同様に、合成例４における変換率を求めた。合成例４における変換率は、６８．８％であった。
得られたＳＰ−０１８について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを行った。結果を表２に示す。
以下の手順に基づく反応工程により、本発明の一実施形態に係るポリマーであるＰＡＡ−０１を合成した：（１）アミン量として２５ｍｍｏｌに相当するポリアリルアミン（ＰＡＡ−ＨＣＬ−０１）を蒸留水２０ｍＬに溶解させ、ポリアリルアミン溶液を作製した。また、２−ピコリルクロリド塩酸塩８．２ｇ（５０ｍｍｏｌ）を蒸留水６０ｍＬに溶解させ、２−ピコリルクロリド塩酸塩溶液を作製した。；（２）２−ピコリルクロリド塩酸塩溶液に、ポリアリルアミン溶液の全量をゆっくり滴下することで添加し、第１の混合溶液を作製した；（３）第１の混合溶液を６０℃に温めながら撹拌した；（４）ＮａＯＨ（６ｇ、１５０ｍｍｏｌ）を蒸留水４０ｍＬに溶解させて作製したＮａＯＨ溶液を、第１の混合溶液にゆっくり滴下することで添加し、第２の混合溶液を作製した；（５）第２の混合溶液を６０℃で一晩（１２時間）、攪拌することにより、ＰＡＡ−０１を合成した。
次に、以下の手順に基づく抽出工程により、ＰＡＡ−０１を得た：（１）第２の混合溶液の温度を室温にした後、ＣＨＣｌ３で３回抽出し、有機層を得た；（２）飽和重曹水を用いて得られた有機層を洗浄した；（３）液相分離濾紙を用いて、洗浄後の有機層を濾過し、濾液を得た；（４）得られた濾液において、濾液中の溶媒を減圧留去することにより、ＰＡＡ−０１として、茶褐色の油状物質を得た。
得られたＰＡＡ−０１について、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。結果を図３の（ａ）に示す。図３の（ａ）に示した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果から、合成例５における変換率を求めた。具体的には次の通りである。δ２．３７７ｐｐｍのピークを、ポリマーの主鎖のピークとした。δ２．３７７ｐｐｍのピーク（２Ｈに相当する）１つあたり、１つのＮが存在する。当該Ｎ１つに関して、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミンがそれぞれ存在することが想定され、それらアミンの比率は、製品カタログに記載の通りとする。ここで、１級アミノ基は２つの水素原子（活性点）を、２級アミノ基は１つの水素原子（活性点）を有するものであり、これらの水素原子の和を求める。一方、ｄ〜ｇの何れか１つのピークを用いて、末端に存在するピリジンの個数を決定し、これを、導入されたα-ピコリル基の数とする。得られた導入されたα-ピコリル基の数を分子、水素原子の和を分母として、変換率を求める。このようにして変換率を求めたところ、合成例５における変換率は、７９％であった。
得られたＰＡＡ−０１について、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。結果を図３の（ａ）に示す。図３の（ａ）に示した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果から、合成例５における変換率を求めた。具体的には次の通りである。δ２．３７７ｐｐｍのピークを、ポリマーの主鎖のピークとした。δ２．３７７ｐｐｍのピーク（２Ｈに相当する）１つあたり、１つのＮが存在する。当該Ｎ１つに関して、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミンがそれぞれ存在することが想定され、それらアミンの比率は、製品カタログに記載の通りとする。ここで、１級アミノ基は２つの水素原子（活性点）を、２級アミノ基は１つの水素原子（活性点）を有するものであり、これらの水素原子の和を求める。一方、ｄ〜ｇの何れか１つのピークを用いて、末端に存在するピリジンの個数を決定し、これを、導入されたα-ピコリル基の数とする。得られた導入されたα-ピコリル基の数を分子、水素原子の和を分母として、変換率を求める。このようにして変換率を求めたところ、合成例５における変換率は、７９％であった。
得られたＰＡＡ−０１について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを行った。結果を表３に示す。
ポリアリルアミンとして、ＰＡＡ−ＨＣＬ−０１に替えて、ＰＡＡ−ＨＣＬ−０５を用いた以外は、合成例５と同一の方法により、ＰＡＡ−０５を合成し、ＰＡＡ−０５を得た。得られたＰＡＡ−０５について、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。結果を図３の（ｂ）に示す。図３の（ｂ）に示した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果から、合成例６における変換率を求めた。変換率は、６８％であった。
（合成例７：ＰＡＡ−３Ｌ）
ポリアリルアミンとして、ＰＡＡ−ＨＣＬ−０１に替えて、ＰＡＡ−ＨＣＬ−３Ｌを用いた以外は、合成例５と同一の方法により、ＰＡＡ−３Ｌを合成し、ＰＡＡ−３Ｌを得た。得られたＰＡＡ−３Ｌについて、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。結果を図４に示す。図４に示した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果から、合成例７における変換率を求めた。変換率は、６３％であった。
ポリアリルアミンとして、ＰＡＡ−ＨＣＬ−０１に替えて、ＰＡＡ−ＨＣＬ−３Ｌを用いた以外は、合成例５と同一の方法により、ＰＡＡ−３Ｌを合成し、ＰＡＡ−３Ｌを得た。得られたＰＡＡ−３Ｌについて、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。結果を図４に示す。図４に示した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果から、合成例７における変換率を求めた。変換率は、６３％であった。
亜鉛と錯体を形成しているＤＰＡ構造を有するポリマーを得るために、上述した方法により得られたポリマーの一部を用いて、混合工程を行った。具体的には、得られたポリマーの一部と、０．２５ｍＭの亜鉛水溶液とを混合し、亜鉛と錯体を形成しているＤＰＡ構造を有するポリマーを得た。Ｍａｇａｉｎｉｎ−２についても、同様に、０．２５ｍＭの亜鉛水溶液と混合した。
（合成例８：ＳＰ−０１８（サンプル番号１〜８））
反応に用いる２−ピコリルクロリド塩酸塩の量を変えた以外は、上述した合成例４と同様の方法によって、ＳＰ−０１８（サンプル番号１〜８）を得た。
反応に用いる２−ピコリルクロリド塩酸塩の量を変えた以外は、上述した合成例４と同様の方法によって、ＳＰ−０１８（サンプル番号１〜８）を得た。
得られたＳＰ−０１８（サンプル番号１〜８）について、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果から、合成例１と同様に、合成例８における変換率を求めた。表４に示すように、サンプル番号１〜８における変換率は、各々、１４％、１６％、１９％、２０％、３２％、５６％、６４％および９３％であった。
（評価方法）
＜抗微生物活性の評価＞
微生物として、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ａｕｒｅｕｓ）を用いて、合成したポリマーの抗微生物活性の評価を行った。具体的には、細菌に対するポリマーの最小阻止濃度（minimum inhibitory concentration、ＭＩＣ、μｇ・ｍＬ−１）を測定することにより、ポリマーの抗微生物活性の評価を行った。抗微生物活性の評価の手順は、ＮＣＣＬＳ，ＡｐｐｒｏｖｅｄｓｔａｎｄａｒｄｓＭ７−Ａ３に従った。抗微生物活性の評価の一連の操作は、測定試料の汚染を防ぐために、（ａ）手袋を着用し、（ｂ）７０％エタノールで手を消毒し、かつ、（ｃ）ガスバーナーの火の下で行った。具体的な手順の内容を下記に説明する。
＜抗微生物活性の評価＞
微生物として、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ａｕｒｅｕｓ）を用いて、合成したポリマーの抗微生物活性の評価を行った。具体的には、細菌に対するポリマーの最小阻止濃度（minimum inhibitory concentration、ＭＩＣ、μｇ・ｍＬ−１）を測定することにより、ポリマーの抗微生物活性の評価を行った。抗微生物活性の評価の手順は、ＮＣＣＬＳ，ＡｐｐｒｏｖｅｄｓｔａｎｄａｒｄｓＭ７−Ａ３に従った。抗微生物活性の評価の一連の操作は、測定試料の汚染を防ぐために、（ａ）手袋を着用し、（ｂ）７０％エタノールで手を消毒し、かつ、（ｃ）ガスバーナーの火の下で行った。具体的な手順の内容を下記に説明する。
（１．Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ−ｂｒｏｔｈ（以下、ＭＨ−ｂｒｏｔｈとも称する）溶液の調製）
まず、細菌の培養に用いる培地である、ＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液を調製した。具体的には、（ｉ）粉末状のＭＨ−ｂｒｏｔｈの２２ｇを超純水（１Ｌ）に溶解し、ＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液（未溶解）を作製し、（ｉｉ）次に、１Ｎの水酸化ナトリウム溶液および１Ｎの塩酸溶液を用いて、ＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液（未溶解）のｐＨを７．３に調整した後、（ｉｉｉ）ｐＨ調製後のＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液（未溶解）をオートクレーブ（１２１℃、２０分間）処理を行い、ＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液を調製した。
まず、細菌の培養に用いる培地である、ＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液を調製した。具体的には、（ｉ）粉末状のＭＨ−ｂｒｏｔｈの２２ｇを超純水（１Ｌ）に溶解し、ＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液（未溶解）を作製し、（ｉｉ）次に、１Ｎの水酸化ナトリウム溶液および１Ｎの塩酸溶液を用いて、ＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液（未溶解）のｐＨを７．３に調整した後、（ｉｉｉ）ｐＨ調製後のＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液（未溶解）をオートクレーブ（１２１℃、２０分間）処理を行い、ＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液を調製した。
（２．寒天培地の作製）
次に、作製したＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液を用いて、細菌の培養に用いる寒天培地（Ａｇａｒ ｐｌａｔｅとも称する）を作製した。具体的には、以下の手順で寒天培地を作製した。
次に、作製したＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液を用いて、細菌の培養に用いる寒天培地（Ａｇａｒ ｐｌａｔｅとも称する）を作製した。具体的には、以下の手順で寒天培地を作製した。
（ｉ）作製されたＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液４０ｍＬに、０．６ｇの寒天を添加し、オートクレーブ（１２１℃、２０分間）処理を行いＭＨ−ａｇａｒ溶液を調製した。
（ｉｉ）次に、（ｉ）で得られたＭＨ−ａｇａｒ溶液１０ｍＬをシャーレに流し込み、室温に静置することでＭＨ−ａｇａｒ溶液を冷却および固化し、寒天培地を作製した。
（３．細菌の培養）
作製したＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液および寒天培地を用いて、細菌を培養する方法について、具体的に説明する。
作製したＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液および寒天培地を用いて、細菌を培養する方法について、具体的に説明する。
（ｉ）凍結している細菌、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳ．ａｕｒｅｕｓをマイクロチップでほんの少しだけ取り、採取した細菌をマイクロチップごと、５〜７ｍＬのＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液に加え、当該ＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液を３７℃、１８０ｒｐｍで１８時間培養した。
（ｉｉ）１８時間培養後、１０μＬの細菌溶液を寒天培地に滴下した。
（ｉｉｉ）その後、滴下した細菌溶液を、白金耳を用いて寒天培地全体に引き伸ばした。
（ｉｖ）細菌溶液を塗布した寒天培地を、シャーレの蓋を下にして、３７℃のインキュベーターの中で１８時間静置することによって、細菌を培養した。
（４．ＭＩＣの測定）
寒天培地上の培養された細菌を用いて、以下の手順によって、合成したポリマーの抗微生物活性を評価した。
寒天培地上の培養された細菌を用いて、以下の手順によって、合成したポリマーの抗微生物活性を評価した。
（ｉ）寒天培地上の、培養された細菌（バクテリア）のコロニー１つを、ピペットチップを用いて採取し、採取した細菌を、７ｍＬのＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液中にピペットチップごと入れ、３７℃で１２〜１８時間、培養した。このとき、１８０ｒｐｍの速度でＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液を攪拌した。
（ｉｉ）得られた細菌の懸濁液を、ＯＤ６００が０．１となるように、ＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液を用いて希釈した。希釈後の懸濁液を、３７℃で９０分間、培養した。このとき、１８０ｒｐｍの速度でＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液を攪拌した。
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）で得られた細菌の懸濁液をＯＤ６００が０．１となるように、ＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液を用いて懸濁液を希釈した。その後、希釈後の懸濁液を、ＯＤ６００が０．００１となるように、ＭＨ−ｂｒｏｔｈ溶液を用いてさらに希釈した。最終的に得られた細菌の懸濁液は、ＯＤ６００が０．００１であり、９．４×１０５ＣＦＵ／３０ｍＬであった。ＣＦＵは、コロニー形成単位（Colony forming unit）を表す。
（ｉｖ）合成したポリマー（ＳＰ−００３−Ａ、ＳＰ−０１８、ＰＡＡ−０１、ＰＡＡ−０５、ＰＡＡ−３Ｌ、またはＳＰ−０１８（サンプル番号１〜８））、もしくはＭａｇａｉｎｉｎ−２、または、上述した方法で作製した亜鉛と錯体を形成しているポリマー、もしくは亜鉛と混合したＭａｇａｉｎｉｎ−２、を下記の濃度となるように水に溶解した試料溶液を調製した。ポリマー溶液中のポリマーの濃度、または、Ｍａｇａｉｎｉｎ溶液中のＭａｇａｉｎｉｎ−２の濃度は、５００μｇ・ｍＬ−１、２５０μｇ・ｍＬ−１、１２５μｇ・ｍＬ−１、６２．５μｇ・ｍＬ−１、３１．３μｇ・ｍＬ−１、１５．６μｇ・ｍＬ−１、７．８μｇ・ｍＬ−１、および３．９μｇ・ｍＬ−１とした。調製した試料溶液を、それぞれ、１０μＬ／ウェルずつ、コーニング社製の９６ウェルプレートの８ウェルに添加した。コントロールとして、水１０μＬを加えたウェル、および、ＭＨ−Ｂｒｏｔｈ１００μＬを加えたウェル、をそれぞれ用意した。
（ｖ）上記（ｉｉｉ）で得られた細菌の懸濁液を、上記（ｉｖ）で調整した９６ウェルプレートの各ウェルに、９０μＬずつ添加した。その後、９６ウェルプレートに蓋をし、３７℃のインキュベーターにて、１８時間静置した。
（ｖｉ）１８時間の培養後、ウェルにおけるコロニー形成の有無を確認した。コロニー形成の有無の結果から、合成したポリマーまたはＭａｇａｉｎｉｎ−２のＭＩＣを決定した。
（評価結果−１）
抗微生物活性の評価の結果を、図５に示す。図５の（ａ）は本発明の一実施形態に係るポリマーの、Ｅ．ｃｏｌｉに対する抗微生物活性の評価結果を示すグラフであり、図５の（ｂ）は本発明の一実施形態に係るポリマーの、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する抗微生物活性の評価結果を示すグラフである。図５において、各棒グラフの上に記載した数字は、縦軸のＭＩＣ（μｇ・ｍＬ−１）の値を示している。
抗微生物活性の評価の結果を、図５に示す。図５の（ａ）は本発明の一実施形態に係るポリマーの、Ｅ．ｃｏｌｉに対する抗微生物活性の評価結果を示すグラフであり、図５の（ｂ）は本発明の一実施形態に係るポリマーの、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する抗微生物活性の評価結果を示すグラフである。図５において、各棒グラフの上に記載した数字は、縦軸のＭＩＣ（μｇ・ｍＬ−１）の値を示している。
図５の（ａ）より、本発明の一実施形態に係るポリマーである、ＳＰ−００３−Ａ、ＳＰ−０１８、ＰＡＡ−０５、およびＰＡＡ−３Ｌは、亜鉛を含まない場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して抗微生物活性を有することが分かる。また、ＳＰ−０１８、ＰＡＡ−０１、ＰＡＡ−０５、およびＰＡＡ−３Ｌは、亜鉛の存在下において、大腸菌に対して、既知の抗菌物質であるＭａｇａｉｎｉｎ−２よりも高い抗微生物活性を示した。
図５の（ｂ）より、本発明の一実施形態に係るポリマーである、ＳＰ−００３−Ａ、ＳＰ−０１８、およびＰＡＡ−０５は、亜鉛を含まない場合、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対して抗微生物活性を有することが分かる。また、ＳＰ−００３−Ａ、ＳＰ−０１８、ＰＡＡ−０１、ＰＡＡ−０５、およびＰＡＡ−３Ｌは、亜鉛の存在下において、黄色ブドウ球菌に対して、既知の抗菌物質であるＭａｇａｉｎｉｎ−２よりも高い抗微生物活性を示した。
（評価結果−２）
ＳＰ−０１８（サンプル番号１〜８）の試験結果を、下記の表４および図６に示す。なお、図６は、表４の数値データをグラフ化したものである。本試験では、亜鉛を用いた試験（＋Ｚｎと表記）では、亜鉛の濃度を０．２５ｍＭとした。
ＳＰ−０１８（サンプル番号１〜８）の試験結果を、下記の表４および図６に示す。なお、図６は、表４の数値データをグラフ化したものである。本試験では、亜鉛を用いた試験（＋Ｚｎと表記）では、亜鉛の濃度を０．２５ｍＭとした。
本発明の一実施形態に係るポリマーは、簡易な手順で合成することができ、かつ、抗微生物活性を有する。そのため、当該ポリマーは、抗微生物剤、抗細菌剤、抗真菌剤、防腐剤および防カビ剤等として、業務用品、民生品、医療機器および医薬品などに好適に利用することができる。
Claims (9)
- アミノ基を有するポリマーにおいて、当該アミノ基にα−ピコリル基２分子を修飾してなる、下記式（１）で表されるジピコリルアミン構造を有するポリマー：
-
または、
で示される繰り返し単位を有する請求項１に記載のポリマー。 -
である、請求項１または２に記載のポリマー。 - 上記ジピコリルアミン構造を有するポリマーは、原料ポリマーのアミノ基が有する水素原子のうちα−ピコリル基に置換された水素原子の割合として示される変換率が、１０％以上のものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリマー。
- 上記金属Ｍは、二価金属である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリマー。
- 上記ジピコリルアミン構造を有するポリマーは、重量平均分子量または数平均分子量が２５０以上１０００００以下のものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリマー。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリマーを含む、抗微生物剤。
- 末端および／または側鎖にアミノ基を有するポリマーに、α−ピコリル基を反応させる反応工程を含む、下記式（６）で表されるジピコリルアミン構造を有するポリマーの製造方法：
- 請求項７に記載の抗微生物剤を用いて対象物を処理する処理工程を含む、抗菌方法。
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-
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