WO2022034880A1 - 細胞培養系、細胞培養方法、及び培地添加剤 - Google Patents

細胞培養系、細胞培養方法、及び培地添加剤 Download PDF

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ascorbic acid
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cells
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重仁 大澤
英典 大塚
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学校法人東京理科大学
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture system, a cell culture method, and a medium additive.
  • Regenerative medicine involves transplanting artificially cultured cultured cells or tissues artificially constructed from cultured cells into a patient to reconstruct or repair a part of the body.
  • research toward the practical application of regenerative medicine has been actively promoted, and along with this, the industrialization of cell culture is accelerating.
  • Ascorbic acid is one of the additives added to the medium. Ascorbic acid is known to have various actions such as a growth promoting action of various cells, a differentiation promoting action of mesenchymal stem cells and pluripotent stem cells, and an extracellular matrix production promoting action of stromal cells. However, since ascorbic acid has low stability and is difficult to be taken up into cells, it cannot be said that ascorbic acid added to the medium is effectively utilized in cells.
  • the present invention has been proposed in view of the above, and is a novel cell culture system using ascorbic acid or a salt thereof, or an ascorbic acid derivative, a cell culture method using the cell culture system, and a cell culture system thereof. It is an object of the present invention to provide a medium additive that can be used in the above.
  • a metal complex polymer having a medium containing ascorbic acid or a salt thereof or an ascorbic acid derivative and at least one metal selected from the group consisting of Cu, Fe, Mn, Ni, and Co as a coordination metal.
  • a cell culture system including.
  • ⁇ 2> The cell culture system according to ⁇ 1>, wherein the metal complex polymer is a medium additive added to the medium.
  • the metal complex polymer is derived from a metal complex monomer in which a polymerizable monomer represented by the following formula (1) is coordinated with a metal selected from the group consisting of Cu, Fe, Mn, Ni, and Co.
  • R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • Ar 1 and Ar 2 independently represent a group represented by the following formula (2) or formula (3), and n 1 , n 2 , respectively.
  • n 3 each independently represent an integer of 1 to 4.
  • R 2 represents a hydrogen atom or an alkyl group.
  • ⁇ 5> The cell culture system according to ⁇ 1> or ⁇ 4>, wherein the metal complex polymer has a structural unit derived from a sugar or an amino acid.
  • ⁇ 6> A cell culture method comprising culturing cells using the cell culture system according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>.
  • ⁇ 7> The cell culture method according to ⁇ 6>, wherein the cell is at least one selected from the group consisting of stromal cells, nerve cells, embryonic cells, mesenchymal stem cells, and pluripotent stem cells. ..
  • a metal selected from the group consisting of Cu, Fe, Mn, Ni, and Co contains a metal complex polymer having a structural unit derived from a metal complex monomer coordinated with a polymerizable monomer represented by the following formula (1). , Medium additive.
  • R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • Ar 1 and Ar 2 independently represent a group represented by the following formula (2) or formula (3), and n 1 , n 2 , respectively.
  • n 3 each independently represent an integer of 1 to 4.
  • R 2 represents a hydrogen atom or an alkyl group.
  • a novel cell culture system using ascorbic acid or a salt thereof, or an ascorbic acid derivative, a cell culture method using the cell culture system, and a medium additive that can be used for the cell culture system are provided. can do.
  • the cell culture system includes a medium containing ascorbic acid or a salt thereof, or an ascorbic acid derivative (hereinafter, these are collectively referred to as “ascorbic acid or the like"), Cu, Fe, Mn, Ni. , And a metal complex polymer having at least one metal selected from the group consisting of Co (hereinafter, also referred to as “specific metal”) as a coordination metal.
  • ascorbic acid or the like a medium containing ascorbic acid or a salt thereof, or an ascorbic acid derivative (hereinafter, these are collectively referred to as “ascorbic acid or the like"), Cu, Fe, Mn, Ni.
  • a metal complex polymer having at least one metal selected from the group consisting of Co hereinafter, also referred to as “specific metal” as a coordination metal.
  • the cell culture system it is possible to promote the utilization of ascorbic acid in cells or enhance the action of ascorbic acid derivatives on cells.
  • ascorbic acid when ascorbic acid is contained in the medium of the cell culture system according to the present embodiment, the ascorbic acid is oxidized by the metal complex polymer to become dehydroascorbic acid.
  • Dehydroascorbic acid is lipophilic, is easily taken up into cells via a glucose transporter, and is reduced intracellularly to ascorbic acid, which exhibits bioactivity.
  • the medium is not particularly limited, and for example, a basal medium to which ascorbic acid or the like is added can be used.
  • MEM medium As the basal medium, MEM medium, BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glassgow MEM medium, Applied MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, ham medium, RPMI 1640 Examples include a medium, a Fisher's medium, and a mixed medium thereof.
  • the medium may be a serum-containing medium or a serum-free medium.
  • the serum concentration is preferably, for example, 0.1% (v / v) to 20% (v / v), and 0.1% (v / v) to 10% (v / v) (v / v). It is more preferably v / v), and even more preferably 0.1% (v / v) to 5% (v / v).
  • serum include bovine serum, fetal bovine serum, human serum and the like.
  • salt of ascorbic acid examples include sodium salt, potassium salt, magnesium salt, calcium salt, barium salt, ammonium salt, monoethanolamine salt, diethanolamine salt, triethanolamine salt, monoisopropanolamine salt, triisopropanolamine salt and the like. Can be mentioned.
  • ascorbic acid derivative examples include ascorbic acid glucoside such as ascorbic acid-2-glucoside; ascorbic acid glucoside fatty acid; ascorbic acid-2-phosphate ester, ascorbic acid-3-phosphate ester, and ascorbic acid-6-phosphate.
  • Ascorbic acid phosphate ester such as ester; Ascorbic acid polyphosphate ester such as ascorbic acid-2-polyphosphate ester; Ascorbic acid sulfate ester such as ascorbic acid-2-sulfate ester; Ascorbic acid-2-palmitic acid ester, ascorbic acid Ascorbic acid palmitic acid ester such as -6-palmitic acid ester; Ascorbic acid stearic acid ester such as ascorbic acid-2-stearate ester, ascorbic acid-6-stearic acid ester; Ascorbic acid-2,6-dibutyl ester; Ascorbin Acid-2,6-dipalmitic acid ester; ascorbyl tetrahexyldecanoate; ascorbic acid-2-phosphate-6-palmitic acid (APPS); ascorbyl ethyl; and salts thereof.
  • Ascorbic acid phosphate ester such as ester
  • Ascorbic acid polyphosphate ester such as ascorbic
  • salt examples include sodium salt, potassium salt, magnesium salt, calcium salt, barium salt, ammonium salt, monoethanolamine salt, diethanolamine salt, triethanolamine salt, monoisopropanolamine salt, triisopropanolamine salt and the like. ..
  • Ascorbic acid and ascorbic acid derivatives may have D-form, L-form, and DL-form, but any of them may be present, and L-form is preferable.
  • the concentration of ascorbic acid or the like in the medium is preferably, for example, 1 ⁇ 10 -4 % (w / v) to 200 ⁇ 10 -4 % (w / v), and is preferably 10 ⁇ 10 -4 % (w / v). v) ⁇ 60 ⁇ 10 -4 % (w / v) is more preferable.
  • the metal complex polymer has a specific metal as a coordination metal.
  • the polymer that can be complexed with the specific metal may be a natural polymer or a derivative thereof, or may be a synthetic polymer.
  • natural polymers that can be complexed with a specific metal include those having a structural unit derived from a sugar or an amino acid.
  • natural polymers such as chitosan, collagen, and gelatin can be complex-formed with a specific metal
  • a metal complex polymer in which a specific metal is coordinated with these natural polymers can be used. If the natural polymer is not complexable with the specific metal, a ligand such as a dipicorylamino group may be introduced into the natural polymer.
  • examples of the synthetic polymer that can be complexed with the specific metal include a polymer obtained by polymerizing a polymerizable monomer having a ligand (and other polymerizable monomers if necessary).
  • the polymerizable monomer having a ligand those represented by the following formula (1) are preferable. That is, the metal complex polymer has a structural unit derived from the metal complex monomer in which the polymerizable monomer represented by the following formula (1) is coordinated with the specific metal (hereinafter, also referred to as “specific metal complex polymer”. ) Is preferable.
  • R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • Ar 1 and Ar 2 independently represent a group represented by the following formula (2) or formula (3), and n 1 , n 2 , respectively.
  • n 3 each independently represent an integer of 1 to 4.
  • R 2 represents a hydrogen atom or an alkyl group.
  • the group represented by the above formula (2) includes a pyridyl group and a substituted pyridyl group
  • the group represented by the above formula (3) includes a pyrrolyl group and a substituted pyrrolyl group.
  • the alkyl group in R2 an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms such as a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group and an n-butyl group is preferable.
  • a hydrogen atom is preferable as R2 .
  • Ar 1 and Ar 2 may be the same or different from each other, and preferably have the same structure. Further, Ar 1 and Ar 2 are preferably a group represented by the above formula (2), and more preferably a pyridyl group.
  • n 1 , 2 or 3 is preferable, and 2 is more preferable.
  • n 2 and n 3 , 1 or 2 is preferable independently, and 1 is more preferable.
  • polymerizable monomer represented by the above formula (1) examples include polymerizable monomers represented by the following formulas (1-1) to (1-3). R 1 in the formula is synonymous with the above formula (1).
  • the structural unit derived from the metal complex monomer in which the polymerizable monomer represented by the following formula (1) is coordinated to the specific metal is represented by the following formula (1a).
  • M in the formula indicates a specific metal.
  • the specific metal complex polymer may have a structural unit derived from another polymerizable monomer in addition to the structural unit represented by the above formula (1a).
  • the ratio of the structural unit represented by the above formula (1a) is preferably 30 mol% or more, and more preferably 50 mol% or more.
  • polymerizable monomers include unsaturated carboxylic acids such as (meth) acrylic acid, maleic acid and its anhydrides, itaconic acid and its anhydrides; methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, chloroethyl (meth).
  • unsaturated carboxylic acids such as (meth) acrylic acid, maleic acid and its anhydrides, itaconic acid and its anhydrides
  • (Meta) acrylic acid esters such as acrylates and polyethylene glycol (meth) acrylates; (meth) acrylamides such as (meth) acrylamide, N-methyl (meth) acrylamide, N-phenyl (meth) acrylamide; allyl acetate, capron Allyl compounds such as allyl acid and allyl caprylate; vinyl ethers such as hexyl vinyl ether, octyl vinyl ether and methoxyethyl vinyl ether; vinyl esters such as vinyl butyrate, vinyl isobutyrate and vinyl benzoate; styrene, methyl styrene and chloro Examples include styrenes such as styrene; and the like.
  • One type of these polymerizable monomers may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • (meth) acrylic acid means both “acrylic acid” and “methacrylic acid”. The same applies to other terms such as "(meth) acrylate”.
  • the specific metal complex polymer is obtained, for example, by polymerizing a polymerizable monomer represented by the above formula (1) (and other polymerizable monomers if necessary) to obtain a polymer, and then adding a specific metal to the polymer. It can be obtained by coordinating.
  • the method for producing the polymer is not particularly limited, and a known production method using a polymerization initiator or a chain transfer agent can be adopted.
  • the specific metal complex polymer is obtained by coordinating a specific metal with the polymerizable monomer represented by the above formula (1) to obtain a metal complex monomer, and then the metal complex monomer (and other polymerizable monomers if necessary). It can also be obtained by polymerizing a monomer).
  • the average degree of polymerization of the specific metal complex polymer is, for example, preferably 10 to 1000, and more preferably 20 to 100.
  • the above-mentioned metal complex polymer may be a medium additive added to the medium, or may constitute a scaffold material used for cell culture.
  • the metal complex polymer is a medium additive
  • the above-mentioned metal complex polymer can be used without particular limitation.
  • the above-mentioned specific metal complex polymer can be preferably used.
  • the metal complex polymer constitutes the scaffold material
  • a natural polymer chitosan, collagen, gelatin, etc. having a specific metal as a coordination metal or a derivative thereof can be preferably used.
  • Cell culture method By culturing cells using the cell culture system according to the present embodiment, it is possible to promote the utilization of ascorbic acid in the cells or enhance the action of the ascorbic acid derivative on the cells.
  • the cell culture method is not particularly limited.
  • the cells when the metal complex polymer is a medium additive, the cells may be cultured in a medium containing ascorbic acid or the like and the metal complex polymer.
  • the metal complex polymer constitutes a scaffold material, the cells may be seeded on the scaffold material, or the cells may be embedded in the scaffold material and cultured in a medium containing ascorbic acid or the like.
  • the cells to be cultured in the cell culture system according to the present embodiment are not particularly limited as long as they are cells to be cultured in a medium containing ascorbic acid or the like.
  • Specific examples of such cells include at least one selected from the group consisting of stromal cells, neurons, embryonic cells, mesenchymal stem cells, and pluripotent stem cells.
  • stromal cells include vascular endothelial cells, fibroblasts, chondrocytes, cardiomyocytes and the like.
  • pluripotent stem cells include induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), adult pluripotent stem cells (APS cells), and the like.
  • DPA-OH viscous liquid compound
  • DPAMA 955 mg, 2.94 mmol
  • 2-phenyl-2-propyl-benzodithioate 8.41 mg, 30.9 ⁇ mol
  • RAFT agents were dissolved in N, N-dimethylformamide (DMF; 5 mL).
  • the molar ratio of the monomer to the RAFT agent was confirmed by 1 H-NMR (Bruker Avance 400 Hz) by taking out a part of the solution.
  • a solution prepared by dissolving 2,2'-azobisisobutyronitrile (AIBN; 1.01 mg, 6.3 ⁇ mol) in DMF (1 mL) was added to this solution to prepare a mixed solution.
  • AIBN 2,2'-azobisisobutyronitrile
  • the mixed solution was degassed by repeating freezing and thawing three times, and polymerization was carried out by stirring at 60 ° C. for 48 hours under a nitrogen atmosphere.
  • the monomer conversion rate was confirmed by 1 H-NMR.
  • the reaction solution was then poured into diethyl ether (150 mL) to form a precipitate.
  • the precipitate was dissolved in DMF (6 mL), poured into diethyl ether (150 mL) to generate the precipitate again, and then vacuum dried to obtain a powdery compound (pDPAMA) (yield: 604 mg, yield). Rate: 62.7%).
  • the structure of the obtained compound was determined by 1 H-NMR and size exclusion chromatography (HLC-8020 GPC system, Tosoh Corporation). TSKgel SuperHZM-H (Tosoh Corporation) was used as the column for size exclusion chromatography, and DMF containing 10 mM lithium chloride was used as the eluent.
  • the charged molar ratio of the monomer to the RAFT agent was 90.
  • the monomer conversion rate was 73%, and the degree of polymerization was 65.
  • the obtained polyethylene glycol-equivalent number average molecular weight (Mn) was 6980, the mass average molecular weight (Mw) was 10670, and the dispersity (Mw / Mn) was 1.528.
  • Example 1 Evaluation of Oxidative Activity of Copper Complex Polymer (pDPACu (II) MA) for Ascorbic Acid>
  • a 100 mM ascorbic acid aqueous solution was prepared and ice-cooled.
  • Aqueous ascorbic acid solution, copper complex (pDPACu (II) MA or DPACu (II) OH), and deionized water were mixed to adjust the concentrations of ascorbic acid and copper to 1 mM and 25 ⁇ M, respectively.
  • the mixed solution was shaken at 37 ° C., a part of the solution was taken out at various time points, and the absorption of ultraviolet rays derived from ascorbic acid was confirmed by a spectrophotometer (BioSpec-nano, Shimadzu Corporation).
  • ultraviolet absorption derived from ascorbic acid was confirmed by a spectrophotometer in the same manner as above except that oxygen was removed by nitrogen bubbling at 37 ° C. for 15 minutes in a mixed solution containing pDPACu (II) MA. ..
  • FIG. 1 shows the residual rate of ascorbic acid when the ascorbic acid concentration immediately after preparation of the mixed solution is 1.
  • pDPACu (II) MA oxidized ascorbic acid significantly faster than DPACu (II) OH.
  • the oxidation rate of ascorbic acid by pDPACu (II) MA was greatly reduced. From this result, it is suggested that in pDPACu (II) MA, the copper-oxygen complex of the dinuclear system was easily formed by the local concentration of the copper complex site.
  • a sample solution was prepared in which the copper concentration was 80 ⁇ M and the copper concentration of the copper complex was 0.8 ⁇ M, 1.1 ⁇ M, 1.6 ⁇ M, or 8.0 ⁇ M.
  • a sample solution having a pDNA concentration of 16.7 ng / ⁇ L and a copper complex having a copper concentration of 8.0 ⁇ M was also prepared. After allowing these sample solutions to stand at 37 ° C. for 30 minutes, each 15 ⁇ L was loaded on a 0.9% agarose gel together with 3 ⁇ L of 6 ⁇ Loading Dye (Toyobo Co., Ltd.), and the TAE buffer was used as a mobile phase at 50 V at 60. It was run for a minute.
  • the agarose gel after migration was immersed in a 5 ⁇ g / mL ethidium bromide solution for 20 minutes, soaked in pure water for 2 minutes, and then observed on a GEL DOC EZ Imager (BIO-RAD Lab).
  • ⁇ Experimental Example 3 Evaluation of toxicity to human fibroblasts> Human skin fibroblasts (NHDF) were seeded in 24-well plates at a cell density of 5000 cells / well and DMEM medium (containing 10% (v / v) FBS and 2% (w / v) penicillin / streptomycin) ( Incubated overnight in 400 ⁇ L). It then contains DMEM medium (10% (v / v) FBS and 2% (w / v) penicillin / streptomycin) containing a copper complex (pDPACu (II) MA or DPACu (II) OH) of 25 ⁇ M in terms of copper concentration. ) (400 ⁇ L) for 24 hours. After 24 hours, the medium was changed, and the cell viability was measured using Cell Counting Kit 8 (Dojin Kagaku Kenkyusho Co., Ltd.).
  • Figure 3 shows the measurement results of cell viability. As can be seen from FIG. 3, pDPACu (II) MA was less toxic to human skin fibroblasts than DPACu (II) OH.
  • Bovine knee chondrocytes were seeded in 24-well plates at a cell density of 20000 cells / well and in DMEM medium (containing 10% (v / v) FBS and 2% (w / v) penicillin / streptomycin) (400 ⁇ L). Incubated overnight. DMEM medium containing 1 ⁇ M copper complex (pDPACu (II) MA) and 100 ⁇ M ascorbic acid in terms of copper concentration (including 10% (v / v) FBS and 2% (w / v) penicillin / streptomycin). Culture was continued in (400 ⁇ L). The medium was changed after 1 day, 3 days, or 7 days after culturing, and the cell viability was measured using Cell Counting Kit 8 (Dojin Kagaku Kenkyusho Co., Ltd.).
  • DMMB dimethylmethylene blue
  • Cytolysis (20 ⁇ L) and DMMB colorant (125 ⁇ L) were mixed on a 96-well plate, and the absorbance of light having a wavelength of 570 nm was measured with a microplate reader.
  • a calibration curve was prepared using chondroitin sulfate derived from sharks, and the amount of glycosaminoglycan (GAG) actually produced by the cells was estimated from the absorbance.
  • FIG. 4A shows the measurement results of the cell viability after 1 day, 3 days, or 7 days of culturing.
  • the measurement result of the production amount of glycosaminoglycan after 3 days of culture is shown in FIG. 4B.
  • pDPACu (II) MA showed no significant toxicity to bovine knee chondrocytes.
  • the coexistence of ascorbic acid improves the production ability of glycosaminoglycan, which is an extracellular matrix produced by bovine knee chondrocytes, and further causes pDPACu (II) MA to coexist.
  • the production ability of glycosaminoglycan was significantly improved.
  • ⁇ Experimental Example 5 Culture evaluation of human fibroblasts> Human skin fibroblasts (NHDF) were seeded in 24-well plates at a cell density of 4000 cells / well and included DMEM medium (2.5% (v / v) FBS and 2% (w / v) penicillin / streptomycin. ) (400 ⁇ L) was cultured overnight. Then, DMEM medium (2.5) containing 5 ⁇ M copper complex (pDPACu (II) MA or DPACu (II) OH) in terms of copper concentration and 100 ⁇ g / mL ascorbic acid-2-phosphate ester magnesium salt (MAP).
  • DMEM medium 2.5
  • containing 5 ⁇ M copper complex pDPACu (II) MA or DPACu (II) OH
  • Culturing was continued in% (v / v) FBS and 2% (w / v) penicillin / streptomycin) (400 ⁇ L). After 3 days of culturing, the medium was changed and the number of cells was measured using Cell Counting Kit 8 (Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd.). As a control, the cells were similarly cultured without adding a copper complex and / or MAP, and the number of cells was counted.
  • Figure 5 shows the number of cells (relative value) after 3 days of culturing.
  • addition of MAP to the medium promoted the proliferation of human skin fibroblasts, resulting in an increase in cell number
  • addition of pDPACu (II) MA with MAP further increased the number of cells.
  • pDPACu (II) MA is useful as an additive for enhancing the cell proliferation promoting action of MAP.
  • DPACu (II) OH was added together with MAP, the number of cells decreased as compared with the case where only MAP was added. It is considered that this is because DPACu (II) OH was toxic to human skin fibroblasts.

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Abstract

アスコルビン酸若しくはその塩、又はアスコルビン酸誘導体を含有する培地と、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｎｉ、及びＣｏからなる群より選択される少なくとも１種の金属を配位金属として有する金属錯体ポリマーとを含む、細胞培養系を提供する。また、その細胞培養系を用いた細胞培養方法、及びその細胞培養系に使用可能な培地添加剤を提供する。

Description

細胞培養系、細胞培養方法、及び培地添加剤
　本発明は、細胞培養系、細胞培養方法、及び培地添加剤に関する。
　再生医療は、人工的に培養した培養細胞、又は培養細胞から人工的に構築した組織を患者に移植し、身体の一部を再建又は修復するものである。近年、再生医療の実用化に向けた研究が積極的に進められており、これに伴い、細胞培養の産業化が加速している。
　従来、細胞培養には、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）等の動物由来血清を５％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）程度含有する培地が多用されてきた。しかし、動物由来血清は、ロット差が大きい上に不明成分が多く含まれているため、安定した培養が困難である。また、動物由来血清を含有する培地を用いて細胞を培養すると、培養細胞を患者に移植する場合の感染リスクが避けられない。感染リスクを低減するために患者自身の血清を利用することも考えられるが、患者への負担が大きい上、コスト高にも繋がる。そこで、血清濃度を低めた低血清培地又は無血清培地を用いて細胞を培養することが試みられている。
　一般に、低血清培地又は無血清培地を用いて細胞を培養すると、細胞の培養効率が低下することが知られている。このため、通常、培地には、血清を代替する種々の添加剤が添加される（例えば、特許文献１～３参照）。
国際公開第２００７／０８０９１９号 特開２０１９－１５００５７号公報 特開２０２１－０４０５５１号公報
　培地に添加される添加剤の１つとしてアスコルビン酸がある。アスコルビン酸は、種々の細胞の増殖促進作用、間葉系幹細胞や多能性幹細胞の分化促進作用、間質細胞の細胞外基質産生促進作用等の様々な作用を有することが知られている。しかし、アスコルビン酸は安定性が低い上、細胞内に取り込まれ難いという性質があるため、培地に添加したアスコルビン酸が細胞内で有効に利用されているとはいえない。
　アスコルビン酸の安定性に関する問題を解消するため、アスコルビン酸の代わりに、アスコルビン酸－２－リン酸エステル又はその塩等のアスコルビン酸誘導体を添加することも知られている。しかし、このようにアスコルビン酸誘導体を添加する場合であっても、その作用をより高めることが望まれる。
　本発明は、上記に鑑みて提案されたものであり、アスコルビン酸若しくはその塩、又はアスコルビン酸誘導体を利用した新規な細胞培養系、その細胞培養系を用いた細胞培養方法、及びその細胞培養系に使用可能な培地添加剤を提供することを課題とする。
　上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞　アスコルビン酸若しくはその塩、又はアスコルビン酸誘導体を含有する培地と、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｎｉ、及びＣｏからなる群より選択される少なくとも１種の金属を配位金属として有する金属錯体ポリマーとを含む、細胞培養系。
＜２＞　前記金属錯体ポリマーが、前記培地に添加される培地添加剤である、＜１＞に記載の細胞培養系。
＜３＞　前記金属錯体ポリマーが、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｎｉ、及びＣｏからなる群より選択される金属に下記式（１）で表される重合性モノマーが配位した金属錯体モノマーに由来する構成単位を有する、＜１＞又は＜２＞に記載の細胞培養系。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式中、Ｒ１は、水素原子又はメチル基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２は、それぞれ独立に下記式（２）又は式（３）で表される基を示し、ｎ１、ｎ２、及びｎ３は、それぞれ独立に１～４の整数を示す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［式中、Ｒ２は、水素原子又はアルキル基を示す。］
＜４＞　前記金属錯体ポリマーが、細胞培養用の足場材を構成する、＜１＞に記載の細胞培養系。
＜５＞　前記金属錯体ポリマーが、糖又はアミノ酸に由来する構成単位を有する、＜１＞又は＜４＞に記載の細胞培養系。
＜６＞　＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の細胞培養系を用いて細胞を培養することを含む細胞培養方法。
＜７＞　前記細胞が、間質細胞、神経細胞、胚細胞、間葉系幹細胞、及び多能性幹細胞からなる群よりから選択される少なくとも１種である、＜６＞に記載の細胞培養方法。
＜８＞　アスコルビン酸若しくはその塩又はアスコルビン酸誘導体を含有する細胞培養用の培地に添加される培地添加剤であって、
　Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｎｉ、及びＣｏからなる群より選択される金属に下記式（１）で表される重合性モノマーが配位した金属錯体モノマーに由来する構成単位を有する金属錯体ポリマーを含む、培地添加剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［式中、Ｒ１は、水素原子又はメチル基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２は、それぞれ独立に下記式（２）又は式（３）で表される基を示し、ｎ１、ｎ２、及びｎ３は、それぞれ独立に１～４の整数を示す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［式中、Ｒ２は、水素原子又はアルキル基を示す。］
　本発明によれば、アスコルビン酸若しくはその塩、又はアスコルビン酸誘導体を利用した新規な細胞培養系、その細胞培養系を用いた細胞培養方法、及びその細胞培養系に使用可能な培地添加剤を提供することができる。
銅錯体ポリマー（ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡ）又は低分子銅錯体（ＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＯＨ）によってアスコルビン酸を酸化する際のアスコルビン酸残存率の時間変化を示す図である。 銅錯体ポリマー（ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡ）又は低分子銅錯体（ＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＯＨ）によってアスコルビン酸を酸化する際のヒドロキシラジカルの発生量を、プラスミドＤＮＡに対する傷害性により評価した結果を示す図である。 銅錯体ポリマー（ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡ）又は低分子銅錯体（ＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＯＨ）を添加した培地中でヒト皮膚繊維芽細胞を２４時間培養した際の細胞生存率を示す図である。 銅錯体ポリマー（ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡ）を添加した培地中でウシ膝軟骨細胞を培養した際の細胞生存率を示す図である。 アスコルビン酸、又はアスコルビン酸及び銅錯体ポリマー（ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡ）を添加した培地中でウシ膝軟骨細胞を３日間培養した際のグリコサミノグリカンの産生量を示す図である。 アスコルビン酸－２－リン酸エステルマグネシウム塩（ＭＡＰ）及び／又は銅錯体（ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡ又はＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＯＨ）を添加した培地中でヒト皮膚繊維芽細胞を３日間培養した際の細胞数を示す図である。
　本実施形態に係る細胞培養系は、アスコルビン酸若しくはその塩、又はアスコルビン酸誘導体（以下、これらを総称して「アスコルビン酸等」ともいう。）を含有する培地と、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｎｉ、及びＣｏからなる群より選択される少なくとも１種の金属（以下、「特定金属」ともいう。）を配位金属として有する金属錯体ポリマーとを含む。
　本実施形態に係る細胞培養系によれば、細胞内におけるアスコルビン酸の利用を促進し、又は細胞に対するアスコルビン酸誘導体の作用を高めることができる。例えば、本実施形態に係る細胞培養系の培地にアスコルビン酸が含有される場合、該アスコルビン酸は金属錯体ポリマーによって酸化されてデヒドロアスコルビン酸となる。デヒドロアスコルビン酸は脂溶性であり、グルコーストランスポーターを介して細胞内に容易に取り込まれ、細胞内で還元されてアスコルビン酸となり、生理活性を示す。このように、本実施形態に係る細胞培養系によれば、細胞内におけるアスコルビン酸の利用を促進することが可能となる。
（培地）
　培地としては特に限定されず、例えば、基礎培地にアスコルビン酸等を添加したものを使用することができる。
　基礎培地としては、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ　１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地等が挙げられる。
　培地は、血清含有培地であっても無血清培地であってもよい。血清含有培地である場合、血清の濃度は、例えば、０．１％（ｖ／ｖ）～２０％（ｖ／ｖ）であることが好ましく、０．１％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）であることがより好ましく、０．１％（ｖ／ｖ）～５％（ｖ／ｖ）であることがさらに好ましい。血清としては、ウシ血清、ウシ胎仔血清、ヒト血清等が挙げられる。
　アスコルビン酸の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩、アンモニウム塩、モノエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、モノイソプロパノールアミン塩、トリイソプロパノールアミン塩等が挙げられる。
　アスコルビン酸誘導体としては、例えば、アスコルビン酸－２－グルコシド等のアスコルビン酸グルコシド；アスコルビン酸グルコシド脂肪酸；アスコルビン酸－２－リン酸エステル、アスコルビン酸－３－リン酸エステル、アスコルビン酸－６－リン酸エステル等のアスコルビン酸リン酸エステル；アスコルビン酸－２－ポリリン酸エステル等のアスコルビン酸ポリリン酸エステル；アスコルビン酸－２－硫酸エステル等のアスコルビン酸硫酸エステル；アスコルビン酸－２－パルミチン酸エステル、アスコルビン酸－６－パルミチン酸エステル等のアスコルビン酸パルミチン酸エステル；アスコルビン酸－２－ステアリン酸エステル、アスコルビン酸－６－ステアリン酸エステル等のアスコルビン酸ステアリン酸エステル；アスコルビン酸－２，６－ジブチルエステル；アスコルビン酸－２，６－ジパルミチン酸エステル；テトラヘキシルデカン酸アスコルビル；アスコルビン酸－２－リン酸－６－パルミチン酸（ＡＰＰＳ）；アスコルビルエチル；及びこれらの塩が挙げられる。塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩、アンモニウム塩、モノエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、モノイソプロパノールアミン塩、トリイソプロパノールアミン塩等が挙げられる。
　アスコルビン酸及びアスコルビン酸誘導体には、Ｄ体、Ｌ体、及びＤＬ体が存在し得るが、そのいずれであってもよく、好ましくはＬ体である。
　培地中のアスコルビン酸等の濃度は、例えば、１×１０－４％（ｗ／ｖ）～２００×１０－４％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、１０×１０－４％（ｗ／ｖ）～６０×１０－４％（ｗ／ｖ）であることがより好ましい。
（金属錯体ポリマー）
　金属錯体ポリマーは、特定金属を配位金属として有する。特定金属と錯形成可能なポリマーは、天然ポリマー又はその誘導体であってもよく、合成ポリマーであってもよい。
　特定金属と錯形成可能な天然ポリマーとしては、糖又はアミノ酸に由来する構成単位を有するものが挙げられる。例えば、キトサン、コラーゲン、ゼラチン等の天然ポリマーは、特定金属と錯形成可能であるため、これらの天然ポリマーに特定金属を配位させた金属錯体ポリマーを使用することができる。天然ポリマーが特定金属と錯形成可能でない場合には、ジピコリルアミノ基等の配位子を天然ポリマーに導入してもよい。
　一方、特定金属と錯形成可能な合成ポリマーとしては、配位子を有する重合性モノマー（及び必要に応じて他の重合性モノマー）を重合させて得られる重合体が挙げられる。配位子を有する重合性モノマーとしては、下記式（１）で表されるものが好ましい。すなわち、金属錯体ポリマーとしては、特定金属に下記式（１）で表される重合性モノマーが配位した金属錯体モノマーに由来する構成単位を有するもの（以下、「特定金属錯体ポリマー」ともいう。）が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ［式中、Ｒ１は、水素原子又はメチル基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２は、それぞれ独立に下記式（２）又は式（３）で表される基を示し、ｎ１、ｎ２、及びｎ３は、それぞれ独立に１～４の整数を示す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 ［式中、Ｒ２は、水素原子又はアルキル基を示す。］
　上記式（２）で表される基には、ピリジル基及び置換ピリジル基が含まれ、上記式（３）で表される基には、ピロリル基及び置換ピロリル基が含まれる。Ｒ２におけるアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基等の炭素数１～４のアルキル基が好ましい。Ｒ２としては、水素原子が好ましい。
　Ａｒ１及びＡｒ２は、互いに同一であっても異なっていてもよく、同一構造であることが好ましい。また、Ａｒ１及びＡｒ２としては、上記式（２）で表される基であることが好ましく、ピリジル基であることがより好ましい。
　ｎ１としては、２又は３が好ましく、２がより好ましい。ｎ２及びｎ３としては、それぞれ独立に１又は２が好ましく、１がより好ましい。
　上記式（１）で表される重合性モノマーの具体例としては、例えば、下記式（１－１）～（１－３）で表される重合性モノマーが挙げられる。式中のＲ１は、上記式（１）と同義である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　特定金属に下記式（１）で表される重合性モノマーが配位した金属錯体モノマーに由来する構成単位は、下記式（１ａ）で表される。式中のＭは、特定金属を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　特定金属錯体ポリマーは、上記式（１ａ）で表される構成単位以外に、他の重合性モノマーに由来する構成単位を有していてもよい。ただし、上記式（１ａ）で表される構成単位の割合は、３０ｍｏｌ％以上であることが好ましく、５０ｍｏｌ％以上であることがより好ましい。
　他の重合性モノマーとしては、（メタ）アクリル酸、マレイン酸及びその無水物、イタコン酸及びその無水物等の不飽和カルボン酸類；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、クロロエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル類；（メタ）アクリルアミド、Ｎ－メチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－フェニル（メタ）アクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド類；酢酸アリル、カプロン酸アリル、カプリル酸アリル等のアリル化合物類；ヘキシルビニルエーテル、オクチルビニルエーテル、メトキシエチルビニルエーテル等のビニルエーテル類；ビニルブチレート、ビニルイソブチレート、安息香酸ビニル等のビニルエステル類；スチレン、メチルスチレン、クロロスチレン等のスチレン類；などが挙げられる。これらの重合性モノマーは、１種類を単独で使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。
　なお、本明細書において、「（メタ）アクリル酸」との用語は、「アクリル酸」及び「メタクリル酸」の両方を意味する。「（メタ）アクリレート」等の他の用語についても同様である。
　特定金属錯体ポリマーは、例えば、上記式（１）で表される重合性モノマー（及び必要に応じて他の重合性モノマー）を重合させて重合体を得た後、その重合体に特定金属を配位させることにより得ることができる。重合体の製造方法は特に制限されず、重合開始剤又は連鎖移動剤を用いた公知の製造方法を採用することができる。あるいは、特定金属錯体ポリマーは、上記式（１）で表される重合性モノマーに特定金属を配位させて金属錯体モノマーを得た後、この金属錯体モノマー（及び必要に応じて他の重合性モノマー）を重合させることにより得ることもできる。
　特定金属錯体ポリマーの平均重合度は、例えば、１０～１０００であることが好ましく、２０～１００であることがより好ましい。
　上述した金属錯体ポリマーは、培地に添加される培地添加剤であってもよく、細胞培養に用いられる足場材を構成するものであってもよい。
　金属錯体ポリマーが培地添加剤である場合、上述した金属錯体ポリマーを特に制限なく使用することができる。中でも、上述した特定金属錯体ポリマーを好適に使用することができる。一方、金属錯体ポリマーが足場材を構成する場合、特定金属を配位金属として有する天然ポリマー（キトサン、コラーゲン、ゼラチン等）、又はその誘導体を好適に使用することができる。
（細胞培養方法）
　本実施形態に係る細胞培養系を用いて細胞を培養することにより、細胞内におけるアスコルビン酸の利用を促進し、又は細胞に対するアスコルビン酸誘導体の作用を高めることができる。
　細胞培養方法は特に制限されない。例えば、金属錯体ポリマーが培地添加剤である場合には、アスコルビン酸等と金属錯体ポリマーとを含有する培地中で細胞を培養すればよい。また、金属錯体ポリマーが足場材を構成する場合には、足場材上に細胞を播種し、又は足場材内に細胞を包埋し、アスコルビン酸等を含有する培地中で培養すればよい。
　本実施形態に係る細胞培養系で培養する細胞としては、アスコルビン酸等を含有する培地で培養される細胞であれば特に制限されない。そのような細胞の具体例としては、間質細胞、神経細胞、胚細胞、間葉系幹細胞、及び多能性幹細胞からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。間質細胞としては、血管内皮細胞、繊維芽細胞、軟骨細胞、心筋細胞等が挙げられる。多能性幹細胞としては、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、成体多能性幹細胞（ＡＰＳ細胞）等が挙げられる。
　以下、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。
＜合成例１：銅錯体ポリマー（ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡ）の合成＞
（１）配位子としてジピコリルアミノ基（ＤＰＡ）を有するメタクリレートモノマー（ＤＰＡＭＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　２－（クロロメチル）ピリジン塩酸塩（４０．１１ｇ，２４５ｍｍｏｌ）、臭化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＢ；１．３１ｇ，４．０８ｍｍｏｌ）、及び炭酸カリウム（１１２．６ｇ，８１５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５００ｍＬ）に溶解し、窒素雰囲気下で撹拌した。混合液に３－アミノ－１－プロパノール（６．１２ｇ，８１．５ｍｍｏｌ）を加え、９５℃で６０時間還流した。反応溶液をセライト（Ｃｅｌｉｔｅ　Ｎｏ．５０３、富士フイルム和光純薬（株））により濾過し、濾液をエバポレーターで濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：酢酸エチル／メタノール＝９０／１０）により精製し、目的物を含むフラクションを真空乾燥することにより、粘性液状の化合物（ＤＰＡ－ＯＨ）を得た（収量：８．８９３ｇ、収率：４２．０％）。得られた化合物の構造は、１Ｈ－ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ　Ａｖａｎｃｅ　４００Ｈｚ）により確認した。
　次いで、ＤＰＡ－ＯＨ（４．０６ｇ，１５．７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（ＴＥＡ；１．９７ｇ，１９．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を氷冷した。別途、塩化メタクリロイル（２．０４ｇ，１９．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４ｍＬ）に溶解した。氷浴上で撹拌しながら塩化メタクリロイル溶液にＤＰＡ－ＯＨ溶液を滴下し、室温で２４時間撹拌した。次いで、反応溶液をセライト（Ｃｅｌｉｔｅ　Ｎｏ．５０３、富士フイルム和光純薬（株））により濾過し、濾液をエバポレーターで濃縮した。不純物を除くため、濃縮物に酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で３回、塩化ナトリウム水溶液で１回洗浄して油相を回収した。回収した油相に硫酸ナトリウムを加えて脱水し、桐山ロートで濾過した後、濾液を濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：酢酸エチル／メタノール＝９０／１０）により精製し、目的物を含むフラクションを真空乾燥することにより、粘性液状の化合物（ＤＰＡＭＡ）を得た（収量：１．５８２ｇ、収率：３１．０％）。得られた化合物の構造は、１Ｈ－ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ　Ａｖａｎｃｅ　４００Ｈｚ）により確認した。
（２）ＤＰＡＭＡのＲＡＦＴ重合による重合体（ｐＤＰＡＭＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　ＤＰＡＭＡ（９５５ｍｇ，２．９４ｍｍｏｌ）及びＲＡＦＴ剤としての２－フェニル－２－プロピル－ベンゾジチオエート（８．４１ｍｇ，３０．９μｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；５ｍＬ）に溶解した。モノマーとＲＡＦＴ剤とのモル比は、溶液の一部を取り出して１Ｈ－ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ　Ａｖａｎｃｅ　４００Ｈｚ）により確認した。この溶液に、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ；１．０１ｍｇ，６．３μｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した溶液を加え、混合溶液とした。凍結融解を３回繰り返すことにより混合溶液を脱気し、窒素雰囲気下、６０℃で４８時間撹拌することにより重合を行った。モノマー転化率は１Ｈ－ＮＭＲにより確認した。次いで、反応溶液をジエチルエーテル（１５０ｍＬ）に注ぎ込んで沈殿物を生じさせた。沈殿物をＤＭＦ（６ｍＬ）に溶解し、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）に注ぎ込んで沈殿物を再度生じさせた後、真空乾燥することにより、粉末状の化合物（ｐＤＰＡＭＡ）を得た（収量：６０４ｍｇ、収率：６２．７％）。得られた化合物の構造は、１Ｈ－ＮＭＲ及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＨＬＣ－８０２０　ＧＰＣシステム、東ソー（株））により決定した。サイズ排除クロマトグラフィーのカラムにはＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＨＺＭ－Ｈ（東ソー（株））を使用し、溶離液には１０ｍＭ　塩化リチウムを含有するＤＭＦを使用した。
　分析の結果、モノマーのＲＡＦＴ剤に対する仕込みモル比は９０であった。また、モノマー転化率は７３％であり、重合度は６５であった。また、精製によって未反応のモノマーが完全に除去されていることが１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにより確認された。得られたｐＤＰＡＭＡのポリエチレングリコール換算の数平均分子量（Ｍｎ）は６９８０であり、質量平均分子量（Ｍｗ）は１０６７０であり、分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は１．５２８であった。
（３）銅錯体ポリマー（ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡ）の合成
　ｐＤＰＡＭＡ（５２．８９ｍｇ；１６０．５μｍｏｌのＤＰＡを含む）をメタノール（２ｍＬ）に溶解した。別途、塩化銅（ＩＩ）二水和物（３５．５６ｍｇ，２０８．６μｍｏｌ）をメタノール（２ｍＬ）に溶解した。ｐＤＰＡＭＡ溶液を銅溶液に滴下して撹拌し、さらに室温で１２時間撹拌した。次いで、溶液を水に対して５回透析（ＭＷＣＯ：３．５ｋＤａ）し、凍結乾燥することにより、粉末状の銅錯体ポリマー（ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡ）を得た（収量：７９．４０ｍｇ、収率：９８．８％）。
＜合成例２：比較用の低分子銅錯体（ＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＯＨ）の合成＞
　合成例１（１）で得られたＤＰＡ－ＯＨ（４０ｍｇ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；４．３１ｍＬ）に溶解し、３６ｍＭのＤＰＡ－ＯＨ溶液を調製した。また、塩化銅（ＩＩ）二水和物（３３ｍｇ）をＤＭＳＯ（６４．５ｍＬ）に溶解し、３ｍＭの塩化銅溶液を調製した。そして、ＤＰＡ－ＯＨ溶液に塩化銅溶液を添加することにより、低分子銅錯体（ＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＯＨ）を得た。
＜実験例１：銅錯体ポリマー（ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡ）のアスコルビン酸に対する酸化活性の評価＞
　１００ｍＭのアスコルビン酸水溶液を調製し、氷冷した。アスコルビン酸水溶液、銅錯体（ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡ又はＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＯＨ）、及び脱イオン水を混合し、アスコルビン酸及び銅の濃度をそれぞれ１ｍＭ及び２５μＭに調整した。混合溶液を３７℃で振盪し、種々の時点で溶液の一部を取り出し、アスコルビン酸に由来する紫外線吸収を分光光度計（ＢｉｏＳｐｅｃ－ｎａｎｏ、（株）島津製作所）により確認した。また、ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡを含有する混合溶液に３７℃で１５分間、窒素バブリングを行って酸素を除去したほかは上記と同様にして、アスコルビン酸に由来する紫外線吸収を分光光度計により確認した。
　混合溶液の調製直後におけるアスコルビン酸濃度を１としたときのアスコルビン酸の残存率を図１に示す。図１から分かるように、ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡは、ＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＯＨに比べて顕著に早くアスコルビン酸を酸化した。また、酸素を除去すると、ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡによるアスコルビン酸の酸化速度は大きく低下した。この結果から、ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡでは、銅錯体部位が局所濃縮されることにより、複核系の銅－酸素錯体が形成されやすかったことが示唆される。
＜実験例２：プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を用いたヒドロキシラジカル発生量の評価＞
　アスコルビン酸を酸化する際のヒドロキシラジカルの発生量について、酸化還元反応系に共存させたｐＤＮＡに対する傷害性を観察することで評価した。ｐＤＮＡ（ｐＵＣ１８ベクター、ＢＡＹＯＵ　ＢＩＯＬＡＢＳ）、アスコルビン酸、銅錯体（ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡ又はＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＯＨ）、及び脱イオン水を混合し、ｐＤＮＡの濃度が１６．７ｎｇ／μＬ、アスコルビン酸の濃度が８０μＭ、銅錯体の銅濃度が０．８μＭ、１．１μＭ、１．６μＭ、又は８．０μＭであるサンプル溶液を調製した。また、コントロールとして、ｐＤＮＡの濃度が１６．７ｎｇ／μＬ、銅錯体の銅濃度が８．０μＭであるサンプル溶液も調製した。これらのサンプル溶液を３７℃で３０分間静置した後、各１５μＬを３μＬの６×Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｄｙｅ（東洋紡（株））とともに０．９％　アガロースゲルにロードし、ＴＡＥバッファーを移動相として５０Ｖで６０分間泳動した。泳動後のアガロースゲルは、５μｇ／ｍＬのエチジウムブロマイド溶液に２０分間浸し、純水に２分間浸した後、ＧＥＬ　ＤＯＣ　ＥＺ　Ｉｍａｇｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ　Ｌａｂ）で観察した。
　ｐＤＮＡの電気泳動結果を図２に示す。図２から分かるように、銅濃度が高くなると無傷なｐＤＮＡの比率は小さくなったが、ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡでは、ＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＯＨに比べて無傷なｐＤＮＡの比率が顕著に高かった。これは、高分子化によって、銅錯体のヒドロキシラジカル発生量が小さくなることを示唆している。すなわち、高分子化によって、アスコルビン酸の酸化時における細胞に対する毒性が低くなっていることが予想される。
＜実験例３：ヒト繊維芽細胞に対する毒性の評価＞
　ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）を２４ウェルプレートに５０００個／ウェルの細胞密度で播種し、ＤＭＥＭ培地（１０％（ｖ／ｖ）　ＦＢＳ及び２％（ｗ／ｖ）　ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）（４００μＬ）中で一晩培養した。次いで、銅濃度換算で２５μＭの銅錯体（ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡ又はＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＯＨ）を含有するＤＭＥＭ培地（１０％（ｖ／ｖ）　ＦＢＳ及び２％（ｗ／ｖ）　ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）（４００μＬ）中で２４時間培養した。２４時間後に培地を交換し、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ　８（（株）同仁化学研究所）を用いて細胞生存率を測定した。
　細胞生存率の測定結果を図３に示す。図３から分かるように、ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡは、ＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＯＨに比べてヒト皮膚繊維芽細胞に対する毒性が低かった。
＜実験例４：ウシ軟骨細胞の培養評価＞
　ウシ膝軟骨細胞を２４ウェルプレートに２００００個／ウェルの細胞密度で播種し、ＤＭＥＭ培地（１０％（ｖ／ｖ）　ＦＢＳ及び２％（ｗ／ｖ）　ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）（４００μＬ）中で一晩培養した。次いで、銅濃度換算で１μＭの銅錯体（ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡ）及び１００μＭのアスコルビン酸を含有するＤＭＥＭ培地（１０％（ｖ／ｖ）　ＦＢＳ及び２％（ｗ／ｖ）　ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）（４００μＬ）中で培養を継続した。培養１日後、３日後、又は７日後に培地を交換し、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ　８（（株）同仁化学研究所）を用いて細胞生存率を測定した。
　また、培養３日後に培地を除き、ＰＢＳで細胞を洗浄し、２Ｎ　ＮａＯＨ水溶液（５００μＬ）を加え、２４時間静置して細胞を溶解した。エタノール（１．２５ｍＬ）にジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ；４ｍｇ）を溶解し、ギ酸（０．７５ｍＬ）及び１Ｎ　ＮａＯＨ水溶液（６．４ｍＬ）を加え、イオン交換水で２５０ｍＬまでメスアップしてＤＭＭＢ呈色液とした。９６ウェルプレート上で細胞溶解液（２０μＬ）とＤＭＭＢ呈色液（１２５μＬ）とを混合し、マイクロプレートリーダーで波長５７０ｎｍの光の吸光度を測定した。鮫由来のコンドロイチン硫酸を用いて検量線を作成し、吸光度から実際に細胞が産生したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）量を見積もった。
　培養１日後、３日後、又は７日後における細胞生存率の測定結果を図４Ａに示す。また、培養３日後におけるグリコサミノグリカンの産生量の測定結果を図４Ｂに示す。図４Ａから分かるように、ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡは、ウシ膝軟骨細胞に対して顕著な毒性を示さなかった。また、図４Ｂから分かるように、アスコルビン酸を共存させることにより、ウシ膝軟骨細胞が産生する細胞外基質であるグリコサミノグリカンの産生能が向上し、さらにｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡを共存させることにより、グリコサミノグリカンの産生能が顕著に向上した。これらの結果は、ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡが、培地中のアスコルビン酸の利用を促進させるための添加剤として有用であることを示している。
＜実験例５：ヒト繊維芽細胞の培養評価＞
　ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）を２４ウェルプレートに４０００個／ウェルの細胞密度で播種し、ＤＭＥＭ培地（２．５％（ｖ／ｖ）　ＦＢＳ及び２％（ｗ／ｖ）　ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）（４００μＬ）中で一晩培養した。次いで、銅濃度換算で５μＭの銅錯体（ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡ又はＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＯＨ）及び１００μｇ／ｍＬのアスコルビン酸－２－リン酸エステルマグネシウム塩（ＭＡＰ）を含有するＤＭＥＭ培地（２．５％（ｖ／ｖ）　ＦＢＳ及び２％（ｗ／ｖ）　ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）（４００μＬ）中で培養を継続した。培養３日後に培地を交換し、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ　８（（株）同仁化学研究所）を用いて細胞数を計測した。コントロールとしては、銅錯体及び／又はＭＡＰを添加せずに同様に培養を行い、細胞数を計測した。
　培養３日後における細胞数（相対値）を図５に示す。図５から分かるように、培地にＭＡＰを添加すると、ヒト皮膚繊維芽細胞の増殖が促進する結果、細胞数が増加し、ＭＡＰとともにｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡを添加すると、細胞数がさらに増加した。この結果は、ｐＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＭＡが、ＭＡＰの細胞増殖促進作用を高めるための添加剤として有用であることを示している。一方、ＭＡＰとともにＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＯＨを添加した場合には、ＭＡＰのみを添加した場合よりも細胞数が減少した。これは、ＤＰＡＣｕ（ＩＩ）ＯＨがヒト皮膚繊維芽細胞に対して毒性を示したためと考えられる。

Claims (8)

  1. 　アスコルビン酸若しくはその塩、又はアスコルビン酸誘導体を含有する培地と、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｎｉ、及びＣｏからなる群より選択される少なくとも１種の金属を配位金属として有する金属錯体ポリマーとを含む、細胞培養系。
  2. 　前記金属錯体ポリマーが、前記培地に添加される培地添加剤である、請求項１に記載の細胞培養系。
  3. 　前記金属錯体ポリマーが、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｎｉ、及びＣｏからなる群より選択される金属に下記式（１）で表される重合性モノマーが配位した金属錯体モノマーに由来する構成単位を有する、請求項１又は２に記載の細胞培養系。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｒ１は、水素原子又はメチル基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２は、それぞれ独立に下記式（２）又は式（３）で表される基を示し、ｎ１、ｎ２、及びｎ３は、それぞれ独立に１～４の整数を示す。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、Ｒ２は、水素原子又はアルキル基を示す。］
  4. 　前記金属錯体ポリマーが、細胞培養用の足場材を構成する、請求項１に記載の細胞培養系。
  5. 　前記金属錯体ポリマーが、糖又はアミノ酸に由来する構成単位を有する、請求項１又は４に記載の細胞培養系。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞培養系を用いて細胞を培養することを含む細胞培養方法。
  7. 　前記細胞が、間質細胞、神経細胞、胚細胞、間葉系幹細胞、及び多能性幹細胞からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項６に記載の細胞培養方法。
  8. 　アスコルビン酸若しくはその塩、又はアスコルビン酸誘導体を含有する細胞培養用の培地に添加される培地添加剤であって、
    　Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｎｉ、及びＣｏからなる群より選択される金属に下記式（１）で表される重合性モノマーが配位した金属錯体モノマーに由来する構成単位を有する金属錯体ポリマーを含む、培地添加剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、Ｒ１は、水素原子又はメチル基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２は、それぞれ独立に下記式（２）又は式（３）で表される基を示し、ｎ１、ｎ２、及びｎ３は、それぞれ独立に１～４の整数を示す。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［式中、Ｒ２は、水素原子又はアルキル基を示す。］
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