JPWO2019124522A1 - 細胞外小胞の安定化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法。
〔2〕細胞外小胞がエクソソームである、〔1〕の方法。
〔3〕細胞外小胞含有試料が体液または培養上清である、〔1〕または〔2〕の方法。
〔4〕細胞外小胞含有試料が血液試料である、〔1〕〜〔3〕のいずれかの方法。
〔5〕混合における糖の濃度が2.5〜100mg/mLである、〔1〕〜〔4〕のいずれかの方法。
〔6〕混合におけるキレート剤の濃度が1〜200mMである、〔1〕〜〔5〕のいずれかの方法。
〔7〕以下を含む、細胞外小胞の安定化方法:
(1)細胞外小胞含有試料を糖と混合すること;および
(2)細胞外小胞含有試料と糖との混合物を凍結させること。
〔8〕凍結が凍結乾燥である、〔7〕の方法。
〔9〕以下を含む、細胞外小胞の安定化方法:
(1)細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合すること;および
(2)細胞外小胞含有試料とキレート剤との混合物を凍結させること。
〔10〕凍結が凍結乾燥である、〔9〕の方法。
〔11〕糖およびキレート剤を含む、細胞外小胞安定化試薬。
〔12〕糖またはキレート剤を含む、細胞外小胞の凍結保存安定化試薬。
本発明は、細胞外小胞含有試料を糖と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する。
C1〜6アルケニル基は、炭素原子数1〜6個のアルケニル基であり、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖または分岐鎖のアルケニルが好ましい。C1〜6アルケニル基としては、例えば、エテニル(ビニル)、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、へキセニルが挙げられる。C1〜6アルケニル基としては、C1〜4アルケニル基が好ましく、C1〜3アルケニル基がより好ましい。
C1〜6アルキルオキシ基は、炭素原子数1〜6個のアルキルオキシ基である。C1〜6アルキルオキシ基としては、例えば、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、iso−プロピルオキシ、ブチルオキシ、iso−ブチルオキシ、sec−ブチルオキシ、tert−ブチルオキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、1−エチルプロピルオキシ、ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ、1,1−ジメチルブチルオキシ、2,2−ジメチルブチルオキシ、3,3−ジメチルブチルオキシ、2−エチルブチルオキシが挙げられる。C1〜6アルキルオキシ基としては、C1〜4アルキルオキシ基が好ましく、C1〜3アルキルオキシ基がより好ましい。
カルボキシアルキルとしては、例えば、カルボキシメチル、カルボキシエチル(1−カルボキシエチル、2−カルボキシエチル)、カルボキシプロピル(1−カルボキシプロピル、2−カルボキシプロピル、3−カルボキシプロピル)、カルボキシイソプロピル(1−カルボキシ−2−メチルエチル、2−カルボキシ−2−メチルエチル)、カルボキシブチル(1−カルボキシブチル、2−カルボキシブチル、3−カルボキシブチル、4−カルボキシブチル)、カルボキシt−ブチル、カルボキシペンチル(1−カルボキシペンチル、2−カルボキシペンチル、3−カルボキシペンチル、4−カルボキシペンチル、5−カルボキシペンチル)、カルボキシヘキシル(1−カルボキシヘキシル、2−カルボキシヘキシル、3−カルボキシヘキシル、4−カルボキシヘキシル、5−カルボキシヘキシル、6−カルボキシヘキシル)が挙げられる。
ヒドロキシアルキルとしては、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル(1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル)、ヒドロキシプロピル(1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル)、ヒドロキシイソプロピル(1−ヒドロキシ−2−メチルエチル、2−ヒドロキシ−2−メチルエチル)、ヒドロキシブチル(1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル)、ヒドロキシt−ブチル、ヒドロキシペンチル(1−ヒドロキシペンチル、2−ヒドロキシペンチル、3−ヒドロキシペンチル、4−ヒドロキシペンチル、5−ヒドロキシペンチル)、ヒドロキシヘキシル(1−ヒドロキシヘキシル、2−ヒドロキシヘキシル、3−ヒドロキシヘキシル、4−ヒドロキシヘキシル、5−ヒドロキシヘキシル、6−ヒドロキシヘキシル)が挙げられる。
セルロース誘導体の具体例としては、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられる。
セルロース誘導体には、ナノセルロース誘導体も含まれる。ナノセルロース誘導体とは、後述するナノセルロースの誘導体である。
細胞外小胞マーカーがタンパク質である場合、測定方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。イムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、およびサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光イムノアッセイ(CLIA)〔例、化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)〕、免疫比濁法(TIA)、酵素免疫測定法(EIA)(例、直接競合ELISA、間接競合ELISA、およびサンドイッチELISA)、放射イムノアッセイ(RIA)、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ(FIA)、およびイムノクロマトグラフィー法、ウェスタンブロッティング、免疫染色、蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting、FACS)が挙げられる。複数成分が検出される場合、プロテオーム分析が行われてもよい。
細胞外小胞マーカーが核酸である場合、測定方法としては、例えば、プローブを用いるハイブリダイゼーション法、プライマー(例、2、3、または4個のプライマー)を用いる遺伝子増幅法、質量分析法が挙げられる。
細胞外小胞マーカーがタンパク質および核酸以外の成分である場合、測定方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。複数成分が測定される場合、メタボローム分析が行われてもよい。
(1)細胞外小胞含有試料を糖と混合すること;および
(2)細胞外小胞含有試料と糖との混合物を凍結させること。
(1)細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合すること;および
(2)細胞外小胞含有試料とキレート剤との混合物を凍結させること。
(1)細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合すること;および
(2)細胞外小胞含有試料と糖およびキレート剤との混合物を凍結させること。
本発明はまた、細胞外小胞安定化試薬を提供する。本発明の試薬は、糖またはキレート剤を含む。好ましくは、本発明の試薬は、糖およびキレート剤を含んでいてもよい。糖およびキレート剤は、上述したものと同様である。本発明の試薬は、糖およびキレート剤に加えて、他の成分(例、細胞外小胞の安定化に有用な他の成分)を含んでいてもよい。
本発明はまた、糖および/またはキレート剤と、細胞外小胞とを含む混合物を提供する。本発明の混合物は、さらに水溶液(例、上述したような緩衝液)を含んでいてもよい。混合物の形態は特に限定されないが、水溶液またはその凍結物(例、凍結乾燥物)が好ましい。本発明の混合物は、細胞外小胞含有試料を、上述したような本発明の方法または試薬で処理することにより得ることができる。本発明の混合物は、例えば、細胞外小胞の保存に有用である。
エクソソームの凍結乾燥に対するキレート剤の効果を検討した。
3日間無血清培地で培養したヒト非小細胞肺癌細胞H1299の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、2,000×g、4℃で5分間遠心し、0.22μmフィルター(ミリポア社製)で濾過した後、Amicon Ultra−15(ミリポア社製)を用いて濃縮した。濃縮物を20,000×g、4℃で15分間遠心した。次に、上清を、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、PBS(2.9mM NaH2PO4、9.0mM Na2HPO4、137mM NaCl)または50mM EDTA/50mM EGTA/PBSを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、新たにPBSまたは50mM EDTA/50mM EGTA/PBS(回収緩衝液)を加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
回収したエクソソームをQubit(商標) Protein Assay Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々に回収緩衝液をさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム1容量に対し、凍結乾燥緩衝液24容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、凍結乾燥機(東京理化器械株式会社製)を用いて、−28℃で2時間、−10℃で4時間、その後20℃のプログラムで凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。凍結乾燥緩衝液としては、PBSまたはEDTA/EGTA/PBS(final conc.50mM EDTA/ 50mM EGTA)を用いた。用いたPBSのpHは7.4であった(実施例1〜3において同様)。
その後、凍結乾燥物をミリQ水(ミリポア社製)または50mM EDTA/50mM EGTA/H2O(溶解緩衝液)に溶解させた。
これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、ELISA系で評価した。具体的には、96ウェルELISAプレート(NUNC社製)に、自社製抗CD9抗体を含むPBS(pH7.4)を添加し、4℃で一晩インキュベートした。その後、各ウェルを0.05重量%Tween(登録商標)20を含むPBS(PBS−T)で3回洗浄し、0.5重量%Caseinを含むPBS200μLを添加して、室温で2時間インキュベートした。PBS−Tで洗浄後、PBSで希釈した凍結乾燥物の溶解物100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBS−Tで洗浄後、ビオチン化した同自社製抗CD9抗体と、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ(SA−ALP、GeneTex社製)とを含むPBS100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBSで洗浄し、ルミパルス(登録商標)基質液(富士レビオ社製)100μLを添加し、37℃で10分反応させた後、波長477nmの発光カウントを測定した。凍結乾燥していないサンプルのカウントを100%とした。
その結果、キレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した(図1)。
したがって、エクソソームの凍結乾燥においてキレート剤がエクソソームを安定化できることが示された。
エクソソームの凍結乾燥に対する糖の効果を検討した。
3日間無血清培地で培養したヒト結腸癌細胞SW480の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、2,000×g、4℃で5分間遠心し、0.22μmフィルター(ミリポア社製)で濾過した後、Amicon Ultra−15(ミリポア社製)を用いて濃縮した。濃縮物を20,000×g、4℃で15分間遠心した。次に、上清を、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、PBSを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、新たにPBSを加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
回収したエクソソームをQubit(商標) Protein Assay Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々にPBSをさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム1容量に対し、凍結乾燥緩衝液24容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、上述した凍結乾燥機を用いて、−28℃で2時間、−10℃で4時間、その後20℃のプログラムで凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。なお、凍結乾燥緩衝液として、PBS、EDTA/EGTA/PBS(final conc.50mM EDTA/50mM EGTA)、ショ糖/PBS(final conc.10mg/mLショ糖)、またはEDTA/EGTA/ショ糖/PBS(final conc.50mM EDTA/50mM EGTA/10mg/mLショ糖)を用いた。
その後、凍結乾燥物をミリQ水(ミリポア社製)に溶解させた。
これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、ELISA系で評価した。具体的には、96ウェルELISAプレート(NUNC社製)に、自社製抗CD9抗体を含むPBS(pH7.4)を添加し、4℃で一晩インキュベートした。その後、各ウェルをPBS−Tで3回洗浄し、0.5重量%Caseinを含むPBS200μLを添加して、室温で2時間インキュベートした。PBS−Tで洗浄後、PBSで希釈した凍結乾燥物の溶解物100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBS−Tで洗浄後、ビオチン化した同自社製抗CD9抗体と、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ(SA−ALP、GeneTex社製)とを含むPBS100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBSで洗浄し、ルミパルス基質液100μLを添加し、37℃で5分反応させた後、波長477nmの発光カウントを測定した。凍結乾燥していないサンプルのカウントを100%とした。
その結果、ショ糖を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した(図2)。また、ショ糖およびキレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量がより増大した。
したがって、エクソソームの凍結乾燥において、糖がエクソソームを安定化できることが示された。また、糖によるエクソソームの安定化は、キレート剤の存在下で向上されることが示された。
凍結乾燥を行ったサンプルをNanoSightで測定して、凍結乾燥エクソソームの粒子量に基づき安定性を評価した。
3日間無血清培地で培養したヒト結腸癌細胞SW1116の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、2,000×g、4℃で5分間遠心し、0.22μmフィルター(ミリポア社製)で濾過した後、Amicon Ultra−15(ミリポア社製)を用いて濃縮した。濃縮物を20,000×g、4℃で15分間遠心した。次に、上清を、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、PBS(Control)または50mM EDTA/50mM EGTA/PBS(ED/EG)を加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、新たにPBSまたは50mM EDTA/50mM EGTA/PBS(ED/EG)を加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
回収したエクソソームをQubit(商標) Protein Assay Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々に回収緩衝液をさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム1容量に対し、凍結乾燥緩衝液24容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、上述した凍結乾燥機を用いて、−28℃で2時間、−10℃で4時間、その後20℃のプログラムで凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。なお、凍結乾燥緩衝液として、PBS、EDTA/EGTA/PBS(final conc.50mM EDTA/50mM EGTA)(ED/EG)を用いた。
その後、凍結乾燥物をミリQ水(ミリポア社製)に溶解させた。
溶解した凍結乾燥エクソソームの粒子数および分布の測定をNanoSight LM10(Malvern Instruments社製)により行った。測定は測定時間30秒、繰り返し回数3回で行い、detection thresholdを15で解析した。
その結果、キレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソームに対応すると考えられる100〜200nmの粒子量が、増加していた(表1および図3A〜3D)。
したがって、粒子量の測定によっても、エクソソームの凍結乾燥においてキレート剤がエクソソームを安定化できることが示された。
キレート剤として、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA・2Na)、グリコールエーテルジアミン四酢酸(EGTA)、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸(HEDTA)、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸(HIDA)、ニトリロ三酢酸(NTA)、シュウ酸二水和物、エチレンジアミンテトラ(メチレンホスホン酸)(EDTMP)(EDTA・2Na、EGTAは同仁化学研究所社製、HEDTA、HIDA、NTA、EDTMPは東京化成工業社製、シュウ酸二水和物は和光純薬工業社製)を使用した。各キレート剤のエクソソームの沈降量への影響を検討した。
300μLの血清検体または血漿検体を、600μLのPBSまたは各キレート剤添加PBSと混合した。各キレート剤の濃度はそれぞれ終濃度で1、10および50mMとなるように使用した(ただし、EDTMPのみは1、10および30mM)。次いで、溶液を室温で30分放置した後、20,000×g、4℃で15分間遠心した。その上清を新しいチューブに移し、そこに、CD9を認識する自社モノクローナル抗体を2μg固定した磁性ビーズ(Protein G Dynabeads)を添加した。4℃で一晩反応させた後に、磁性ビーズをPBSで3回洗浄し、サンプルをサンプルバッファー(SDS含有)で磁性ビーズから溶出し、ウェスタンブロッティング用サンプルとした。これらのサンプルをビオチン化抗CD9抗体によるウェスタンブロッティングで分析した。
その結果、血清(図4A)および血漿(図4B)の両方において、使用したキレート剤はいずれも、免疫沈降法によるエクソソームの回収を示し、また、濃度が高くなるにつれてエクソソームの免疫沈降量が増加した。特に、30mMのEDTMP、50mMのEDTA、EGTA、HEDTA、NTA、シュウ酸で、エクソソームの免疫沈降量が大幅に増加した(図4A、4B)。
エクソソームの凍結乾燥に対する各種糖の効果を検討した。
3日間無血清培地で培養したヒト非小細胞肺癌細胞H1299の培養上清をサンプルとして用い、実施例2の回収方法にて、エクソソームを回収した。
回収したエクソソームをQubit(商標) Protein Assay Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々にPBSをさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム1容量に対し、凍結乾燥緩衝液9容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、凍結乾燥機(Genevac社製)を用いて、凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。なお、凍結乾燥緩衝液として、PBS、およびPBSにラクトース、フルクトース、メチルβシクロデキストリン(MβCD)、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン(HpβCD)、γシクロデキストリン(γCD)、グルコース、ラクチトール、ソルビトール、キシリトール、ショ糖、トレハロース、マンニトール、キシロースをfinal conc.2.0mg/mL、10mg/mL、50mg/mLとなるように用いた。
その後、凍結乾燥物をミリQ水(ミリポア社製)に溶解させた。
これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、ELISA系で評価した。具体的には、96ウェルELISAプレート(NUNC社製)に、自社製抗CD9抗体を含むPBS(pH7.4)を添加し、4℃で一晩インキュベートした。その後、各ウェルをPBS−Tで3回洗浄し、0.5重量%BSAを含むPBS200μLを添加して、室温で2時間インキュベートした。PBS−Tで洗浄後、凍結乾燥物の溶解物100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBS−Tで洗浄後、ビオチン化した同自社製抗CD9抗体を含むPBS100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBS−Tで洗浄後、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ(SA−ALP、GeneTex社製)を含むPBS100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBS−Tで洗浄し、ルミパルス基質液100μLを添加し、37℃で5分反応させた後、波長480nmの発光カウントを測定した。凍結乾燥していないサンプルのカウントを100%とした。
その結果、これら糖類を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した(図5Aおよび図5B)。特に、糖を10mg/mLまたは50mg/mLで含む凍結乾燥緩衝液では、検討した大部分の糖でエクソソーム量が増大した。
したがって、エクソソームの凍結乾燥において、各種糖がエクソソームを安定化できること、および、特に糖の濃度が10〜50mg/mLである場合に高い安定化効果が奏されることが示された。
エクソソームの凍結乾燥に対する各種糖およびキレート剤の併用による効果を検討した。
凍結乾燥緩衝液を除き、実施例4に記載の方法にて、エクソソームの回収および凍結乾燥、並びにエクソソームの安定性評価を行った。
凍結乾燥緩衝液としては、PBSもしくはEDTA/EGTA/PBS(final conc.50mM EDTA/50mM EGTA)(ED/EG)、またはこれらのいずれかにラクトース、γシクロデキストリン(γCD)、グルコース、ラクチトールをfinal conc.10mg/mLで添加したものを用いた。
したがって、糖によるエクソソームの安定化は、キレート剤の存在下で向上されることが示された。
血清由来のエクソソームの凍結乾燥に対する各種糖もしくはキレート剤またはこれらの併用による効果を検討した。
ヒト血清をサンプルとして用いた。血清を、2,000×g、4℃で5分間遠心した後、20,000×g、4℃で15分間遠心した。次に、上清を、100,000×g、4℃で3時間遠心した。上清を捨て、PBSを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、新たにPBSを加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
エクソソームの凍結乾燥およびエクソソームの安定性評価は、凍結乾燥緩衝液を除き、実施例4に記載の方法にて行った。
凍結乾燥緩衝液としては、PBSもしくはEDTA/EGTA/PBS(final conc.50mM EDTA/50mM EGTA)(ED/EG)、またはこれらのいずれかにラクトース、グルコース、ラクチトールをfinal conc.10mg/mLもしくは50mg/mLで添加したものを用いた。
したがって、糖類およびキレート剤によるエクソソームの安定化向上の効果は血清由来のエクソソームにも示された。
エクソソームの凍結乾燥に対するカルボキシメチルセルロース(CMC)の効果を検討した。
3日間無血清培地で培養したヒト非小細胞肺癌細胞H1299の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、2,000×g、4℃で5分間遠心し、0.22μmフィルター(ミリポア社製)で濾過した後、Amicon Ultra−15(ミリポア社製)を用いて濃縮した。濃縮物を100,000×g、4℃で3時間遠心した。上清を捨て、PBSを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、新たにPBSを加えて、エクソソームを回収した。
回収したエクソソームをQubit(商標) Protein Assay Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にてタンパク定量を行い、濃度を調整した。次に、回収したエクソソーム1容量に対し、等量の凍結乾燥緩衝液と混合し、−20℃で3時間凍結した後、遠心エバポレーター(スクラム社製)を用いて乾燥させた。その後、凍結乾燥物をミリQ水(ミリポア社製)で溶解させ、さらにPBSを加えて希釈した。なお、凍結乾燥緩衝液としてPBS、CMC/PBS(final conc.0.2重量%または1重量%CMC)を用いた。
これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、固相に自社製抗CD9抗体、検出にビオチン化した同自社製抗CD9抗体およびSA−ALP(GeneTex社製)を用いたELISA系で、凍結乾燥していないサンプルのカウントを100%として評価した。
その結果、凍結乾燥時に0.2重量%CMCまたは1重量%CMCを含む条件では、残存するエクソソームの量が増大した(図8)。
したがって、エクソソームの凍結乾燥においてCMCがエクソソームを安定化できることが示された。
Claims (12)
- 細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法。
- 細胞外小胞がエクソソームである、請求項1に記載の方法。
- 細胞外小胞含有試料が体液または培養上清である、請求項1または2に記載の方法。
- 細胞外小胞含有試料が血液試料である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 混合における糖の濃度が2.5〜100mg/mLである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 混合におけるキレート剤の濃度が1〜200mMである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 以下を含む、細胞外小胞の安定化方法:
(1)細胞外小胞含有試料を糖と混合すること;および
(2)細胞外小胞含有試料と糖との混合物を凍結させること。 - 凍結が凍結乾燥である、請求項7に記載の方法。
- 以下を含む、細胞外小胞の安定化方法:
(1)細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合すること;および
(2)細胞外小胞含有試料とキレート剤との混合物を凍結させること。 - 凍結が凍結乾燥である、請求項9に記載の方法。
- 糖およびキレート剤を含む、細胞外小胞安定化試薬。
- 糖またはキレート剤を含む、細胞外小胞の凍結保存安定化試薬。
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