JP7402727B2 - リン脂質含有物質安定化剤およびそれを含む体液検査キット - Google Patents
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本発明は、リン脂質含有物質安定化剤およびそれを含む体液検査キットに関する。
近年、バイオ医薬品、細胞治療、再生治療など、バイオマテリアルを利用した医薬品および医療機器の開発が活発に行われている。これらは、サイトカイン、免疫反応など、生体が日常的に使用しているシグナルを通じて、投与された局所、あるいは生体全体を、治療に適した環境に変化させる事が可能である。また、長期に渡って、その変化を持続可能である。そのため、従来の低分子薬や抗体医薬と比べて、低い副作用と、長期の治療効果をもつものと期待されている。
バイオマテリアルを利用した医薬品および医療機器は、不安定なものが多く、これらを保護する技術にも注目が集まっている。
例えば、抗体等のバイオ医薬品は、シリコンとの接触や輸送時の振動により変性し、薬効に影響が及ぶことが知られている。また、細胞治療の実現のためには、治療用の細胞の状態が重要であることが認識されている（非特許文献１）。
さらに、診断薬の分野では、血液を対象としたリキッドバイオプシーにおいて、上記技術の重要性が強く認識されている。血液を対象としたリキッドバイオプシーでは、少量の血液からｃｆＤＮＡ（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ＤＮＡ）、エクソソームなどを抽出し、癌の診断、治療などに利用する。具体的には、コンパニオン診断への利用、適切な抗癌剤の選択、癌に対する治療効果のモニター、再発癌の早期発見への利用などが活発に検討されている。
特に、ｃｆＤＮＡにおいては、バイオマテリアルを保護する技術が、採血後の血液細胞の崩壊を防ぎ、検査の精度を向上させる技術として期待されている。
これらを実現する技術としては、種々のものが検討されている。例えば、非特許文献２には、ポリエチレングリコール修飾による、リポソーム製剤の安定化が検討されている。非特許文献３には、核酸医薬の安定性向上を検討した種々の報告がなされている。非特許文献４には、ＲＮＡ医薬品の安定性向上の検討が報告されている。
ＳＴＡＣＥＹ，Ｇ． ｅｔ ａｌ．，２０１７．Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ： ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ａｎ ｅｘｐｅｒｔ ｗｏｒｋｓｈｏｐ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２（５），ｐｐ．５５３－５６４
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バイオマテリアルを利用した医薬品および医療機器の多くは、リン脂質膜を構成として有するリン脂質含有物質であり、これらは一般的に不安定である。例えば、血液を対象とするリキッドバイオプシーでは、ｃｆＤＮＡは微量であるために、採血後の血液細胞を保護し、有核細胞からのＤＮＡの溶出を抑える必要がある。また、エクソソームでは、それ自身が熱、凍結融解、容器吸着などにより消失することから、検査の質を向上させるためにも、エクソソーム自身を安定化することが望まれている。
非特許文献２に記載の技術のように、ポリエチレングリコールを使用することによって、リン脂質含有物質の安定性向上が図られている。しかし、リン脂質含有物質をより安定化させる技術が望まれている。
そこで、本発明は、リン脂質含有物質をより安定して保護することができるリン脂質含有物質安定化剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を積み重ねた。その結果、直線状分子とγ－シクロデキストリンとを組み合わせて使用することによって、上記課題を解決することを見出し、本発明の完成に至った。
すなわち、本発明の一形態によれば、直線状分子とγ－シクロデキストリンとを含み、前記直線状分子に対する前記γ－シクロデキストリンの質量比が９未満である、リン脂質含有物質安定化剤が提供される。
また、本発明の他の形態によれば、直線状分子とγ－シクロデキストリンとを有する可溶性の複合体を含む、リン脂質含有物質安定化剤が提供される。
本発明によれば、リン脂質含有物質をより安定して保護することができるリン脂質含有物質安定化剤を提供することができる。
以下、本発明の一形態に係る実施の形態を説明する。本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。
本明細書において、範囲を示す「Ｘ～Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０～２５℃）／相対湿度４０～５０％ＲＨの条件で測定する。
本明細書において、リン脂質含有物質安定化とは、保管や外部負荷に対しても、リン脂質含有物質が有するリン脂質によって構成される構造の崩壊を抑制することができることを意味する。例えば、リン脂質含有物質がリン脂質膜を含む場合、安定化とは、リン脂質膜の構造を維持できる（崩壊を抑制できる）ことを意味する。より具体的には、リン脂質含有物質が血液中の有核細胞（例えば、白血球）である場合、安定化とは、有核細胞の崩壊を抑制し、よって有核細胞内の成分（例えば、ＤＮＡ）が血液中に放出されることを抑制する。
＜リン脂質含有物質安定化剤＞
本発明の第１の形態は、直線状分子とγ－シクロデキストリンとを含み、前記直線状分子に対する前記γ－シクロデキストリンの質量比が９未満である、リン脂質含有物質安定化剤である。
本発明の第１の形態は、直線状分子とγ－シクロデキストリンとを含み、前記直線状分子に対する前記γ－シクロデキストリンの質量比が９未満である、リン脂質含有物質安定化剤である。
また、本発明の第２の形態は、直線状分子とγ－シクロデキストリンとを有する可溶性の複合体を含む、リン脂質含有物質安定化剤である。
本発明のリン脂質含有物質安定化剤によって、リン脂質含有物質が保護されるメカニズムは、完全には解明されていないが、以下のように推測される。
液体中に直線状分子（例えば、ポリエチレングリコール）とγ－シクロデキストリンとが存在すると、γ－シクロデキストリンが直線状分子をとりこむ、すなわち包接が進行し、直線状分子とγ－シクロデキストリンとの複合体（包接錯体）が形成される。このような複合体は、γ－シクロデキストリンのヒドロキシ基同士が水素結合することにより３次元ネットワークを形成することによってゲルを形成し、沈殿を生じる場合がある。あるいは、２本の直線状分子が、γ－シクロデキストリンに包接し、３次元ネットワークを形成することによってゲルを形成する場合がある。しかし、直線状分子とγ－シクロデキストリンとを所定の質量比で使用することにより、複合体は可溶性を維持できる。
γ－シクロデキストリンは、リン脂質含有物質、例えばリン脂質膜を含む材料と相互作用し、リン脂質膜に吸着する作用を有する。本発明者らは、複合体を構成するγ－シクロデキストリンにおいても同様に、リン脂質膜に吸着する作用を有することを確認した。
よって、γ－シクロデキストリンを介して、複合体がリン脂質膜に吸着し、その結果、リン脂質膜に直線状分子が導入されることで、Ｐｅｇ－ｌｉｐｏｓｏｍｅのようにリン脂質膜を含む材料を安定化すると考えられる。また、リン脂質膜に直線状分子が導入されることで、外部負荷（振動、衝撃など）に対しても、リン脂質膜を含む材料を安定化すると考えられる。
なお、上記メカニズムは推定であり、本発明は上記推定によって限定されない。
（リン脂質含有物質）
本発明の第１の形態および第２の形態に係るリン脂質含有物質は、共通しており、以下の説明も共通である。
本発明の第１の形態および第２の形態に係るリン脂質含有物質は、共通しており、以下の説明も共通である。
リン脂質含有物質は、リン脂質を含むものであれば特に制限されない。リン脂質含有物質は、好ましくはリン脂質膜を含む材料であり、より好ましくは白血球、赤血球、培養細胞、リポソームおよびエクソソームからなる群から選択される少なくとも一種である。
なお、白血球をより具体的に例示すると、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球であり、リンパ球をより具体的に例示するとＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞であり、単球をより具体的に例示すると、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞である。
（直線状分子）
本発明の第１の形態および第２の形態に係る直線状分子は、共通しており、以下の説明も共通である。
本発明の第１の形態および第２の形態に係る直線状分子は、共通しており、以下の説明も共通である。
直線状分子は、γ－シクロデキストリンを貫通しうるものであれば、特に制限されない。直線状分子は、リン脂質含有物質をより保護できるとの観点から、好ましくはポリエチレングリコール（本明細書中、単に「Ｐｅｇ」とも称する）、ポリプロピレングリコール（本明細書中、単に「ＰＰＧ」とも称する）、ポリビニルアルコール（本明細書中、単に「ＰＶＡ」とも称する）からなる群から選択される少なくとも一つであり、より好ましくはポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールから選択される少なくとも一つである。
直線状分子の重量平均分子量は、特に制限されないが、リン脂質含有物質をより保護できるとの観点から、好ましくは１０００～２０００００である。
直線状分子としてＰｅｇを用いる場合、Ｐｅｇの重量平均分子量は、より好ましくは６０００～２０００００であり、さらに好ましくは２００００～１０００００であり、よりさらに好ましくは３５０００～６００００である。
直線状分子としてＰＰＧを用いる場合、ＰＰＧの重量平均分子量は、より好ましくは１０００～４０００であり、さらに好ましくは２０００～３０００である。
直線状分子としてＰＶＡを用いる場合、ＰＶＡの重量平均分子量は、より好ましくは１０００～４０００であり、さらに好ましくは１５００～３０００である。
重量平均分子量は、標準物質としてポリスチレンを用いたゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）によって測定した値を採用する。
直線状分子は、市販品を用いてもよく、また合成品を用いてもよい。
（γ－シクロデキストリン）
本発明の第１の形態および第２の形態に係るγ－シクロデキストリンは、共通しており、以下の説明も共通である。
本発明の第１の形態および第２の形態に係るγ－シクロデキストリンは、共通しており、以下の説明も共通である。
シクロデキストリン（ＣｙＤ）は、グルコースがα（１→４）グルコシド結合によって結合し、環状構造をとった環状オリゴ糖の一種である。γ－シクロデキストリン（本明細書中、単に「γＣｙＤ」とも称する）は、グルコースが８個結合している。
γＣｙＤとしては、市販品を使用することができる。市販品としては、デキシパール γ－１００（塩水港精糖株式会社製）などが挙げられる。
（直線状分子およびγ－シクロデキストリンの含有量）
第１の形態のリン脂質含有物質安定化剤において、直線状分子に対するγ－シクロデキストリンの質量比が９未満である。質量比の下限は、０超である。このような質量比であることにより、リン脂質含有物質を保護し、安定化することができる。前記質量比は、リン脂質含有物質の安定化をより高めるとの観点から、好ましくは０．０００２～２．５であり、より好ましくは０．０００２～１．２であり、さらに好ましくは０．０００２～０．６である。
第１の形態のリン脂質含有物質安定化剤において、直線状分子に対するγ－シクロデキストリンの質量比が９未満である。質量比の下限は、０超である。このような質量比であることにより、リン脂質含有物質を保護し、安定化することができる。前記質量比は、リン脂質含有物質の安定化をより高めるとの観点から、好ましくは０．０００２～２．５であり、より好ましくは０．０００２～１．２であり、さらに好ましくは０．０００２～０．６である。
（直線状分子とγ－シクロデキストリンとを有する可溶性の複合体）
第２の形態のリン脂質含有物質安定化剤は、直線状分子とγ－シクロデキストリンとを有する可溶性の複合体を含む。
第２の形態のリン脂質含有物質安定化剤は、直線状分子とγ－シクロデキストリンとを有する可溶性の複合体を含む。
本明細書において、「可溶性」とは、水に可溶であることを言う。
本明細書において、「複合体」とは、γＣｙＤの環を直線状分子が貫通した構造を有するもの、およびこれらの集合体を意味する。
上述のとおり、液体中に直線状分子（例えば、ポリエチレングリコール）とγＣｙＤとが存在すると、γＣｙＤが直線状分子をとりこむ、すなわち包接が進行することで、直線状分子とγＣｙＤとの複合体（包接錯体）を形成することができる。
また、第２の形態に係る複合体は、ゲルを形成しない程度に３次元ネットワークを形成し得る。そのため、複合体は、２以上の複合体の集合体であってもよい。
第２の形態に係る複合体において、直線状分子に対するγＣｙＤの質量比は、可溶性を維持するとの観点から、好ましくは０を超えて９未満である。前記質量比は、リン脂質含有物質の安定化をより高めるとの観点から、好ましくは０．０００２～２．５であり、より好ましくは０．０００２～１．２であり、さらに好ましくは０．０００２～０．６である。なお、当該質量比は、直線状分子およびγＣｙＤの仕込み量から算出することができる。
（好ましい実施形態）
第１の形態および第２の形態のリン脂質含有物質安定化剤は、好ましくは液状の形態である。
第１の形態および第２の形態のリン脂質含有物質安定化剤は、好ましくは液状の形態である。
上述のとおり、液体中に直線状分子（例えば、ポリエチレングリコール）とγＣｙＤとが存在すると、γＣｙＤが直線状分子をとりこむ、すなわち包接が進行し、直線状分子とγＣｙＤとの複合体（包接錯体）が形成される。したがって、第１の形態のリン脂質含有物質安定化剤は、直線状分子の少なくとも一部がγＣｙＤと複合体を形成することができる。
本実施形態のリン脂質含有物質安定化剤に含まれる溶媒は、特に制限されず、例えば水（滅菌水）、生理食塩水、ＰＢＳ、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液などが挙げられる。
本実施形態のリン脂質含有物質安定化剤中の直線状分子の濃度は、例えば２０～７８０ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは１８０～７８０ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは３００～７８０ｍｇ／ｍＬである。また、直線状分子の濃度の下限は、４００ｍｇ／ｍＬ以上または５００ｍｇ／ｍＬ以上であってもよい。
本実施形態のリン脂質含有物質安定化剤中のγＣｙＤの濃度は、例えば０．１～５０ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは０．１５～２５ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは０．３～１５ｍｇ／ｍＬである。また、γＣｙＤの濃度の上限は、６ｍｇ／ｍＬ以下、３ｍｇ／ｍＬ以下、１．５ｍｇ／ｍＬ以下または１ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。
本実施形態のリン脂質含有物質安定化剤は、溶媒に加えて、必要に応じてその他の成分を選択して含むことができる。その他の成分としては、抗凝固剤、等張化剤、抗酸化剤、防腐剤、プロテアーゼ阻害剤、カスパーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、組織固定剤などが挙げられる。これらの具体的成分としては次に示すものが例示されるがその限りではない。抗凝固剤としては、エチレンジアミン四酢酸（以降、ＥＤＴＡと略称する）及びその塩、クエン酸及びその塩、ヘパリンなどが例示される。等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、亜硫酸水素ナトリウム、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、ぶどう糖、グリセリン、プロピレングリコール、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、乳酸ナトリウム、タウリンなどが例示される。抗酸化剤としては、トコフェロール、アスコルビン酸、グルタチオンなどが例示される。プロテアーゼ阻害剤としては、フェニルメチルスルフォニルフロリド、アミノエチルベンジルスルフォニルフロリド、ロイペプチン、ペプステインＡ、アプロチニン、ベンズアミジンなどが例示される。防腐剤としては、パラベン類、塩化ベンザルコニウム、塩化ゼンゼトニウム、クロルヘキシジン及びその塩、アジ化ナトリウム、フッ化ナトリウムなどが例示される。カスパーゼ阻害剤としては、エンゾライフサイエンシス社から販売されているＺ－ＹＶＡＤ－ＦＭＫ、Ｚ－ＶＤＶＡＤ－ＦＭＫ、Ｚ－ＤＥＶＤ－ＦＭＫ、Ｚ－ＬＥＨＤ－ＦＭＫが例示されるが、製造会社、製品名、化学構造などこの限りでない。ヌクレアーゼ阻害剤としては、プロテイナーゼＫが例示される。組織固定剤としては、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジアゾリジニル尿素、イミダゾリジニル尿素などが例示される。
本実施形態のリン脂質含有物質安定化剤が抗凝固剤を含む場合、ＥＤＴＡおよびその塩の濃度は、特に制限されず、例えば１～１００ｍｇ／ｍＬである。また、クエン酸およびその塩の濃度は、特に制限されず、例えば１～１０００ｍｇ／ｍＬである。
本実施形態のリン脂質含有物質安定化剤の温度は、特に制限されず、例えば、４～４０℃であればよい。
本実施形態のリン脂質含有物質安定化剤のｐＨは、特に制限されず、例えば２～１１の範囲で適宜選択できる。ｐＨは、酸（例えば、塩酸）および塩基（例えば、水酸化ナトリウム）を用いて適宜調整することができる。
本実施形態のリン脂質含有物質安定化剤の浸透圧は、特に制限されず、例えばＮａＣｌ濃度が１～２０００ｍＭに相当する浸透圧である。
なお、本実施形態において、リン脂質含有物質安定化剤は、固体のゲルの形態を含まない。
（リン脂質含有物質安定化剤の用途）
本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、後述の体液検査キットなどに加えて、培養細胞の保護、ｉＰＳ細胞の保存、生体から採取した細胞の保護、リポソーム製剤の保存、エクソソームの保存などに使用することができる。
本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、後述の体液検査キットなどに加えて、培養細胞の保護、ｉＰＳ細胞の保存、生体から採取した細胞の保護、リポソーム製剤の保存、エクソソームの保存などに使用することができる。
＜リン脂質含有物質安定化剤の調製方法＞
本発明のリン脂質含有物質安定化剤の調製方法は、特に制限されない。リン脂質含有物質安定化剤が溶液の形態の場合、上述の直線状分子、γＣｙＤ、溶媒および必要に応じてその他の成分を混合することで、リン脂質含有物質安定化剤を調製することができる。例えば、リン脂質含有物質安定化剤の調製方法としては、直線状分子を含む溶液とγＣｙＤを含む溶液とを混合する；γＣｙＤを含む溶液に直線状分子を添加して混合する；直線状分子を含む溶液にγＣｙＤを添加して混合する；直線状分子およびγＣｙＤを一括して溶媒に添加して混合する、などが挙げられる。
本発明のリン脂質含有物質安定化剤の調製方法は、特に制限されない。リン脂質含有物質安定化剤が溶液の形態の場合、上述の直線状分子、γＣｙＤ、溶媒および必要に応じてその他の成分を混合することで、リン脂質含有物質安定化剤を調製することができる。例えば、リン脂質含有物質安定化剤の調製方法としては、直線状分子を含む溶液とγＣｙＤを含む溶液とを混合する；γＣｙＤを含む溶液に直線状分子を添加して混合する；直線状分子を含む溶液にγＣｙＤを添加して混合する；直線状分子およびγＣｙＤを一括して溶媒に添加して混合する、などが挙げられる。
混合する際の温度は、特に制限されず、例えば４～４０℃程度であればよい。
＜体液検査キット＞
本発明の一形態は、上記リン脂質含有物質安定化剤を含む、体液検査キットである。
本発明の一形態は、上記リン脂質含有物質安定化剤を含む、体液検査キットである。
体液としては、例えば血液、尿、涙、唾液などが挙げられる。体液は、好ましくは血液である。
本発明の体液検査キットは、体液中のリン脂質含有物質（例えば、有核細胞）を保護するとの観点から、リン脂質含有物質安定化剤を体液１ｍＬあたり３～１３０ｍｇとなるように含むことが好ましく、６～１００ｍｇとなるように含むことがより好ましい。また、本発明の体液検査キットは、体液中のリン脂質含有物質（例えば、有核細胞）を保護するとの観点から、リン脂質含有物質安定化剤を、体液と直線状分子とγ－シクロデキストリンとの質量比（体液：直線状分子：γＣｙＤ）が１０００：２：１～１０００：１２５：５となるように含むことが好ましく、１０００：４：２～１０００：９５：５となるように含むことがより好ましい。
本発明の体液検査キットは、診断薬の分野、特にリキッドバイオプシーの分野において、好適に使用することができる。そのため、体液検査キットは、体液を収容する容器（例えば、採血管）を含んでもよい。この場合、リン脂質含有物質安定化剤は、体液を収容する容器に充填されていてもよく、体液を収容する容器とは別の容器に収容されていてもよい。
以下に具体例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。
［試薬等］
実施例では下記の化合物を用いた。試薬名と製品名が同一の場合は製品名を省略した。
実施例では下記の化合物を用いた。試薬名と製品名が同一の場合は製品名を省略した。
（１）直線状分子、およびシクロデキストリン
・ポリエチレングリコールＭｗ６，０００（三洋化成工業株式会社製）
・ポリエチレングリコールＭｗ３５，０００（ＣｈｅｍＣｒａｚ社製）
・ポリエチレングリコールＭｗ４０，０００（ＳＥＲＶＡ社製）
・ポリエチレングリコールＭｗ１００，０００（ＡｌｆａＡｅｓａｒ社製）
・ポリエチレングリコールＭｗ２００，０００（Ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・ポリプロピレングリコールＭｗ２，０００（Ｍｅｒｃｋ社製）
・ポリビニルアルコールＭｗ１，５００、けん化度７８～８２％（富士フイルム和光純薬社製）
・α－シクロデキストリン（αＣｙＤ）（日本食品化工株式会社製：セルデックス Ａ－１００）
・γ－シクロデキストリン（塩水港精糖株式会社製：デキシパール γ－１００）。
・ポリエチレングリコールＭｗ６，０００（三洋化成工業株式会社製）
・ポリエチレングリコールＭｗ３５，０００（ＣｈｅｍＣｒａｚ社製）
・ポリエチレングリコールＭｗ４０，０００（ＳＥＲＶＡ社製）
・ポリエチレングリコールＭｗ１００，０００（ＡｌｆａＡｅｓａｒ社製）
・ポリエチレングリコールＭｗ２００，０００（Ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・ポリプロピレングリコールＭｗ２，０００（Ｍｅｒｃｋ社製）
・ポリビニルアルコールＭｗ１，５００、けん化度７８～８２％（富士フイルム和光純薬社製）
・α－シクロデキストリン（αＣｙＤ）（日本食品化工株式会社製：セルデックス Ａ－１００）
・γ－シクロデキストリン（塩水港精糖株式会社製：デキシパール γ－１００）。
（２）溶媒
・滅菌水（ナカライテスク株式会社製）
・生理食塩液（テルモ株式会社製）。
・滅菌水（ナカライテスク株式会社製）
・生理食塩液（テルモ株式会社製）。
（３）その他試薬
・塩化ナトリウム（関東化学株式会社製）
・Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（富士フイルム和光純薬株式会社製）
・塩酸（ナカライテスク株式会社製：０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸）
・水酸化ナトリウム水溶液（ナカライテスク株式会社製：０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム）
・Ｐｙｒａｎｉｎｅ（東京化成工業株式会社製）
・ＤＰＸ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製：ｐ－ｘｙｌｅｎｅ－ｂｉｓ－ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）。
・塩化ナトリウム（関東化学株式会社製）
・Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（富士フイルム和光純薬株式会社製）
・塩酸（ナカライテスク株式会社製：０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸）
・水酸化ナトリウム水溶液（ナカライテスク株式会社製：０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム）
・Ｐｙｒａｎｉｎｅ（東京化成工業株式会社製）
・ＤＰＸ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製：ｐ－ｘｙｌｅｎｅ－ｂｉｓ－ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）。
［使用機器］
・遠心分離機（株式会社久保田製作所製：マイクロ冷却遠心機 ３７４０）
・蛍光分光光度計（日本分光株式会社製：ＦＰ－６５００）
・プレートリーダー（モレキュラーデバイスジャパン社製：ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５）
・ローテーター（アズワン株式会社製：ＡＴＲ２８０）
・サーモミキサーＣ（エッペンドルフ社製）
・ｐＨメーター（東亜ディーケーケー株式会社製：ＨＭ－５０Ｇ）。
・遠心分離機（株式会社久保田製作所製：マイクロ冷却遠心機 ３７４０）
・蛍光分光光度計（日本分光株式会社製：ＦＰ－６５００）
・プレートリーダー（モレキュラーデバイスジャパン社製：ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５）
・ローテーター（アズワン株式会社製：ＡＴＲ２８０）
・サーモミキサーＣ（エッペンドルフ社製）
・ｐＨメーター（東亜ディーケーケー株式会社製：ＨＭ－５０Ｇ）。
［試料の調製方法］
＜ＰＢＳ＞
ＰＢＳは、１０錠のＰＢＳ Ｔａｂｌｅｔｓ（タカラバイオ株式会社製）を１０００ｍＬの蒸留水に溶解して調製した。または、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ナカライテスク株式会社製）を使用した。
＜ＰＢＳ＞
ＰＢＳは、１０錠のＰＢＳ Ｔａｂｌｅｔｓ（タカラバイオ株式会社製）を１０００ｍＬの蒸留水に溶解して調製した。または、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ナカライテスク株式会社製）を使用した。
＜クエン酸緩衝液＞
クエン酸緩衝液は、５８．８ｍｇのクエン酸３Ｎａ（ナカライテスク株式会社製：クエン酸三ナトリウム二水和物）を１０ｍＬの滅菌水に溶した後、塩酸を用いてｐＨを７．４に調整して調製した。
クエン酸緩衝液は、５８．８ｍｇのクエン酸３Ｎａ（ナカライテスク株式会社製：クエン酸三ナトリウム二水和物）を１０ｍＬの滅菌水に溶した後、塩酸を用いてｐＨを７．４に調整して調製した。
＜トリス緩衝液＞
トリス緩衝液は、２４．２ｍｇのトリス（ナカライテスク株式会社製：トリス（ヒドロキシ）アミノメタン）を１０ｍＬの滅菌水に溶した後、塩酸を用いてｐＨを７．４に調整して調製した。
トリス緩衝液は、２４．２ｍｇのトリス（ナカライテスク株式会社製：トリス（ヒドロキシ）アミノメタン）を１０ｍＬの滅菌水に溶した後、塩酸を用いてｐＨを７．４に調整して調製した。
＜炭酸緩衝液＞
炭酸緩衝液は、２０ｍｇの炭酸ナトリウム（関東化学株式会社製）を１０ｍＬの滅菌水に溶した後、塩酸を用いてｐＨを７．４に調整して調製した。
炭酸緩衝液は、２０ｍｇの炭酸ナトリウム（関東化学株式会社製）を１０ｍＬの滅菌水に溶した後、塩酸を用いてｐＨを７．４に調整して調製した。
＜酢酸緩衝液＞
酢酸緩衝液は、１６．４ｍｇの酢酸ナトリウム（関東化学株式会社製）を１０ｍＬの滅菌水に溶した後、塩酸を用いてｐＨを７．４に調整して調製した。
酢酸緩衝液は、１６．４ｍｇの酢酸ナトリウム（関東化学株式会社製）を１０ｍＬの滅菌水に溶した後、塩酸を用いてｐＨを７．４に調整して調製した。
＜ＥＤＴＡ溶液＞
ＥＤＴＡ溶液は、ＥＤＴＡ濃度が１、５、１０、５０または１００ｍｇ／ｍＬとなるように、ＥＤＴＡ－２Ｎａ（ナカライテスク株式会社製：エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム）を生理食塩液に溶解して、調製した。
ＥＤＴＡ溶液は、ＥＤＴＡ濃度が１、５、１０、５０または１００ｍｇ／ｍＬとなるように、ＥＤＴＡ－２Ｎａ（ナカライテスク株式会社製：エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム）を生理食塩液に溶解して、調製した。
＜クエン酸溶液＞
クエン酸溶液は、クエン酸の濃度が１、１０、１００または１０００ｍｇ／ｍＬとなるように、クエン酸－３Ｎａ（ナカライテスク株式会社製：クエン酸三ナトリウム二水和物）を生理食塩液に溶解して、調製した。
クエン酸溶液は、クエン酸の濃度が１、１０、１００または１０００ｍｇ／ｍＬとなるように、クエン酸－３Ｎａ（ナカライテスク株式会社製：クエン酸三ナトリウム二水和物）を生理食塩液に溶解して、調製した。
＜ＭＥＳ緩衝液＞
ＭＥＳ緩衝液は、５３３ｍｇのＭＥＳ－Ｎａ（メルク社製）と７３３ｍｇのＮａＣｌとを秤量した後、滅菌水にて溶解し、塩酸にてｐＨを７．４に調整して調製した。
ＭＥＳ緩衝液は、５３３ｍｇのＭＥＳ－Ｎａ（メルク社製）と７３３ｍｇのＮａＣｌとを秤量した後、滅菌水にて溶解し、塩酸にてｐＨを７．４に調整して調製した。
＜ＴＥ緩衝液＞
ＴＥ緩衝液は、２０倍ＴＥ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製：２０×ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．５）を、滅菌水にて２０倍希釈して調製した。
ＴＥ緩衝液は、２０倍ＴＥ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製：２０×ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．５）を、滅菌水にて２０倍希釈して調製した。
＜ＳＹＴＯＸ溶液＞
ＳＹＴＯＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製：ＳＹＴＯＸ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）をＰＢＳにて１００倍希釈して、１０μＭのＳＹＴＯＸ溶液を調製した。
ＳＹＴＯＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製：ＳＹＴＯＸ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）をＰＢＳにて１００倍希釈して、１０μＭのＳＹＴＯＸ溶液を調製した。
＜１０％血清含有ＲＰＭＩメディウム＞
１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムは、ＲＰＭＩ培地（ナカライテスク株式会社製：ＲＰＭＩ１６４０培地（液体））に、抗生物質としてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔａｍｙｃｉｎ Ｍｉｘｅｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク株式会社製）をペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）となるように添加した後、ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社製：Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，Ｃｅｎｔｉｆｉｅｄ，Ｈｅａｔ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｅｄ，ＵＳ Ｏｒｉｇｉｎ）を添加して調製した。
１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムは、ＲＰＭＩ培地（ナカライテスク株式会社製：ＲＰＭＩ１６４０培地（液体））に、抗生物質としてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔａｍｙｃｉｎ Ｍｉｘｅｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク株式会社製）をペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）となるように添加した後、ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社製：Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，Ｃｅｎｔｉｆｉｅｄ，Ｈｅａｔ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｅｄ，ＵＳ Ｏｒｉｇｉｎ）を添加して調製した。
［リン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法］
溶媒は、滅菌水、ＰＢＳ、生理食塩液または上記で調製した緩衝液を使用した。
溶媒は、滅菌水、ＰＢＳ、生理食塩液または上記で調製した緩衝液を使用した。
＜Ｐｅｇ溶液の調製方法＞
Ｐｅｇを秤量した後、溶媒を用いて溶解して、Ｐｅｇ溶液を調製した。Ｐｅｇ溶液中のＰｅｇ濃度は、後述の試験例のリン脂質含有物質安定化剤または比較組成物の組成となるように適宜調整した。
Ｐｅｇを秤量した後、溶媒を用いて溶解して、Ｐｅｇ溶液を調製した。Ｐｅｇ溶液中のＰｅｇ濃度は、後述の試験例のリン脂質含有物質安定化剤または比較組成物の組成となるように適宜調整した。
＜ＣｙＤ溶液の調製方法＞
γＣｙＤを秤量した後、溶媒を用いて溶解して、γＣｙＤ溶液を調製した。γＣｙＤ溶液中のγＣｙＤ濃度は、後述の試験例のリン脂質含有物質安定化剤、比較組成物またはγＣｙＤ溶液の組成となるように適宜調整した。
γＣｙＤを秤量した後、溶媒を用いて溶解して、γＣｙＤ溶液を調製した。γＣｙＤ溶液中のγＣｙＤ濃度は、後述の試験例のリン脂質含有物質安定化剤、比較組成物またはγＣｙＤ溶液の組成となるように適宜調整した。
また、αＣｙＤを秤量した後、溶媒を用いて溶解して、αＣｙＤ溶液を調製した。αＣｙＤ溶液中のαＣｙＤ濃度は、後述の試験例のαＣｙＤ溶液の組成となるように適宜調整した。
＜リン脂質含有物質安定化剤の調製方法＞
上記で調製したＰｅｇ溶液とγＣｙＤ溶液とを混合した後、室温で一晩静置して、リン脂質含有物質安定化剤（可溶性）または比較組成物（固体）を調製した。所望の組成となるように、適宜溶媒を添加した。
上記で調製したＰｅｇ溶液とγＣｙＤ溶液とを混合した後、室温で一晩静置して、リン脂質含有物質安定化剤（可溶性）または比較組成物（固体）を調製した。所望の組成となるように、適宜溶媒を添加した。
［リン脂質含有物質安定化剤の調製方法２］
直線状分子と上記で調製したγＣｙＤ溶液とを混合した後、室温で一晩撹拌して、リン脂質含有物質安定化剤を調製した。
直線状分子と上記で調製したγＣｙＤ溶液とを混合した後、室温で一晩撹拌して、リン脂質含有物質安定化剤を調製した。
［血液］
血液として、体重４０～９０ｋｇのＳＰＦ家畜ブタ（株式会社サンエスブリーディングから購入）から採血した血液を使用した。採血は、テルモ株式会社における動物実験に関する指針に従って実施した。
血液として、体重４０～９０ｋｇのＳＰＦ家畜ブタ（株式会社サンエスブリーディングから購入）から採血した血液を使用した。採血は、テルモ株式会社における動物実験に関する指針に従って実施した。
［測定方法］
＜血液中への溶出ＤＮＡ量の測定方法＞
後述の試験例で得られた評価物に対して、１０００ｒｐｍの遠心を１０分間かけ、上清と沈殿物とに分離した。さらに、上清を３０μＬ回収した後、３０μＬのＳＹＴＯＸ溶液を添加し、５分間静置した。その後、上清とＳＹＴＯＸ溶液との混合液から２０μＬを採取し、２９８０μＬのＴＥ緩衝液中に添加し、蛍光強度を評価するサンプルとした。蛍光強度を、蛍光分光光度計を用いてＥｘ４４４ｎｍ、Ｅｍ４８０ｎｍにて測定して、血液中への溶出ＤＮＡ量を測定した。
＜血液中への溶出ＤＮＡ量の測定方法＞
後述の試験例で得られた評価物に対して、１０００ｒｐｍの遠心を１０分間かけ、上清と沈殿物とに分離した。さらに、上清を３０μＬ回収した後、３０μＬのＳＹＴＯＸ溶液を添加し、５分間静置した。その後、上清とＳＹＴＯＸ溶液との混合液から２０μＬを採取し、２９８０μＬのＴＥ緩衝液中に添加し、蛍光強度を評価するサンプルとした。蛍光強度を、蛍光分光光度計を用いてＥｘ４４４ｎｍ、Ｅｍ４８０ｎｍにて測定して、血液中への溶出ＤＮＡ量を測定した。
＜血液上清中のヘモグロビン吸光度の測定方法＞
後述の試験例で得られた評価物に対して、１０００ｒｐｍの遠心を１０分間かけ、上清と沈殿物とに分離した。上清を２０μＬ採取し、２９８０μＬのＴＥ緩衝液中に添加して、サンプルとした。プレートリーダーを用いて、５７６ｎｍの吸光度を測定することで、赤血球の破壊により血液上清中に溶出したヘモグロビン量を求めた。
後述の試験例で得られた評価物に対して、１０００ｒｐｍの遠心を１０分間かけ、上清と沈殿物とに分離した。上清を２０μＬ採取し、２９８０μＬのＴＥ緩衝液中に添加して、サンプルとした。プレートリーダーを用いて、５７６ｎｍの吸光度を測定することで、赤血球の破壊により血液上清中に溶出したヘモグロビン量を求めた。
＜上清中への溶出ＤＮＡ量の測定方法＞
後述の試験例で得られた評価物に対して、３０００ｒｐｍの遠心を１０分間かけ、上清と沈殿物とに分離した。さらに、上清を３０μＬ回収した後、３０μＬのＳＹＴＯＸ溶液を添加し、５分間静置した。その後、上清とＳＹＴＯＸ溶液との混合液から２０μＬを採取し、２９８０μＬのＴＥ緩衝液中に添加し、蛍光強度を評価するサンプルとした。蛍光強度を、蛍光分光光度計を用いてＥｘ４４４ｎｍ、Ｅｍ４８０ｎｍにて測定して、上清中への溶出ＤＮＡ量を測定した。
後述の試験例で得られた評価物に対して、３０００ｒｐｍの遠心を１０分間かけ、上清と沈殿物とに分離した。さらに、上清を３０μＬ回収した後、３０μＬのＳＹＴＯＸ溶液を添加し、５分間静置した。その後、上清とＳＹＴＯＸ溶液との混合液から２０μＬを採取し、２９８０μＬのＴＥ緩衝液中に添加し、蛍光強度を評価するサンプルとした。蛍光強度を、蛍光分光光度計を用いてＥｘ４４４ｎｍ、Ｅｍ４８０ｎｍにて測定して、上清中への溶出ＤＮＡ量を測定した。
＜リポソームからの溶出蛍光物質の測定方法＞
後述の試験例で得られた評価物を２０～４０μＬ採取した後、２９６０μＬのＭＥＳ緩衝液に添加した。その後、蛍光強度を、蛍光分光光度計を用いてＥｘ４１６、Ｅｍ５１２ｎｍにて測定して、リポソームからの蛍光物質の溶出量を測定した。
後述の試験例で得られた評価物を２０～４０μＬ採取した後、２９６０μＬのＭＥＳ緩衝液に添加した。その後、蛍光強度を、蛍光分光光度計を用いてＥｘ４１６、Ｅｍ５１２ｎｍにて測定して、リポソームからの蛍光物質の溶出量を測定した。
＜電気泳動によるＤＮＡ量の測定方法＞
後述の試験例で得られた評価物を遠心分離機を用いて４℃、１，９００×ｇで１０分間遠心した。遠心後、上清を３ｍＬ抜き取り、新しい１５ｍＬ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄ Ｔｕｂｅ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）に回収し、遠心分離機を用いて４℃、１６，０００×ｇで１０分間遠心した。遠心後、上清を２．４ｍＬ抜き取り、新しい１５ｍＬ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄ Ｔｕｂｅ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）に回収した。回収した上清にＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に付属のＭａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎを７２μＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを１３２μＬ、Ｂｅａｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを３６０μＬを加えて混合した。混合液をローテーターを用いて２０ｒｐｍで１０分間転倒混和した。遠心分離機で２００×ｇ、３０秒間遠心して、キャップに付いた液を落とした。その後、１５ｍＬ用磁気ラックにサンプルをセットして、３分間静置した。静置後、ピペットを用いて磁気ビーズ以外を全て除去した。磁気ビーズに２００μＬのＢｅａｄ Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを加え、ピペッティングして壁をすすぎながら液２００μＬを回収し、ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔに付属のＢｅａｄ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｔｕｂｅに移した。このＢｅａｄ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｔｕｂｅをサーモミキサーを用いて室温、３００ｒｐｍで５分間撹拌した。２ｍＬ用磁気ラックに撹拌後のＢｅａｄ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｔｕｂｅをセットした後、１分間静置した。その後、上清１８５μＬをＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔに付属の新しいＢｅａｄ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｔｕｂｅに回収した。回収した上清にＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔに付属のＢｕｆｆｅｒ ＡＣＢを３００μＬ添加し混合した。その混合液４６０μＬをＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔに付属のカラムチューブの中心に添加した。そのカラムチューブを遠心分離機を用いて４℃、６，０００×ｇで１分間遠心した。その後、カラムチューブのカラム部品をＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔに付属の新しい２ｍＬ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅに付け替えた。このカラムチューブにＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔに付属のＢｕｆｆｅｒ ＡＣＷ２を５００μＬ添加し、遠心分離機を用いて４℃、６，０００×ｇで１分間遠心した。その後、カラムチューブのカラム部品をＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔに付属の新しい２ｍＬ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅに付け替えた。このカラムチューブを遠心分離機を用いて４℃、２０，０００ｇで３分間遠心した。このカラムチューブのカラム部品をＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔに付属の新しい１．５ ｍＬ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅにセットし、フタを開けたままサーモミキサーにて５６℃で３分間静置して、カラムを完全に乾燥させた。乾燥させたカラムの中心にＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔに付属の滅菌水４０μＬを添加し、蓋を閉めて室温で１分間静置した。その後、遠心分離機を用いて室温下、２０，０００×ｇで１分間遠心した。遠心後に得られた液４μＬをＨｉｇｈＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ５０００用試薬（アジレント・テクノロジー株式会社製）４μＬと混合し、全自動ハイスループット電気泳動システム（アジレント・テクノロジー株式会社製：Ａｊｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ）を用いて液中に含有するＤＮＡ量を測定した。
後述の試験例で得られた評価物を遠心分離機を用いて４℃、１，９００×ｇで１０分間遠心した。遠心後、上清を３ｍＬ抜き取り、新しい１５ｍＬ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄ Ｔｕｂｅ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）に回収し、遠心分離機を用いて４℃、１６，０００×ｇで１０分間遠心した。遠心後、上清を２．４ｍＬ抜き取り、新しい１５ｍＬ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄ Ｔｕｂｅ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）に回収した。回収した上清にＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に付属のＭａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎを７２μＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを１３２μＬ、Ｂｅａｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを３６０μＬを加えて混合した。混合液をローテーターを用いて２０ｒｐｍで１０分間転倒混和した。遠心分離機で２００×ｇ、３０秒間遠心して、キャップに付いた液を落とした。その後、１５ｍＬ用磁気ラックにサンプルをセットして、３分間静置した。静置後、ピペットを用いて磁気ビーズ以外を全て除去した。磁気ビーズに２００μＬのＢｅａｄ Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを加え、ピペッティングして壁をすすぎながら液２００μＬを回収し、ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔに付属のＢｅａｄ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｔｕｂｅに移した。このＢｅａｄ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｔｕｂｅをサーモミキサーを用いて室温、３００ｒｐｍで５分間撹拌した。２ｍＬ用磁気ラックに撹拌後のＢｅａｄ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｔｕｂｅをセットした後、１分間静置した。その後、上清１８５μＬをＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔに付属の新しいＢｅａｄ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｔｕｂｅに回収した。回収した上清にＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔに付属のＢｕｆｆｅｒ ＡＣＢを３００μＬ添加し混合した。その混合液４６０μＬをＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔに付属のカラムチューブの中心に添加した。そのカラムチューブを遠心分離機を用いて４℃、６，０００×ｇで１分間遠心した。その後、カラムチューブのカラム部品をＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔに付属の新しい２ｍＬ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅに付け替えた。このカラムチューブにＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔに付属のＢｕｆｆｅｒ ＡＣＷ２を５００μＬ添加し、遠心分離機を用いて４℃、６，０００×ｇで１分間遠心した。その後、カラムチューブのカラム部品をＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔに付属の新しい２ｍＬ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅに付け替えた。このカラムチューブを遠心分離機を用いて４℃、２０，０００ｇで３分間遠心した。このカラムチューブのカラム部品をＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔに付属の新しい１．５ ｍＬ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅにセットし、フタを開けたままサーモミキサーにて５６℃で３分間静置して、カラムを完全に乾燥させた。乾燥させたカラムの中心にＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡ Ｋｉｔに付属の滅菌水４０μＬを添加し、蓋を閉めて室温で１分間静置した。その後、遠心分離機を用いて室温下、２０，０００×ｇで１分間遠心した。遠心後に得られた液４μＬをＨｉｇｈＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｄ５０００用試薬（アジレント・テクノロジー株式会社製）４μＬと混合し、全自動ハイスループット電気泳動システム（アジレント・テクノロジー株式会社製：Ａｊｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ）を用いて液中に含有するＤＮＡ量を測定した。
［試験例１］血液中の有核細胞を保護する効果の評価
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表１の組成のリン脂質含有物質安定化剤１－１～１－４および比較組成物１－５～１－９を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表１の組成のリン脂質含有物質安定化剤１－１～１－４および比較組成物１－５～１－９を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
上記で調製した各リン脂質含有物質安定化剤または各比較組成物と血液とを体積比にて１：１で混合し、２０℃にて１日、４日、７日または１４日間静置して評価物を得た。また、血液（未処置）を２０℃にて１日、４日、７日または１４日間静置して評価物を得た。
得られた評価物について、上述の血液中への溶出ＤＮＡ量の測定方法により、蛍光強度を測定して、血液中への溶出ＤＮＡ量を測定した。
結果を表１および図１に示す。表１に示す蛍光強度の値は、未処置（「Ｎｏ ｔｒｅａｔ」）の評価物の蛍光強度を１００とした場合の相対値である。
表１および図１に示すように、比較組成物１－６～１－８（γＣｙＤ単独）では、いずれの濃度においても未処置（Ｎｏ ｔｒｅａｔ）と同等の値を示しており、γＣｙＤ単独では有核細胞を保護する効果がないことが分かる。また、比較組成物１－５（Ｐｅｇ単独）も未処置と同等の値を示したことから、Ｐｅｇ単独では、有核細胞を保護する効果がないことが分かる。さらに、比較組成物１－９は、未処置よりも大きな値となり、有核細胞を破壊してしまうことが分かる。これは、比較組成物１－９において、Ｐｅｇに対するγＣｙＤの質量比が大きく、チキソトロピー性を有する固体のゲルが形成された（可溶性ではない）ため、ソフトマテリアルである細胞膜を物理的に破壊してしまったためと考えられる（図２）。
一方、リン脂質含有物質安定化剤１－１～１－４は、未処置および比較組成物よりも小さな値であり、ＰｅｇとγＣｙＤとを組み合わせて使用することにより、有核細胞を保護する効果を有することが分かる。
［試験例２］ＣｙＤ単独による血液中の有核細胞を保護する効果の評価
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表２の組成のＣｙＤ溶液２－１～２－１０を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表２の組成のＣｙＤ溶液２－１～２－１０を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
上記で調製した各ＣｙＤ溶液と血液とを体積比にて１：１で混合し、２０℃にて１４日間静置して評価物を得た。また、ＰＢＳで２５倍に希釈したＴｒｉｔｏｎＸ－１００またはＰＢＳと血液とを体積比にて１：１で混合し、２０℃にて１４日間静置して評価物を得た。さらに、血液（未処置）を２０℃にて１４日間静置して評価物を得た。
得られた評価物について、上述の血液中への溶出ＤＮＡ量の測定方法により、蛍光強度を測定して、血液中への溶出ＤＮＡ量を測定した。
結果を表２および図３に示す。表２に示す蛍光強度の値は、未処置（「Ｎｏ ｔｒｅａｔ」）の評価物の蛍光強度を１００とした場合の相対値である。
表２および図３に示すように、いずれの濃度においてもγＣｙＤは、ＰＢＳおよび未処置（Ｎｏ ｔｒｅａｔ）と同等の値を示し、血液中の有核細胞を保護する効果を有さないことが分かる。また、αＣｙＤにおいては、ＰＢＳおよび未処置を、やや上回る値となる蛍光を示した。αＣｙＤは、血液中の有核細胞を保護する効果を有していないのみならず、有核細胞を破壊する性質であることが分かる。
［試験例３］血液中の有核細胞を保護する効果に及ぼす、Ｐｅｇ重量平均分子量の影響、およびＰｅｇ濃度の影響の評価
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表３－１の組成のリン脂質含有物質安定化剤３－１～３－９、３－１３～３－２１、３－２５～３－３３、３－３７～３－４５および３－４９～３－５７ならびに３－１０～３－１２、３－２２～３－２４、３－３４～３－３６、３－４６～３－４８および３－５８～３－６０を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表３－１の組成のリン脂質含有物質安定化剤３－１～３－９、３－１３～３－２１、３－２５～３－３３、３－３７～３－４５および３－４９～３－５７ならびに３－１０～３－１２、３－２２～３－２４、３－３４～３－３６、３－４６～３－４８および３－５８～３－６０を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
上記で調製した各リン脂質含有物質安定化剤または各比較組成物と血液とを体積比にて１：１で混合し、３０℃にて１４日間静置して評価物を得た。
得られた評価物について、上述の血液中への溶出ＤＮＡ量の測定方法により、蛍光強度を測定して、血液中への溶出ＤＮＡ量を測定した。
結果を表３－１および表３－２ならびに図４に示す。表３－１に示す蛍光強度の値は、各比較組成物の評価物の蛍光強度を１００とした場合の相対値である。表３－２に示す蛍光強度の値は、未処置（「Ｎｏ ｔｒｅａｔ」）の評価物の蛍光強度を１００とした場合の相対値である。図４は、リン脂質含有物質安定化剤の評価物の蛍光強度を示す。
表３－１に示すように、重量平均分子量が６０００、３５０００、４００００、１０万または２０万であるＰｅｇを用いた場合、リン脂質含有物質安定化剤中のγＣｙＤの濃度が４６．４ｍｇ／ｍＬ、１１．６ｍｇ／ｍＬおよび２．９ｍｇ／ｍＬのいずれであっても、溶出ＤＮＡ量は、比較組成物（Ｐｅｇ単独）と比べて小さな値を示した。
また、リン脂質含有物質安定化剤中のＰｅｇの濃度が４０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬおよび８０ｍｇ／ｍＬのいずれであっても、溶出ＤＮＡ量は、比較組成物と比べて小さな値を示した。
これらのことから、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、ＰｅｇおよびγＣｙＤを含むことにより、Ｐｅｇ単独と比べて、血液中の有核細胞を保護する効果を増強できることが分かる。
また、表３－２および図４に示すように、溶出ＤＮＡ量は、Ｐｅｇの濃度を高くするにつれて小さな値を示した。よって、リン脂質含有物質安定化剤の有核細胞を保護する効果は、リン脂質含有物質安定化剤中のＰｅｇ濃度を高くすることで、より高くできることが分かる。
［試験例４］赤血球を保護する効果の評価
＜リン脂質含有物質安定化剤の調製＞
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表４の組成のリン脂質含有物質安定化剤４－１～４－３、４－６～４－８、４－１１～４－１３、４－１６～４－１８および４－２１～４－２３ならびに比較組成物４－４、４－５、４－９、４－１０、４－１４、４－１５、４－１９、４－２０、４－２４および４－２５を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
＜リン脂質含有物質安定化剤の調製＞
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表４の組成のリン脂質含有物質安定化剤４－１～４－３、４－６～４－８、４－１１～４－１３、４－１６～４－１８および４－２１～４－２３ならびに比較組成物４－４、４－５、４－９、４－１０、４－１４、４－１５、４－１９、４－２０、４－２４および４－２５を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
上記で調製した各リン脂質含有物質安定化剤または各比較組成物と血液とを体積比にて１：１で混合し、３０℃にて１４日間静置して評価物を得た。また、血液（未処置）を２０℃にて１４日間静置して評価物を得た。
得られた評価物について、上述の血液上清中のヘモグロビン吸光度の測定方法により、吸光度を測定して、赤血球の破壊により血液上清中に溶出したヘモグロビン量を求めた。
結果を表４および図５に示す。表４に示す吸光度の値は、未処置（「Ｎｏ ｔｒｅａｔ」）の評価物の吸光度を１００とした場合の相対値である。
表４および図５に示すように、リン脂質含有物質安定化剤および比較組成物（Ｐｅｇのみを含む）は、未処置（Ｎｏ ｔｒｅａｔ）よりも小さい値を示した。すなわち、これらは赤血球を保護する効果を有していることが分かる。
リン脂質含有物質安定化剤と比較組成物（Ｐｅｇのみを含む）とを比較すると、リン脂質含有物質安定化剤は、比較組成物（Ｐｅｇのみを含む）よりも、小さい値を示した。このことから、ＰｅｇとγＣｙＤとを組み合わせて使用することにより、Ｐｅｇ単独と比較して、赤血球を保護する効果をより高くすることが分かる。
なお、チキソトロピー性を有する固体のゲルである比較組成物４－５、４－１０、４－１５、４－２０および４－２５は、比較組成物（Ｐｅｇのみを含む）よりも、大きな値を示した。このことから、Ｐｅｇに対するγＣｙＤの質量比が所定の値より大きい場合、Ｐｅｇ単独に比べて、赤血球を保護する効果が低いことが分かる。
［試験例５］血液中の細胞に対して、増強された保護効果を有するリン脂質含有物質安定化剤の組成の検討
試験例１、３および４において、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、Ｐｅｇ単独と比べて有核細胞および赤血球を保護する効果がより高いことが確認された。また、本発明のリン脂質含有物質安定化剤の保護効果は、リン脂質含有物質安定化剤中のＰｅｇ濃度を高めることで、増大することも明らかとなった。そのため、試験例５では、リン脂質含有物質安定化剤の組成について、さらなる検討を行った。
試験例１、３および４において、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、Ｐｅｇ単独と比べて有核細胞および赤血球を保護する効果がより高いことが確認された。また、本発明のリン脂質含有物質安定化剤の保護効果は、リン脂質含有物質安定化剤中のＰｅｇ濃度を高めることで、増大することも明らかとなった。そのため、試験例５では、リン脂質含有物質安定化剤の組成について、さらなる検討を行った。
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表５の組成のリン脂質含有物質安定化剤５－１～５－４６を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
上記で調製した各リン脂質含有物質安定化剤と血液とを体積比にて１：９で混合し、３０℃にて７日間静置して評価物を得た。
得られた評価物について、上述の血液中への溶出ＤＮＡ量の測定方法により、蛍光強度を測定して、血液中への溶出ＤＮＡ量を測定した。
結果を表５および図６に示す。表５および図６に示す蛍光強度の値は、リン脂質含有物質安定化剤５－１の評価物の蛍光強度を１００とした場合の相対値である。
表５および図６に示すように、リン脂質含有物質安定化剤中のＰｅｇの濃度を高めるほど、溶出ＤＮＡ量を示す値は小さくなり、より強力に血液中の有核細胞を保護できることが分かる。
［試験例６］リン脂質含有物質安定化剤と血液との混合比率の検討－１
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表６の組成のリン脂質含有物質安定化剤６－１および比較組成物６－２を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表６の組成のリン脂質含有物質安定化剤６－１および比較組成物６－２を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
上記で調製したリン脂質含有物質安定化剤または比較組成物と血液とを体積比にて１：１、１：２、１：４、１：７または１：１９で混合し、３０℃にて７日間静置して評価物を得た。また、ＰＢＳと血液とを体積比にて１：１、１：２、１：４、１：７または１：１９で混合し、３０℃にて７日間静置して評価物を得た。
得られた評価物について、上述の血液中への溶出ＤＮＡ量の測定方法により、蛍光強度を測定して、血液中への溶出ＤＮＡ量を測定した。
結果を表６および図７に示す。表６に示す蛍光強度の値は、ＰＢＳの評価物の蛍光強度を１００とした場合の相対値である。
表６および図７に示すように、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、血液との混合比１：１～１：１９（リン脂質含有物質安定化剤：血液）において、比較組成物およびＰＢＳよりも小さい値を示し、有核細胞を保護する増強された効果を有することが分かる。
［試験例７］リン脂質含有物質安定化剤と血液との混合比率の検討－２
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表７の組成のリン脂質含有物質安定化剤７－１～７－４および比較組成物７－５～７－８を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表７の組成のリン脂質含有物質安定化剤７－１～７－４および比較組成物７－５～７－８を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
上記で調製した各リン脂質含有物質安定化剤または各比較組成物と血液とを体積比にて１：１、１：２、１：４、１：８、１：１６または１：３２で混合し、３０℃にて７日間静置して評価物を得た。また、ＰＢＳと血液とを体積比にて１：１、１：２、１：４、１：８、１：１６または１：３２で混合し、３０℃にて７日間静置して評価物を得た。
得られた評価物について、上述の血液中への溶出ＤＮＡ量の測定方法により、蛍光強度を測定して、血液中への溶出ＤＮＡ量を測定した。
結果を表７および図８に示す。表７に示す蛍光強度の値は、ＰＢＳの評価物の蛍光強度を１００とした場合の相対値である。
表７および図８に示すように、リン脂質含有物質安定化剤７－１～７－４は、血液との混合比１：１～１：１９（リン脂質含有物質安定化剤：血液）において、血液中の有核細胞を保護する効果を有することが分かる。
また、リン脂質含有物質安定化剤中のＰｅｇおよびＣｙＤの濃度を増大させることで、溶出ＤＮＡ量を低く抑えることができ、血液中の有核細胞をより強力に保護可能であることが分かる。
［試験例８］リン脂質含有物質安定化剤の保護効果に及ぼす、溶媒の影響の評価
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、異なる溶媒を使用した下記表８の組成のリン脂質含有物質安定化剤８－１および比較組成物８－２～８－３を調製した。溶媒は、滅菌水、ＰＢＳ、生理食塩液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液または酢酸緩衝液を使用した。
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、異なる溶媒を使用した下記表８の組成のリン脂質含有物質安定化剤８－１および比較組成物８－２～８－３を調製した。溶媒は、滅菌水、ＰＢＳ、生理食塩液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液または酢酸緩衝液を使用した。
上記で調製したリン脂質含有物質安定化剤または各比較組成物と血液とを体積比にて１：９で混合し、３０℃にて１４日間静置して評価物を得た。
得られた評価物について、上述の血液中への溶出ＤＮＡ量の測定方法により、蛍光強度を測定して、血液中への溶出ＤＮＡ量を測定した。
結果を表８および図９に示す。表８に示す蛍光強度の値は、滅菌水を使用した比較組成物８－２の評価物の蛍光強度を１００とした場合の相対値である。
表８および図９に示すように、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、調整に用いる溶媒に影響されることなく、いずれの溶媒を用いた場合においても高い保護効果を発現することが分かる。
［試験例９］ｐＨの影響の評価
＜リン脂質含有物質安定化剤の調製＞
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表９の組成のリン脂質含有物質安定化剤９－１および比較組成物９－２～９－３を調製した。その後、リン脂質含有物質安定化剤および比較組成物は、塩酸または水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを２、３、４、６、９、１０または１１に調整した。溶媒は、生理食塩液を使用した。
＜リン脂質含有物質安定化剤の調製＞
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表９の組成のリン脂質含有物質安定化剤９－１および比較組成物９－２～９－３を調製した。その後、リン脂質含有物質安定化剤および比較組成物は、塩酸または水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを２、３、４、６、９、１０または１１に調整した。溶媒は、生理食塩液を使用した。
上記で調製したリン脂質含有物質安定化剤または各比較組成物と血液とを体積比にて１：９で混合し、３０℃にて１４日間静置して評価物を得た。また、ｐＨ６．０に調整した生理食塩液と血液とを体積比にて１：９で混合し、３０℃にて１４日間静置して評価物を得た。
得られた評価物について、上述の血液中への溶出ＤＮＡ量の測定方法により、蛍光強度を測定して、血液中への溶出ＤＮＡ量を測定した。
結果を表９および図１０に示す。表９に示す蛍光強度の値は、生理食塩液の評価物の蛍光強度を１００とした場合の相対値である。
表９および図１０に示すように、ｐＨ２～１１のいずれにおいても、リン脂質含有物質安定化剤９－１は、比較組成物（Ｐｅｇ単独またはγＣｙＤ単独）よりもＤＮＡの溶出を低く抑えたことが分かる。したがって、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、調製時のｐＨに影響されることなく、有核細胞を保護する高い効果を発現することが分かる。
［試験例１０］浸透圧の影響の評価
＜リン脂質含有物質安定化剤の調製＞
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、異なる濃度のＮａＣｌを含む下記表１０の組成のリン脂質含有物質安定化剤１０－１および比較組成物１０－２～１０－３を調製した。溶媒は、滅菌水または塩化ナトリウム（２００、５００または１０００ｍＭ）を含む生理食塩液を使用した。
＜リン脂質含有物質安定化剤の調製＞
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、異なる濃度のＮａＣｌを含む下記表１０の組成のリン脂質含有物質安定化剤１０－１および比較組成物１０－２～１０－３を調製した。溶媒は、滅菌水または塩化ナトリウム（２００、５００または１０００ｍＭ）を含む生理食塩液を使用した。
上記で調製したリン脂質含有物質安定化剤または各比較組成物と血液とを体積比にて１：９で混合し、３０℃にて１４日間静置して評価物を得た。
得られた評価物について、上述の血液中への溶出ＤＮＡ量の測定方法により、蛍光強度を測定して、血液中への溶出ＤＮＡ量を測定した。
結果を表１０および図１１に示す。表１０に示す蛍光強度の値は、滅菌水を用いて調製した比較組成物１０－２（ＮａＣｌ濃度：０ｍＭ）の評価物の蛍光強度を１００とした場合の相対値である。
表１０および図１１に示すように、２００～１０００ｍＭのＮａＣｌ濃度に相当する浸透圧であっても、リン脂質含有物質安定化剤１０－１は、比較組成物（Ｐｅｇ単独またはγＣｙＤ単独）よりもＤＮＡの溶出を低く抑えたことが分かる。したがって、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、少なくとも１０００ｍＭのＮａＣｌ濃度に相当する浸透圧において、有核細胞を保護する高い効果を発現することが分かる。
［試験例１１］調製時の温度の影響の評価
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表１１の組成のリン脂質含有物質安定化剤１１－１および比較組成物１１－２～１１－３を、異なる温度で調製した。リン脂質含有物質安定化剤は、室温の代わりに４℃、２０℃または４０℃で一晩静置して調製した。また、比較組成物は、４℃、２０℃または４０℃となるように調製した。溶媒は、生理食塩液を使用した。
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表１１の組成のリン脂質含有物質安定化剤１１－１および比較組成物１１－２～１１－３を、異なる温度で調製した。リン脂質含有物質安定化剤は、室温の代わりに４℃、２０℃または４０℃で一晩静置して調製した。また、比較組成物は、４℃、２０℃または４０℃となるように調製した。溶媒は、生理食塩液を使用した。
上記で調製した各リン脂質含有物質安定化剤または各比較組成物と血液とを体積比にて１：９で混合し、３０℃にて１４日間静置して評価物を得た。
得られた評価物について、上述の血液中への溶出ＤＮＡ量の測定方法により、蛍光強度を測定して、血液中への溶出ＤＮＡ量を測定した。
結果を表１１および図１２に示す。表１１に示す蛍光強度の値は、２０℃の比較組成物１１－２の評価物の蛍光強度を１００とした場合の相対値である。
表１１および図１２に示すように、調製時の温度が４～４０℃であっても、リン脂質含有物質安定化剤１１－１は、比較組成物（Ｐｅｇ単独またはγＣｙＤ単独）よりもＤＮＡの溶出を低く抑えたことが分かる。したがって、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、調製時の温度に影響されることなく、４～４０℃において、有核細胞を保護する高い効果を発現することが分かる。
［試験例１２］ＥＤＴＡ濃度の影響の評価
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表１２の組成のリン脂質含有物質安定化剤１２－１～１２－６および比較組成物１２－７～１２－１８を調製した。溶媒は、滅菌水またはＥＤＴＡ溶液（ＥＤＴＡ濃度：１、５、１０、５０または１００ｍｇ／ｍＬ）を使用した。
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表１２の組成のリン脂質含有物質安定化剤１２－１～１２－６および比較組成物１２－７～１２－１８を調製した。溶媒は、滅菌水またはＥＤＴＡ溶液（ＥＤＴＡ濃度：１、５、１０、５０または１００ｍｇ／ｍＬ）を使用した。
また、滅菌水およびＥＤＴＡ溶液（ＥＤＴＡ濃度：１、５、１０、５０または１００ｍｇ／ｍＬ）を比較組成物１２－１９～１２－２４とした。
上記で調製したリン脂質含有物質安定化剤または各比較組成物と血液とを体積比にて１：９で混合し、３０℃にて７日間静置して評価物を得た。なお、使用した血液は、採血管ではなくシリンジを用いて採取し、ＥＤＴＡが含まれないよう留意した。
得られた評価物について、上述の血液中への溶出ＤＮＡ量の測定方法により、蛍光強度を測定して、血液中への溶出ＤＮＡ量を測定した。
各ＥＤＴＡ濃度での結果を表１２および図１３に示す。表１２に示す蛍光強度の値は、比較組成物１２－７～１２－１２の評価物の蛍光強度をそれぞれ１００とした場合の相対値である。
ＥＤＴＡは、血液の抗凝固剤として多用されている。
表１２および図１３に示すように、１～１００ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ濃度においても、リン脂質含有物質安定化剤は、比較組成物（γＣｙＤ単独およびＰｅｇ単独）よりも低い値を示し、ＤＮＡの溶出を低く抑えたことがわかる。したがって、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、ＥＤＴＡの濃度に関わらず、有核細胞を保護する高い効果を有することが分かる。
［試験例１３］クエン酸濃度の影響の評価
＜リン脂質含有物質安定化剤の調製＞
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表１３の組成のリン脂質含有物質安定化剤１３－１～１３－４および比較組成物１３－５～１３－１２を調製した。溶媒は、クエン酸溶液（クエン酸濃度：１、１０、１００または１０００ｍｇ／ｍＬ）を使用した。
＜リン脂質含有物質安定化剤の調製＞
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表１３の組成のリン脂質含有物質安定化剤１３－１～１３－４および比較組成物１３－５～１３－１２を調製した。溶媒は、クエン酸溶液（クエン酸濃度：１、１０、１００または１０００ｍｇ／ｍＬ）を使用した。
また、クエン酸溶液（クエン酸濃度：１、１０、１００または１０００ｍｇ／ｍＬ）を比較組成物１３－１３～１３－１６とした。
上記で調製した各リン脂質含有物質安定化剤または各比較組成物と血液とを体積比にて１：９で混合し、３０℃にて７日間静置して評価物を得た。
得られた評価物について、上述の血液中への溶出ＤＮＡ量の測定方法により、蛍光強度を測定して、血液中への溶出ＤＮＡ量を測定した。
各クエン酸濃度での結果を表１３および図１４に示す。表１３に示す蛍光強度の値は、比較組成物１２－５～１２－８の評価物の蛍光強度をそれぞれ１００とした場合の相対値である。
クエン酸は、血液の抗凝固剤として多用されている。
表１３および図１４に示すように、１～１０００ｍｇ／ｍＬのクエン酸濃度においても、リン脂質含有物質安定化剤は、比較組成物（γＣｙＤ単独およびＰｅｇ単独）よりも低い値を示し、ＤＮＡの溶出を低く抑えたことが分かる。したがって、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、クエン酸の濃度に関わらず、有核細胞を保護する高い効果を有することが分かる。
［試験例１４］外部負荷の影響の評価
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表１４の組成のリン脂質含有物質安定化剤１４－１および比較組成物１４－２～１４－３を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表１４の組成のリン脂質含有物質安定化剤１４－１および比較組成物１４－２～１４－３を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
上記で調製したリン脂質含有物質安定化剤、各比較組成物または滅菌水と血液とを体積比にて１：９で混合し、（Ａ）振動に対する評価の場合、振動試験機（アズワン株式会社製：Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ Ｖｉｂｒａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔｅｒ ＣＶ－１０１Ｍ）を用いて、スイープモード、１０～１００Ｈｚ、加速度２Ｇ、の振動を３、５または２４時間、３０℃にて加えて、評価物を得た；および（Ｂ）衝撃に対する評価の場合、振とう機（タイテック株式会社製：ＢｉｏＳｎａｋｅｒ ＶＢＲ－３６）を用いて、４５０ｒｐｍ、０～３時間、３０℃にて加えて、評価物を得た。
得られた評価物について、上述の血液中への溶出ＤＮＡ量の測定方法により、蛍光強度を測定して、血液中への溶出ＤＮＡ量を測定した。
結果を表１４ならびに図１５（振動）および図１６（衝撃）に示す。表１４に示す蛍光強度の値は、滅菌水を添加した評価物の蛍光強度を１００とした場合の相対値である。
（振動に対する評価）
表１４および図１５に示すように、リン脂質含有物質安定化剤１４－１は、比較組成物１４－２および１４－３（Ｐｅｇ単独およびγＣｙＤ単独）よりも低い値を示し、ＤＮＡの溶出を低く抑えたことが分かる。したがって、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、振動の外部負荷から、有核細胞を保護する高い効果を有することが分かる。
表１４および図１５に示すように、リン脂質含有物質安定化剤１４－１は、比較組成物１４－２および１４－３（Ｐｅｇ単独およびγＣｙＤ単独）よりも低い値を示し、ＤＮＡの溶出を低く抑えたことが分かる。したがって、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、振動の外部負荷から、有核細胞を保護する高い効果を有することが分かる。
（衝撃に対する評価）
表１４および図１６に示すように、リン脂質含有物質安定化剤１４－１は、比較組成物１４－２および１４－３（Ｐｅｇ単独およびγＣｙＤ単独）よりも低い値を示し、ＤＮＡの溶出を低く抑えたことが分かる。したがって、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、衝撃の外部負荷から、有核細胞を保護する高い効果を有することが分かる。
表１４および図１６に示すように、リン脂質含有物質安定化剤１４－１は、比較組成物１４－２および１４－３（Ｐｅｇ単独およびγＣｙＤ単独）よりも低い値を示し、ＤＮＡの溶出を低く抑えたことが分かる。したがって、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、衝撃の外部負荷から、有核細胞を保護する高い効果を有することが分かる。
［試験例１５］培養細胞を保護する効果の評価
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表１５の組成のリン脂質含有物質安定化剤１５－１および比較組成物１５－２～１５－３を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表１５の組成のリン脂質含有物質安定化剤１５－１および比較組成物１５－２～１５－３を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
培養細胞は、ＡＴＣＣより購入したＥＧ７細胞を使用した。ＥＧ７細胞の培養は、１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを用いて行った。また、ＥＧ７細胞の培養は、５％ＣＯ２、３７℃に設定したインキュベーター（ＭＣＯ２０ＡＩＣ、三菱電機エンジニアリング株式会社製）を用いて実施した。
培養したＥＧ７細胞を回収した後、ＰＢＳにて２回洗浄した。その後、細胞の密度が２０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、ＰＢＳを用いて細胞を分散させ、細胞懸濁液を得た。
上記で調製したリン脂質含有物質安定化剤または各比較組成物と細胞懸濁液とを体積比にて１：１で混合し、３０℃にて１または５時間静置して、評価物を得た。また、細胞懸濁液（未処置）を３０℃にて１または５時間静置して、評価物を得た。
得られた評価物について、上述の上清中への溶出ＤＮＡ量の測定方法により、蛍光強度を測定して、上清中への溶出ＤＮＡ量を測定した。
結果を表１５および図１７に示す。表１５に示す蛍光強度の値は、未処置（「Ｃｅｌｌ ｏｎｌｙ」）の評価物の蛍光強度を１００とした場合の相対値である。
表１５および図１７に示すように、リン脂質含有物質安定化剤１５－１は、未処置および比較組成物よりも低い値を示し、培養細胞の破壊に伴うＤＮＡの遊離が少ないことが分かる。したがって、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、培養細胞を保護する高い効果を有することが分かる。また、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、細胞治療、ｉＰＳ細胞の保存などへの応用が期待できる。
［試験例１６］リポソームを保護する効果の評価
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表１６の組成のリン脂質含有物質安定化剤１６－１～１６－２および比較組成物１６－３～１６－４を調製した。溶媒は、生理食塩水を使用した。
上述のリン脂質含有物質安定化剤および比較組成物の調製方法により、下記表１６の組成のリン脂質含有物質安定化剤１６－１～１６－２および比較組成物１６－３～１６－４を調製した。溶媒は、生理食塩水を使用した。
クロロホルム（富士フイルム和光純薬株式会社製）に溶解させた３０００ｎｍｏｌのＥＹＰＣ（卵黄ホスファチジルコリン）（日油株式会社製：ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＣ－５０）を１０ｍＬナスフラスコに測り入れ、ロータリーエバポレーターを用いて薄膜とした。５００μＬのＰｙｒａｎｉｎｅ溶液（Ｐｙｒａｎｉｎｅ：３５ｍＭ、ＤＰＸ：５０ｍＭ、ＭＥＳ：２５ｍＭ、ｐＨ７．４）を加えた後、超音波照射装置（ＵＳＣ－Ｊ）を用いて分散させた。さらに、分散液をエクストルーダーによって孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜に通し、粒子径を揃えた。ＭＥＳ緩衝液とＧ１００カラムを用いて外水層の置換を行い、蛍光物質であるＰｙｒａｉｎｅを内包したＥＹＰＣリポソーム分散液を得た。その後、リン脂質Ｃ－テストワコー（富士フイルム和光純薬株式会社）を用いてリン脂質の濃度を求め、リン脂質が１．０ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＭＥＳ緩衝液にて濃度を調整して、リポソーム懸濁液を調製した。
上記で調製したリン脂質含有物質安定化剤または各比較組成物とリポソーム懸濁液とを体積比にて１：１で混合して、混合液を得た。
高浸透圧負荷の実験では、混合液と４０００ｍＭのＮａＣｌ溶液とを体積比にて１：１で混合し、３０℃にて１時間静置して、評価物を得た。また、リポソーム懸濁液（未処置）を３０℃にて１時間静置して、評価物を得た。
熱負荷の実験では、混合液を３０℃にて２時間、４時間、３日、７日または１４日静置して、評価物を得た。また、リポソーム懸濁液（未処置）を３０℃にて２時間、４時間、３日、７日または１４日静置して、評価物を得た。
得られた評価物について、上述のリポソームからの溶出蛍光物質の測定方法により、蛍光強度を測定して、リポソームからの蛍光物質の溶出量を測定した。
結果を表１６ならびに図１８（高浸透圧負荷）および図１９（熱負荷）に示す。表１６に示す蛍光強度の値は、未処置（「ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｏｎｌｙ」）の評価物の蛍光強度を１００とした場合の相対値である。
表１６ならびに図１８および図１９に示すように、リン脂質含有物質安定化剤１６－１は、比較組成物１６－３および１６－４（Ｐｅｇ単独およびγＣｙＤ単独）よりも低い値を示し、リポソームからの蛍光物質の溶出を低く抑えたことが分かる。したがって、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、リポソームを保護する高い効果を有し、さらに高浸透圧負荷および熱負荷からもリポソームを保護する高い効果を有することが分かる。
［試験例１７］電気泳動によるＤＮＡ量の測定
上述のリン脂質含有物質安定化剤の調製方法２および比較組成物の調製方法により、下記表１７の組成のリン脂質含有物質安定化剤１７－１～１７－７および比較組成物１７－８～１７－９を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
上述のリン脂質含有物質安定化剤の調製方法２および比較組成物の調製方法により、下記表１７の組成のリン脂質含有物質安定化剤１７－１～１７－７および比較組成物１７－８～１７－９を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
リン脂質含有物質安定化剤または比較組成物０．８６ｍＬを採血管に加えた。その採血管に血液６ｍＬを加え、栓をした後転倒混和した。転倒混和したサンプルを２５℃の恒温槽に入れ、７日間保管して、評価物とした。
また、０．９ｗ／ｖ％の生理食塩液（参考組成物１７－１０）０．８６ｍＬを採血管に加えた。その採血管に血液６ｍＬを加え、栓をした後転倒混和した。転倒混和したサンプルを４℃の恒温槽に入れ、７日間保管して、評価物とした。
得られた評価物について、上述の電気泳動によるＤＮＡ量の測定方法により、ＤＮＡ量を測定した。
結果を図２０および表１７に示す。図２０の横軸はＤＮＡの塩基対数、図２０の縦軸はＤＮＡ量を示す。また、図２０中の１５ｂｐおよび１０，０００ｂｐのピークは、それぞれＬｏｗｅｒマーカーおよびＵｐｐｅｒマーカーを意味し、ＤＮＡのピークではない。
図２０に示すように、リン脂質含有物質安定化剤１７－１のピーク高さは、比較組成物１７－８および１７－９よりも低かった。よって、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、白血球由来のＤＮＡの放出を抑制できることが分かる。
また、表１７に示すように、リン脂質含有物質安定化剤１７－５～１７－７を使用した場合のＤＮＡ量は、４℃で保管した参考組成物１７－１０を使用した場合のＤＮＡ量よりも低かった。よって、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、白血球由来のＤＮＡの放出を抑制できることが分かる。
［試験例１８］赤血球を保護する効果の評価
＜リン脂質含有物質安定化剤の調製＞
上述のリン脂質含有物質安定化剤の調製方法２および比較組成物の調製方法により、下記表１８の組成のリン脂質含有物質安定化剤１８－１および１８－３ならびに比較組成物１８－２および１８－４を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
＜リン脂質含有物質安定化剤の調製＞
上述のリン脂質含有物質安定化剤の調製方法２および比較組成物の調製方法により、下記表１８の組成のリン脂質含有物質安定化剤１８－１および１８－３ならびに比較組成物１８－２および１８－４を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。
上記で調製した各リン脂質含有物質安定化剤または各比較組成物と血液とを体積比にて１：１で混合し、２５℃にて７日間静置して評価物を得た。また、血液（未処置）を４℃にて７日間静置して評価物を得た。
得られた評価物について、上述の血液上清中のヘモグロビン吸光度の測定方法により、吸光度を測定して、赤血球の破壊により血液上清中に溶出したヘモグロビン量を求めた。
結果を表１８に示す。
表１８に示すように、リン脂質含有物質安定化剤１８－１および１８－３は、それぞれ比較組成物１８－２（ＰＰＧのみ）および１８－４（ＰＶＡのみ）よりも小さい値を示した。このことから、直線状分子とγＣｙＤとを組み合わせて使用することにより、直線状分子単独と比較して、赤血球を保護する効果をより高くすることが分かる。
［試験例１９］エクソソームを保護する効果の評価
上述のリン脂質含有物質安定化剤の調製方法２および比較組成物の調製方法により、下記表１９の組成のリン脂質含有物質安定化剤１９－１および比較組成物１９－２（滅菌水のみ）を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。また、３０μｇのＬｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｌａｓｍａ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈｙ ｄｏｎｏｒｓ（ＨａｎｓａＢｉｏＭｅｄ社製）を滅菌水１００μＬで希釈した。これをエクソソーム溶液とした。
上述のリン脂質含有物質安定化剤の調製方法２および比較組成物の調製方法により、下記表１９の組成のリン脂質含有物質安定化剤１９－１および比較組成物１９－２（滅菌水のみ）を調製した。溶媒は、滅菌水を使用した。また、３０μｇのＬｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｌａｓｍａ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈｙ ｄｏｎｏｒｓ（ＨａｎｓａＢｉｏＭｅｄ社製）を滅菌水１００μＬで希釈した。これをエクソソーム溶液とした。
上記で調製したリン脂質含有物質安定化剤または比較組成物とエクソソーム溶液とを体積比にて１：１で混合した。これらを２ｍＬのポリプロピレン製チューブに８０μＬ加えた。その後、３分間撹拌し、新しい２ｍＬのポリプロピレン製チューブに全量移した。これを２０回まで繰り返した。その後、ＣＤ９／ＣＤ６３ Ｅｘｏｓｏｍｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ，Ｈｕｍａｎ（コスモ・バイオ株式会社製）を用いて残存するエクソソーム量を定量した。
結果を表１９に示す。
表１９に示すように、リン脂質安定化剤は、比較組成物よりも大きな値を示した。このことから、本発明のリン脂質含有物質安定化剤は、エクソソームを保護する高い効果を有することが分かる。
Claims (8)
- 直線状分子とγ－シクロデキストリンとを含み、前記直線状分子に対する前記γ－シクロデキストリンの質量比が９未満であり、
前記直線状分子がポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびポリビニルアルコールから選択される少なくとも一つであり、
前記直線状分子の重量平均分子量が１０００～２０００００である、リン脂質含有物質安定化剤。 - 前記直線状分子に対する前記γ－シクロデキストリンの質量比が０．０００２～２．５である、請求項１に記載のリン脂質含有物質安定化剤。
- 直線状分子とγ－シクロデキストリンとを有する可溶性の複合体を含み、
前記直線状分子がポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびポリビニルアルコールから選択される少なくとも一つであり、
前記直線状分子の重量平均分子量が１０００～２０００００であり、
前記直線状分子に対する前記γ－シクロデキストリンの質量比が９未満である、リン脂質含有物質安定化剤。 - 前記リン脂質含有物質が白血球、赤血球、培養細胞、リポソームおよびエクソソームからなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１～３のいずれか１項に記載のリン脂質含有物質安定化剤。
- 請求項１～４のいずれか１項に記載のリン脂質含有物質安定化剤を含む、体液検査キット。
- 前記体液が血液である、請求項５に記載の体液検査キット。
- 前記リン脂質含有物質安定化剤を前記体液１ｍＬあたり３～１３０ｍｇとなるように含む、請求項５または６に記載の体液検査キット。
- 前記リン脂質含有物質安定化剤を、前記体液と前記直線状分子と前記γ－シクロデキストリンとの質量比が１０００：２：１～１０００：１２５：５となるように含む、請求項５～７のいずれか１項に記載の体液検査キット。
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