JP2023153401A - 細胞外小胞の安定化方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】細胞外小胞を安定化すること。【解決手段】細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法など。【選択図】なし

Description

本発明は、細胞外小胞の安定化方法などに関する。
細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）は、さまざまな種類の細胞から分泌される、膜構造を有する微小な小胞であり、血液などの体液中に存在する。細胞外に分泌される細胞外小胞には、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）、アポトーシス胞（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｂｌｅｂ）が含まれる。細胞外小胞は、細胞間の情報伝達等の機能を担う種々の物質を含むことから、診断、創薬等の目的のために解析されている。よって、このような解析に有用な細胞外小胞の処理方法の開発が求められている。例えば、特許文献１には、（１）約３．０ｍｇ／ｍＬ（約１０μＭ）以下という低濃度のＥＤＴＡ（キレート剤）の存在下で細胞外小胞の収量を改善できるものの、それより高濃度のＥＤＴＡの存在下では細胞外小胞の収量を改善できないこと（実施例１、図１Ａ～１Ｃ）、（２）約２．２５ｍｇ／ｍＬ（約７．７μＭ）という低濃度のＥＤＴＡの存在下で、所定の温度および時間において細胞外小胞を保存すること（実施例２、図２Ａおよび２Ｂ、図３Ａ～３Ｆ）、ならびに（３）約２．２５ｍｇ／ｍＬ（約７．７μＭ）という低濃度のＥＤＴＡの存在下で細胞外小胞を凍結・融解すること（実施例３、図４Ａおよび４Ｂ）が記載されている。
米国特許出願公開第２０１５／０１２５８６４号明細書
細胞外小胞を安定化できれば、細胞外小胞の保存性を向上でき、診断、創薬等の分野への応用に有用である。したがって、本発明の目的は、細胞外小胞を安定化できる方法を開発することである。
本発明者らは、鋭意検討した結果、細胞外小胞含有試料を糖などの所定の成分と混合することにより、細胞外小胞含有試料中の細胞外小胞を安定化できること等を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法。
〔２〕細胞外小胞がエクソソームである、〔１〕の方法。
〔３〕細胞外小胞含有試料が体液または培養上清である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕細胞外小胞含有試料が血液試料である、〔１〕～〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕混合における糖の濃度が２．５～１００ｍｇ／ｍＬである、〔１〕～〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕混合におけるキレート剤の濃度が１～２００ｍＭである、〔１〕～〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕以下を含む、細胞外小胞の安定化方法：
（１）細胞外小胞含有試料を糖と混合すること；および
（２）細胞外小胞含有試料と糖との混合物を凍結させること。
〔８〕凍結が凍結乾燥である、〔７〕の方法。
〔９〕以下を含む、細胞外小胞の安定化方法：
（１）細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合すること；および
（２）細胞外小胞含有試料とキレート剤との混合物を凍結させること。
〔１０〕凍結が凍結乾燥である、〔９〕の方法。
〔１１〕糖およびキレート剤を含む、細胞外小胞安定化試薬。
〔１２〕糖またはキレート剤を含む、細胞外小胞の凍結保存安定化試薬。
細胞外小胞含有試料を糖と混合することにより、細胞外小胞含有試料中の細胞外小胞を安定化できる。したがって、本発明は、例えば、細胞外小胞の保存に有用である。
図１は、実施例１における各緩衝液条件下での凍結乾燥後のエクソソーム収量を示すグラフである。凍結乾燥しない条件下でのエクソソーム収量を１００％で示す。 図２は、実施例２における各緩衝液条件下での凍結乾燥後のエクソソーム収量を示すグラフである。凍結乾燥しない条件下でのエクソソーム収量を１００％で示す。 図３Ａは、実施例３において、ヒト結腸癌細胞ＳＷ１１１６の培養上清の凍結乾燥前サンプル（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の粒子数および粒子径分布の測定を示す図である。 図３Ｂは、実施例３において、ヒト結腸癌細胞ＳＷ１１１６の培養上清の凍結乾燥前サンプル（ＥＤ／ＥＧ）の粒子数および粒子径分布の測定を示す図である。 図３Ｃは、実施例３において、ヒト結腸癌細胞ＳＷ１１１６の培養上清の凍結乾燥後サンプル（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の粒子数および粒子径分布の測定を示す図である。 図３Ｄは、実施例３において、ヒト結腸癌細胞ＳＷ１１１６の培養上清の凍結乾燥後サンプル（ＥＤ／ＥＧ）の粒子数および粒子径分布の測定を示す図である。 図４Ａは、参考例１における各濃度の各キレート剤と混合した血清検体の免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウェスタンブロッティングを示す図である。 図４Ｂは、参考例１における各濃度の各キレート剤と混合した血漿検体の免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウェスタンブロッティングを示す図である。 図５Ａは、実施例４における各緩衝液条件下での凍結乾燥後のエクソソーム収量を示すグラフである（図５Ｂに続く）。凍結乾燥しない条件下でのエクソソーム収量を１００％で示す。 図５Ｂは、実施例４における各緩衝液条件下での凍結乾燥後のエクソソーム収量を示すグラフである。凍結乾燥しない条件下でのエクソソーム収量を１００％で示す。 図６は、実施例５における各緩衝液条件下での凍結乾燥後のエクソソーム収量を示すグラフである。凍結乾燥しない条件下でのエクソソーム収量を１００％で示す。 図７は、実施例６における各緩衝液条件下でのヒト血清サンプルの凍結乾燥後のエクソソーム収量を示すグラフである。凍結乾燥しない条件下でのエクソソーム収量を１００％で示す。 図８は、実施例７における各緩衝液条件下での凍結乾燥後のエクソソーム収量を示すグラフである。凍結乾燥しない条件下でのエクソソーム収量を１００％で示す。
１．細胞外小胞の安定化方法
本発明は、細胞外小胞含有試料を糖と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する。
本発明はまた、細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する。
本発明はまた、細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する。
細胞外小胞は、さまざまな種類の細胞から分泌される、膜構造を有する微小な小胞である。細胞外小胞としては、例えば、エクソソーム、エクトソーム、およびアポトーシス胞が挙げられる。好ましくは、細胞外小胞は、エクソソームである。細胞外小胞はまた、そのサイズにより規定することができる。細胞外小胞のサイズは、例えば、３０～１０００ｎｍであり、好ましくは５０～３００ｎｍ、より好ましくは８０～２００ｎｍである。細胞外小胞のサイズの測定は、例えば、細胞外小胞のブラウン運動に基づく方法、光散乱法、および電気抵抗法などにより行うことができる。好ましくは、細胞外小胞のサイズの測定は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）により行われる。ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０を用いる場合、測定条件として、測定時間３０秒、繰り返し回数３回、ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ １５を採用することができる。細胞外小胞はさらに、細胞外小胞マーカーにより規定することができる。細胞外小胞マーカーとしては、例えば、ＣＤ９、癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）、ＣＤ８１、ＣＤ６３、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、ＨＳＰ９０、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ、腫瘍感受性遺伝子（ＴＳＧ）１０１、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）１、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）－１、インテグリン、セラミド、コレステロール、ホスファチジルセリン、ＡＬＩＸ、Ａｎｎｅｘｉｎｓ、Ｃａｖｅｏｌｉｎ－I、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－Ｉ、Ｒａｂタンパク、ＥｐＣＡＭが挙げられる。
細胞外小胞含有試料は、細胞外小胞を含有する任意の試料である。好ましくは、細胞外小胞含有試料は、生物学的な液体試料である。細胞外小胞含有試料は、本発明の方法に用いられる前に、他の処理に付されてもよい。このような処理としては、例えば、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、加熱、冷蔵、および攪拌が挙げられる。
一実施形態では、細胞外小胞含有試料は、培養上清である。培養上清は、細胞培養上清であっても組織培養上清であってもよい。培養される細胞または組織が由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル等の霊長類；マウス、ラット、ウサギ等の齧歯類；ウシ、ブタ、ヤギ等の家畜；およびウマ、ヒツジ等の使役動物）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物（例、細菌類）、植物、および魚類が挙げられる。好ましくは、生物は、ヒト等の哺乳動物である。
別の実施形態では、細胞外小胞含有試料は、体液である。体液は、上述したような生物に由来する体液である。体液としては、例えば、血液試料（例、全血、血清および血漿）、リンパ液、組織液、脳脊髄液、腹水、唾液、膵液、胆汁、汗、精液、尿、涙液、粘液、乳汁、胸腔液、気管支肺胞洗浄液および羊水が挙げられる。好ましくは、体液は、血液である。
さらに別の実施形態では、細胞外小胞含有試料は、牛乳または果汁である。
糖は、単糖（例、アルドース、ケトース）、または２個以上の単糖がグリコシド結合により連結した多糖である。本発明において、糖には誘導体および糖アルコールも含まれる。糖の誘導体とは、糖において水素原子、水酸基、またはカルボニル基が置換基で置換された化合物をいう。糖アルコールとは、糖においてカルボニル基が還元された化合物をいう。
より具体的には、単糖としては、例えば、トリオース（例、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン）、テトロース（例、エリトロース、トレオース、エリトルロース）、ペントース（例、キシロース、リボース、アラビノース、リキソース、リブロース、キシルロース、アピオース）、ヘキソース（例、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、プシコース、ソルボース、タガトース）、ヘプトース（例、セドヘプツロース、コリオース）が挙げられる。アルドースとしては、例えば、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、グリセルアルデヒド、エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロースが挙げられる。ケトースとしては、例えば、フルクトース、ジヒドロキシアセトン、エリトルロース、キシルロース、リブロース、プシコース、ソルボース、タガトース、セドヘプツロース、コリオースが挙げられる。
多糖としては、例えば、上述したような単糖が２個以上連結した多糖が挙げられる。好ましくは、多糖としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロースからなる群から選ばれる１種または複数種の２個以上の単糖単位がグリコシド結合した多糖（例、１個以上のグルコースおよび１個以上のフルクトースがグリコシド結合した多糖）が挙げられる。このような多糖は、鎖状多糖または環状多糖であってもよい。鎖状多糖は、鎖状オリゴ糖または鎖状高分子多糖であってもよい。多糖が鎖状オリゴ糖である場合、多糖における単糖単位の個数の合計は、例えば２～２０個、好ましくは２～１０個、より好ましくは２～６個、さらにより好ましくは２～４個であってもよい。例えば、多糖が１個以上のグルコースおよび１個以上のフルクトースがグリコシド結合した多糖である場合、多糖におけるグルコースおよびフルクトースの個数は、それぞれ独立して、例えば１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、さらにより好ましくは１もしくは２個であってもよい。鎖状オリゴ糖としては、例えば、二糖が挙げられる。二糖としては、例えば、ショ糖、ラクトース、トレハロースが挙げられる。特に好ましくは、二糖は、１個のグルコースおよび１個のフルクトースがグリコシド結合したショ糖である。鎖状高分子多糖としては、セルロース、アミロース、アミロペクチン、グルコマンナン、プルラン、ガラクトマンナン、イヌリン、グリコーゲン、キチン、キトサン、グルクロノキシラン、アラビノキシラン、アガロース、カラギーナン、ペクチン、ペクチン酸、アルギン酸、フコイダン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロナンが挙げられる。多糖が環状多糖である場合、多糖における単糖単位の個数の合計は、例えば５～１００個、好ましくは５～２０個、より好ましくは５～１０個、さらにより好ましくは６～８個であってもよい。環状多糖としては、例えば、シクロデキストリン（αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、γシクロデキストリン）が挙げられる。
糖の誘導体における置換基としては、例えば、水素原子、水酸基、Ｃ１～６アルキル基、Ｃ１～６アルケニル基、Ｃ１～６アルキニル基、Ｃ１～６アルキルオキシ（アルコキシ）基、Ｃ６～１４芳香族炭化水素基、Ｃ１～６アルキル－カルボニル（アシル）基、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、シアノ基が挙げられる。
Ｃ１～６アルキル基は、炭素原子数１～６個のアルキルであり、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖または分岐鎖のアルキルが好ましい。Ｃ１～６アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１－エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、２－エチルブチルが挙げられる。Ｃ１～６アルキル基としては、Ｃ１～４アルキル基が好ましく、Ｃ１～３アルキル基がより好ましい。
Ｃ１～６アルケニル基は、炭素原子数１～６個のアルケニル基であり、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖または分岐鎖のアルケニルが好ましい。Ｃ１～６アルケニル基としては、例えば、エテニル（ビニル）、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、へキセニルが挙げられる。Ｃ１～６アルケニル基としては、Ｃ１～４アルケニル基が好ましく、Ｃ１～３アルケニル基がより好ましい。
Ｃ１～６アルキニル基は、炭素原子数１～６個のアルキニル基であり、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖または分岐鎖のアルキニルが好ましい。Ｃ１～６アルキニル基としては、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、へキシニルが挙げられる。Ｃ１～６アルキニル基としては、Ｃ１～４アルキニル基が好ましく、Ｃ１～３アルキニル基がより好ましい。
Ｃ１～６アルキルオキシ基は、炭素原子数１～６個のアルキルオキシ基である。Ｃ１～６アルキルオキシ基としては、例えば、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、ｉｓｏ－プロピルオキシ、ブチルオキシ、ｉｓｏ－ブチルオキシ、ｓｅｃ－ブチルオキシ、ｔｅｒｔ－ブチルオキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、１－エチルプロピルオキシ、ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ、１，１－ジメチルブチルオキシ、２，２－ジメチルブチルオキシ、３，３－ジメチルブチルオキシ、２－エチルブチルオキシが挙げられる。Ｃ１～６アルキルオキシ基としては、Ｃ１～４アルキルオキシ基が好ましく、Ｃ１～３アルキルオキシ基がより好ましい。
Ｃ６～１４芳香族炭化水素基としては、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニルが挙げられる。Ｃ６～１４芳香族炭化水素基としては、フェニル、ナフチルが好ましく、フェニルがより好ましい。
Ｃ１～６アルキル－カルボニル（アシル）基としては、上述したようなＣ１～６アルキル基を有するカルボニル基である。Ｃ１～６アルキル－カルボニル基としては、例えば、メチルカルボニル（アセチル）、エチルカルボニル、プロピルカルボニル、ｉｓｏ－プロピルカルボニル、ブチルカルボニル、ｉｓｏ－ブチルカルボニル、ｓｅｃ－ブチルカルボニル、ｔｅｒｔ－ブチルカルボニル、ペンチルカルボニル、イソペンチルカルボニル、ネオペンチルカルボニル、１－エチルプロピルカルボニル、ヘキシルカルボニル、イソヘキシルカルボニル、１，１－ジメチルブチルカルボニル、２，２－ジメチルブチルカルボニル、３，３－ジメチルブチルカルボニル、２－エチルブチルカルボニルが挙げられる。Ｃ１～６アルキルカルボニル基としては、Ｃ１～４アルキルカルボニル基が好ましく、Ｃ１～３アルキルカルボニル基がより好ましい。
これらの置換基は、別の置換基でさらに置換されていてもよい。別の置換基としては、例えば、水酸基、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、シアノ基が挙げられる。
置換基で置換された糖の誘導体としては、例えば、環状多糖（例、αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、またはγシクロデキストリン等のシクロデキストリン）および鎖状高分子多糖（例、セルロース）の誘導体が挙げられる。環状多糖の誘導体としては、例えば、置換されていてもよいアルキル基で置換された環状多糖（例、メチルβシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン）が挙げられる。鎖状高分子多糖の誘導体としては、例えば、セルロース誘導体が挙げられる。
セルロース誘導体とは、セルロースの少なくとも１つの水酸基の水素原子が親水性基で置換されたセルロース誘導体である。セルロース誘導体における親水性基としては、例えば、カルボキシアルキル（例、カルボキシＣ１～６アルキル）、ヒドロキシアルキル（例、ヒドロキシＣ１～６アルキル）が挙げられる。セルロース誘導体における親水性基は、カルボキシアルキルまたはヒドロキシアルキルが好ましい。
カルボキシアルキルとしては、例えば、カルボキシメチル、カルボキシエチル（１－カルボキシエチル、２－カルボキシエチル）、カルボキシプロピル（１－カルボキシプロピル、２－カルボキシプロピル、３－カルボキシプロピル）、カルボキシイソプロピル（１－カルボキシ－２－メチルエチル、２－カルボキシ－２－メチルエチル）、カルボキシブチル（１－カルボキシブチル、２－カルボキシブチル、３－カルボキシブチル、４－カルボキシブチル）、カルボキシｔ－ブチル、カルボキシペンチル（１－カルボキシペンチル、２－カルボキシペンチル、３－カルボキシペンチル、４－カルボキシペンチル、５－カルボキシペンチル）、カルボキシヘキシル（１－カルボキシヘキシル、２－カルボキシヘキシル、３－カルボキシヘキシル、４－カルボキシヘキシル、５－カルボキシヘキシル、６－カルボキシヘキシル）が挙げられる。
ヒドロキシアルキルとしては、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル（１－ヒドロキシエチル、２－ヒドロキシエチル）、ヒドロキシプロピル（１－ヒドロキシプロピル、２－ヒドロキシプロピル、３－ヒドロキシプロピル）、ヒドロキシイソプロピル（１－ヒドロキシ－２－メチルエチル、２－ヒドロキシ－２－メチルエチル）、ヒドロキシブチル（１－ヒドロキシブチル、２－ヒドロキシブチル、３－ヒドロキシブチル、４－ヒドロキシブチル）、ヒドロキシｔ－ブチル、ヒドロキシペンチル（１－ヒドロキシペンチル、２－ヒドロキシペンチル、３－ヒドロキシペンチル、４－ヒドロキシペンチル、５－ヒドロキシペンチル）、ヒドロキシヘキシル（１－ヒドロキシヘキシル、２－ヒドロキシヘキシル、３－ヒドロキシヘキシル、４－ヒドロキシヘキシル、５－ヒドロキシヘキシル、６－ヒドロキシヘキシル）が挙げられる。
セルロース誘導体の具体例としては、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられる。
セルロース誘導体には、ナノセルロース誘導体も含まれる。ナノセルロース誘導体とは、後述するナノセルロースの誘導体である。
ナノセルロースとは、ナノメートルオーダーの繊維幅を有する繊維状セルロースである。ナノセルロースの繊維幅は、例えば５００ｎｍ以下であり、好ましくは２００ｎｍ以下、より好ましくは１００ｎｍ以下、さらにより好ましくは５０ｎｍ以下、なおさらにより好ましくは１０ｎｍ以下、特により好ましくは５ｎｍ以下であってもよい。
セルロース誘導体には、それらの塩も含まれる。塩としては、例えば、金属（例、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、およびセシウム等の一価の金属、ならびにカルシウム、マグネシウム、および亜鉛等の二価の金属）の塩、ならびに無機塩基（例、アンモニア）の塩が挙げられる。
糖アルコールとしては、例えば、上述したような単糖においてカルボニル基が還元された単量体、これらの単量体同士が例えばグリコシド結合により結合した多量体、およびこれらの単量体と単糖を構成単位として例えばグリコシド結合により結合した多量体が挙げられる。上記の単量体としては、例えば、トリトール（例、グリセリン）、テトリトール（例、エリトリトール、トレイトール）、ペンチトール（例、キシリトール、アラビニトール、リビトール）、ヘキシトール（例、ソルビトール、マンニトール、イジトール、ガラクチトール）、ヘプチトール（例、ボレミトール、ペルセイトール）、オクチルトール（例、エリスロガラクトオクチトール）が挙げられる。糖アルコールとしては、例えば、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、フシトール、ボレミトール、アラビニトール、グリセリン、イジトール、エリトリトール、トレイトール、リビトール等の単量体、ラクチトール、マルチトール等の二量体が挙げられる。
本発明では、２種以上（例、２種、３種、４種、５種）の糖の混合物を細胞外小胞含有試料と混合してもよい。本発明では、細胞外小胞含有試料と糖との混合前に、細胞外小胞含有試料に糖を添加することを含んでいてもよい。糖は、キレート剤と同時または別々に添加されてもよい。
細胞外小胞含有試料を糖と混合する場合、混合における糖の濃度は、細胞外小胞を安定化できる限り特に限定されない。このような濃度は、糖の種類等の因子によっても異なるが、例えば、２．５ｍｇ／ｍＬ以上であってもよく、好ましくは３．０ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは３．５ｍｇ／ｍＬ以上、さらにより好ましくは４．０ｍｇ／ｍＬ以上、なおさらにより好ましくは４．５ｍｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは５．０ｍｇ／ｍＬ以上、６．０ｍｇ／ｍＬ以上、８．０ｍｇ／ｍＬ以上、または１０．０ｍｇ／ｍＬ以上であってもよい。このような濃度はまた、糖の種類等の因子によっても異なるが、例えば、６００ｍｇ／ｍＬ以下、４００ｍｇ／ｍＬ以下、２００ｍｇ／ｍＬ以下、または１００ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、好ましくは９５ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは９０ｍｇ／ｍＬ以下、さらにより好ましくは８５ｍｇ／ｍＬ以下、なおさらにより好ましくは８０ｍｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは７５ｍｇ／ｍＬ以下、７０ｍｇ／ｍＬ以下、６０ｍｇ／ｍＬ以下、または５０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。より具体的には、糖の濃度は、糖の種類等の因子によっても異なるが、例えば、２．５～８００ｍｇ／ｍＬ、２．５～６００ｍｇ／ｍＬ、２．５～４００ｍｇ／ｍＬ、２．５～２００ｍｇ／ｍＬ、または２．５～１００ｍｇ／ｍＬであってもよく、好ましくは３．０～９５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは３．５～９０ｍｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは４．０～８５ｍｇ／ｍＬ、なおさらにより好ましくは４．５～８０ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは５．０～７５ｍｇ／ｍＬ、６．０～７０ｍｇ／ｍＬ、８．０～６０ｍｇ／ｍＬ、または１０．０～５０ｍｇ／ｍＬであってもよい。
キレート剤は、金属イオンとの配位結合が可能である配位部分を有する化合物またはその塩である。配位部分の数は、好ましくは２個以上、より好ましくは３個以上（例、３個または６個）である。配位部分としての配位原子としては、例えば、酸素原子、リン原子、窒素原子、硫黄原子、および塩素原子が挙げられる。配位原子は、好ましくは酸素原子またはリン原子であり、より好ましくは酸素原子である。配位部分としての配位基としては、例えば、上記配位原子を有する基が挙げられる。配位基は、好ましくはカルボン酸基またはリン酸基であり、より好ましくはカルボン酸基である。
キレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、シュウ酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰ）、およびそれらの塩が挙げられる。塩としては、例えば、金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩等の一価の金属塩、およびカルシウム塩、マグネシウム塩等の二価の金属塩）、無機塩（例、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物等のハロゲン化物塩、およびアンモニウム塩）、有機塩（例、アルキル基で置換されたアンモニウム塩）、および酸付加塩（例、硫酸、塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸等の無機酸との塩、および酢酸、シュウ酸、乳酸、クエン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸等の塩）が挙げられる。本発明では、２種以上（例、２種、３種、４種、５種）のキレート剤の混合物を細胞外小胞含有試料と混合してもよい。本発明では、細胞外小胞含有試料とキレート剤との混合前に、細胞外小胞含有試料にキレート剤を添加することを含んでいてもよい。
細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合する場合、混合におけるキレート剤の濃度は、細胞外小胞を安定化できる限り特に限定されない。このような濃度は、キレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば１ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上、さらにより好ましくは１５ｍＭ以上、なおさらにより好ましくは２０ｍＭ以上、特に好ましくは３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、または５０ｍＭ以上であってもよい。このような濃度はまた、キレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば２００ｍＭ以下、好ましくは１８０ｍＭ以下、より好ましくは１７０ｍＭ以下、さらにより好ましくは１６０ｍＭ以下、なおさらにより好ましくは１５０ｍＭ以下、特に好ましくは１４０ｍＭ以下、１２０ｍＭ以下、または１００ｍＭ以下であってもよい。より具体的には、キレート剤の濃度は、例えば１ｍＭ～２００ｍＭ、好ましくは５～１８０ｍＭ、より好ましくは１０～１７０ｍＭ、さらにより好ましくは１５～１６０ｍＭ、なおさらにより好ましくは２０～１５０ｍＭ、特に好ましくは３０～１４０ｍＭ、４０～１２０ｍＭ、または５０～１００ｍＭであってもよい。
細胞外小胞含有試料は、糖およびキレート剤の双方と混合されてもよい。
本発明において糖およびキレート剤の双方が用いられる場合、混合において使用される糖およびキレート剤の濃度は、それらの比率によって規定することもできる。例えば、混合における、糖１０ｍｇ／ｍＬあたりのキレート剤の濃度は、糖およびキレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば１ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、好ましくは１０ｍＭ以上、さらにより好ましくは１５ｍＭ以上、なおさらにより好ましくは２０ｍＭ以上、特に好ましくは３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、または５０ｍＭ以上であってもよい。このような濃度はまた、糖およびキレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば２００ｍＭ以下、好ましくは１８０ｍＭ以下、より好ましくは１７０ｍＭ以下、さらにより好ましくは１６０ｍＭ以下、なおさらにより好ましくは１５０ｍＭ以下、特に好ましくは１４０ｍＭ以下、１２０ｍＭ以下、または１００ｍＭ以下であってもよい。より具体的には、キレート剤の濃度は、例えば１ｍＭ～２００ｍＭ、好ましくは５～１８０ｍＭ、より好ましくは１０～１７０ｍＭ、さらにより好ましくは１５～１６０ｍＭ、なおさらにより好ましくは２０～１５０ｍＭ、特に好ましくは３０～１４０ｍＭ、４０～１２０ｍＭ、または５０～１００ｍＭであってもよい。
混合は、任意の様式で行うことができる。例えば、本発明において糖およびキレート剤の双方が用いられる場合、混合は、同時または別々に行うことができる。より具体的には、細胞外小胞含有試料は、（１）糖およびキレート剤と同時に混合されてもよく、（２）糖と混合された後、キレート剤と混合されてもよく、または（３）キレート剤と混合された後、糖と混合されてもよい。操作の簡便等の観点から、細胞外小胞含有試料は、好ましくは、糖およびキレート剤と同時に混合されてもよい。
混合温度は、例えば４～３７℃であり、好ましくは１５～３０℃であってもよい。混合時間は、細胞外小胞を安定化できる限り特に限定されず、適宜設定することができる。細胞外小胞含有試料は、糖などの所定の成分との混合後に放置されてもよい。
細胞外小胞が糖などの所定の成分との混合により安定化されているか否かは、例えば、細胞外小胞と糖などの所定の成分との混合後に測定される指標値を、糖などの所定の成分の不在下における細胞外小胞について測定されるコントロール値（糖などの所定の成分の存在または非存在以外の条件は同じ）と比較し、指標値がコントロール値よりも優れているか否かを評価することにより行うことができる。例えば、凍結乾燥物の安定化を評価する場合、凍結乾燥機（東京理化器械株式会社製）を用いて、－２８℃で２時間、－１０℃で４時間、その後２０℃のプログラムで凍結乾燥させ、糖などの所定の成分の有無における凍結乾燥物の指標値を比較してもよい。このような指標値としては、例えば、細胞外小胞マーカー量、または細胞外小胞に相当する粒子数の測定値を利用することができる。
細胞外小胞マーカー量の測定は、当該分野において公知である任意の方法により行うことができる。
細胞外小胞マーカーがタンパク質である場合、測定方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。イムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、およびサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）〔例、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）〕、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、およびサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、およびイムノクロマトグラフィー法、ウェスタンブロッティング、免疫染色、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）が挙げられる。複数成分が検出される場合、プロテオーム分析が行われてもよい。
細胞外小胞マーカーが核酸である場合、測定方法としては、例えば、プローブを用いるハイブリダイゼーション法、プライマー（例、２、３、または４個のプライマー）を用いる遺伝子増幅法、質量分析法が挙げられる。
細胞外小胞マーカーがタンパク質および核酸以外の成分である場合、測定方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。複数成分が測定される場合、メタボローム分析が行われてもよい。
細胞外小胞に相当する粒子数の測定は、例えば、粒子分析機器、電子顕微鏡、フローサイトメーター等の機器により行うことができる。好ましくは、このような粒子数の測定は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）により行うことができる。ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０を用いる場合、測定条件として、測定時間３０秒、繰り返し回数３回、ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ １５を採用することができる。
本発明の方法は、混合物を凍結することをさらに含んでいてもよい。
すなわち、本発明はさらに、以下を含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する：
（１）細胞外小胞含有試料を糖と混合すること；および
（２）細胞外小胞含有試料と糖との混合物を凍結させること。
本発明はさらに、以下を含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する：
（１）細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合すること；および
（２）細胞外小胞含有試料とキレート剤との混合物を凍結させること。
本発明はさらに、以下を含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する：
（１）細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合すること；および
（２）細胞外小胞含有試料と糖およびキレート剤との混合物を凍結させること。
凍結は、凍結乾燥または溶液の凍結（非乾燥凍結）のいずれであってもよいが、より長期にわたり細胞外小胞を保存する場合、凍結乾燥が好ましい。
糖およびキレート剤の種類および混合における濃度の例は、上述したとおりである。
２．細胞外小胞安定化試薬
本発明はまた、細胞外小胞安定化試薬を提供する。本発明の試薬は、糖またはキレート剤を含む。好ましくは、本発明の試薬は、糖およびキレート剤を含んでいてもよい。糖およびキレート剤は、上述したものと同様である。本発明の試薬は、糖およびキレート剤に加えて、他の成分（例、細胞外小胞の安定化に有用な他の成分）を含んでいてもよい。
一実施形態では、本発明の試薬は、糖を含む細胞外小胞安定化組成物である。別の実施形態では、本発明の試薬は、キレート剤を含む細胞外小胞安定化組成物である。さらに別の実施形態では、本発明の組成物は、糖およびキレート剤の双方を含む細胞外小胞安定化組成物である。
細胞外小胞を安定化するために、本発明の試薬は、細胞外小胞含有試料と混合させて用いることができる。細胞外小胞を安定的に保存するために、細胞外小胞含有試料と本発明の試薬との混合物は、凍結されてもよい。この場合、本発明の試薬は、細胞外小胞の凍結保存安定化試薬として用いることができる。凍結は、凍結乾燥または溶液の凍結（非乾燥凍結）のいずれであってもよいが、より長期にわたり細胞外小胞を保存する場合、凍結乾燥が好ましい。
組成物中の糖の濃度は、細胞外小胞含有試料と混合された後、細胞外小胞を安定化できる限り特に限定されない。このような濃度は、糖の種類等の因子によっても異なるが、例えば、２．７ｍｇ／ｍＬ以上であってもよく、好ましくは３．０ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは３．５ｍｇ／ｍＬ以上、さらにより好ましくは４．０ｍｇ／ｍＬ以上、なおさらにより好ましくは４．５ｍｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは５．０ｍｇ／ｍＬ以上、６．０ｍｇ／ｍＬ以上、８．０ｍｇ／ｍＬ以上、または１０．０ｍｇ／ｍＬ以上であってもよい。このような濃度はまた、糖の種類等の因子によっても異なるが、例えば、６００ｍｇ／ｍＬ以下、４００ｍｇ／ｍＬ以下、２００ｍｇ／ｍＬ以下、１００ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、好ましくは９５ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは９０ｍｇ／ｍＬ以下、さらにより好ましくは８５ｍｇ／ｍＬ以下、なおさらにより好ましくは８０ｍｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは７５ｍｇ／ｍＬ以下、７０ｍｇ／ｍＬ以下、６０ｍｇ／ｍＬ以下、または５０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。より具体的には、糖の濃度は、糖の種類等の因子によっても異なるが、例えば、２．７～８００ｍｇ／ｍＬ、２．７～６００ｍｇ／ｍＬ、２．７～４００ｍｇ／ｍＬ、２．７～２００ｍｇ／ｍＬ、または２．７～１００ｍｇ／ｍＬであってもよく、好ましくは３．０～９５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは３．５～９０ｍｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは４．０～８５ｍｇ／ｍＬ、なおさらにより好ましくは４．５～８０ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは５．０～７５ｍｇ／ｍＬ、６．０～７０ｍｇ／ｍＬ、８．０～６０ｍｇ／ｍＬ、または１０．０～５０ｍｇ／ｍＬであってもよい。
組成物中のキレート剤の濃度は、細胞外小胞含有試料と混合された後、細胞外小胞を安定化できる限り特に限定されない。このような濃度は、キレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば１．１ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、好ましくは１０ｍＭ以上、好ましくは１５ｍＭ以上、より好ましくは２０ｍＭ以上、さらにより好ましくは３０ｍＭ以上、なおさらにより好ましくは４０ｍＭ以上、特に好ましくは５０ｍＭ以上であってもよい。このような濃度はまた、キレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば２００ｍＭ以下、好ましくは１８０ｍＭ以下、より好ましくは１７０ｍＭ以下、さらにより好ましくは１６０ｍＭ以下、なおさらにより好ましくは１５０ｍＭ以下、特に好ましくは１４０ｍＭ以下、１２０ｍＭ以下、または１００ｍＭ以下であってもよい。より具体的には、キレート剤の濃度は、例えば１．１ｍＭ～２００ｍＭ、好ましくは５～１８０ｍＭ、より好ましくは１０～１７０ｍＭ、さらにより好ましくは１５～１６０ｍＭ、なおさらにより好ましくは２０～１５０ｍＭ、特に好ましくは３０～１４０ｍＭ、４０～１２０ｍＭ、または５０～１００ｍＭであってもよい。
本発明の組成物が糖およびキレート剤の双方を含む場合、糖およびキレート剤の濃度はまた、それらの比率によって規定することもできる。例えば、糖１０ｍｇ／ｍＬあたりのキレート剤の濃度は、糖およびキレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば１ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、好ましくは１０ｍＭ以上、好ましくは１５ｍＭ以上、より好ましくは２０ｍＭ以上、さらにより好ましくは３０ｍＭ以上、なおさらにより好ましくは４０ｍＭ以上、特に好ましくは５０ｍＭ以上であってもよい。このような濃度はまた、糖およびキレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば２００ｍＭ以下、好ましくは１８０ｍＭ以下、より好ましくは１７０ｍＭ以下、さらにより好ましくは１６０ｍＭ以下、なおさらにより好ましくは１５０ｍＭ以下、特に好ましくは１４０ｍＭ以下、１２０ｍＭ以下、または１００ｍＭ以下であってもよい。より具体的には、キレート剤の濃度は、例えば１ｍＭ～２００ｍＭ、好ましくは５～１８０ｍＭ、より好ましくは１０～１７０ｍＭ、さらにより好ましくは１５～１６０ｍＭ、なおさらにより好ましくは２０～１５０ｍＭ、特に好ましくは３０～１４０ｍＭ、４０～１２０ｍＭ、または５０～１００ｍＭであってもよい。
本発明の組成物は、使用に際して水溶液に溶解される、糖および／またはキレート剤を含む非水性組成物（例、混合粉末）であっても、糖および／またはキレート剤を含む水溶液であってもよいが、迅速かつ簡便な使用等の観点からは、糖および／またはキレート剤を含む水溶液が好ましい。水溶液としては、例えば、水（例、蒸留水、滅菌水、滅菌蒸留水、および純水）、ならびに緩衝液が挙げられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、酒石酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グリシン緩衝液、炭酸緩衝液、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、ホウ酸緩衝液、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）緩衝液、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）緩衝液、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）１－ピペラジニルエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液が挙げられる。緩衝液のｐＨは中性が好ましい。より具体的には、このようなｐＨは、好ましくは５．０以上、より好ましくは５．５以上、さらにより好ましくは６．０以上であってもよい。ｐＨはまた、好ましくは９．０以下、より好ましくは８．５以下、さらにより好ましくは８．０以下であってもよい。ｐＨの測定は、当該分野における公知の方法を用いて行うことができる。好ましくは、ｐＨは、ガラス電極を有するｐＨ計を用いて２５℃で測定された値を採用することができる。
本発明の組成物は、細胞外小胞含有試料と適宜混合して使用することができる。本発明の組成物と細胞外小胞含有試料との混合比率（細胞外小胞含有試料／組成物）は、例えば１／３０～３０、好ましくは１／２０～２０、より好ましくは１／１０～１０、さらにより好ましくは１／１０～１である。
本発明の組成物が水溶液である場合、水溶液の容量は、例えば、１μＬ～１００ｍＬである。好ましくは、水溶液の容量は、１０μＬ以上、１００μＬ以上、または１０００μＬ以上であってもよい。水溶液の容量はまた、５０ｍＬ以下、１０ｍＬ以下、または２ｍＬ以下であってもよい。
別の実施形態では、本発明の試薬は、糖および／またはキレート剤を含むキットである。糖および／またはキレート剤は、固体または水溶液の形態において提供することができるが、好ましくは水溶液の形態で提供される。したがって、本発明のキットは、糖を含む水溶液の形態において提供されてもよく、キレート剤を含む水溶液の形態において提供されてもよく、糖およびキレート剤を含む水溶液の形態において提供されてもよく、糖を含む第１水溶液、およびキレート剤を含む第２水溶液の形態において提供されてもよい。水溶液は、上述したとおりであるが、緩衝液が好ましい。緩衝液の例およびｐＨは、上述したとおりである。第１水溶液中の糖の濃度、第２水溶液中のキレート剤の濃度、ならびに第１および第２水溶液における糖およびキレート剤の濃度比率の関係は、本発明の組成物について上述したものと同様である。また、第１および第２水溶液と細胞外小胞含有試料との混合比率、ならびに第１および第２水溶液の各容量は、本発明の組成物について上述したものと同様である。
３．細胞外小胞を含む混合物
本発明はまた、糖および／またはキレート剤と、細胞外小胞とを含む混合物を提供する。本発明の混合物は、さらに水溶液（例、上述したような緩衝液）を含んでいてもよい。混合物の形態は特に限定されないが、水溶液またはその凍結物（例、凍結乾燥物）が好ましい。本発明の混合物は、細胞外小胞含有試料を、上述したような本発明の方法または試薬で処理することにより得ることができる。本発明の混合物は、例えば、細胞外小胞の保存に有用である。
混合物中の糖またはキレート剤の濃度、ならびに糖およびキレート剤の濃度比率は、本発明の方法について上述したものと同様である。混合物中の細胞外小胞の濃度（粒子数／ｍＬ）は、例えば１×１０２～１×１０１５、好ましくは１×１０３～１×１０１４、より好ましくは１×１０４～１×１０１３、さらにより好ましくは１×１０５～１×１０１２、特に好ましくは１×１０６～１×１０１１である。
本発明の混合物が水溶液である場合、水溶液の容量は、例えば、１μＬ～１００ｍＬである。好ましくは、水溶液の容量は、１０μＬ以上、１００μＬ以上、または１０００μＬ以上であってもよい。水溶液の容量はまた、５０ｍＬ以下、１０ｍＬ以下、または２ｍＬ以下であってもよい。
以下、実施例を参照して本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：キレート剤によるエクソソームの安定化
エクソソームの凍結乾燥に対するキレート剤の効果を検討した。
１）エクソソームの回収
３日間無血清培地で培養したヒト非小細胞肺癌細胞Ｈ１２９９の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５（ミリポア社製）を用いて濃縮した。濃縮物を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。次に、上清を、１００，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、ＰＢＳ（２．９ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、９．０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ）または５０ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ ＥＧＴＡ／ＰＢＳを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、１００，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、新たにＰＢＳまたは５０ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（回収緩衝液）を加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
２）エクソソームの凍結乾燥
回収したエクソソームをＱｕｂｉｔ（商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々に回収緩衝液をさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム１容量に対し、凍結乾燥緩衝液２４容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、凍結乾燥機（東京理化器械株式会社製）を用いて、－２８℃で２時間、－１０℃で４時間、その後２０℃のプログラムで凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。凍結乾燥緩衝液としては、ＰＢＳまたはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．５０ｍＭ ＥＤＴＡ／ ５０ｍＭ ＥＧＴＡ）を用いた。用いたＰＢＳのｐＨは７．４であった（実施例１～３において同様）。
その後、凍結乾燥物をミリＱ水（ミリポア社製）または５０ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ ＥＧＴＡ／Ｈ２Ｏ（溶解緩衝液）に溶解させた。
３）エクソソーム特異的抗原（ＣＤ９）量の測定に基づくエクソソームの安定性評価
これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、ＥＬＩＳＡ系で評価した。具体的には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ社製）に、自社製抗ＣＤ９抗体を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。その後、各ウェルを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）で３回洗浄し、０．５重量％Ｃａｓｅｉｎを含むＰＢＳ２００μＬを添加して、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ＰＢＳで希釈した凍結乾燥物の溶解物１００μＬを各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ビオチン化した同自社製抗ＣＤ９抗体と、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ（ＳＡ－ＡＬＰ、ＧｅｎｅＴｅｘ社製）とを含むＰＢＳ１００μＬを各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳで洗浄し、ルミパルス（登録商標）基質液（富士レビオ社製）１００μＬを添加し、３７℃で１０分反応させた後、波長４７７ｎｍの発光カウントを測定した。凍結乾燥していないサンプルのカウントを１００％とした。
その結果、キレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した（図１）。
したがって、エクソソームの凍結乾燥においてキレート剤がエクソソームを安定化できることが示された。
実施例２：ショ糖によるエクソソームの安定化
エクソソームの凍結乾燥に対する糖の効果を検討した。
１）エクソソームの回収
３日間無血清培地で培養したヒト結腸癌細胞ＳＷ４８０の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５（ミリポア社製）を用いて濃縮した。濃縮物を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。次に、上清を、１００，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、ＰＢＳを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、１００，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、新たにＰＢＳを加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
２）エクソソームの凍結乾燥
回収したエクソソームをＱｕｂｉｔ（商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々にＰＢＳをさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム１容量に対し、凍結乾燥緩衝液２４容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、上述した凍結乾燥機を用いて、－２８℃で２時間、－１０℃で４時間、その後２０℃のプログラムで凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。なお、凍結乾燥緩衝液として、ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．５０ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ ＥＧＴＡ）、ショ糖／ＰＢＳ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１０ｍｇ／ｍＬショ糖）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ショ糖／ＰＢＳ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．５０ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ ＥＧＴＡ／１０ｍｇ／ｍＬショ糖）を用いた。
その後、凍結乾燥物をミリＱ水（ミリポア社製）に溶解させた。
３）エクソソーム特異的抗原（ＣＤ９）量の測定に基づくエクソソームの安定性評価
これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、ＥＬＩＳＡ系で評価した。具体的には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ社製）に、自社製抗ＣＤ９抗体を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。その後、各ウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、０．５重量％Ｃａｓｅｉｎを含むＰＢＳ２００μＬを添加して、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ＰＢＳで希釈した凍結乾燥物の溶解物１００μＬを各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ビオチン化した同自社製抗ＣＤ９抗体と、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ（ＳＡ－ＡＬＰ、ＧｅｎｅＴｅｘ社製）とを含むＰＢＳ１００μＬを各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳで洗浄し、ルミパルス基質液１００μＬを添加し、３７℃で５分反応させた後、波長４７７ｎｍの発光カウントを測定した。凍結乾燥していないサンプルのカウントを１００％とした。
その結果、ショ糖を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した（図２）。また、ショ糖およびキレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量がより増大した。
したがって、エクソソームの凍結乾燥において、糖がエクソソームを安定化できることが示された。また、糖によるエクソソームの安定化は、キレート剤の存在下で向上されることが示された。
実施例３：粒子量測定に基づく凍結乾燥エクソソームの安定性評価
凍結乾燥を行ったサンプルをＮａｎｏＳｉｇｈｔで測定して、凍結乾燥エクソソームの粒子量に基づき安定性を評価した。
１）エクソソームの回収
３日間無血清培地で培養したヒト結腸癌細胞ＳＷ１１１６の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５（ミリポア社製）を用いて濃縮した。濃縮物を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。次に、上清を、１００，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、ＰＢＳ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）または５０ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（ＥＤ／ＥＧ）を加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、１００，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、新たにＰＢＳまたは５０ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（ＥＤ／ＥＧ）を加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
２）エクソソームの凍結乾燥
回収したエクソソームをＱｕｂｉｔ（商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々に回収緩衝液をさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム１容量に対し、凍結乾燥緩衝液２４容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、上述した凍結乾燥機を用いて、－２８℃で２時間、－１０℃で４時間、その後２０℃のプログラムで凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。なお、凍結乾燥緩衝液として、ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．５０ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ ＥＧＴＡ）（ＥＤ／ＥＧ）を用いた。
その後、凍結乾燥物をミリＱ水（ミリポア社製）に溶解させた。
３）凍結乾燥エクソソームの安定性評価
溶解した凍結乾燥エクソソームの粒子数および分布の測定をＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）により行った。測定は測定時間３０秒、繰り返し回数３回で行い、ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを１５で解析した。
その結果、キレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソームに対応すると考えられる１００～２００ｎｍの粒子量が、増加していた（表１および図３Ａ～３Ｄ）。
したがって、粒子量の測定によっても、エクソソームの凍結乾燥においてキレート剤がエクソソームを安定化できることが示された。
Figure 2023153401000001
参考例１：各種キレート剤でのエクソソームの処理
キレート剤として、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、シュウ酸二水和物、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰ）（ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＥＧＴＡは同仁化学研究所社製、ＨＥＤＴＡ、ＨＩＤＡ、ＮＴＡ、ＥＤＴＭＰは東京化成工業社製、シュウ酸二水和物は和光純薬工業社製）を使用した。各キレート剤のエクソソームの沈降量への影響を検討した。
３００μＬの血清検体または血漿検体を、６００μＬのＰＢＳまたは各キレート剤添加ＰＢＳと混合した。各キレート剤の濃度はそれぞれ終濃度で１、１０および５０ｍＭとなるように使用した（ただし、ＥＤＴＭＰのみは１、１０および３０ｍＭ）。次いで、溶液を室温で３０分放置した後、２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。その上清を新しいチューブに移し、そこに、ＣＤ９を認識する自社モノクローナル抗体を２μｇ固定した磁性ビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を添加した。４℃で一晩反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、サンプルをサンプルバッファー（ＳＤＳ含有）で磁性ビーズから溶出し、ウェスタンブロッティング用サンプルとした。これらのサンプルをビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウェスタンブロッティングで分析した。
その結果、血清（図４Ａ）および血漿（図４Ｂ）の両方において、使用したキレート剤はいずれも、免疫沈降法によるエクソソームの回収を示し、また、濃度が高くなるにつれてエクソソームの免疫沈降量が増加した。特に、３０ｍＭのＥＤＴＭＰ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＨＥＤＴＡ、ＮＴＡ、シュウ酸で、エクソソームの免疫沈降量が大幅に増加した（図４Ａ、４Ｂ）。
実施例４:各種糖によるエクソソームの安定化
エクソソームの凍結乾燥に対する各種糖の効果を検討した。
１）エクソソームの回収
３日間無血清培地で培養したヒト非小細胞肺癌細胞Ｈ１２９９の培養上清をサンプルとして用い、実施例２の回収方法にて、エクソソームを回収した。
２）エクソソームの凍結乾燥
回収したエクソソームをＱｕｂｉｔ（商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々にＰＢＳをさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム１容量に対し、凍結乾燥緩衝液９容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、凍結乾燥機（Ｇｅｎｅｖａｃ社製）を用いて、凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。なお、凍結乾燥緩衝液として、ＰＢＳ、およびＰＢＳにラクトース、フルクトース、メチルβシクロデキストリン（ＭβＣＤ）、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（ＨｐβＣＤ）、γシクロデキストリン（γＣＤ）、グルコース、ラクチトール、ソルビトール、キシリトール、ショ糖、トレハロース、マンニトール、キシロースをｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．２．０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬとなるように用いた。
その後、凍結乾燥物をミリＱ水（ミリポア社製）に溶解させた。
３）エクソソーム特異的抗原（ＣＤ９）量の測定に基づくエクソソームの安定性評価
これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、ＥＬＩＳＡ系で評価した。具体的には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ社製）に、自社製抗ＣＤ９抗体を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。その後、各ウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、０．５重量％ＢＳＡを含むＰＢＳ２００μＬを添加して、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、凍結乾燥物の溶解物１００μＬを各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ビオチン化した同自社製抗ＣＤ９抗体を含むＰＢＳ１００μＬを各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ（ＳＡ－ＡＬＰ、ＧｅｎｅＴｅｘ社製）を含むＰＢＳ１００μＬを各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄し、ルミパルス基質液１００μＬを添加し、３７℃で５分反応させた後、波長４８０ｎｍの発光カウントを測定した。凍結乾燥していないサンプルのカウントを１００％とした。
その結果、これら糖類を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した（図５Ａおよび図５Ｂ）。特に、糖を１０ｍｇ／ｍＬまたは５０ｍｇ／ｍＬで含む凍結乾燥緩衝液では、検討した大部分の糖でエクソソーム量が増大した。
したがって、エクソソームの凍結乾燥において、各種糖がエクソソームを安定化できること、および、特に糖の濃度が１０～５０ｍｇ／ｍＬである場合に高い安定化効果が奏されることが示された。
実施例５:各種糖およびキレート剤の併用によるエクソソームの安定化
エクソソームの凍結乾燥に対する各種糖およびキレート剤の併用による効果を検討した。
１）エクソソームの回収、エクソソームの凍結乾燥およびエクソソーム特異的抗原（ＣＤ９）量の測定に基づくエクソソームの安定性評価
凍結乾燥緩衝液を除き、実施例４に記載の方法にて、エクソソームの回収および凍結乾燥、並びにエクソソームの安定性評価を行った。
凍結乾燥緩衝液としては、ＰＢＳもしくはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．５０ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ ＥＧＴＡ）（ＥＤ／ＥＧ）、またはこれらのいずれかにラクトース、γシクロデキストリン（γＣＤ）、グルコース、ラクチトールをｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１０ｍｇ／ｍＬで添加したものを用いた。
その結果、これら糖類およびキレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した（図６）。
したがって、糖によるエクソソームの安定化は、キレート剤の存在下で向上されることが示された。
実施例６:血清由来のエクソソームの安定化
血清由来のエクソソームの凍結乾燥に対する各種糖もしくはキレート剤またはこれらの併用による効果を検討した。
１）エクソソームの回収
ヒト血清をサンプルとして用いた。血清を、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心した後、２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。次に、上清を、１００，０００×ｇ、４℃で３時間遠心した。上清を捨て、ＰＢＳを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、１００，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、新たにＰＢＳを加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
２）エクソソームの凍結乾燥およびエクソソーム特異的抗原（ＣＤ９）量の測定に基づくエクソソームの安定性評価
エクソソームの凍結乾燥およびエクソソームの安定性評価は、凍結乾燥緩衝液を除き、実施例４に記載の方法にて行った。
凍結乾燥緩衝液としては、ＰＢＳもしくはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．５０ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ ＥＧＴＡ）（ＥＤ／ＥＧ）、またはこれらのいずれかにラクトース、グルコース、ラクチトールをｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１０ｍｇ／ｍＬもしくは５０ｍｇ／ｍＬで添加したものを用いた。
その結果、これら糖類またはキレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した（図７）。さらに、糖類とキレート剤の両方を含む凍結乾燥緩衝液を用いた場合は、エクソソーム量がさらに増大した。
したがって、糖類およびキレート剤によるエクソソームの安定化向上の効果は血清由来のエクソソームにも示された。
実施例７：カルボキシメチルセルロースによるエクソソームの安定化
エクソソームの凍結乾燥に対するカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の効果を検討した。
１）エクソソームの回収
３日間無血清培地で培養したヒト非小細胞肺癌細胞Ｈ１２９９の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５（ミリポア社製）を用いて濃縮した。濃縮物を１００，０００×ｇ、４℃で３時間遠心した。上清を捨て、ＰＢＳを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、１００，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、新たにＰＢＳを加えて、エクソソームを回収した。
２）エクソソームの凍結乾燥
回収したエクソソームをＱｕｂｉｔ（商標） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にてタンパク定量を行い、濃度を調整した。次に、回収したエクソソーム１容量に対し、等量の凍結乾燥緩衝液と混合し、－２０℃で３時間凍結した後、遠心エバポレーター（スクラム社製）を用いて乾燥させた。その後、凍結乾燥物をミリＱ水（ミリポア社製）で溶解させ、さらにＰＢＳを加えて希釈した。なお、凍結乾燥緩衝液としてＰＢＳ、ＣＭＣ／ＰＢＳ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．０．２重量％または１重量％ＣＭＣ）を用いた。
３）エクソソーム特異的抗原（ＣＤ９）量の測定に基づくエクソソームの安定性評価
これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、固相に自社製抗ＣＤ９抗体、検出にビオチン化した同自社製抗ＣＤ９抗体およびＳＡ－ＡＬＰ（ＧｅｎｅＴｅｘ社製）を用いたＥＬＩＳＡ系で、凍結乾燥していないサンプルのカウントを１００％として評価した。
その結果、凍結乾燥時に０．２重量％ＣＭＣまたは１重量％ＣＭＣを含む条件では、残存するエクソソームの量が増大した（図８）。
したがって、エクソソームの凍結乾燥においてＣＭＣがエクソソームを安定化できることが示された。

Claims (12)

  1. 細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法。
  2. 細胞外小胞がエクソソームである、請求項１に記載の方法。
  3. 細胞外小胞含有試料が体液または培養上清である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 細胞外小胞含有試料が血液試料である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 混合における糖の濃度が２．５～１００ｍｇ／ｍＬである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 混合におけるキレート剤の濃度が１～２００ｍＭである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 以下を含む、細胞外小胞の安定化方法：
    （１）細胞外小胞含有試料を糖と混合すること；および
    （２）細胞外小胞含有試料と糖との混合物を凍結させること。
  8. 凍結が凍結乾燥である、請求項７に記載の方法。
  9. 以下を含む、細胞外小胞の安定化方法：
    （１）細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合すること；および
    （２）細胞外小胞含有試料とキレート剤との混合物を凍結させること。
  10. 凍結が凍結乾燥である、請求項９に記載の方法。
  11. 糖およびキレート剤を含む、細胞外小胞安定化試薬。
  12. 糖またはキレート剤を含む、細胞外小胞の凍結保存安定化試薬。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102452657B1 (ko) * 2020-09-09 2022-10-11 조선대학교 산학협력단 Noxa 단백질에서 유래한 펩타이드를 포함하는 세포외 소포 생산 촉진용 조성물 및 이를 이용한 세포외 소포의 생산 방법
US11833224B1 (en) * 2023-02-08 2023-12-05 Leuvian Llc Lyoprotectant compositions and uses thereof
JP2024114631A (ja) * 2023-02-10 2024-08-23 中国▲医▼薬大学 細胞外小胞／エクソソーム保存溶液及びその混合溶液
CN116855439B (zh) * 2023-08-23 2024-03-15 深圳市华健生物技术有限公司 一种提高植物外泌体稳定性的提取方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150052667A (ko) 2013-11-06 2015-05-14 삼성전자주식회사 시료 중 소포를 안정화시키는 방법
KR20180042217A (ko) * 2015-06-12 2018-04-25 허드슨 인스티튜트 오브 메디컬 리서치 치료 방법
US20190060367A1 (en) * 2016-03-03 2019-02-28 Henry Ford Health System 3-d collagen scaffold-generated exosomes and uses thereof
WO2017194499A1 (en) * 2016-05-09 2017-11-16 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Tissue-specific exosomes as biomarkers
US20190231694A1 (en) * 2016-10-12 2019-08-01 Agency For Science, Technology And Research Method for lyophilising an exosome

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