WO2019124522A1 - 細胞外小胞の安定化方法 - Google Patents

細胞外小胞の安定化方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2019124522A1
WO2019124522A1 PCT/JP2018/047098 JP2018047098W WO2019124522A1 WO 2019124522 A1 WO2019124522 A1 WO 2019124522A1 JP 2018047098 W JP2018047098 W JP 2018047098W WO 2019124522 A1 WO2019124522 A1 WO 2019124522A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sugar
chelating agent
exosome
extracellular
pbs
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/047098
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
達俊 犬塚
綾子 栗本
佑季 川▲崎▼
Original Assignee
合同会社みらか中央研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 合同会社みらか中央研究所 filed Critical 合同会社みらか中央研究所
Priority to EP18892197.7A priority Critical patent/EP3730603A4/en
Priority to US16/955,553 priority patent/US20200319175A1/en
Priority to JP2019560577A priority patent/JPWO2019124522A1/ja
Publication of WO2019124522A1 publication Critical patent/WO2019124522A1/ja
Priority to JP2023137566A priority patent/JP2023153401A/ja
Priority to US18/544,491 priority patent/US20240118270A1/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/40—Cyclodextrins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/96—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood or serum control standard

Definitions

  • the present invention relates to a method of stabilizing extracellular vesicles and the like.
  • Extracellular vesicles are small vesicles having a membrane structure secreted from various types of cells, and are present in body fluids such as blood. Extracellularly secreted extracellular vesicles include exosomes, ectosomes, and apoptotic blebs. Extracellular vesicles are analyzed for purposes such as diagnosis and drug discovery because they contain various substances responsible for functions such as signal transduction between cells. Therefore, development of a method for treating extracellular vesicles useful for such analysis is required.
  • Patent Document 1 (1) can improve the yield of extracellular vesicles in the presence of EDTA (chelating agent) as low as about 3.0 mg / mL (about 10 ⁇ M) or less, but the concentration is higher In the presence of EDTA (Example 1, FIGS. 1A-1C), (2) in the presence of a low concentration of EDTA of about 2.25 mg / mL (about 7.7 ⁇ M). Storage of extracellular vesicles at a given temperature and time (Example 2, FIGS. 2A and 2B, FIGS. 3A to 3F), and (3) a low concentration of about 2.25 mg / mL (about 7.7 ⁇ M). Freezing and thawing extracellular vesicles in the presence of concentrations of EDTA (Example 3, FIGS. 4A and 4B) is described.
  • EDTA chelating agent
  • the object of the present invention is to develop a method which can stabilize extracellular vesicles.
  • the present inventors have found that, by mixing an extracellular vesicle-containing sample with a predetermined component such as a sugar, the extracellular vesicles in the extracellular vesicle-containing sample can be stabilized, etc.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • a method for stabilizing extracellular vesicles which comprises mixing an extracellular vesicle-containing sample with a sugar and a chelating agent.
  • the method of any of [1] to [4], wherein the concentration of sugar in the mixture is 2.5 to 100 mg / mL.
  • a method of stabilizing extracellular vesicles including the following: (1) mixing the extracellular vesicle-containing sample with sugar; and (2) freezing the mixture of extracellular vesicle-containing sample and sugar.
  • the method of [7], wherein the freezing is lyophilization.
  • a method for stabilizing extracellular vesicles including the following: (1) mixing the extracellular vesicle-containing sample with the chelating agent; and (2) freezing the mixture of the extracellular vesicle-containing sample and the chelating agent.
  • Extracellular vesicle-containing samples can be mixed with sugar to stabilize extracellular vesicles in the extracellular vesicle-containing sample.
  • the invention is useful, for example, for the preservation of extracellular vesicles.
  • FIG. 1 is a graph showing exosome yield after lyophilization under each buffer condition in Example 1. The exosome yield under non-lyophilized conditions is shown at 100%.
  • FIG. 2 is a graph showing exosome yield after lyophilization under each buffer condition in Example 2. The exosome yield under non-lyophilized conditions is shown at 100%.
  • 3A is a diagram showing measurement of particle number and particle size distribution of a pre-lyophilized sample (Control) of culture supernatant of human colon cancer cells SW1116 in Example 3.
  • FIG. 3B is a diagram showing measurement of particle number and particle size distribution of a pre-lyophilization sample (ED / EG) of culture supernatant of human colon cancer cells SW1116 in Example 3.
  • FIG. 3C is a diagram showing measurement of particle number and particle size distribution of a freeze-dried sample (Control) of culture supernatant of human colon cancer cells SW1116 in Example 3.
  • FIG. 3D is a diagram showing measurement of particle number and particle size distribution of a freeze-dried sample (ED / EG) of culture supernatant of human colon cancer cells SW1116 in Example 3.
  • FIG. 4A is a drawing showing western blotting of a sample obtained by immunoprecipitation of serum samples mixed with each chelating agent at each concentration in Reference Example 1 with a biotinylated anti-CD9 antibody.
  • FIG. 4B is a diagram showing Western blotting of a sample obtained by immunoprecipitation of a plasma sample mixed with each chelating agent at each concentration in Reference Example 1 with a biotinylated anti-CD9 antibody.
  • FIG. 5A is a graph showing exosome yield after lyophilization under each buffer condition in Example 4 (following FIG. 5B). The exosome yield under non-lyophilized conditions is shown at 100%.
  • FIG. 5B is a graph showing exosome yield after lyophilization under each buffer condition in Example 4. The exosome yield under non-lyophilized conditions is shown at 100%.
  • FIG. 6 is a graph showing exosome yield after lyophilization under each buffer condition in Example 5. The exosome yield under non-lyophilized conditions is shown at 100%.
  • FIG. 5A is a graph showing exosome yield after lyophilization under each buffer condition in Example 4 (following FIG. 5B). The exosome yield under non-lyophilized conditions is shown at 100%.
  • FIG. 7 is a graph showing exosome yield after lyophilization of human serum samples under each buffer condition in Example 6. The exosome yield under non-lyophilized conditions is shown at 100%.
  • FIG. 8 is a graph showing exosome yield after lyophilization under each buffer condition in Example 7. The exosome yield under non-lyophilized conditions is shown at 100%.
  • the present invention provides a method of stabilizing extracellular vesicles, which comprises mixing an extracellular vesicle-containing sample with a sugar.
  • the present invention also provides a method of stabilizing extracellular vesicles, which comprises mixing an extracellular vesicle-containing sample with a chelating agent.
  • the present invention also provides a method of stabilizing extracellular vesicles, which comprises mixing an extracellular vesicle-containing sample with a sugar and a chelating agent.
  • Extracellular vesicles are microscopic vesicles with membrane structures that are secreted from various types of cells.
  • Extracellular vesicles include, for example, exosomes, ectosomes, and apoptotic vesicles.
  • the extracellular vesicles are exosomes.
  • Extracellular vesicles can also be defined by their size. The size of extracellular vesicles is, for example, 30 to 1000 nm, preferably 50 to 300 nm, more preferably 80 to 200 nm.
  • the measurement of the size of extracellular vesicles can be performed by, for example, a method based on Brownian movement of extracellular vesicles, a light scattering method, and an electrical resistance method.
  • measurement of extracellular vesicle size is performed by NanoSight LM10 (manufactured by Malvern Instruments).
  • NanoSight LM10 manufactured by Malvern Instruments
  • detection threshold 15 can be adopted as measurement conditions: measurement time 30 seconds, repetition number 3 times.
  • Extracellular vesicles can be further defined by extracellular vesicle markers.
  • extracellular vesicle markers for example, CD9, carcinoembryonic antigen (CEA), CD81, CD63, heat shock protein (HSP) 70, HSP90, major histocompatibility complex (MHC) I, tumor sensitivity Gene (TSG) 101, lysosome associated membrane protein (LAMP) 1, intercellular adhesion molecule (ICAM) -1, integrin, ceramide, cholesterol, phosphatidylserine, ALIX, Annexins, Caveolin-I, Flotillin-I, Rab protein, EpCAM Can be mentioned.
  • CCA carcinoembryonic antigen
  • HSP heat shock protein
  • MHC major histocompatibility complex
  • TSG tumor sensitivity Gene
  • LAMP lysosome associated membrane protein
  • IAM intercellular adhesion molecule
  • integrin integrin
  • ceramide cholesterol
  • cholesterol phosphatidylserine
  • ALIX phosphatidylserine
  • ALIX Annex
  • Extracellular vesicle-containing sample is any sample containing extracellular vesicles.
  • the extracellular vesicle-containing sample is a biological fluid sample.
  • the extracellular vesicle-containing sample may be subjected to other treatments before being used in the method of the present invention. Such treatments include, for example, centrifugation, extraction, filtration, precipitation, heating, refrigeration, and agitation.
  • the extracellular vesicle-containing sample is a culture supernatant.
  • the culture supernatant may be a cell culture supernatant or a tissue culture supernatant.
  • organisms from which cells or tissues to be cultured are derived include, for example, mammals (eg, primates such as humans and monkeys; rodents such as mice, rats and rabbits; domestic animals such as cows, pigs and goats; , Working animals such as sheep), animals such as birds (eg, chickens), insects, microorganisms (eg, bacteria), plants, and fish.
  • the organism is a mammal, such as a human.
  • the extracellular vesicle-containing sample is a body fluid.
  • Body fluid is body fluid derived from an organism as described above.
  • body fluids include blood samples (eg, whole blood, serum and plasma), lymph fluid, tissue fluid, cerebrospinal fluid, ascites fluid, saliva, pancreatic fluid, bile, sweat, semen, urine, tears, mucus, milk, thorax fluid Bronchoalveolar lavage fluid and amniotic fluid.
  • the body fluid is blood.
  • the extracellular vesicle-containing sample is milk or fruit juice.
  • sugar is a monosaccharide (eg, aldose, ketose) or a polysaccharide in which two or more monosaccharides are linked by glycosidic linkage.
  • sugars also include derivatives and sugar alcohols.
  • the derivative of a sugar refers to a compound in which a hydrogen atom, a hydroxyl group or a carbonyl group in a sugar is substituted by a substituent.
  • Sugar alcohol refers to a compound in which a carbonyl group is reduced in sugar.
  • triose eg, glyceraldehyde, dihydroxyacetone
  • tetrose eg, erythrose, threose, erythrulose
  • pentose eg, xylose, ribose, arabinose, liquisose, ribulose
  • examples include xylulose, apiose
  • hexose eg, glucose, fructose, galactose, mannose, allose, altrose, gulose, idose, talose, psicose, sorbose, tagatose
  • heptose eg, sedoheptulose, coriose
  • Aldoses include, for example, xylose, glucose, galactose, mannose, glyceraldehyde, erythrose, threose, ribose, arabinose, lyxose, allose, allose, gulose, idose, talose.
  • ketoses include fructose, dihydroxyacetone, erythrulose, xylulose, ribulose, psicose, sorbose, tagatose, sedoheptulose, coriose.
  • polysaccharides examples include polysaccharides in which two or more monosaccharides as described above are linked.
  • a polysaccharide in which one or more kinds of two or more monosaccharide units selected from the group consisting of glucose, fructose, galactose, mannose, xylose are glycosidically linked (eg, one or more glucose and 1 Polysaccharides in which one or more fructoses are glycosidically linked.
  • Such polysaccharides may be linear or cyclic polysaccharides.
  • the linear polysaccharide may be a linear oligosaccharide or a linear polymeric polysaccharide.
  • the polysaccharide is a linear oligosaccharide
  • the total number of monosaccharide units in the polysaccharide is, for example, 2 to 20, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 6, still more preferably 2 to 4
  • the number of glucose and fructose in the polysaccharide is independently, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5 More preferably, it may be 1 to 3, still more preferably 1 or 2.
  • linear oligosaccharides include disaccharides. Examples of disaccharides include sucrose, lactose and trehalose.
  • the disaccharide is sucrose in which one glucose and one fructose are glycosidically linked.
  • chain polymer polysaccharides include cellulose, amylose, amylopectin, glucomannan, pullulan, galactomannan, inulin, glycogen, chitin, chitosan, glucuronoxylan, arabinoxylan, agarose, carrageenan, pectin, pectic acid, alginic acid, fucoidan, chondroitin Examples include sulfuric acid and hyaluronan.
  • the polysaccharide is a cyclic polysaccharide
  • the total number of monosaccharide units in the polysaccharide is, for example, 5 to 100, preferably 5 to 20, more preferably 5 to 10, still more preferably 6 to 8 May be
  • cyclic polysaccharides include cyclodextrin ( ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin).
  • the substituent in derivatives of sugars for example, a hydrogen atom, a hydroxyl group, C 1 ⁇ 6 alkyl group, C 1 ⁇ 6 alkenyl group, C 1 ⁇ 6 alkynyl group, C 1 ⁇ 6 alkyloxy (alkoxy) group, C 6 And an aromatic hydrocarbon group, a C 1-6 alkyl-carbonyl (acyl) group, a carboxy group, a nitro group, an amino group and a cyano group.
  • the C 1-6 alkyl group is an alkyl having 1 to 6 carbon atoms, and may be linear, branched or cyclic, and linear or branched alkyl is preferable.
  • a C 1-6 alkyl group for example, methyl, ethyl, propyl, iso-propyl, butyl, iso-butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, 1-ethylpropyl, hexyl, isohexyl, Examples include 1,1-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl and 2-ethylbutyl.
  • the C 1-6 alkyl group is an alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, and may be linear, branched or cyclic, with linear or branched alkenyl being preferred.
  • Examples of C 1-6 alkenyl groups include ethenyl (vinyl), propenyl, butenyl, pentenyl and hexenyl.
  • a C 1-4 alkenyl group is preferable, and a C 1-3 alkenyl group is more preferable.
  • the C 1-6 alkynyl group is an alkynyl group having 1 to 6 carbon atoms, and may be linear, branched or cyclic, with linear or branched alkynyl being preferred.
  • the C 1-6 alkynyl group for example, ethynyl, propynyl, butynyl, pentynyl and hexynyl can be mentioned.
  • As the C 1-6 alkynyl group a C 1-4 alkynyl group is preferable, and a C 1-3 alkynyl group is more preferable.
  • C 1-6 alkyloxy group is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the C 1 ⁇ 6 alkyl group for example, methyloxy, ethyloxy, propyloxy, iso- propyloxy, butyloxy, iso- butyloxy, sec- butyloxy, tert- butyloxy, pentyloxy, isopentyloxy, neopentyloxy, 1-ethylpropyloxy, hexyloxy, isohexyloxy, 1,1-dimethylbutyloxy, 2,2-dimethylbutyloxy, 3,3-dimethylbutyloxy, 2-ethylbutyloxy.
  • the C 1 ⁇ 6 alkyl group preferably C 1 ⁇ 4 alkyl group, C 1 ⁇ 3 alkyl group is more preferable.
  • the C 6 ⁇ 14 aromatic hydrocarbon group for example, phenyl, naphthyl, anthracenyl.
  • the C 6 ⁇ 14 aromatic hydrocarbon groups include phenyl, naphthyl are preferable, and phenyl is more preferable.
  • C 1 ⁇ 6 alkyl - as carbonyl (acyl) group a carbonyl group having a C 1 ⁇ 6 alkyl group as defined above.
  • a C 1-6 alkyl-carbonyl group for example, methylcarbonyl (acetyl), ethylcarbonyl, propylcarbonyl, iso-propylcarbonyl, butylcarbonyl, iso-butylcarbonyl, sec-butylcarbonyl, tert-butylcarbonyl, pentylcarbonyl , Isopentylcarbonyl, neopentylcarbonyl, 1-ethylpropylcarbonyl, hexylcarbonyl, isohexylcarbonyl, 1,1-dimethylbutylcarbonyl, 2,2-dimethylbutylcarbonyl, 3,3-dimethylbutylcarbonyl, 2-ethylbutyl Carbonyl is mentioned.
  • substituents may be further substituted by another substituent.
  • a hydroxyl group, a carboxy group, a nitro group, an amino group, a cyano group is mentioned, for example.
  • derivatives of substituted sugars include derivatives of cyclic polysaccharides (eg, cyclodextrins such as ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, or ⁇ -cyclodextrin, etc.) and chain polymer polysaccharides (eg, cellulose) It can be mentioned.
  • Derivatives of cyclic polysaccharides include, for example, cyclic polysaccharides substituted with an optionally substituted alkyl group (eg, methyl ⁇ cyclodextrin, hydroxypropyl ⁇ cyclodextrin).
  • derivatives of linear high molecular weight polysaccharides include cellulose derivatives.
  • the cellulose derivative is a cellulose derivative in which a hydrogen atom of at least one hydroxyl group of cellulose is substituted by a hydrophilic group.
  • the hydrophilic group in the cellulose derivative include carboxyalkyl (eg, carboxy C 1-6 alkyl) and hydroxyalkyl (eg, hydroxy C 1-6 alkyl).
  • the hydrophilic group in the cellulose derivative is preferably carboxyalkyl or hydroxyalkyl.
  • carboxyalkyl examples include carboxymethyl, carboxyethyl (1-carboxyethyl, 2-carboxyethyl), carboxypropyl (1-carboxypropyl, 2-carboxypropyl, 3-carboxypropyl), carboxyisopropyl (1-carboxy-) 2-Methylethyl, 2-carboxy-2-methylethyl), carboxybutyl (1-carboxybutyl, 2-carboxybutyl, 3-carboxybutyl, 4-carboxybutyl), carboxy t-butyl, carboxypentyl (1-carboxy Pentyl, 2-carboxypentyl, 3-carboxypentyl, 4-carboxypentyl, 5-carboxypentyl, carboxyhexyl (1-carboxyhexyl, 2-carboxyhexyl, 3-carboxyhexyl) , 4-carboxy-hexyl, 5-carboxy-hexy
  • hydroxyalkyl examples include hydroxymethyl, hydroxyethyl (1-hydroxyethyl, 2-hydroxyethyl), hydroxypropyl (1-hydroxypropyl, 2-hydroxypropyl, 3-hydroxypropyl), hydroxyisopropyl (1-hydroxy-) 2-Methylethyl, 2-hydroxy-2-methylethyl), hydroxybutyl (1-hydroxybutyl, 2-hydroxybutyl, 3-hydroxybutyl, 4-hydroxybutyl), hydroxy tert-butyl, hydroxypentyl (1-hydroxy Pentyl, 2-hydroxypentyl, 3-hydroxypentyl, 4-hydroxypentyl, 5-hydroxypentyl), hydroxyhexyl (1-hydroxyhexyl, 2-hydroxyhexyl, 3-hydroxyhexyl) , 4-hydroxyhexyl, 5-hydroxyhexyl, 6-hydroxyhexyl) and the like.
  • Specific examples of the cellulose derivative include carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose or
  • Nanocellulose is a fibrous cellulose having a fiber width of nanometer order.
  • the fiber width of the nanocellulose may be, for example, 500 nm or less, preferably 200 nm or less, more preferably 100 nm or less, still more preferably 50 nm or less, still more preferably 10 nm or less, particularly preferably 5 nm or less.
  • Cellulose derivatives also include their salts.
  • a salt for example, salts of metals (eg, monovalent metals such as lithium, sodium, potassium, rubidium and cesium, and divalent metals such as calcium, magnesium and zinc), and inorganic bases (eg, Salts of ammonia).
  • metals eg, monovalent metals such as lithium, sodium, potassium, rubidium and cesium, and divalent metals such as calcium, magnesium and zinc
  • inorganic bases eg, Salts of ammonia
  • sugar alcohol for example, monomers obtained by reducing the carbonyl group in a monosaccharide as described above, multimers in which these monomers are linked by, for example, glycosidic bond, and monomers and monosaccharides thereof As a structural unit, for example, a multimer linked by glycosidic bond can be mentioned.
  • Examples of the above monomers include tritol (eg, glycerol), tetolytol (eg, erythritol, tritol), pentitol (eg, xylitol, arabinitol, ribitol), hexitol (eg, sorbitol, mannitol, iditol, gato) Lactitol), heptitol (eg, boremitol, perseitol), octyltol (eg, erythrogalactonoctitol).
  • tritol eg, glycerol
  • tetolytol eg, erythritol, tritol
  • pentitol eg, xylitol, arabinitol, ribitol
  • hexitol eg, sorbitol, mannitol, iditol,
  • sugar alcohols include monomers such as xylitol, sorbitol, mannitol, galactitol, fusitol, boremitol, arabinitol, glycerin, iditol, erythritol, threitol, ribitol, and dimers such as lactitol and maltitol. .
  • a mixture of two or more (eg, two, three, four, five) sugars may be mixed with the extracellular vesicle-containing sample.
  • the present invention may include the addition of sugar to the extracellular vesicle-containing sample before mixing the extracellular vesicle-containing sample with the sugar.
  • the sugar may be added simultaneously or separately with the chelating agent.
  • the concentration of sugar in the mixture is not particularly limited as long as the extracellular vesicle can be stabilized.
  • concentration varies depending on factors such as the type of sugar, but may be, for example, 2.5 mg / mL or more, preferably 3.0 mg / mL or more, more preferably 3.5 mg / mL or more, Still more preferably 4.0 mg / mL or more, even more preferably 4.5 mg / mL or more, particularly preferably 5.0 mg / mL or more, 6.0 mg / mL or more, 8.0 mg / mL or more, or 10.0 mg It may be / mL or more.
  • Such concentration also varies depending on factors such as the type of sugar, but may be, for example, 600 mg / mL or less, 400 mg / mL or less, 200 mg / mL or less, or 100 mg / mL or less, preferably 95 mg / mL. mL or less, more preferably 90 mg / mL or less, even more preferably 85 mg / mL or less, even more preferably 80 mg / mL or less, particularly preferably 75 mg / mL or less, 70 mg / mL or less, 60 mg / mL or less, or 50 mg / mL It may be less than or equal to mL.
  • the concentration of sugar varies depending on factors such as the type of sugar, for example, 2.5 to 800 mg / mL, 2.5 to 600 mg / mL, 2.5 to 400 mg / mL, It may be 5 to 200 mg / mL, or 2.5 to 100 mg / mL, preferably 3.0 to 95 mg / mL, more preferably 3.5 to 90 mg / mL, still more preferably 4.0 to 85 mg / ML, even more preferably 4.5 to 80 mg / mL, particularly preferably 5.0 to 75 mg / mL, 6.0 to 70 mg / mL, 8.0 to 60 mg / mL, or 10.0 to 50 mg / mL It may be
  • the chelating agent is a compound having a coordinating moiety capable of coordinate bond with a metal ion or a salt thereof.
  • the number of coordinating moieties is preferably 2 or more, more preferably 3 or more (eg, 3 or 6).
  • a coordination atom as a coordination part, an oxygen atom, a phosphorus atom, a nitrogen atom, a sulfur atom, and a chlorine atom are mentioned, for example.
  • the coordinating atom is preferably an oxygen atom or a phosphorus atom, more preferably an oxygen atom.
  • As a coordination group as a coordination part the group which has the said coordination atom is mentioned, for example.
  • the coordinating group is preferably a carboxylic acid group or a phosphoric acid group, more preferably a carboxylic acid group.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • EGTA glycol ether diamine tetraacetic acid
  • HEDTA hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid
  • HIDA hydroxyethyliminodiacetic acid
  • NTA nitrilotriacetic acid
  • Ethylene diamine tetra (methylene phosphonic acid) (EDTMP) and salts thereof.
  • the salt examples include metal salts (eg, monovalent metal salts such as sodium salt and potassium salt, and divalent metal salts such as calcium salt and magnesium salt), inorganic salts (eg, fluoride, chloride, Bromides, halide salts such as iodide, and ammonium salts), organic salts (eg, ammonium salts substituted with alkyl group), and acid addition salts (eg, sulfuric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, phosphoric acid) And salts with inorganic acids, and salts with organic acids such as acetic acid, oxalic acid, lactic acid, citric acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid and the like).
  • metal salts eg, monovalent metal salts such as sodium salt and potassium salt, and divalent metal salts such as calcium salt and magnesium salt
  • inorganic salts eg, fluoride, chloride, Bromides, halide salt
  • a mixture of two or more (e.g., two, three, four, five) chelating agents may be mixed with the extracellular vesicle-containing sample.
  • the present invention may include adding a chelating agent to the extracellular vesicle-containing sample prior to mixing the extracellular vesicle-containing sample with the chelating agent.
  • the concentration of the chelating agent in the mixture is not particularly limited as long as extracellular vesicles can be stabilized.
  • concentration varies depending on factors such as the type of chelating agent, but is, for example, 1 mM or more, preferably 5 mM or more, more preferably 10 mM or more, still more preferably 15 mM or more, still more preferably 20 mM or more, particularly preferably It may be 30 mM or more, 40 mM or more, or 50 mM or more.
  • Such concentration also varies depending on factors such as the type of chelating agent, but is, for example, 200 mM or less, preferably 180 mM or less, more preferably 170 mM or less, still more preferably 160 mM or less, still more preferably 150 mM or less, particularly preferably May be 140 mM or less, 120 mM or less, or 100 mM or less.
  • the concentration of the chelating agent is, for example, 1 mM to 200 mM, preferably 5 to 180 mM, more preferably 10 to 170 mM, still more preferably 15 to 160 mM, still more preferably 20 to 150 mM, particularly preferably 30 It may be ⁇ 140 mM, 40-120 mM, or 50-100 mM.
  • Extracellular vesicle-containing samples may be mixed with both sugars and chelating agents.
  • the concentration of sugar and chelating agent used in the mixing can also be defined by their ratio.
  • the concentration of chelating agent per 10 mg / mL of sugar in mixing varies depending on factors such as sugar and type of chelating agent, but it is, for example, 1 mM or more, preferably 5 mM or more, preferably 10 mM or more, still more preferably 15 mM
  • the above may be even more preferably 20 mM or more, particularly preferably 30 mM or more, 40 mM or more, or 50 mM or more.
  • Such concentration also varies depending on factors such as sugar and type of chelating agent, but for example 200 mM or less, preferably 180 mM or less, more preferably 170 mM or less, still more preferably 160 mM or less, still more preferably 150 mM or less, Particularly preferably, it may be 140 mM or less, 120 mM or less, or 100 mM or less.
  • the concentration of the chelating agent is, for example, 1 mM to 200 mM, preferably 5 to 180 mM, more preferably 10 to 170 mM, still more preferably 15 to 160 mM, still more preferably 20 to 150 mM, particularly preferably 30 It may be ⁇ 140 mM, 40-120 mM, or 50-100 mM.
  • the mixing can be done in any manner.
  • the mixing can be done simultaneously or separately.
  • the extracellular vesicle-containing sample may be (1) mixed simultaneously with the sugar and the chelating agent, (2) mixed with the sugar, and then mixed with the chelating agent, or 3) After being mixed with a chelating agent, it may be mixed with sugar. From the viewpoint of simplicity of operation, etc., the extracellular vesicle-containing sample may preferably be mixed simultaneously with the sugar and the chelating agent.
  • the mixing temperature may be, for example, 4 to 37 ° C, preferably 15 to 30 ° C.
  • the mixing time is not particularly limited as long as extracellular vesicles can be stabilized, and can be set as appropriate.
  • the extracellular vesicle-containing sample may be left after mixing with predetermined components such as sugars.
  • whether or not the extracellular vesicle is stabilized by mixing with a predetermined component such as sugar can be determined by, for example, an index value measured after mixing the extracellular vesicle with a predetermined component such as sugar, sugar, etc. Whether the index value is superior to the control value as compared to the control value measured for extracellular vesicles in the absence of the predetermined component of (the condition other than the presence or absence of the predetermined component such as sugar being the same) It can do by evaluating whether or not.
  • lyophilization is performed at -28 ° C for 2 hours, -10 ° C for 4 hours, and then at 20 ° C.
  • index values of the lyophilizate in the presence or absence of predetermined components such as sugar may be compared.
  • an index value for example, a measurement value of an extracellular vesicle marker amount or a particle number corresponding to the extracellular vesicle can be used.
  • Measurement of extracellular vesicle marker levels can be performed by any method known in the art.
  • the extracellular vesicle marker is a protein
  • examples of the measurement method include immunoassay and mass spectrometry.
  • Immunoassays include, for example, direct competition, indirect competition, and sandwich techniques.
  • chemiluminescence immunoassay [eg, chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA)], immunoturbidimetric assay (TIA), enzyme immunoassay (EIA) (eg, direct competition ELISA) , Indirect competitive ELISA, and sandwich ELISA), radioimmunoassay (RIA), latex agglutination, fluorescence immunoassay (FIA), and immunochromatography, Western blotting, immunostaining, fluorescence activated cell sorting, FACS Can be mentioned. If multiple components are detected, proteome analysis may be performed.
  • CLIA chemiluminescence immunoassay
  • TIA immunoturbidimetric assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • FIA fluorescence immunoassay
  • FACS fluorescence immunoassay
  • the measurement method may, for example, be a hybridization method using a probe, a gene amplification method using a primer (eg, 2, 3 or 4 primers) or mass spectrometry.
  • a primer eg, 2, 3 or 4 primers
  • mass spectrometry e.g., mass spectrometry.
  • the number of particles corresponding to extracellular vesicles can be measured, for example, by a device such as a particle analysis device, an electron microscope, or a flow cytometer.
  • a device such as a particle analysis device, an electron microscope, or a flow cytometer.
  • particle number measurement can be performed by NanoSight LM10 (manufactured by Malvern Instruments).
  • detection threshold 15 can be adopted as measurement conditions: measurement time 30 seconds, repetition number 3 times.
  • the method of the invention may further comprise freezing the mixture.
  • the present invention further provides a method of stabilizing extracellular vesicles, which comprises: (1) mixing the extracellular vesicle-containing sample with sugar; and (2) freezing the mixture of extracellular vesicle-containing sample and sugar.
  • the invention further provides a method of stabilizing extracellular vesicles, which comprises: (1) mixing the extracellular vesicle-containing sample with the chelating agent; and (2) freezing the mixture of the extracellular vesicle-containing sample and the chelating agent.
  • the invention further provides a method of stabilizing extracellular vesicles, which comprises: (1) mixing the extracellular vesicle-containing sample with a sugar and a chelating agent; and (2) freezing a mixture of the extracellular vesicle-containing sample and the sugar and the chelating agent.
  • the freezing may be either lyophilization or freezing of the solution (non-drying freezing), but lyophilization is preferred if the extracellular vesicles are stored for longer periods of time.
  • sugar and chelating agent types and concentrations in mixtures are as described above.
  • Extracellular Vesicle Stabilizing Reagent The present invention also provides an extracellular vesicle stabilizing reagent.
  • the reagents of the present invention include sugars or chelating agents.
  • the reagent of the present invention may contain a sugar and a chelating agent.
  • Sugars and chelating agents are as described above.
  • the reagent of the present invention may contain, in addition to the sugar and the chelating agent, other components (eg, other components useful for stabilizing extracellular vesicles).
  • the reagent of the present invention is an extracellular vesicle stabilizing composition comprising sugar. In another embodiment, the reagent of the present invention is an extracellular vesicle stabilizing composition comprising a chelating agent. In yet another embodiment, the composition of the present invention is an extracellular vesicle stabilizing composition comprising both a sugar and a chelating agent.
  • the reagents of the present invention can be used in admixture with extracellular vesicle-containing samples.
  • the mixture of extracellular vesicle-containing sample and the reagent of the present invention may be frozen.
  • the reagent of the present invention can be used as a cryopreservation stabilization reagent for extracellular vesicles.
  • the freezing may be either lyophilization or freezing of the solution (non-drying freezing), but lyophilization is preferred if the extracellular vesicles are stored for longer periods of time.
  • the concentration of sugar in the composition is not particularly limited as long as it can stabilize extracellular vesicles after being mixed with the extracellular vesicle-containing sample.
  • concentration varies depending on factors such as the type of sugar, but may be, for example, 2.7 mg / mL or more, preferably 3.0 mg / mL or more, more preferably 3.5 mg / mL or more, Still more preferably 4.0 mg / mL or more, even more preferably 4.5 mg / mL or more, particularly preferably 5.0 mg / mL or more, 6.0 mg / mL or more, 8.0 mg / mL or more, or 10.0 mg It may be / mL or more.
  • Such concentration also varies depending on factors such as the type of sugar, but may be, for example, 600 mg / mL or less, 400 mg / mL or less, 200 mg / mL or less, 100 mg / mL or less, preferably 95 mg / mL Or less, more preferably 90 mg / mL or less, still more preferably 85 mg / mL or less, still more preferably 80 mg / mL or less, particularly preferably 75 mg / mL or less, 70 mg / mL or less, 60 mg / mL or less, or 50 mg / mL It may be the following.
  • the concentration of sugar varies depending on factors such as the type of sugar, for example, 2.7 to 800 mg / mL, 2.7 to 600 mg / mL, 2.7 to 400 mg / mL, It may be 7 to 200 mg / mL, or 2.7 to 100 mg / mL, preferably 3.0 to 95 mg / mL, more preferably 3.5 to 90 mg / mL, still more preferably 4.0 to 85 mg / ML, even more preferably 4.5 to 80 mg / mL, particularly preferably 5.0 to 75 mg / mL, 6.0 to 70 mg / mL, 8.0 to 60 mg / mL, or 10.0 to 50 mg / mL It may be
  • the concentration of the chelating agent in the composition is not particularly limited as long as it can stabilize the extracellular vesicles after being mixed with the extracellular vesicle-containing sample. Such concentration varies depending on factors such as the type of chelating agent, but is, for example, 1.1 mM or more, preferably 5 mM or more, preferably 10 mM or more, preferably 15 mM or more, more preferably 20 mM or more, still more preferably 30 mM The above may be even more preferably 40 mM or more, particularly preferably 50 mM or more.
  • Such concentration also varies depending on factors such as the type of chelating agent, but is, for example, 200 mM or less, preferably 180 mM or less, more preferably 170 mM or less, still more preferably 160 mM or less, still more preferably 150 mM or less, particularly preferably May be 140 mM or less, 120 mM or less, or 100 mM or less.
  • the concentration of the chelating agent is, for example, 1.1 mM to 200 mM, preferably 5 to 180 mM, more preferably 10 to 170 mM, still more preferably 15 to 160 mM, still more preferably 20 to 150 mM, particularly preferably May be 30-140 mM, 40-120 mM, or 50-100 mM.
  • the concentration of sugar and chelating agent can also be defined by their ratio.
  • concentration of chelating agent per 10 mg / mL of sugar varies depending on factors such as sugar and type of chelating agent, but for example 1 mM or more, preferably 5 mM or more, preferably 10 mM or more, preferably 15 mM or more, more preferably It may be 20 mM or more, still more preferably 30 mM or more, still more preferably 40 mM or more, particularly preferably 50 mM or more.
  • Such concentration also varies depending on factors such as sugar and type of chelating agent, but for example 200 mM or less, preferably 180 mM or less, more preferably 170 mM or less, still more preferably 160 mM or less, still more preferably 150 mM or less, Particularly preferably, it may be 140 mM or less, 120 mM or less, or 100 mM or less.
  • the concentration of the chelating agent is, for example, 1 mM to 200 mM, preferably 5 to 180 mM, more preferably 10 to 170 mM, still more preferably 15 to 160 mM, still more preferably 20 to 150 mM, particularly preferably 30 It may be ⁇ 140 mM, 40-120 mM, or 50-100 mM.
  • the composition of the present invention is an aqueous solution containing a sugar and / or a chelating agent, even if it is a non-aqueous composition containing sugar and / or a chelating agent (eg mixed powder) dissolved in an aqueous solution upon use
  • a aqueous solution containing a sugar and / or a chelating agent is preferable from the viewpoint of quick and easy use and the like.
  • Aqueous solutions include, for example, water (eg, distilled water, sterile water, sterile distilled water, and pure water), and buffers, with buffers being preferred.
  • buffers examples include phosphate buffer, phosphate buffered saline (PBS), tartrate buffer, citrate buffer, acetate buffer, glycine buffer, carbonate buffer, 2-morpholinoethanesulfonic acid (for example, MES) buffer, trishydroxymethylaminomethane (Tris) buffer, borate buffer, 3-morpholinopropane sulfonic acid (MOPS) buffer, N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine (Bicine) buffer And N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine (Bis-Tris) buffer, 2- [4- (2-hydroxyethyl) 1-piperazinyl ethane sulfonic acid (HEPES) buffer.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Tris trishydroxymethylaminomethane
  • MOPS 3-morpholinopropane sulfonic acid
  • Na N-bis (2-hydroxyethyl) glycine
  • the pH of the buffer is preferably neutral. More specifically, such pH may be preferably 5.0 or more, more preferably 5.5 or more, and even more preferably 6.0 or more. The pH may also be preferably 9.0 or less, more preferably 8.5 or less, and even more preferably 8.0 or less.
  • the measurement of pH can be performed using methods known in the art. Preferably, pH can adopt a value measured at 25 ° C. using a pH meter having a glass electrode.
  • the composition of the present invention can be used as appropriate mixed with an extracellular vesicle-containing sample.
  • the mixing ratio of the composition of the present invention to the extracellular vesicle-containing sample is, for example, 1/30 to 30, preferably 1/20 to 20, more preferably 1/10. To 10, and even more preferably 1/10 to 1.
  • the volume of the aqueous solution is, for example, 1 ⁇ L to 100 mL.
  • the volume of the aqueous solution may be 10 ⁇ L or more, 100 ⁇ L or more, or 1000 ⁇ L or more.
  • the volume of the aqueous solution may also be 50 mL or less, 10 mL or less, or 2 mL or less.
  • the reagent of the present invention is a kit comprising a sugar and / or a chelating agent.
  • the sugar and / or chelating agent can be provided in the form of a solid or an aqueous solution, but is preferably provided in the form of an aqueous solution.
  • the kit of the present invention may be provided in the form of an aqueous solution containing sugar, may be provided in the form of an aqueous solution containing a chelating agent, and may be provided in the form of an aqueous solution containing sugar and a chelating agent , A first aqueous solution containing sugar, and a second aqueous solution containing a chelating agent.
  • the aqueous solution is as described above, but a buffer is preferred. Examples of buffers and pH are as described above.
  • the relationship between the concentration of sugar in the first aqueous solution, the concentration of chelating agent in the second aqueous solution, and the concentration ratio of sugar and chelating agent in the first and second aqueous solutions is the same as that described above for the composition of the present invention is there.
  • the mixing ratio of the first and second aqueous solutions to the extracellular vesicle-containing sample, and the volumes of the first and second aqueous solutions are the same as those described above for the composition of the present invention.
  • the invention also provides mixtures comprising sugars and / or chelating agents and extracellular vesicles.
  • the mixture of the present invention may further comprise an aqueous solution (eg, a buffer as described above).
  • the form of the mixture is not particularly limited, but an aqueous solution or a frozen product thereof (eg, a lyophilizate) is preferred.
  • the mixture of the present invention can be obtained by treating an extracellular vesicle-containing sample with the method or reagent of the present invention as described above.
  • the mixtures of the invention are useful, for example, for the preservation of extracellular vesicles.
  • the concentration of sugar or chelating agent in the mixture and the concentration ratio of sugar and chelating agent are similar to those described above for the method of the invention.
  • the concentration of extracellular vesicles in the mixture is, for example, 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 15 , preferably 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 14 , more preferably 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ It is 10 13 , still more preferably 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 12 , particularly preferably 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 11 .
  • the volume of the aqueous solution is, for example, 1 ⁇ L to 100 mL.
  • the volume of the aqueous solution may be 10 ⁇ L or more, 100 ⁇ L or more, or 1000 ⁇ L or more.
  • the volume of the aqueous solution may also be 50 mL or less, 10 mL or less, or 2 mL or less.
  • Example 1 Stabilization of exosome by chelating agent The effect of the chelating agent on lyophilization of exosome was examined.
  • PBS or EDTA / EGTA / PBS (final conc. 50 mM EDTA / 50 mM EGTA) was used as a lyophilization buffer.
  • the pH of PBS used was 7.4 (same as in Examples 1 to 3).
  • the lyophilizate was then dissolved in Milli Q water (Millipore) or 50 mM EDTA / 50 mM EGTA / H 2 O (lysis buffer).
  • Example 2 Stabilization of Exosomes with Sucrose The effect of saccharides on lyophilization of exosomes was examined.
  • a lyophilizate containing lyophilized exosomes As a lyophilization buffer, PBS, EDTA / EGTA / PBS (final conc. 50 mM EDTA / 50 mM EGTA), sucrose / PBS (final conc. 10 mg / mL sucrose), or EDTA / EGTA / sucrose / PBS (Final conc. 50 mM EDTA / 50 mM EGTA / 10 mg / mL sucrose) was used. Thereafter, the lyophilizate was dissolved in Milli Q water (manufactured by Millipore).
  • the count of non-lyophilized samples was taken as 100%.
  • the amount of exosome increased (FIG. 2).
  • the freeze-drying buffer containing sucrose and the chelating agent further increased the amount of exosome. Therefore, it was shown that sugars can stabilize exosomes upon lyophilization of exosomes. Also, it has been shown that the stabilization of exosomes by sugars is enhanced in the presence of a chelating agent.
  • Example 3 Stability Assessment of Lyophilized Exosomes Based on Particle Mass Measurement
  • the lyophilized samples were measured with NanoSight to assess stability based on the particle mass of the lyophilized exosomes.
  • Reference Example 1 Treatment of exosomes with various chelating agents Disodium ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA ⁇ 2Na), glycol ether diamine tetraacetic acid (EGTA), hydroxyethyl ethylenediamine triacetic acid (HEDTA), hydroxyethyl iminodiacetic acid as a chelating agent (HIDA), nitrilotriacetic acid (NTA), oxalic acid dihydrate, ethylenediaminetetra (methylene phosphonic acid) (EDTMP) (EDTA ⁇ 2Na, EGTA is manufactured by Dojindo Laboratories, HEDTA, HIDA, NTA, EDTMP The oxalic acid dihydrate manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • EDTA ⁇ 2Na Disodium ethylenediaminetetraacetic acid
  • EGTA glycol ether diamine tetraacetic acid
  • HEDTA hydroxyethyl ethylene
  • Example 4 Stabilization of exosomes by various sugars The effects of various sugars on lyophilization of exosomes were examined.
  • lyophilization buffer PBS, and PBS, lactose, fructose, methyl beta cyclodextrin (M beta CD), hydroxypropyl beta cyclodextrin (Hp beta CD), gamma cyclodextrin (gamma CD), glucose, lactitol, sorbitol, xylitol, sucrose Sugar, trehalose, mannitol, xylose are final conc. It used so that it might become 2.0 mg / mL, 10 mg / mL, and 50 mg / mL. Thereafter, the lyophilizate was dissolved in Milli Q water (manufactured by Millipore).
  • the count of non-lyophilized samples was taken as 100%.
  • the amount of exosome increased in the lyophilization buffer containing these saccharides (FIGS. 5A and 5B).
  • lyophilization buffer containing 10 mg / mL or 50 mg / mL of sugar increased the amount of exosomes for most of the sugars examined. Therefore, it was shown that various saccharides can stabilize exosomes in lyophilization of exosomes, and that a high stabilization effect is exerted particularly when the concentration of saccharides is 10 to 50 mg / mL.
  • Example 5 Stabilization of Exosome by Combination of Various Sugars and Chelating Agents The effect of the combination of various sugars and chelating agents on lyophilization of exosomes was examined.
  • Example 6 Stabilization of serum-derived exosomes The effect of various sugars or chelating agents or their combination on lyophilization of serum-derived exosomes was examined.
  • lyophilization buffer containing these saccharides or chelating agents increased the amount of exosome (FIG. 7). Furthermore, the amount of exosomes was further increased when using a lyophilization buffer containing both saccharides and chelating agents. Therefore, the effect of saccharides and chelating agents on the stabilization of exosomes was also shown in serum-derived exosomes.
  • Example 7 Stabilization of exosomes by carboxymethylcellulose The effect of carboxymethylcellulose (CMC) on lyophilization of exosomes was examined.
  • CMC carboxymethylcellulose

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、細胞外小胞を安定化することを提供する。具体的には、本発明は、細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法などを提供する。

Description

細胞外小胞の安定化方法
　本発明は、細胞外小胞の安定化方法などに関する。
　細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ）は、さまざまな種類の細胞から分泌される、膜構造を有する微小な小胞であり、血液などの体液中に存在する。細胞外に分泌される細胞外小胞には、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）、アポトーシス胞（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｂｌｅｂ）が含まれる。細胞外小胞は、細胞間の情報伝達等の機能を担う種々の物質を含むことから、診断、創薬等の目的のために解析されている。よって、このような解析に有用な細胞外小胞の処理方法の開発が求められている。例えば、特許文献１には、（１）約３．０ｍｇ／ｍＬ（約１０μＭ）以下という低濃度のＥＤＴＡ（キレート剤）の存在下で細胞外小胞の収量を改善できるものの、それより高濃度のＥＤＴＡの存在下では細胞外小胞の収量を改善できないこと（実施例１、図１Ａ～１Ｃ）、（２）約２．２５ｍｇ／ｍＬ（約７．７μＭ）という低濃度のＥＤＴＡの存在下で、所定の温度および時間において細胞外小胞を保存すること（実施例２、図２Ａおよび２Ｂ、図３Ａ～３Ｆ）、ならびに（３）約２．２５ｍｇ／ｍＬ（約７．７μＭ）という低濃度のＥＤＴＡの存在下で細胞外小胞を凍結・融解すること（実施例３、図４Ａおよび４Ｂ）が記載されている。
米国特許出願公開第２０１５／０１２５８６４号明細書
　細胞外小胞を安定化できれば、細胞外小胞の保存性を向上でき、診断、創薬等の分野への応用に有用である。したがって、本発明の目的は、細胞外小胞を安定化できる方法を開発することである。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、細胞外小胞含有試料を糖などの所定の成分と混合することにより、細胞外小胞含有試料中の細胞外小胞を安定化できること等を見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法。
〔２〕細胞外小胞がエクソソームである、〔１〕の方法。
〔３〕細胞外小胞含有試料が体液または培養上清である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕細胞外小胞含有試料が血液試料である、〔１〕～〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕混合における糖の濃度が２．５～１００ｍｇ／ｍＬである、〔１〕～〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕混合におけるキレート剤の濃度が１～２００ｍＭである、〔１〕～〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕以下を含む、細胞外小胞の安定化方法：
（１）細胞外小胞含有試料を糖と混合すること；および
（２）細胞外小胞含有試料と糖との混合物を凍結させること。
〔８〕凍結が凍結乾燥である、〔７〕の方法。
〔９〕以下を含む、細胞外小胞の安定化方法：
（１）細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合すること；および
（２）細胞外小胞含有試料とキレート剤との混合物を凍結させること。
〔１０〕凍結が凍結乾燥である、〔９〕の方法。
〔１１〕糖およびキレート剤を含む、細胞外小胞安定化試薬。
〔１２〕糖またはキレート剤を含む、細胞外小胞の凍結保存安定化試薬。
　細胞外小胞含有試料を糖と混合することにより、細胞外小胞含有試料中の細胞外小胞を安定化できる。したがって、本発明は、例えば、細胞外小胞の保存に有用である。
図１は、実施例１における各緩衝液条件下での凍結乾燥後のエクソソーム収量を示すグラフである。凍結乾燥しない条件下でのエクソソーム収量を１００％で示す。 図２は、実施例２における各緩衝液条件下での凍結乾燥後のエクソソーム収量を示すグラフである。凍結乾燥しない条件下でのエクソソーム収量を１００％で示す。 図３Ａは、実施例３において、ヒト結腸癌細胞ＳＷ１１１６の培養上清の凍結乾燥前サンプル（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の粒子数および粒子径分布の測定を示す図である。 図３Ｂは、実施例３において、ヒト結腸癌細胞ＳＷ１１１６の培養上清の凍結乾燥前サンプル（ＥＤ／ＥＧ）の粒子数および粒子径分布の測定を示す図である。 図３Ｃは、実施例３において、ヒト結腸癌細胞ＳＷ１１１６の培養上清の凍結乾燥後サンプル（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の粒子数および粒子径分布の測定を示す図である。 図３Ｄは、実施例３において、ヒト結腸癌細胞ＳＷ１１１６の培養上清の凍結乾燥後サンプル（ＥＤ／ＥＧ）の粒子数および粒子径分布の測定を示す図である。 図４Ａは、参考例１における各濃度の各キレート剤と混合した血清検体の免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウェスタンブロッティングを示す図である。 図４Ｂは、参考例１における各濃度の各キレート剤と混合した血漿検体の免疫沈降法で得られたサンプルのビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウェスタンブロッティングを示す図である。 図５Ａは、実施例４における各緩衝液条件下での凍結乾燥後のエクソソーム収量を示すグラフである（図５Ｂに続く）。凍結乾燥しない条件下でのエクソソーム収量を１００％で示す。 図５Ｂは、実施例４における各緩衝液条件下での凍結乾燥後のエクソソーム収量を示すグラフである。凍結乾燥しない条件下でのエクソソーム収量を１００％で示す。 図６は、実施例５における各緩衝液条件下での凍結乾燥後のエクソソーム収量を示すグラフである。凍結乾燥しない条件下でのエクソソーム収量を１００％で示す。 図７は、実施例６における各緩衝液条件下でのヒト血清サンプルの凍結乾燥後のエクソソーム収量を示すグラフである。凍結乾燥しない条件下でのエクソソーム収量を１００％で示す。 図８は、実施例７における各緩衝液条件下での凍結乾燥後のエクソソーム収量を示すグラフである。凍結乾燥しない条件下でのエクソソーム収量を１００％で示す。
１．細胞外小胞の安定化方法
　本発明は、細胞外小胞含有試料を糖と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する。
　本発明はまた、細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する。
　本発明はまた、細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する。
　細胞外小胞は、さまざまな種類の細胞から分泌される、膜構造を有する微小な小胞である。細胞外小胞としては、例えば、エクソソーム、エクトソーム、およびアポトーシス胞が挙げられる。好ましくは、細胞外小胞は、エクソソームである。細胞外小胞はまた、そのサイズにより規定することができる。細胞外小胞のサイズは、例えば、３０～１０００ｎｍであり、好ましくは５０～３００ｎｍ、より好ましくは８０～２００ｎｍである。細胞外小胞のサイズの測定は、例えば、細胞外小胞のブラウン運動に基づく方法、光散乱法、および電気抵抗法などにより行うことができる。好ましくは、細胞外小胞のサイズの測定は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）により行われる。ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０を用いる場合、測定条件として、測定時間３０秒、繰り返し回数３回、ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　１５を採用することができる。細胞外小胞はさらに、細胞外小胞マーカーにより規定することができる。細胞外小胞マーカーとしては、例えば、ＣＤ９、癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）、ＣＤ８１、ＣＤ６３、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）７０、ＨＳＰ９０、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ、腫瘍感受性遺伝子（ＴＳＧ）１０１、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）１、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）－１、インテグリン、セラミド、コレステロール、ホスファチジルセリン、ＡＬＩＸ、Ａｎｎｅｘｉｎｓ、Ｃａｖｅｏｌｉｎ－I、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－Ｉ、Ｒａｂタンパク、ＥｐＣＡＭが挙げられる。
　細胞外小胞含有試料は、細胞外小胞を含有する任意の試料である。好ましくは、細胞外小胞含有試料は、生物学的な液体試料である。細胞外小胞含有試料は、本発明の方法に用いられる前に、他の処理に付されてもよい。このような処理としては、例えば、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、加熱、冷蔵、および攪拌が挙げられる。
　一実施形態では、細胞外小胞含有試料は、培養上清である。培養上清は、細胞培養上清であっても組織培養上清であってもよい。培養される細胞または組織が由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル等の霊長類；マウス、ラット、ウサギ等の齧歯類；ウシ、ブタ、ヤギ等の家畜；およびウマ、ヒツジ等の使役動物）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物（例、細菌類）、植物、および魚類が挙げられる。好ましくは、生物は、ヒト等の哺乳動物である。
　別の実施形態では、細胞外小胞含有試料は、体液である。体液は、上述したような生物に由来する体液である。体液としては、例えば、血液試料（例、全血、血清および血漿）、リンパ液、組織液、脳脊髄液、腹水、唾液、膵液、胆汁、汗、精液、尿、涙液、粘液、乳汁、胸腔液、気管支肺胞洗浄液および羊水が挙げられる。好ましくは、体液は、血液である。
　さらに別の実施形態では、細胞外小胞含有試料は、牛乳または果汁である。
　糖は、単糖（例、アルドース、ケトース）、または２個以上の単糖がグリコシド結合により連結した多糖である。本発明において、糖には誘導体および糖アルコールも含まれる。糖の誘導体とは、糖において水素原子、水酸基、またはカルボニル基が置換基で置換された化合物をいう。糖アルコールとは、糖においてカルボニル基が還元された化合物をいう。
　より具体的には、単糖としては、例えば、トリオース（例、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン）、テトロース（例、エリトロース、トレオース、エリトルロース）、ペントース（例、キシロース、リボース、アラビノース、リキソース、リブロース、キシルロース、アピオース）、ヘキソース（例、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、プシコース、ソルボース、タガトース）、ヘプトース（例、セドヘプツロース、コリオース）が挙げられる。アルドースとしては、例えば、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、グリセルアルデヒド、エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロースが挙げられる。ケトースとしては、例えば、フルクトース、ジヒドロキシアセトン、エリトルロース、キシルロース、リブロース、プシコース、ソルボース、タガトース、セドヘプツロース、コリオースが挙げられる。
　多糖としては、例えば、上述したような単糖が２個以上連結した多糖が挙げられる。好ましくは、多糖としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロースからなる群から選ばれる１種または複数種の２個以上の単糖単位がグリコシド結合した多糖（例、１個以上のグルコースおよび１個以上のフルクトースがグリコシド結合した多糖）が挙げられる。このような多糖は、鎖状多糖または環状多糖であってもよい。鎖状多糖は、鎖状オリゴ糖または鎖状高分子多糖であってもよい。多糖が鎖状オリゴ糖である場合、多糖における単糖単位の個数の合計は、例えば２～２０個、好ましくは２～１０個、より好ましくは２～６個、さらにより好ましくは２～４個であってもよい。例えば、多糖が１個以上のグルコースおよび１個以上のフルクトースがグリコシド結合した多糖である場合、多糖におけるグルコースおよびフルクトースの個数は、それぞれ独立して、例えば１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、さらにより好ましくは１もしくは２個であってもよい。鎖状オリゴ糖としては、例えば、二糖が挙げられる。二糖としては、例えば、ショ糖、ラクトース、トレハロースが挙げられる。特に好ましくは、二糖は、１個のグルコースおよび１個のフルクトースがグリコシド結合したショ糖である。鎖状高分子多糖としては、セルロース、アミロース、アミロペクチン、グルコマンナン、プルラン、ガラクトマンナン、イヌリン、グリコーゲン、キチン、キトサン、グルクロノキシラン、アラビノキシラン、アガロース、カラギーナン、ペクチン、ペクチン酸、アルギン酸、フコイダン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロナンが挙げられる。多糖が環状多糖である場合、多糖における単糖単位の個数の合計は、例えば５～１００個、好ましくは５～２０個、より好ましくは５～１０個、さらにより好ましくは６～８個であってもよい。環状多糖としては、例えば、シクロデキストリン（αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、γシクロデキストリン）が挙げられる。
　糖の誘導体における置換基としては、例えば、水素原子、水酸基、Ｃ１～６アルキル基、Ｃ１～６アルケニル基、Ｃ１～６アルキニル基、Ｃ１～６アルキルオキシ（アルコキシ）基、Ｃ６～１４芳香族炭化水素基、Ｃ１～６アルキル－カルボニル（アシル）基、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、シアノ基が挙げられる。
　Ｃ１～６アルキル基は、炭素原子数１～６個のアルキルであり、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖または分岐鎖のアルキルが好ましい。Ｃ１～６アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１－エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、２－エチルブチルが挙げられる。Ｃ１～６アルキル基としては、Ｃ１～４アルキル基が好ましく、Ｃ１～３アルキル基がより好ましい。
　Ｃ１～６アルケニル基は、炭素原子数１～６個のアルケニル基であり、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖または分岐鎖のアルケニルが好ましい。Ｃ１～６アルケニル基としては、例えば、エテニル（ビニル）、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、へキセニルが挙げられる。Ｃ１～６アルケニル基としては、Ｃ１～４アルケニル基が好ましく、Ｃ１～３アルケニル基がより好ましい。
　Ｃ１～６アルキニル基は、炭素原子数１～６個のアルキニル基であり、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖または分岐鎖のアルキニルが好ましい。Ｃ１～６アルキニル基としては、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、へキシニルが挙げられる。Ｃ１～６アルキニル基としては、Ｃ１～４アルキニル基が好ましく、Ｃ１～３アルキニル基がより好ましい。
　Ｃ１～６アルキルオキシ基は、炭素原子数１～６個のアルキルオキシ基である。Ｃ１～６アルキルオキシ基としては、例えば、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、ｉｓｏ－プロピルオキシ、ブチルオキシ、ｉｓｏ－ブチルオキシ、ｓｅｃ－ブチルオキシ、ｔｅｒｔ－ブチルオキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、１－エチルプロピルオキシ、ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ、１，１－ジメチルブチルオキシ、２，２－ジメチルブチルオキシ、３，３－ジメチルブチルオキシ、２－エチルブチルオキシが挙げられる。Ｃ１～６アルキルオキシ基としては、Ｃ１～４アルキルオキシ基が好ましく、Ｃ１～３アルキルオキシ基がより好ましい。
　Ｃ６～１４芳香族炭化水素基としては、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニルが挙げられる。Ｃ６～１４芳香族炭化水素基としては、フェニル、ナフチルが好ましく、フェニルがより好ましい。
　Ｃ１～６アルキル－カルボニル（アシル）基としては、上述したようなＣ１～６アルキル基を有するカルボニル基である。Ｃ１～６アルキル－カルボニル基としては、例えば、メチルカルボニル（アセチル）、エチルカルボニル、プロピルカルボニル、ｉｓｏ－プロピルカルボニル、ブチルカルボニル、ｉｓｏ－ブチルカルボニル、ｓｅｃ－ブチルカルボニル、ｔｅｒｔ－ブチルカルボニル、ペンチルカルボニル、イソペンチルカルボニル、ネオペンチルカルボニル、１－エチルプロピルカルボニル、ヘキシルカルボニル、イソヘキシルカルボニル、１，１－ジメチルブチルカルボニル、２，２－ジメチルブチルカルボニル、３，３－ジメチルブチルカルボニル、２－エチルブチルカルボニルが挙げられる。Ｃ１～６アルキルカルボニル基としては、Ｃ１～４アルキルカルボニル基が好ましく、Ｃ１～３アルキルカルボニル基がより好ましい。
　これらの置換基は、別の置換基でさらに置換されていてもよい。別の置換基としては、例えば、水酸基、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、シアノ基が挙げられる。
　置換基で置換された糖の誘導体としては、例えば、環状多糖（例、αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、またはγシクロデキストリン等のシクロデキストリン）および鎖状高分子多糖（例、セルロース）の誘導体が挙げられる。環状多糖の誘導体としては、例えば、置換されていてもよいアルキル基で置換された環状多糖（例、メチルβシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン）が挙げられる。鎖状高分子多糖の誘導体としては、例えば、セルロース誘導体が挙げられる。
　セルロース誘導体とは、セルロースの少なくとも１つの水酸基の水素原子が親水性基で置換されたセルロース誘導体である。セルロース誘導体における親水性基としては、例えば、カルボキシアルキル（例、カルボキシＣ１～６アルキル）、ヒドロキシアルキル（例、ヒドロキシＣ１～６アルキル）が挙げられる。セルロース誘導体における親水性基は、カルボキシアルキルまたはヒドロキシアルキルが好ましい。
　カルボキシアルキルとしては、例えば、カルボキシメチル、カルボキシエチル（１－カルボキシエチル、２－カルボキシエチル）、カルボキシプロピル（１－カルボキシプロピル、２－カルボキシプロピル、３－カルボキシプロピル）、カルボキシイソプロピル（１－カルボキシ－２－メチルエチル、２－カルボキシ－２－メチルエチル）、カルボキシブチル（１－カルボキシブチル、２－カルボキシブチル、３－カルボキシブチル、４－カルボキシブチル）、カルボキシｔ－ブチル、カルボキシペンチル（１－カルボキシペンチル、２－カルボキシペンチル、３－カルボキシペンチル、４－カルボキシペンチル、５－カルボキシペンチル）、カルボキシヘキシル（１－カルボキシヘキシル、２－カルボキシヘキシル、３－カルボキシヘキシル、４－カルボキシヘキシル、５－カルボキシヘキシル、６－カルボキシヘキシル）が挙げられる。
　ヒドロキシアルキルとしては、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル（１－ヒドロキシエチル、２－ヒドロキシエチル）、ヒドロキシプロピル（１－ヒドロキシプロピル、２－ヒドロキシプロピル、３－ヒドロキシプロピル）、ヒドロキシイソプロピル（１－ヒドロキシ－２－メチルエチル、２－ヒドロキシ－２－メチルエチル）、ヒドロキシブチル（１－ヒドロキシブチル、２－ヒドロキシブチル、３－ヒドロキシブチル、４－ヒドロキシブチル）、ヒドロキシｔ－ブチル、ヒドロキシペンチル（１－ヒドロキシペンチル、２－ヒドロキシペンチル、３－ヒドロキシペンチル、４－ヒドロキシペンチル、５－ヒドロキシペンチル）、ヒドロキシヘキシル（１－ヒドロキシヘキシル、２－ヒドロキシヘキシル、３－ヒドロキシヘキシル、４－ヒドロキシヘキシル、５－ヒドロキシヘキシル、６－ヒドロキシヘキシル）が挙げられる。
　セルロース誘導体の具体例としては、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられる。
　セルロース誘導体には、ナノセルロース誘導体も含まれる。ナノセルロース誘導体とは、後述するナノセルロースの誘導体である。
　ナノセルロースとは、ナノメートルオーダーの繊維幅を有する繊維状セルロースである。ナノセルロースの繊維幅は、例えば５００ｎｍ以下であり、好ましくは２００ｎｍ以下、より好ましくは１００ｎｍ以下、さらにより好ましくは５０ｎｍ以下、なおさらにより好ましくは１０ｎｍ以下、特により好ましくは５ｎｍ以下であってもよい。
　セルロース誘導体には、それらの塩も含まれる。塩としては、例えば、金属（例、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、およびセシウム等の一価の金属、ならびにカルシウム、マグネシウム、および亜鉛等の二価の金属）の塩、ならびに無機塩基（例、アンモニア）の塩が挙げられる。
　糖アルコールとしては、例えば、上述したような単糖においてカルボニル基が還元された単量体、これらの単量体同士が例えばグリコシド結合により結合した多量体、およびこれらの単量体と単糖を構成単位として例えばグリコシド結合により結合した多量体が挙げられる。上記の単量体としては、例えば、トリトール（例、グリセリン）、テトリトール（例、エリトリトール、トレイトール）、ペンチトール（例、キシリトール、アラビニトール、リビトール）、ヘキシトール（例、ソルビトール、マンニトール、イジトール、ガラクチトール）、ヘプチトール（例、ボレミトール、ペルセイトール）、オクチルトール（例、エリスロガラクトオクチトール）が挙げられる。糖アルコールとしては、例えば、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、フシトール、ボレミトール、アラビニトール、グリセリン、イジトール、エリトリトール、トレイトール、リビトール等の単量体、ラクチトール、マルチトール等の二量体が挙げられる。
　本発明では、２種以上（例、２種、３種、４種、５種）の糖の混合物を細胞外小胞含有試料と混合してもよい。本発明では、細胞外小胞含有試料と糖との混合前に、細胞外小胞含有試料に糖を添加することを含んでいてもよい。糖は、キレート剤と同時または別々に添加されてもよい。
　細胞外小胞含有試料を糖と混合する場合、混合における糖の濃度は、細胞外小胞を安定化できる限り特に限定されない。このような濃度は、糖の種類等の因子によっても異なるが、例えば、２．５ｍｇ／ｍＬ以上であってもよく、好ましくは３．０ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは３．５ｍｇ／ｍＬ以上、さらにより好ましくは４．０ｍｇ／ｍＬ以上、なおさらにより好ましくは４．５ｍｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは５．０ｍｇ／ｍＬ以上、６．０ｍｇ／ｍＬ以上、８．０ｍｇ／ｍＬ以上、または１０．０ｍｇ／ｍＬ以上であってもよい。このような濃度はまた、糖の種類等の因子によっても異なるが、例えば、６００ｍｇ／ｍＬ以下、４００ｍｇ／ｍＬ以下、２００ｍｇ／ｍＬ以下、または１００ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、好ましくは９５ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは９０ｍｇ／ｍＬ以下、さらにより好ましくは８５ｍｇ／ｍＬ以下、なおさらにより好ましくは８０ｍｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは７５ｍｇ／ｍＬ以下、７０ｍｇ／ｍＬ以下、６０ｍｇ／ｍＬ以下、または５０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。より具体的には、糖の濃度は、糖の種類等の因子によっても異なるが、例えば、２．５～８００ｍｇ／ｍＬ、２．５～６００ｍｇ／ｍＬ、２．５～４００ｍｇ／ｍＬ、２．５～２００ｍｇ／ｍＬ、または２．５～１００ｍｇ／ｍＬであってもよく、好ましくは３．０～９５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは３．５～９０ｍｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは４．０～８５ｍｇ／ｍＬ、なおさらにより好ましくは４．５～８０ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは５．０～７５ｍｇ／ｍＬ、６．０～７０ｍｇ／ｍＬ、８．０～６０ｍｇ／ｍＬ、または１０．０～５０ｍｇ／ｍＬであってもよい。
　キレート剤は、金属イオンとの配位結合が可能である配位部分を有する化合物またはその塩である。配位部分の数は、好ましくは２個以上、より好ましくは３個以上（例、３個または６個）である。配位部分としての配位原子としては、例えば、酸素原子、リン原子、窒素原子、硫黄原子、および塩素原子が挙げられる。配位原子は、好ましくは酸素原子またはリン原子であり、より好ましくは酸素原子である。配位部分としての配位基としては、例えば、上記配位原子を有する基が挙げられる。配位基は、好ましくはカルボン酸基またはリン酸基であり、より好ましくはカルボン酸基である。
　キレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、シュウ酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰ）、およびそれらの塩が挙げられる。塩としては、例えば、金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩等の一価の金属塩、およびカルシウム塩、マグネシウム塩等の二価の金属塩）、無機塩（例、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物等のハロゲン化物塩、およびアンモニウム塩）、有機塩（例、アルキル基で置換されたアンモニウム塩）、および酸付加塩（例、硫酸、塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸等の無機酸との塩、および酢酸、シュウ酸、乳酸、クエン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸等の塩）が挙げられる。本発明では、２種以上（例、２種、３種、４種、５種）のキレート剤の混合物を細胞外小胞含有試料と混合してもよい。本発明では、細胞外小胞含有試料とキレート剤との混合前に、細胞外小胞含有試料にキレート剤を添加することを含んでいてもよい。
　細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合する場合、混合におけるキレート剤の濃度は、細胞外小胞を安定化できる限り特に限定されない。このような濃度は、キレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば１ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上、さらにより好ましくは１５ｍＭ以上、なおさらにより好ましくは２０ｍＭ以上、特に好ましくは３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、または５０ｍＭ以上であってもよい。このような濃度はまた、キレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば２００ｍＭ以下、好ましくは１８０ｍＭ以下、より好ましくは１７０ｍＭ以下、さらにより好ましくは１６０ｍＭ以下、なおさらにより好ましくは１５０ｍＭ以下、特に好ましくは１４０ｍＭ以下、１２０ｍＭ以下、または１００ｍＭ以下であってもよい。より具体的には、キレート剤の濃度は、例えば１ｍＭ～２００ｍＭ、好ましくは５～１８０ｍＭ、より好ましくは１０～１７０ｍＭ、さらにより好ましくは１５～１６０ｍＭ、なおさらにより好ましくは２０～１５０ｍＭ、特に好ましくは３０～１４０ｍＭ、４０～１２０ｍＭ、または５０～１００ｍＭであってもよい。
　細胞外小胞含有試料は、糖およびキレート剤の双方と混合されてもよい。
　本発明において糖およびキレート剤の双方が用いられる場合、混合において使用される糖およびキレート剤の濃度は、それらの比率によって規定することもできる。例えば、混合における、糖１０ｍｇ／ｍＬあたりのキレート剤の濃度は、糖およびキレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば１ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、好ましくは１０ｍＭ以上、さらにより好ましくは１５ｍＭ以上、なおさらにより好ましくは２０ｍＭ以上、特に好ましくは３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、または５０ｍＭ以上であってもよい。このような濃度はまた、糖およびキレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば２００ｍＭ以下、好ましくは１８０ｍＭ以下、より好ましくは１７０ｍＭ以下、さらにより好ましくは１６０ｍＭ以下、なおさらにより好ましくは１５０ｍＭ以下、特に好ましくは１４０ｍＭ以下、１２０ｍＭ以下、または１００ｍＭ以下であってもよい。より具体的には、キレート剤の濃度は、例えば１ｍＭ～２００ｍＭ、好ましくは５～１８０ｍＭ、より好ましくは１０～１７０ｍＭ、さらにより好ましくは１５～１６０ｍＭ、なおさらにより好ましくは２０～１５０ｍＭ、特に好ましくは３０～１４０ｍＭ、４０～１２０ｍＭ、または５０～１００ｍＭであってもよい。
　混合は、任意の様式で行うことができる。例えば、本発明において糖およびキレート剤の双方が用いられる場合、混合は、同時または別々に行うことができる。より具体的には、細胞外小胞含有試料は、（１）糖およびキレート剤と同時に混合されてもよく、（２）糖と混合された後、キレート剤と混合されてもよく、または（３）キレート剤と混合された後、糖と混合されてもよい。操作の簡便等の観点から、細胞外小胞含有試料は、好ましくは、糖およびキレート剤と同時に混合されてもよい。
　混合温度は、例えば４～３７℃であり、好ましくは１５～３０℃であってもよい。混合時間は、細胞外小胞を安定化できる限り特に限定されず、適宜設定することができる。細胞外小胞含有試料は、糖などの所定の成分との混合後に放置されてもよい。
　細胞外小胞が糖などの所定の成分との混合により安定化されているか否かは、例えば、細胞外小胞と糖などの所定の成分との混合後に測定される指標値を、糖などの所定の成分の不在下における細胞外小胞について測定されるコントロール値（糖などの所定の成分の存在または非存在以外の条件は同じ）と比較し、指標値がコントロール値よりも優れているか否かを評価することにより行うことができる。例えば、凍結乾燥物の安定化を評価する場合、凍結乾燥機（東京理化器械株式会社製）を用いて、－２８℃で２時間、－１０℃で４時間、その後２０℃のプログラムで凍結乾燥させ、糖などの所定の成分の有無における凍結乾燥物の指標値を比較してもよい。このような指標値としては、例えば、細胞外小胞マーカー量、または細胞外小胞に相当する粒子数の測定値を利用することができる。
　細胞外小胞マーカー量の測定は、当該分野において公知である任意の方法により行うことができる。
　細胞外小胞マーカーがタンパク質である場合、測定方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。イムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、およびサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）〔例、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）〕、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、およびサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、およびイムノクロマトグラフィー法、ウェスタンブロッティング、免疫染色、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）が挙げられる。複数成分が検出される場合、プロテオーム分析が行われてもよい。
　細胞外小胞マーカーが核酸である場合、測定方法としては、例えば、プローブを用いるハイブリダイゼーション法、プライマー（例、２、３、または４個のプライマー）を用いる遺伝子増幅法、質量分析法が挙げられる。
　細胞外小胞マーカーがタンパク質および核酸以外の成分である場合、測定方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。複数成分が測定される場合、メタボローム分析が行われてもよい。
　細胞外小胞に相当する粒子数の測定は、例えば、粒子分析機器、電子顕微鏡、フローサイトメーター等の機器により行うことができる。好ましくは、このような粒子数の測定は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）により行うことができる。ＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０を用いる場合、測定条件として、測定時間３０秒、繰り返し回数３回、ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　１５を採用することができる。
　本発明の方法は、混合物を凍結することをさらに含んでいてもよい。
　すなわち、本発明はさらに、以下を含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する：
（１）細胞外小胞含有試料を糖と混合すること；および
（２）細胞外小胞含有試料と糖との混合物を凍結させること。
　本発明はさらに、以下を含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する：
（１）細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合すること；および
（２）細胞外小胞含有試料とキレート剤との混合物を凍結させること。
　本発明はさらに、以下を含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する：
（１）細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合すること；および
（２）細胞外小胞含有試料と糖およびキレート剤との混合物を凍結させること。
　凍結は、凍結乾燥または溶液の凍結（非乾燥凍結）のいずれであってもよいが、より長期にわたり細胞外小胞を保存する場合、凍結乾燥が好ましい。
　糖およびキレート剤の種類および混合における濃度の例は、上述したとおりである。
２．細胞外小胞安定化試薬
　本発明はまた、細胞外小胞安定化試薬を提供する。本発明の試薬は、糖またはキレート剤を含む。好ましくは、本発明の試薬は、糖およびキレート剤を含んでいてもよい。糖およびキレート剤は、上述したものと同様である。本発明の試薬は、糖およびキレート剤に加えて、他の成分（例、細胞外小胞の安定化に有用な他の成分）を含んでいてもよい。
　一実施形態では、本発明の試薬は、糖を含む細胞外小胞安定化組成物である。別の実施形態では、本発明の試薬は、キレート剤を含む細胞外小胞安定化組成物である。さらに別の実施形態では、本発明の組成物は、糖およびキレート剤の双方を含む細胞外小胞安定化組成物である。
　細胞外小胞を安定化するために、本発明の試薬は、細胞外小胞含有試料と混合させて用いることができる。細胞外小胞を安定的に保存するために、細胞外小胞含有試料と本発明の試薬との混合物は、凍結されてもよい。この場合、本発明の試薬は、細胞外小胞の凍結保存安定化試薬として用いることができる。凍結は、凍結乾燥または溶液の凍結（非乾燥凍結）のいずれであってもよいが、より長期にわたり細胞外小胞を保存する場合、凍結乾燥が好ましい。
　組成物中の糖の濃度は、細胞外小胞含有試料と混合された後、細胞外小胞を安定化できる限り特に限定されない。このような濃度は、糖の種類等の因子によっても異なるが、例えば、２．７ｍｇ／ｍＬ以上であってもよく、好ましくは３．０ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは３．５ｍｇ／ｍＬ以上、さらにより好ましくは４．０ｍｇ／ｍＬ以上、なおさらにより好ましくは４．５ｍｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは５．０ｍｇ／ｍＬ以上、６．０ｍｇ／ｍＬ以上、８．０ｍｇ／ｍＬ以上、または１０．０ｍｇ／ｍＬ以上であってもよい。このような濃度はまた、糖の種類等の因子によっても異なるが、例えば、６００ｍｇ／ｍＬ以下、４００ｍｇ／ｍＬ以下、２００ｍｇ／ｍＬ以下、１００ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、好ましくは９５ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは９０ｍｇ／ｍＬ以下、さらにより好ましくは８５ｍｇ／ｍＬ以下、なおさらにより好ましくは８０ｍｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは７５ｍｇ／ｍＬ以下、７０ｍｇ／ｍＬ以下、６０ｍｇ／ｍＬ以下、または５０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。より具体的には、糖の濃度は、糖の種類等の因子によっても異なるが、例えば、２．７～８００ｍｇ／ｍＬ、２．７～６００ｍｇ／ｍＬ、２．７～４００ｍｇ／ｍＬ、２．７～２００ｍｇ／ｍＬ、または２．７～１００ｍｇ／ｍＬであってもよく、好ましくは３．０～９５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは３．５～９０ｍｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは４．０～８５ｍｇ／ｍＬ、なおさらにより好ましくは４．５～８０ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは５．０～７５ｍｇ／ｍＬ、６．０～７０ｍｇ／ｍＬ、８．０～６０ｍｇ／ｍＬ、または１０．０～５０ｍｇ／ｍＬであってもよい。
　組成物中のキレート剤の濃度は、細胞外小胞含有試料と混合された後、細胞外小胞を安定化できる限り特に限定されない。このような濃度は、キレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば１．１ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、好ましくは１０ｍＭ以上、好ましくは１５ｍＭ以上、より好ましくは２０ｍＭ以上、さらにより好ましくは３０ｍＭ以上、なおさらにより好ましくは４０ｍＭ以上、特に好ましくは５０ｍＭ以上であってもよい。このような濃度はまた、キレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば２００ｍＭ以下、好ましくは１８０ｍＭ以下、より好ましくは１７０ｍＭ以下、さらにより好ましくは１６０ｍＭ以下、なおさらにより好ましくは１５０ｍＭ以下、特に好ましくは１４０ｍＭ以下、１２０ｍＭ以下、または１００ｍＭ以下であってもよい。より具体的には、キレート剤の濃度は、例えば１．１ｍＭ～２００ｍＭ、好ましくは５～１８０ｍＭ、より好ましくは１０～１７０ｍＭ、さらにより好ましくは１５～１６０ｍＭ、なおさらにより好ましくは２０～１５０ｍＭ、特に好ましくは３０～１４０ｍＭ、４０～１２０ｍＭ、または５０～１００ｍＭであってもよい。
　本発明の組成物が糖およびキレート剤の双方を含む場合、糖およびキレート剤の濃度はまた、それらの比率によって規定することもできる。例えば、糖１０ｍｇ／ｍＬあたりのキレート剤の濃度は、糖およびキレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば１ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、好ましくは１０ｍＭ以上、好ましくは１５ｍＭ以上、より好ましくは２０ｍＭ以上、さらにより好ましくは３０ｍＭ以上、なおさらにより好ましくは４０ｍＭ以上、特に好ましくは５０ｍＭ以上であってもよい。このような濃度はまた、糖およびキレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば２００ｍＭ以下、好ましくは１８０ｍＭ以下、より好ましくは１７０ｍＭ以下、さらにより好ましくは１６０ｍＭ以下、なおさらにより好ましくは１５０ｍＭ以下、特に好ましくは１４０ｍＭ以下、１２０ｍＭ以下、または１００ｍＭ以下であってもよい。より具体的には、キレート剤の濃度は、例えば１ｍＭ～２００ｍＭ、好ましくは５～１８０ｍＭ、より好ましくは１０～１７０ｍＭ、さらにより好ましくは１５～１６０ｍＭ、なおさらにより好ましくは２０～１５０ｍＭ、特に好ましくは３０～１４０ｍＭ、４０～１２０ｍＭ、または５０～１００ｍＭであってもよい。
　本発明の組成物は、使用に際して水溶液に溶解される、糖および／またはキレート剤を含む非水性組成物（例、混合粉末）であっても、糖および／またはキレート剤を含む水溶液であってもよいが、迅速かつ簡便な使用等の観点からは、糖および／またはキレート剤を含む水溶液が好ましい。水溶液としては、例えば、水（例、蒸留水、滅菌水、滅菌蒸留水、および純水）、ならびに緩衝液が挙げられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、酒石酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グリシン緩衝液、炭酸緩衝液、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、ホウ酸緩衝液、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）緩衝液、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）緩衝液、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）１－ピペラジニルエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液が挙げられる。緩衝液のｐＨは中性が好ましい。より具体的には、このようなｐＨは、好ましくは５．０以上、より好ましくは５．５以上、さらにより好ましくは６．０以上であってもよい。ｐＨはまた、好ましくは９．０以下、より好ましくは８．５以下、さらにより好ましくは８．０以下であってもよい。ｐＨの測定は、当該分野における公知の方法を用いて行うことができる。好ましくは、ｐＨは、ガラス電極を有するｐＨ計を用いて２５℃で測定された値を採用することができる。
　本発明の組成物は、細胞外小胞含有試料と適宜混合して使用することができる。本発明の組成物と細胞外小胞含有試料との混合比率（細胞外小胞含有試料／組成物）は、例えば１／３０～３０、好ましくは１／２０～２０、より好ましくは１／１０～１０、さらにより好ましくは１／１０～１である。
　本発明の組成物が水溶液である場合、水溶液の容量は、例えば、１μＬ～１００ｍＬである。好ましくは、水溶液の容量は、１０μＬ以上、１００μＬ以上、または１０００μＬ以上であってもよい。水溶液の容量はまた、５０ｍＬ以下、１０ｍＬ以下、または２ｍＬ以下であってもよい。
　別の実施形態では、本発明の試薬は、糖および／またはキレート剤を含むキットである。糖および／またはキレート剤は、固体または水溶液の形態において提供することができるが、好ましくは水溶液の形態で提供される。したがって、本発明のキットは、糖を含む水溶液の形態において提供されてもよく、キレート剤を含む水溶液の形態において提供されてもよく、糖およびキレート剤を含む水溶液の形態において提供されてもよく、糖を含む第１水溶液、およびキレート剤を含む第２水溶液の形態において提供されてもよい。水溶液は、上述したとおりであるが、緩衝液が好ましい。緩衝液の例およびｐＨは、上述したとおりである。第１水溶液中の糖の濃度、第２水溶液中のキレート剤の濃度、ならびに第１および第２水溶液における糖およびキレート剤の濃度比率の関係は、本発明の組成物について上述したものと同様である。また、第１および第２水溶液と細胞外小胞含有試料との混合比率、ならびに第１および第２水溶液の各容量は、本発明の組成物について上述したものと同様である。
３．細胞外小胞を含む混合物
　本発明はまた、糖および／またはキレート剤と、細胞外小胞とを含む混合物を提供する。本発明の混合物は、さらに水溶液（例、上述したような緩衝液）を含んでいてもよい。混合物の形態は特に限定されないが、水溶液またはその凍結物（例、凍結乾燥物）が好ましい。本発明の混合物は、細胞外小胞含有試料を、上述したような本発明の方法または試薬で処理することにより得ることができる。本発明の混合物は、例えば、細胞外小胞の保存に有用である。
　混合物中の糖またはキレート剤の濃度、ならびに糖およびキレート剤の濃度比率は、本発明の方法について上述したものと同様である。混合物中の細胞外小胞の濃度（粒子数／ｍＬ）は、例えば１×１０２～１×１０１５、好ましくは１×１０３～１×１０１４、より好ましくは１×１０４～１×１０１３、さらにより好ましくは１×１０５～１×１０１２、特に好ましくは１×１０６～１×１０１１である。
　本発明の混合物が水溶液である場合、水溶液の容量は、例えば、１μＬ～１００ｍＬである。好ましくは、水溶液の容量は、１０μＬ以上、１００μＬ以上、または１０００μＬ以上であってもよい。水溶液の容量はまた、５０ｍＬ以下、１０ｍＬ以下、または２ｍＬ以下であってもよい。
　以下、実施例を参照して本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：キレート剤によるエクソソームの安定化
　エクソソームの凍結乾燥に対するキレート剤の効果を検討した。
　１）エクソソームの回収
　３日間無血清培地で培養したヒト非小細胞肺癌細胞Ｈ１２９９の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５（ミリポア社製）を用いて濃縮した。濃縮物を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。次に、上清を、１００，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、ＰＢＳ（２．９ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、９．０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ　ＮａＣｌ）または５０ｍＭ　ＥＤＴＡ／５０ｍＭ　ＥＧＴＡ／ＰＢＳを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、１００，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、新たにＰＢＳまたは５０ｍＭ　ＥＤＴＡ／５０ｍＭ　ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（回収緩衝液）を加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
　２）エクソソームの凍結乾燥
　回収したエクソソームをＱｕｂｉｔ（商標）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々に回収緩衝液をさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム１容量に対し、凍結乾燥緩衝液２４容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、凍結乾燥機（東京理化器械株式会社製）を用いて、－２８℃で２時間、－１０℃で４時間、その後２０℃のプログラムで凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。凍結乾燥緩衝液としては、ＰＢＳまたはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃ．５０ｍＭ　ＥＤＴＡ／　５０ｍＭ　ＥＧＴＡ）を用いた。用いたＰＢＳのｐＨは７．４であった（実施例１～３において同様）。
　その後、凍結乾燥物をミリＱ水（ミリポア社製）または５０ｍＭ　ＥＤＴＡ／５０ｍＭ　ＥＧＴＡ／Ｈ２Ｏ（溶解緩衝液）に溶解させた。
　３）エクソソーム特異的抗原（ＣＤ９）量の測定に基づくエクソソームの安定性評価
　これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、ＥＬＩＳＡ系で評価した。具体的には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ社製）に、自社製抗ＣＤ９抗体を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。その後、各ウェルを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）で３回洗浄し、０．５重量％Ｃａｓｅｉｎを含むＰＢＳ２００μＬを添加して、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ＰＢＳで希釈した凍結乾燥物の溶解物１００μＬを各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ビオチン化した同自社製抗ＣＤ９抗体と、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ（ＳＡ－ＡＬＰ、ＧｅｎｅＴｅｘ社製）とを含むＰＢＳ１００μＬを各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳで洗浄し、ルミパルス（登録商標）基質液（富士レビオ社製）１００μＬを添加し、３７℃で１０分反応させた後、波長４７７ｎｍの発光カウントを測定した。凍結乾燥していないサンプルのカウントを１００％とした。
　その結果、キレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した（図１）。
　したがって、エクソソームの凍結乾燥においてキレート剤がエクソソームを安定化できることが示された。
実施例２：ショ糖によるエクソソームの安定化
　エクソソームの凍結乾燥に対する糖の効果を検討した。
　１）エクソソームの回収
　３日間無血清培地で培養したヒト結腸癌細胞ＳＷ４８０の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５（ミリポア社製）を用いて濃縮した。濃縮物を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。次に、上清を、１００，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、ＰＢＳを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、１００，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、新たにＰＢＳを加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
　２）エクソソームの凍結乾燥
　回収したエクソソームをＱｕｂｉｔ（商標）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々にＰＢＳをさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム１容量に対し、凍結乾燥緩衝液２４容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、上述した凍結乾燥機を用いて、－２８℃で２時間、－１０℃で４時間、その後２０℃のプログラムで凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。なお、凍結乾燥緩衝液として、ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃ．５０ｍＭ　ＥＤＴＡ／５０ｍＭ　ＥＧＴＡ）、ショ糖／ＰＢＳ（ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃ．１０ｍｇ／ｍＬショ糖）、またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ショ糖／ＰＢＳ（ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃ．５０ｍＭ　ＥＤＴＡ／５０ｍＭ　ＥＧＴＡ／１０ｍｇ／ｍＬショ糖）を用いた。
　その後、凍結乾燥物をミリＱ水（ミリポア社製）に溶解させた。
　３）エクソソーム特異的抗原（ＣＤ９）量の測定に基づくエクソソームの安定性評価
　これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、ＥＬＩＳＡ系で評価した。具体的には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ社製）に、自社製抗ＣＤ９抗体を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。その後、各ウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、０．５重量％Ｃａｓｅｉｎを含むＰＢＳ２００μＬを添加して、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ＰＢＳで希釈した凍結乾燥物の溶解物１００μＬを各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ビオチン化した同自社製抗ＣＤ９抗体と、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ（ＳＡ－ＡＬＰ、ＧｅｎｅＴｅｘ社製）とを含むＰＢＳ１００μＬを各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳで洗浄し、ルミパルス基質液１００μＬを添加し、３７℃で５分反応させた後、波長４７７ｎｍの発光カウントを測定した。凍結乾燥していないサンプルのカウントを１００％とした。
　その結果、ショ糖を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した（図２）。また、ショ糖およびキレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量がより増大した。
　したがって、エクソソームの凍結乾燥において、糖がエクソソームを安定化できることが示された。また、糖によるエクソソームの安定化は、キレート剤の存在下で向上されることが示された。
実施例３：粒子量測定に基づく凍結乾燥エクソソームの安定性評価
　凍結乾燥を行ったサンプルをＮａｎｏＳｉｇｈｔで測定して、凍結乾燥エクソソームの粒子量に基づき安定性を評価した。
　１）エクソソームの回収
　３日間無血清培地で培養したヒト結腸癌細胞ＳＷ１１１６の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５（ミリポア社製）を用いて濃縮した。濃縮物を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。次に、上清を、１００，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、ＰＢＳ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）または５０ｍＭ　ＥＤＴＡ／５０ｍＭ　ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（ＥＤ／ＥＧ）を加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、１００，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、新たにＰＢＳまたは５０ｍＭ　ＥＤＴＡ／５０ｍＭ　ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（ＥＤ／ＥＧ）を加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
　２）エクソソームの凍結乾燥
　回収したエクソソームをＱｕｂｉｔ（商標）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々に回収緩衝液をさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム１容量に対し、凍結乾燥緩衝液２４容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、上述した凍結乾燥機を用いて、－２８℃で２時間、－１０℃で４時間、その後２０℃のプログラムで凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。なお、凍結乾燥緩衝液として、ＰＢＳ、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃ．５０ｍＭ　ＥＤＴＡ／５０ｍＭ　ＥＧＴＡ）（ＥＤ／ＥＧ）を用いた。
　その後、凍結乾燥物をミリＱ水（ミリポア社製）に溶解させた。
　３）凍結乾燥エクソソームの安定性評価
　溶解した凍結乾燥エクソソームの粒子数および分布の測定をＮａｎｏＳｉｇｈｔ　ＬＭ１０（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）により行った。測定は測定時間３０秒、繰り返し回数３回で行い、ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを１５で解析した。
　その結果、キレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソームに対応すると考えられる１００～２００ｎｍの粒子量が、増加していた（表１および図３Ａ～３Ｄ）。
　したがって、粒子量の測定によっても、エクソソームの凍結乾燥においてキレート剤がエクソソームを安定化できることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
参考例１：各種キレート剤でのエクソソームの処理
　キレート剤として、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、シュウ酸二水和物、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰ）（ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＥＧＴＡは同仁化学研究所社製、ＨＥＤＴＡ、ＨＩＤＡ、ＮＴＡ、ＥＤＴＭＰは東京化成工業社製、シュウ酸二水和物は和光純薬工業社製）を使用した。各キレート剤のエクソソームの沈降量への影響を検討した。
　３００μＬの血清検体または血漿検体を、６００μＬのＰＢＳまたは各キレート剤添加ＰＢＳと混合した。各キレート剤の濃度はそれぞれ終濃度で１、１０および５０ｍＭとなるように使用した（ただし、ＥＤＴＭＰのみは１、１０および３０ｍＭ）。次いで、溶液を室温で３０分放置した後、２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。その上清を新しいチューブに移し、そこに、ＣＤ９を認識する自社モノクローナル抗体を２μｇ固定した磁性ビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を添加した。４℃で一晩反応させた後に、磁性ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、サンプルをサンプルバッファー（ＳＤＳ含有）で磁性ビーズから溶出し、ウェスタンブロッティング用サンプルとした。これらのサンプルをビオチン化抗ＣＤ９抗体によるウェスタンブロッティングで分析した。
　その結果、血清（図４Ａ）および血漿（図４Ｂ）の両方において、使用したキレート剤はいずれも、免疫沈降法によるエクソソームの回収を示し、また、濃度が高くなるにつれてエクソソームの免疫沈降量が増加した。特に、３０ｍＭのＥＤＴＭＰ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＨＥＤＴＡ、ＮＴＡ、シュウ酸で、エクソソームの免疫沈降量が大幅に増加した（図４Ａ、４Ｂ）。
実施例４:各種糖によるエクソソームの安定化
　エクソソームの凍結乾燥に対する各種糖の効果を検討した。
　１）エクソソームの回収
　３日間無血清培地で培養したヒト非小細胞肺癌細胞Ｈ１２９９の培養上清をサンプルとして用い、実施例２の回収方法にて、エクソソームを回収した。
　２）エクソソームの凍結乾燥
　回収したエクソソームをＱｕｂｉｔ（商標）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々にＰＢＳをさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム１容量に対し、凍結乾燥緩衝液９容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、凍結乾燥機（Ｇｅｎｅｖａｃ社製）を用いて、凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。なお、凍結乾燥緩衝液として、ＰＢＳ、およびＰＢＳにラクトース、フルクトース、メチルβシクロデキストリン（ＭβＣＤ）、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（ＨｐβＣＤ）、γシクロデキストリン（γＣＤ）、グルコース、ラクチトール、ソルビトール、キシリトール、ショ糖、トレハロース、マンニトール、キシロースをｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃ．２．０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬとなるように用いた。
　その後、凍結乾燥物をミリＱ水（ミリポア社製）に溶解させた。
　３）エクソソーム特異的抗原（ＣＤ９）量の測定に基づくエクソソームの安定性評価
　これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、ＥＬＩＳＡ系で評価した。具体的には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ社製）に、自社製抗ＣＤ９抗体を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。その後、各ウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、０．５重量％ＢＳＡを含むＰＢＳ２００μＬを添加して、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、凍結乾燥物の溶解物１００μＬを各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ビオチン化した同自社製抗ＣＤ９抗体を含むＰＢＳ１００μＬを各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ（ＳＡ－ＡＬＰ、ＧｅｎｅＴｅｘ社製）を含むＰＢＳ１００μＬを各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄し、ルミパルス基質液１００μＬを添加し、３７℃で５分反応させた後、波長４８０ｎｍの発光カウントを測定した。凍結乾燥していないサンプルのカウントを１００％とした。
　その結果、これら糖類を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した（図５Ａおよび図５Ｂ）。特に、糖を１０ｍｇ／ｍＬまたは５０ｍｇ／ｍＬで含む凍結乾燥緩衝液では、検討した大部分の糖でエクソソーム量が増大した。
　したがって、エクソソームの凍結乾燥において、各種糖がエクソソームを安定化できること、および、特に糖の濃度が１０～５０ｍｇ／ｍＬである場合に高い安定化効果が奏されることが示された。
実施例５:各種糖およびキレート剤の併用によるエクソソームの安定化
　エクソソームの凍結乾燥に対する各種糖およびキレート剤の併用による効果を検討した。
　１）エクソソームの回収、エクソソームの凍結乾燥およびエクソソーム特異的抗原（ＣＤ９）量の測定に基づくエクソソームの安定性評価
　凍結乾燥緩衝液を除き、実施例４に記載の方法にて、エクソソームの回収および凍結乾燥、並びにエクソソームの安定性評価を行った。
　凍結乾燥緩衝液としては、ＰＢＳもしくはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃ．５０ｍＭ　ＥＤＴＡ／５０ｍＭ　ＥＧＴＡ）（ＥＤ／ＥＧ）、またはこれらのいずれかにラクトース、γシクロデキストリン（γＣＤ）、グルコース、ラクチトールをｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃ．１０ｍｇ／ｍＬで添加したものを用いた。
　その結果、これら糖類およびキレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した（図６）。
　したがって、糖によるエクソソームの安定化は、キレート剤の存在下で向上されることが示された。
実施例６:血清由来のエクソソームの安定化
　血清由来のエクソソームの凍結乾燥に対する各種糖もしくはキレート剤またはこれらの併用による効果を検討した。
　１）エクソソームの回収
　ヒト血清をサンプルとして用いた。血清を、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心した後、２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した。次に、上清を、１００，０００×ｇ、４℃で３時間遠心した。上清を捨て、ＰＢＳを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、１００，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、新たにＰＢＳを加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
　２）エクソソームの凍結乾燥およびエクソソーム特異的抗原（ＣＤ９）量の測定に基づくエクソソームの安定性評価
　エクソソームの凍結乾燥およびエクソソームの安定性評価は、凍結乾燥緩衝液を除き、実施例４に記載の方法にて行った。
　凍結乾燥緩衝液としては、ＰＢＳもしくはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ／ＰＢＳ（ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃ．５０ｍＭ　ＥＤＴＡ／５０ｍＭ　ＥＧＴＡ）（ＥＤ／ＥＧ）、またはこれらのいずれかにラクトース、グルコース、ラクチトールをｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃ．１０ｍｇ／ｍＬもしくは５０ｍｇ／ｍＬで添加したものを用いた。
　その結果、これら糖類またはキレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した（図７）。さらに、糖類とキレート剤の両方を含む凍結乾燥緩衝液を用いた場合は、エクソソーム量がさらに増大した。
　したがって、糖類およびキレート剤によるエクソソームの安定化向上の効果は血清由来のエクソソームにも示された。
実施例７：カルボキシメチルセルロースによるエクソソームの安定化
　エクソソームの凍結乾燥に対するカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の効果を検討した。
　１）エクソソームの回収
　３日間無血清培地で培養したヒト非小細胞肺癌細胞Ｈ１２９９の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心し、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５（ミリポア社製）を用いて濃縮した。濃縮物を１００，０００×ｇ、４℃で３時間遠心した。上清を捨て、ＰＢＳを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、１００，０００×ｇ、４℃で１時間遠心した。上清を捨て、新たにＰＢＳを加えて、エクソソームを回収した。
　２）エクソソームの凍結乾燥
　回収したエクソソームをＱｕｂｉｔ（商標）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にてタンパク定量を行い、濃度を調整した。次に、回収したエクソソーム１容量に対し、等量の凍結乾燥緩衝液と混合し、－２０℃で３時間凍結した後、遠心エバポレーター（スクラム社製）を用いて乾燥させた。その後、凍結乾燥物をミリＱ水（ミリポア社製）で溶解させ、さらにＰＢＳを加えて希釈した。なお、凍結乾燥緩衝液としてＰＢＳ、ＣＭＣ／ＰＢＳ（ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃ．０．２重量％または１重量％ＣＭＣ）を用いた。
　３）エクソソーム特異的抗原（ＣＤ９）量の測定に基づくエクソソームの安定性評価
　これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、固相に自社製抗ＣＤ９抗体、検出にビオチン化した同自社製抗ＣＤ９抗体およびＳＡ－ＡＬＰ（ＧｅｎｅＴｅｘ社製）を用いたＥＬＩＳＡ系で、凍結乾燥していないサンプルのカウントを１００％として評価した。
　その結果、凍結乾燥時に０．２重量％ＣＭＣまたは１重量％ＣＭＣを含む条件では、残存するエクソソームの量が増大した（図８）。
　したがって、エクソソームの凍結乾燥においてＣＭＣがエクソソームを安定化できることが示された。

Claims (12)

  1. 　細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法。
  2. 　細胞外小胞がエクソソームである、請求項１に記載の方法。
  3. 　細胞外小胞含有試料が体液または培養上清である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　細胞外小胞含有試料が血液試料である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　混合における糖の濃度が２．５～１００ｍｇ／ｍＬである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　混合におけるキレート剤の濃度が１～２００ｍＭである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　以下を含む、細胞外小胞の安定化方法：
    （１）細胞外小胞含有試料を糖と混合すること；および
    （２）細胞外小胞含有試料と糖との混合物を凍結させること。
  8. 　凍結が凍結乾燥である、請求項７に記載の方法。
  9. 　以下を含む、細胞外小胞の安定化方法：
    （１）細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合すること；および
    （２）細胞外小胞含有試料とキレート剤との混合物を凍結させること。
  10. 　凍結が凍結乾燥である、請求項９に記載の方法。
  11. 　糖およびキレート剤を含む、細胞外小胞安定化試薬。
  12. 　糖またはキレート剤を含む、細胞外小胞の凍結保存安定化試薬。
PCT/JP2018/047098 2017-12-21 2018-12-20 細胞外小胞の安定化方法 WO2019124522A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18892197.7A EP3730603A4 (en) 2017-12-21 2018-12-20 EXTRACELLULAR VESICLE STABILIZATION METHOD
US16/955,553 US20200319175A1 (en) 2017-12-21 2018-12-20 Method for stabilizing extracellular vesicles
JP2019560577A JPWO2019124522A1 (ja) 2017-12-21 2018-12-20 細胞外小胞の安定化方法
JP2023137566A JP2023153401A (ja) 2017-12-21 2023-08-25 細胞外小胞の安定化方法
US18/544,491 US20240118270A1 (en) 2017-12-21 2023-12-19 Method for stabilizing extracellular vesicles

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017-245603 2017-12-21
JP2017245603 2017-12-21
JP2018-076185 2018-04-11
JP2018076185 2018-04-11

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/955,553 A-371-Of-International US20200319175A1 (en) 2017-12-21 2018-12-20 Method for stabilizing extracellular vesicles
US18/544,491 Division US20240118270A1 (en) 2017-12-21 2023-12-19 Method for stabilizing extracellular vesicles

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019124522A1 true WO2019124522A1 (ja) 2019-06-27

Family

ID=66992654

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/047098 WO2019124522A1 (ja) 2017-12-21 2018-12-20 細胞外小胞の安定化方法

Country Status (4)

Country Link
US (2) US20200319175A1 (ja)
EP (1) EP3730603A4 (ja)
JP (2) JPWO2019124522A1 (ja)
WO (1) WO2019124522A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220033138A (ko) * 2020-09-09 2022-03-16 조선대학교산학협력단 Noxa 단백질에서 유래한 펩타이드를 포함하는 세포외 소포 생산 촉진용 조성물 및 이를 이용한 세포외 소포의 생산 방법

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116855439B (zh) * 2023-08-23 2024-03-15 深圳市华健生物技术有限公司 一种提高植物外泌体稳定性的提取方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150125864A1 (en) 2013-11-06 2015-05-07 Samsung Electronics Co., Ltd. Methods of stabilizing a vesicle in a sample
WO2018070939A1 (en) * 2016-10-12 2018-04-19 Agency For Science, Technology And Research Method for lyophilising an exosome

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6967228B2 (ja) * 2015-06-12 2021-11-17 ハドソン インスティチュート オブ メディカル リサーチHudson Institute Of Medical Research 治療方法
WO2017152035A1 (en) * 2016-03-03 2017-09-08 Henry Ford Health System 3-d collagen scaffold-generated exosomes and uses thereof
US11161902B2 (en) * 2016-05-09 2021-11-02 Helmholtz Zentrum Muenchen—Deutsches Forschungszentrum Fuer Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Tissue-specific exosomes as biomarkers

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150125864A1 (en) 2013-11-06 2015-05-07 Samsung Electronics Co., Ltd. Methods of stabilizing a vesicle in a sample
WO2018070939A1 (en) * 2016-10-12 2018-04-19 Agency For Science, Technology And Research Method for lyophilising an exosome

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FUHRMANN G. ET AL.: "Stability of extracellular vesicles during lyophilization - implications for their pharmaceutical use, Journal of Extracellular Vesicles", THE 2ND UNITED KINGDOM EXTRACELLULAR VESICLEFORUM MEETING ABSTRACTS, vol. 5, no. 1, 23 February 2016 (2016-02-23), pages 30924, XP009514159, DOI: doi:10.3402/jev.v5.30924 *
See also references of EP3730603A4

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220033138A (ko) * 2020-09-09 2022-03-16 조선대학교산학협력단 Noxa 단백질에서 유래한 펩타이드를 포함하는 세포외 소포 생산 촉진용 조성물 및 이를 이용한 세포외 소포의 생산 방법
WO2022055077A1 (ko) * 2020-09-09 2022-03-17 조선대학교산학협력단 Noxa 단백질에서 유래한 펩타이드를 포함하는 세포외 소포 생산 촉진용 조성물 및 이를 이용한 세포외 소포의 생산 방법
KR102452657B1 (ko) * 2020-09-09 2022-10-11 조선대학교 산학협력단 Noxa 단백질에서 유래한 펩타이드를 포함하는 세포외 소포 생산 촉진용 조성물 및 이를 이용한 세포외 소포의 생산 방법

Also Published As

Publication number Publication date
US20240118270A1 (en) 2024-04-11
JPWO2019124522A1 (ja) 2020-12-10
EP3730603A4 (en) 2021-11-24
US20200319175A1 (en) 2020-10-08
JP2023153401A (ja) 2023-10-17
EP3730603A1 (en) 2020-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240118270A1 (en) Method for stabilizing extracellular vesicles
JP6669672B2 (ja) 周囲温度における血液サンプル中の変性されていないポリペプチド、核酸、およびエキソソームの安定化
Hutchison et al. The determination of nucleic acids in biological materials. A review
Levintow et al. Studies on the Relationship between the Enzymatic Synthesis of Glutamine and the Glutamyl Transfer Reaction1
EP3527980A1 (en) Method for recovering extracellular vesicles
AU2011335881B2 (en) Histone inhibition
Richter et al. Evaluation of the storage stability of extracellular vesicles
JP6833768B2 (ja) アントラサイクリン製剤
EP3869177A1 (en) Method for recovering extracellular vesicles
Bettelheim et al. Molecular parameters of submaxillary mucins
Vancraeyneste et al. Short fungal fractions of β-1, 3 glucans affect platelet activation
Tenney et al. Leukocyte adenosine triphosphatases and the effect of endotoxin on their activity
Knopp et al. Fluorescence depolarization measurements on pyrene butyric-bovine serum albumin conjugates
KR102124989B1 (ko) 새로운 오당류 친수성기를 가지는 양친매성 화합물 및 이의 활용
JP6932529B2 (ja) 細胞外小胞の濃縮方法及び細胞外小胞濃縮用試薬
JP5392500B2 (ja) 質量分析による糖鎖の分析方法
EP2009441B1 (en) Method for determining the amount of DNA binding protein
Pither et al. Extraction, purification, and chemical degradation of lps from gut microbiota Strains
US11968975B2 (en) Compositions and methods for storing liquid biospecimens
CN109323996B (zh) 一种真菌检测试剂盒
Menken et al. Assay of hepatic glucuronyl transferase activity using [14C] bilirubin as substrate
Hayashi et al. Some properties of ribosomes and RNA from the midguts of the silkworm, Bombyx mori
Tauber et al. Nature of polysaccharides obtained from endotoxins by hydroxylaminolysis
Drescher Assay of nucleic acids by means of the photometric hemaggregation test
JP2023538615A (ja) 修飾単糖化合物を使用して多細胞生物由来の真核細胞を標識する方法及びキット並びにそのような細胞を含む医薬組成物

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18892197

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019560577

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018892197

Country of ref document: EP

Effective date: 20200721