WO2019124522A1 - 細胞外小胞の安定化方法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method of stabilizing extracellular vesicles and the like.
- Extracellular vesicles are small vesicles having a membrane structure secreted from various types of cells, and are present in body fluids such as blood. Extracellularly secreted extracellular vesicles include exosomes, ectosomes, and apoptotic blebs. Extracellular vesicles are analyzed for purposes such as diagnosis and drug discovery because they contain various substances responsible for functions such as signal transduction between cells. Therefore, development of a method for treating extracellular vesicles useful for such analysis is required.
- Patent Document 1 (1) can improve the yield of extracellular vesicles in the presence of EDTA (chelating agent) as low as about 3.0 mg / mL (about 10 ⁇ M) or less, but the concentration is higher In the presence of EDTA (Example 1, FIGS. 1A-1C), (2) in the presence of a low concentration of EDTA of about 2.25 mg / mL (about 7.7 ⁇ M). Storage of extracellular vesicles at a given temperature and time (Example 2, FIGS. 2A and 2B, FIGS. 3A to 3F), and (3) a low concentration of about 2.25 mg / mL (about 7.7 ⁇ M). Freezing and thawing extracellular vesicles in the presence of concentrations of EDTA (Example 3, FIGS. 4A and 4B) is described.
- EDTA chelating agent
- the object of the present invention is to develop a method which can stabilize extracellular vesicles.
- the present inventors have found that, by mixing an extracellular vesicle-containing sample with a predetermined component such as a sugar, the extracellular vesicles in the extracellular vesicle-containing sample can be stabilized, etc.
- the present invention has been completed.
- the present invention is as follows.
- a method for stabilizing extracellular vesicles which comprises mixing an extracellular vesicle-containing sample with a sugar and a chelating agent.
- the method of any of [1] to [4], wherein the concentration of sugar in the mixture is 2.5 to 100 mg / mL.
- a method of stabilizing extracellular vesicles including the following: (1) mixing the extracellular vesicle-containing sample with sugar; and (2) freezing the mixture of extracellular vesicle-containing sample and sugar.
- the method of [7], wherein the freezing is lyophilization.
- a method for stabilizing extracellular vesicles including the following: (1) mixing the extracellular vesicle-containing sample with the chelating agent; and (2) freezing the mixture of the extracellular vesicle-containing sample and the chelating agent.
- Extracellular vesicle-containing samples can be mixed with sugar to stabilize extracellular vesicles in the extracellular vesicle-containing sample.
- the invention is useful, for example, for the preservation of extracellular vesicles.
- FIG. 1 is a graph showing exosome yield after lyophilization under each buffer condition in Example 1. The exosome yield under non-lyophilized conditions is shown at 100%.
- FIG. 2 is a graph showing exosome yield after lyophilization under each buffer condition in Example 2. The exosome yield under non-lyophilized conditions is shown at 100%.
- 3A is a diagram showing measurement of particle number and particle size distribution of a pre-lyophilized sample (Control) of culture supernatant of human colon cancer cells SW1116 in Example 3.
- FIG. 3B is a diagram showing measurement of particle number and particle size distribution of a pre-lyophilization sample (ED / EG) of culture supernatant of human colon cancer cells SW1116 in Example 3.
- FIG. 3C is a diagram showing measurement of particle number and particle size distribution of a freeze-dried sample (Control) of culture supernatant of human colon cancer cells SW1116 in Example 3.
- FIG. 3D is a diagram showing measurement of particle number and particle size distribution of a freeze-dried sample (ED / EG) of culture supernatant of human colon cancer cells SW1116 in Example 3.
- FIG. 4A is a drawing showing western blotting of a sample obtained by immunoprecipitation of serum samples mixed with each chelating agent at each concentration in Reference Example 1 with a biotinylated anti-CD9 antibody.
- FIG. 4B is a diagram showing Western blotting of a sample obtained by immunoprecipitation of a plasma sample mixed with each chelating agent at each concentration in Reference Example 1 with a biotinylated anti-CD9 antibody.
- FIG. 5A is a graph showing exosome yield after lyophilization under each buffer condition in Example 4 (following FIG. 5B). The exosome yield under non-lyophilized conditions is shown at 100%.
- FIG. 5B is a graph showing exosome yield after lyophilization under each buffer condition in Example 4. The exosome yield under non-lyophilized conditions is shown at 100%.
- FIG. 6 is a graph showing exosome yield after lyophilization under each buffer condition in Example 5. The exosome yield under non-lyophilized conditions is shown at 100%.
- FIG. 5A is a graph showing exosome yield after lyophilization under each buffer condition in Example 4 (following FIG. 5B). The exosome yield under non-lyophilized conditions is shown at 100%.
- FIG. 7 is a graph showing exosome yield after lyophilization of human serum samples under each buffer condition in Example 6. The exosome yield under non-lyophilized conditions is shown at 100%.
- FIG. 8 is a graph showing exosome yield after lyophilization under each buffer condition in Example 7. The exosome yield under non-lyophilized conditions is shown at 100%.
- the present invention provides a method of stabilizing extracellular vesicles, which comprises mixing an extracellular vesicle-containing sample with a sugar.
- the present invention also provides a method of stabilizing extracellular vesicles, which comprises mixing an extracellular vesicle-containing sample with a chelating agent.
- the present invention also provides a method of stabilizing extracellular vesicles, which comprises mixing an extracellular vesicle-containing sample with a sugar and a chelating agent.
- Extracellular vesicles are microscopic vesicles with membrane structures that are secreted from various types of cells.
- Extracellular vesicles include, for example, exosomes, ectosomes, and apoptotic vesicles.
- the extracellular vesicles are exosomes.
- Extracellular vesicles can also be defined by their size. The size of extracellular vesicles is, for example, 30 to 1000 nm, preferably 50 to 300 nm, more preferably 80 to 200 nm.
- the measurement of the size of extracellular vesicles can be performed by, for example, a method based on Brownian movement of extracellular vesicles, a light scattering method, and an electrical resistance method.
- measurement of extracellular vesicle size is performed by NanoSight LM10 (manufactured by Malvern Instruments).
- NanoSight LM10 manufactured by Malvern Instruments
- detection threshold 15 can be adopted as measurement conditions: measurement time 30 seconds, repetition number 3 times.
- Extracellular vesicles can be further defined by extracellular vesicle markers.
- extracellular vesicle markers for example, CD9, carcinoembryonic antigen (CEA), CD81, CD63, heat shock protein (HSP) 70, HSP90, major histocompatibility complex (MHC) I, tumor sensitivity Gene (TSG) 101, lysosome associated membrane protein (LAMP) 1, intercellular adhesion molecule (ICAM) -1, integrin, ceramide, cholesterol, phosphatidylserine, ALIX, Annexins, Caveolin-I, Flotillin-I, Rab protein, EpCAM Can be mentioned.
- CCA carcinoembryonic antigen
- HSP heat shock protein
- MHC major histocompatibility complex
- TSG tumor sensitivity Gene
- LAMP lysosome associated membrane protein
- IAM intercellular adhesion molecule
- integrin integrin
- ceramide cholesterol
- cholesterol phosphatidylserine
- ALIX phosphatidylserine
- ALIX Annex
- Extracellular vesicle-containing sample is any sample containing extracellular vesicles.
- the extracellular vesicle-containing sample is a biological fluid sample.
- the extracellular vesicle-containing sample may be subjected to other treatments before being used in the method of the present invention. Such treatments include, for example, centrifugation, extraction, filtration, precipitation, heating, refrigeration, and agitation.
- the extracellular vesicle-containing sample is a culture supernatant.
- the culture supernatant may be a cell culture supernatant or a tissue culture supernatant.
- organisms from which cells or tissues to be cultured are derived include, for example, mammals (eg, primates such as humans and monkeys; rodents such as mice, rats and rabbits; domestic animals such as cows, pigs and goats; , Working animals such as sheep), animals such as birds (eg, chickens), insects, microorganisms (eg, bacteria), plants, and fish.
- the organism is a mammal, such as a human.
- the extracellular vesicle-containing sample is a body fluid.
- Body fluid is body fluid derived from an organism as described above.
- body fluids include blood samples (eg, whole blood, serum and plasma), lymph fluid, tissue fluid, cerebrospinal fluid, ascites fluid, saliva, pancreatic fluid, bile, sweat, semen, urine, tears, mucus, milk, thorax fluid Bronchoalveolar lavage fluid and amniotic fluid.
- the body fluid is blood.
- the extracellular vesicle-containing sample is milk or fruit juice.
- sugar is a monosaccharide (eg, aldose, ketose) or a polysaccharide in which two or more monosaccharides are linked by glycosidic linkage.
- sugars also include derivatives and sugar alcohols.
- the derivative of a sugar refers to a compound in which a hydrogen atom, a hydroxyl group or a carbonyl group in a sugar is substituted by a substituent.
- Sugar alcohol refers to a compound in which a carbonyl group is reduced in sugar.
- triose eg, glyceraldehyde, dihydroxyacetone
- tetrose eg, erythrose, threose, erythrulose
- pentose eg, xylose, ribose, arabinose, liquisose, ribulose
- examples include xylulose, apiose
- hexose eg, glucose, fructose, galactose, mannose, allose, altrose, gulose, idose, talose, psicose, sorbose, tagatose
- heptose eg, sedoheptulose, coriose
- Aldoses include, for example, xylose, glucose, galactose, mannose, glyceraldehyde, erythrose, threose, ribose, arabinose, lyxose, allose, allose, gulose, idose, talose.
- ketoses include fructose, dihydroxyacetone, erythrulose, xylulose, ribulose, psicose, sorbose, tagatose, sedoheptulose, coriose.
- polysaccharides examples include polysaccharides in which two or more monosaccharides as described above are linked.
- a polysaccharide in which one or more kinds of two or more monosaccharide units selected from the group consisting of glucose, fructose, galactose, mannose, xylose are glycosidically linked (eg, one or more glucose and 1 Polysaccharides in which one or more fructoses are glycosidically linked.
- Such polysaccharides may be linear or cyclic polysaccharides.
- the linear polysaccharide may be a linear oligosaccharide or a linear polymeric polysaccharide.
- the polysaccharide is a linear oligosaccharide
- the total number of monosaccharide units in the polysaccharide is, for example, 2 to 20, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 6, still more preferably 2 to 4
- the number of glucose and fructose in the polysaccharide is independently, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5 More preferably, it may be 1 to 3, still more preferably 1 or 2.
- linear oligosaccharides include disaccharides. Examples of disaccharides include sucrose, lactose and trehalose.
- the disaccharide is sucrose in which one glucose and one fructose are glycosidically linked.
- chain polymer polysaccharides include cellulose, amylose, amylopectin, glucomannan, pullulan, galactomannan, inulin, glycogen, chitin, chitosan, glucuronoxylan, arabinoxylan, agarose, carrageenan, pectin, pectic acid, alginic acid, fucoidan, chondroitin Examples include sulfuric acid and hyaluronan.
- the polysaccharide is a cyclic polysaccharide
- the total number of monosaccharide units in the polysaccharide is, for example, 5 to 100, preferably 5 to 20, more preferably 5 to 10, still more preferably 6 to 8 May be
- cyclic polysaccharides include cyclodextrin ( ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin).
- the substituent in derivatives of sugars for example, a hydrogen atom, a hydroxyl group, C 1 ⁇ 6 alkyl group, C 1 ⁇ 6 alkenyl group, C 1 ⁇ 6 alkynyl group, C 1 ⁇ 6 alkyloxy (alkoxy) group, C 6 And an aromatic hydrocarbon group, a C 1-6 alkyl-carbonyl (acyl) group, a carboxy group, a nitro group, an amino group and a cyano group.
- the C 1-6 alkyl group is an alkyl having 1 to 6 carbon atoms, and may be linear, branched or cyclic, and linear or branched alkyl is preferable.
- a C 1-6 alkyl group for example, methyl, ethyl, propyl, iso-propyl, butyl, iso-butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, 1-ethylpropyl, hexyl, isohexyl, Examples include 1,1-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl and 2-ethylbutyl.
- the C 1-6 alkyl group is an alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, and may be linear, branched or cyclic, with linear or branched alkenyl being preferred.
- Examples of C 1-6 alkenyl groups include ethenyl (vinyl), propenyl, butenyl, pentenyl and hexenyl.
- a C 1-4 alkenyl group is preferable, and a C 1-3 alkenyl group is more preferable.
- the C 1-6 alkynyl group is an alkynyl group having 1 to 6 carbon atoms, and may be linear, branched or cyclic, with linear or branched alkynyl being preferred.
- the C 1-6 alkynyl group for example, ethynyl, propynyl, butynyl, pentynyl and hexynyl can be mentioned.
- As the C 1-6 alkynyl group a C 1-4 alkynyl group is preferable, and a C 1-3 alkynyl group is more preferable.
- C 1-6 alkyloxy group is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
- the C 1 ⁇ 6 alkyl group for example, methyloxy, ethyloxy, propyloxy, iso- propyloxy, butyloxy, iso- butyloxy, sec- butyloxy, tert- butyloxy, pentyloxy, isopentyloxy, neopentyloxy, 1-ethylpropyloxy, hexyloxy, isohexyloxy, 1,1-dimethylbutyloxy, 2,2-dimethylbutyloxy, 3,3-dimethylbutyloxy, 2-ethylbutyloxy.
- the C 1 ⁇ 6 alkyl group preferably C 1 ⁇ 4 alkyl group, C 1 ⁇ 3 alkyl group is more preferable.
- the C 6 ⁇ 14 aromatic hydrocarbon group for example, phenyl, naphthyl, anthracenyl.
- the C 6 ⁇ 14 aromatic hydrocarbon groups include phenyl, naphthyl are preferable, and phenyl is more preferable.
- C 1 ⁇ 6 alkyl - as carbonyl (acyl) group a carbonyl group having a C 1 ⁇ 6 alkyl group as defined above.
- a C 1-6 alkyl-carbonyl group for example, methylcarbonyl (acetyl), ethylcarbonyl, propylcarbonyl, iso-propylcarbonyl, butylcarbonyl, iso-butylcarbonyl, sec-butylcarbonyl, tert-butylcarbonyl, pentylcarbonyl , Isopentylcarbonyl, neopentylcarbonyl, 1-ethylpropylcarbonyl, hexylcarbonyl, isohexylcarbonyl, 1,1-dimethylbutylcarbonyl, 2,2-dimethylbutylcarbonyl, 3,3-dimethylbutylcarbonyl, 2-ethylbutyl Carbonyl is mentioned.
- substituents may be further substituted by another substituent.
- a hydroxyl group, a carboxy group, a nitro group, an amino group, a cyano group is mentioned, for example.
- derivatives of substituted sugars include derivatives of cyclic polysaccharides (eg, cyclodextrins such as ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, or ⁇ -cyclodextrin, etc.) and chain polymer polysaccharides (eg, cellulose) It can be mentioned.
- Derivatives of cyclic polysaccharides include, for example, cyclic polysaccharides substituted with an optionally substituted alkyl group (eg, methyl ⁇ cyclodextrin, hydroxypropyl ⁇ cyclodextrin).
- derivatives of linear high molecular weight polysaccharides include cellulose derivatives.
- the cellulose derivative is a cellulose derivative in which a hydrogen atom of at least one hydroxyl group of cellulose is substituted by a hydrophilic group.
- the hydrophilic group in the cellulose derivative include carboxyalkyl (eg, carboxy C 1-6 alkyl) and hydroxyalkyl (eg, hydroxy C 1-6 alkyl).
- the hydrophilic group in the cellulose derivative is preferably carboxyalkyl or hydroxyalkyl.
- carboxyalkyl examples include carboxymethyl, carboxyethyl (1-carboxyethyl, 2-carboxyethyl), carboxypropyl (1-carboxypropyl, 2-carboxypropyl, 3-carboxypropyl), carboxyisopropyl (1-carboxy-) 2-Methylethyl, 2-carboxy-2-methylethyl), carboxybutyl (1-carboxybutyl, 2-carboxybutyl, 3-carboxybutyl, 4-carboxybutyl), carboxy t-butyl, carboxypentyl (1-carboxy Pentyl, 2-carboxypentyl, 3-carboxypentyl, 4-carboxypentyl, 5-carboxypentyl, carboxyhexyl (1-carboxyhexyl, 2-carboxyhexyl, 3-carboxyhexyl) , 4-carboxy-hexyl, 5-carboxy-hexy
- hydroxyalkyl examples include hydroxymethyl, hydroxyethyl (1-hydroxyethyl, 2-hydroxyethyl), hydroxypropyl (1-hydroxypropyl, 2-hydroxypropyl, 3-hydroxypropyl), hydroxyisopropyl (1-hydroxy-) 2-Methylethyl, 2-hydroxy-2-methylethyl), hydroxybutyl (1-hydroxybutyl, 2-hydroxybutyl, 3-hydroxybutyl, 4-hydroxybutyl), hydroxy tert-butyl, hydroxypentyl (1-hydroxy Pentyl, 2-hydroxypentyl, 3-hydroxypentyl, 4-hydroxypentyl, 5-hydroxypentyl), hydroxyhexyl (1-hydroxyhexyl, 2-hydroxyhexyl, 3-hydroxyhexyl) , 4-hydroxyhexyl, 5-hydroxyhexyl, 6-hydroxyhexyl) and the like.
- Specific examples of the cellulose derivative include carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose or
- Nanocellulose is a fibrous cellulose having a fiber width of nanometer order.
- the fiber width of the nanocellulose may be, for example, 500 nm or less, preferably 200 nm or less, more preferably 100 nm or less, still more preferably 50 nm or less, still more preferably 10 nm or less, particularly preferably 5 nm or less.
- Cellulose derivatives also include their salts.
- a salt for example, salts of metals (eg, monovalent metals such as lithium, sodium, potassium, rubidium and cesium, and divalent metals such as calcium, magnesium and zinc), and inorganic bases (eg, Salts of ammonia).
- metals eg, monovalent metals such as lithium, sodium, potassium, rubidium and cesium, and divalent metals such as calcium, magnesium and zinc
- inorganic bases eg, Salts of ammonia
- sugar alcohol for example, monomers obtained by reducing the carbonyl group in a monosaccharide as described above, multimers in which these monomers are linked by, for example, glycosidic bond, and monomers and monosaccharides thereof As a structural unit, for example, a multimer linked by glycosidic bond can be mentioned.
- Examples of the above monomers include tritol (eg, glycerol), tetolytol (eg, erythritol, tritol), pentitol (eg, xylitol, arabinitol, ribitol), hexitol (eg, sorbitol, mannitol, iditol, gato) Lactitol), heptitol (eg, boremitol, perseitol), octyltol (eg, erythrogalactonoctitol).
- tritol eg, glycerol
- tetolytol eg, erythritol, tritol
- pentitol eg, xylitol, arabinitol, ribitol
- hexitol eg, sorbitol, mannitol, iditol,
- sugar alcohols include monomers such as xylitol, sorbitol, mannitol, galactitol, fusitol, boremitol, arabinitol, glycerin, iditol, erythritol, threitol, ribitol, and dimers such as lactitol and maltitol. .
- a mixture of two or more (eg, two, three, four, five) sugars may be mixed with the extracellular vesicle-containing sample.
- the present invention may include the addition of sugar to the extracellular vesicle-containing sample before mixing the extracellular vesicle-containing sample with the sugar.
- the sugar may be added simultaneously or separately with the chelating agent.
- the concentration of sugar in the mixture is not particularly limited as long as the extracellular vesicle can be stabilized.
- concentration varies depending on factors such as the type of sugar, but may be, for example, 2.5 mg / mL or more, preferably 3.0 mg / mL or more, more preferably 3.5 mg / mL or more, Still more preferably 4.0 mg / mL or more, even more preferably 4.5 mg / mL or more, particularly preferably 5.0 mg / mL or more, 6.0 mg / mL or more, 8.0 mg / mL or more, or 10.0 mg It may be / mL or more.
- Such concentration also varies depending on factors such as the type of sugar, but may be, for example, 600 mg / mL or less, 400 mg / mL or less, 200 mg / mL or less, or 100 mg / mL or less, preferably 95 mg / mL. mL or less, more preferably 90 mg / mL or less, even more preferably 85 mg / mL or less, even more preferably 80 mg / mL or less, particularly preferably 75 mg / mL or less, 70 mg / mL or less, 60 mg / mL or less, or 50 mg / mL It may be less than or equal to mL.
- the concentration of sugar varies depending on factors such as the type of sugar, for example, 2.5 to 800 mg / mL, 2.5 to 600 mg / mL, 2.5 to 400 mg / mL, It may be 5 to 200 mg / mL, or 2.5 to 100 mg / mL, preferably 3.0 to 95 mg / mL, more preferably 3.5 to 90 mg / mL, still more preferably 4.0 to 85 mg / ML, even more preferably 4.5 to 80 mg / mL, particularly preferably 5.0 to 75 mg / mL, 6.0 to 70 mg / mL, 8.0 to 60 mg / mL, or 10.0 to 50 mg / mL It may be
- the chelating agent is a compound having a coordinating moiety capable of coordinate bond with a metal ion or a salt thereof.
- the number of coordinating moieties is preferably 2 or more, more preferably 3 or more (eg, 3 or 6).
- a coordination atom as a coordination part, an oxygen atom, a phosphorus atom, a nitrogen atom, a sulfur atom, and a chlorine atom are mentioned, for example.
- the coordinating atom is preferably an oxygen atom or a phosphorus atom, more preferably an oxygen atom.
- As a coordination group as a coordination part the group which has the said coordination atom is mentioned, for example.
- the coordinating group is preferably a carboxylic acid group or a phosphoric acid group, more preferably a carboxylic acid group.
- EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
- EGTA glycol ether diamine tetraacetic acid
- HEDTA hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid
- HIDA hydroxyethyliminodiacetic acid
- NTA nitrilotriacetic acid
- Ethylene diamine tetra (methylene phosphonic acid) (EDTMP) and salts thereof.
- the salt examples include metal salts (eg, monovalent metal salts such as sodium salt and potassium salt, and divalent metal salts such as calcium salt and magnesium salt), inorganic salts (eg, fluoride, chloride, Bromides, halide salts such as iodide, and ammonium salts), organic salts (eg, ammonium salts substituted with alkyl group), and acid addition salts (eg, sulfuric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, phosphoric acid) And salts with inorganic acids, and salts with organic acids such as acetic acid, oxalic acid, lactic acid, citric acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid and the like).
- metal salts eg, monovalent metal salts such as sodium salt and potassium salt, and divalent metal salts such as calcium salt and magnesium salt
- inorganic salts eg, fluoride, chloride, Bromides, halide salt
- a mixture of two or more (e.g., two, three, four, five) chelating agents may be mixed with the extracellular vesicle-containing sample.
- the present invention may include adding a chelating agent to the extracellular vesicle-containing sample prior to mixing the extracellular vesicle-containing sample with the chelating agent.
- the concentration of the chelating agent in the mixture is not particularly limited as long as extracellular vesicles can be stabilized.
- concentration varies depending on factors such as the type of chelating agent, but is, for example, 1 mM or more, preferably 5 mM or more, more preferably 10 mM or more, still more preferably 15 mM or more, still more preferably 20 mM or more, particularly preferably It may be 30 mM or more, 40 mM or more, or 50 mM or more.
- Such concentration also varies depending on factors such as the type of chelating agent, but is, for example, 200 mM or less, preferably 180 mM or less, more preferably 170 mM or less, still more preferably 160 mM or less, still more preferably 150 mM or less, particularly preferably May be 140 mM or less, 120 mM or less, or 100 mM or less.
- the concentration of the chelating agent is, for example, 1 mM to 200 mM, preferably 5 to 180 mM, more preferably 10 to 170 mM, still more preferably 15 to 160 mM, still more preferably 20 to 150 mM, particularly preferably 30 It may be ⁇ 140 mM, 40-120 mM, or 50-100 mM.
- Extracellular vesicle-containing samples may be mixed with both sugars and chelating agents.
- the concentration of sugar and chelating agent used in the mixing can also be defined by their ratio.
- the concentration of chelating agent per 10 mg / mL of sugar in mixing varies depending on factors such as sugar and type of chelating agent, but it is, for example, 1 mM or more, preferably 5 mM or more, preferably 10 mM or more, still more preferably 15 mM
- the above may be even more preferably 20 mM or more, particularly preferably 30 mM or more, 40 mM or more, or 50 mM or more.
- Such concentration also varies depending on factors such as sugar and type of chelating agent, but for example 200 mM or less, preferably 180 mM or less, more preferably 170 mM or less, still more preferably 160 mM or less, still more preferably 150 mM or less, Particularly preferably, it may be 140 mM or less, 120 mM or less, or 100 mM or less.
- the concentration of the chelating agent is, for example, 1 mM to 200 mM, preferably 5 to 180 mM, more preferably 10 to 170 mM, still more preferably 15 to 160 mM, still more preferably 20 to 150 mM, particularly preferably 30 It may be ⁇ 140 mM, 40-120 mM, or 50-100 mM.
- the mixing can be done in any manner.
- the mixing can be done simultaneously or separately.
- the extracellular vesicle-containing sample may be (1) mixed simultaneously with the sugar and the chelating agent, (2) mixed with the sugar, and then mixed with the chelating agent, or 3) After being mixed with a chelating agent, it may be mixed with sugar. From the viewpoint of simplicity of operation, etc., the extracellular vesicle-containing sample may preferably be mixed simultaneously with the sugar and the chelating agent.
- the mixing temperature may be, for example, 4 to 37 ° C, preferably 15 to 30 ° C.
- the mixing time is not particularly limited as long as extracellular vesicles can be stabilized, and can be set as appropriate.
- the extracellular vesicle-containing sample may be left after mixing with predetermined components such as sugars.
- whether or not the extracellular vesicle is stabilized by mixing with a predetermined component such as sugar can be determined by, for example, an index value measured after mixing the extracellular vesicle with a predetermined component such as sugar, sugar, etc. Whether the index value is superior to the control value as compared to the control value measured for extracellular vesicles in the absence of the predetermined component of (the condition other than the presence or absence of the predetermined component such as sugar being the same) It can do by evaluating whether or not.
- lyophilization is performed at -28 ° C for 2 hours, -10 ° C for 4 hours, and then at 20 ° C.
- index values of the lyophilizate in the presence or absence of predetermined components such as sugar may be compared.
- an index value for example, a measurement value of an extracellular vesicle marker amount or a particle number corresponding to the extracellular vesicle can be used.
- Measurement of extracellular vesicle marker levels can be performed by any method known in the art.
- the extracellular vesicle marker is a protein
- examples of the measurement method include immunoassay and mass spectrometry.
- Immunoassays include, for example, direct competition, indirect competition, and sandwich techniques.
- chemiluminescence immunoassay [eg, chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA)], immunoturbidimetric assay (TIA), enzyme immunoassay (EIA) (eg, direct competition ELISA) , Indirect competitive ELISA, and sandwich ELISA), radioimmunoassay (RIA), latex agglutination, fluorescence immunoassay (FIA), and immunochromatography, Western blotting, immunostaining, fluorescence activated cell sorting, FACS Can be mentioned. If multiple components are detected, proteome analysis may be performed.
- CLIA chemiluminescence immunoassay
- TIA immunoturbidimetric assay
- EIA enzyme immunoassay
- RIA radioimmunoassay
- FIA fluorescence immunoassay
- FACS fluorescence immunoassay
- the measurement method may, for example, be a hybridization method using a probe, a gene amplification method using a primer (eg, 2, 3 or 4 primers) or mass spectrometry.
- a primer eg, 2, 3 or 4 primers
- mass spectrometry e.g., mass spectrometry.
- the number of particles corresponding to extracellular vesicles can be measured, for example, by a device such as a particle analysis device, an electron microscope, or a flow cytometer.
- a device such as a particle analysis device, an electron microscope, or a flow cytometer.
- particle number measurement can be performed by NanoSight LM10 (manufactured by Malvern Instruments).
- detection threshold 15 can be adopted as measurement conditions: measurement time 30 seconds, repetition number 3 times.
- the method of the invention may further comprise freezing the mixture.
- the present invention further provides a method of stabilizing extracellular vesicles, which comprises: (1) mixing the extracellular vesicle-containing sample with sugar; and (2) freezing the mixture of extracellular vesicle-containing sample and sugar.
- the invention further provides a method of stabilizing extracellular vesicles, which comprises: (1) mixing the extracellular vesicle-containing sample with the chelating agent; and (2) freezing the mixture of the extracellular vesicle-containing sample and the chelating agent.
- the invention further provides a method of stabilizing extracellular vesicles, which comprises: (1) mixing the extracellular vesicle-containing sample with a sugar and a chelating agent; and (2) freezing a mixture of the extracellular vesicle-containing sample and the sugar and the chelating agent.
- the freezing may be either lyophilization or freezing of the solution (non-drying freezing), but lyophilization is preferred if the extracellular vesicles are stored for longer periods of time.
- sugar and chelating agent types and concentrations in mixtures are as described above.
- Extracellular Vesicle Stabilizing Reagent The present invention also provides an extracellular vesicle stabilizing reagent.
- the reagents of the present invention include sugars or chelating agents.
- the reagent of the present invention may contain a sugar and a chelating agent.
- Sugars and chelating agents are as described above.
- the reagent of the present invention may contain, in addition to the sugar and the chelating agent, other components (eg, other components useful for stabilizing extracellular vesicles).
- the reagent of the present invention is an extracellular vesicle stabilizing composition comprising sugar. In another embodiment, the reagent of the present invention is an extracellular vesicle stabilizing composition comprising a chelating agent. In yet another embodiment, the composition of the present invention is an extracellular vesicle stabilizing composition comprising both a sugar and a chelating agent.
- the reagents of the present invention can be used in admixture with extracellular vesicle-containing samples.
- the mixture of extracellular vesicle-containing sample and the reagent of the present invention may be frozen.
- the reagent of the present invention can be used as a cryopreservation stabilization reagent for extracellular vesicles.
- the freezing may be either lyophilization or freezing of the solution (non-drying freezing), but lyophilization is preferred if the extracellular vesicles are stored for longer periods of time.
- the concentration of sugar in the composition is not particularly limited as long as it can stabilize extracellular vesicles after being mixed with the extracellular vesicle-containing sample.
- concentration varies depending on factors such as the type of sugar, but may be, for example, 2.7 mg / mL or more, preferably 3.0 mg / mL or more, more preferably 3.5 mg / mL or more, Still more preferably 4.0 mg / mL or more, even more preferably 4.5 mg / mL or more, particularly preferably 5.0 mg / mL or more, 6.0 mg / mL or more, 8.0 mg / mL or more, or 10.0 mg It may be / mL or more.
- Such concentration also varies depending on factors such as the type of sugar, but may be, for example, 600 mg / mL or less, 400 mg / mL or less, 200 mg / mL or less, 100 mg / mL or less, preferably 95 mg / mL Or less, more preferably 90 mg / mL or less, still more preferably 85 mg / mL or less, still more preferably 80 mg / mL or less, particularly preferably 75 mg / mL or less, 70 mg / mL or less, 60 mg / mL or less, or 50 mg / mL It may be the following.
- the concentration of sugar varies depending on factors such as the type of sugar, for example, 2.7 to 800 mg / mL, 2.7 to 600 mg / mL, 2.7 to 400 mg / mL, It may be 7 to 200 mg / mL, or 2.7 to 100 mg / mL, preferably 3.0 to 95 mg / mL, more preferably 3.5 to 90 mg / mL, still more preferably 4.0 to 85 mg / ML, even more preferably 4.5 to 80 mg / mL, particularly preferably 5.0 to 75 mg / mL, 6.0 to 70 mg / mL, 8.0 to 60 mg / mL, or 10.0 to 50 mg / mL It may be
- the concentration of the chelating agent in the composition is not particularly limited as long as it can stabilize the extracellular vesicles after being mixed with the extracellular vesicle-containing sample. Such concentration varies depending on factors such as the type of chelating agent, but is, for example, 1.1 mM or more, preferably 5 mM or more, preferably 10 mM or more, preferably 15 mM or more, more preferably 20 mM or more, still more preferably 30 mM The above may be even more preferably 40 mM or more, particularly preferably 50 mM or more.
- Such concentration also varies depending on factors such as the type of chelating agent, but is, for example, 200 mM or less, preferably 180 mM or less, more preferably 170 mM or less, still more preferably 160 mM or less, still more preferably 150 mM or less, particularly preferably May be 140 mM or less, 120 mM or less, or 100 mM or less.
- the concentration of the chelating agent is, for example, 1.1 mM to 200 mM, preferably 5 to 180 mM, more preferably 10 to 170 mM, still more preferably 15 to 160 mM, still more preferably 20 to 150 mM, particularly preferably May be 30-140 mM, 40-120 mM, or 50-100 mM.
- the concentration of sugar and chelating agent can also be defined by their ratio.
- concentration of chelating agent per 10 mg / mL of sugar varies depending on factors such as sugar and type of chelating agent, but for example 1 mM or more, preferably 5 mM or more, preferably 10 mM or more, preferably 15 mM or more, more preferably It may be 20 mM or more, still more preferably 30 mM or more, still more preferably 40 mM or more, particularly preferably 50 mM or more.
- Such concentration also varies depending on factors such as sugar and type of chelating agent, but for example 200 mM or less, preferably 180 mM or less, more preferably 170 mM or less, still more preferably 160 mM or less, still more preferably 150 mM or less, Particularly preferably, it may be 140 mM or less, 120 mM or less, or 100 mM or less.
- the concentration of the chelating agent is, for example, 1 mM to 200 mM, preferably 5 to 180 mM, more preferably 10 to 170 mM, still more preferably 15 to 160 mM, still more preferably 20 to 150 mM, particularly preferably 30 It may be ⁇ 140 mM, 40-120 mM, or 50-100 mM.
- the composition of the present invention is an aqueous solution containing a sugar and / or a chelating agent, even if it is a non-aqueous composition containing sugar and / or a chelating agent (eg mixed powder) dissolved in an aqueous solution upon use
- a aqueous solution containing a sugar and / or a chelating agent is preferable from the viewpoint of quick and easy use and the like.
- Aqueous solutions include, for example, water (eg, distilled water, sterile water, sterile distilled water, and pure water), and buffers, with buffers being preferred.
- buffers examples include phosphate buffer, phosphate buffered saline (PBS), tartrate buffer, citrate buffer, acetate buffer, glycine buffer, carbonate buffer, 2-morpholinoethanesulfonic acid (for example, MES) buffer, trishydroxymethylaminomethane (Tris) buffer, borate buffer, 3-morpholinopropane sulfonic acid (MOPS) buffer, N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine (Bicine) buffer And N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine (Bis-Tris) buffer, 2- [4- (2-hydroxyethyl) 1-piperazinyl ethane sulfonic acid (HEPES) buffer.
- PBS phosphate buffered saline
- Tris trishydroxymethylaminomethane
- MOPS 3-morpholinopropane sulfonic acid
- Na N-bis (2-hydroxyethyl) glycine
- the pH of the buffer is preferably neutral. More specifically, such pH may be preferably 5.0 or more, more preferably 5.5 or more, and even more preferably 6.0 or more. The pH may also be preferably 9.0 or less, more preferably 8.5 or less, and even more preferably 8.0 or less.
- the measurement of pH can be performed using methods known in the art. Preferably, pH can adopt a value measured at 25 ° C. using a pH meter having a glass electrode.
- the composition of the present invention can be used as appropriate mixed with an extracellular vesicle-containing sample.
- the mixing ratio of the composition of the present invention to the extracellular vesicle-containing sample is, for example, 1/30 to 30, preferably 1/20 to 20, more preferably 1/10. To 10, and even more preferably 1/10 to 1.
- the volume of the aqueous solution is, for example, 1 ⁇ L to 100 mL.
- the volume of the aqueous solution may be 10 ⁇ L or more, 100 ⁇ L or more, or 1000 ⁇ L or more.
- the volume of the aqueous solution may also be 50 mL or less, 10 mL or less, or 2 mL or less.
- the reagent of the present invention is a kit comprising a sugar and / or a chelating agent.
- the sugar and / or chelating agent can be provided in the form of a solid or an aqueous solution, but is preferably provided in the form of an aqueous solution.
- the kit of the present invention may be provided in the form of an aqueous solution containing sugar, may be provided in the form of an aqueous solution containing a chelating agent, and may be provided in the form of an aqueous solution containing sugar and a chelating agent , A first aqueous solution containing sugar, and a second aqueous solution containing a chelating agent.
- the aqueous solution is as described above, but a buffer is preferred. Examples of buffers and pH are as described above.
- the relationship between the concentration of sugar in the first aqueous solution, the concentration of chelating agent in the second aqueous solution, and the concentration ratio of sugar and chelating agent in the first and second aqueous solutions is the same as that described above for the composition of the present invention is there.
- the mixing ratio of the first and second aqueous solutions to the extracellular vesicle-containing sample, and the volumes of the first and second aqueous solutions are the same as those described above for the composition of the present invention.
- the invention also provides mixtures comprising sugars and / or chelating agents and extracellular vesicles.
- the mixture of the present invention may further comprise an aqueous solution (eg, a buffer as described above).
- the form of the mixture is not particularly limited, but an aqueous solution or a frozen product thereof (eg, a lyophilizate) is preferred.
- the mixture of the present invention can be obtained by treating an extracellular vesicle-containing sample with the method or reagent of the present invention as described above.
- the mixtures of the invention are useful, for example, for the preservation of extracellular vesicles.
- the concentration of sugar or chelating agent in the mixture and the concentration ratio of sugar and chelating agent are similar to those described above for the method of the invention.
- the concentration of extracellular vesicles in the mixture is, for example, 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 15 , preferably 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 14 , more preferably 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ It is 10 13 , still more preferably 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 12 , particularly preferably 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 11 .
- the volume of the aqueous solution is, for example, 1 ⁇ L to 100 mL.
- the volume of the aqueous solution may be 10 ⁇ L or more, 100 ⁇ L or more, or 1000 ⁇ L or more.
- the volume of the aqueous solution may also be 50 mL or less, 10 mL or less, or 2 mL or less.
- Example 1 Stabilization of exosome by chelating agent The effect of the chelating agent on lyophilization of exosome was examined.
- PBS or EDTA / EGTA / PBS (final conc. 50 mM EDTA / 50 mM EGTA) was used as a lyophilization buffer.
- the pH of PBS used was 7.4 (same as in Examples 1 to 3).
- the lyophilizate was then dissolved in Milli Q water (Millipore) or 50 mM EDTA / 50 mM EGTA / H 2 O (lysis buffer).
- Example 2 Stabilization of Exosomes with Sucrose The effect of saccharides on lyophilization of exosomes was examined.
- a lyophilizate containing lyophilized exosomes As a lyophilization buffer, PBS, EDTA / EGTA / PBS (final conc. 50 mM EDTA / 50 mM EGTA), sucrose / PBS (final conc. 10 mg / mL sucrose), or EDTA / EGTA / sucrose / PBS (Final conc. 50 mM EDTA / 50 mM EGTA / 10 mg / mL sucrose) was used. Thereafter, the lyophilizate was dissolved in Milli Q water (manufactured by Millipore).
- the count of non-lyophilized samples was taken as 100%.
- the amount of exosome increased (FIG. 2).
- the freeze-drying buffer containing sucrose and the chelating agent further increased the amount of exosome. Therefore, it was shown that sugars can stabilize exosomes upon lyophilization of exosomes. Also, it has been shown that the stabilization of exosomes by sugars is enhanced in the presence of a chelating agent.
- Example 3 Stability Assessment of Lyophilized Exosomes Based on Particle Mass Measurement
- the lyophilized samples were measured with NanoSight to assess stability based on the particle mass of the lyophilized exosomes.
- Reference Example 1 Treatment of exosomes with various chelating agents Disodium ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA ⁇ 2Na), glycol ether diamine tetraacetic acid (EGTA), hydroxyethyl ethylenediamine triacetic acid (HEDTA), hydroxyethyl iminodiacetic acid as a chelating agent (HIDA), nitrilotriacetic acid (NTA), oxalic acid dihydrate, ethylenediaminetetra (methylene phosphonic acid) (EDTMP) (EDTA ⁇ 2Na, EGTA is manufactured by Dojindo Laboratories, HEDTA, HIDA, NTA, EDTMP The oxalic acid dihydrate manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
- EDTA ⁇ 2Na Disodium ethylenediaminetetraacetic acid
- EGTA glycol ether diamine tetraacetic acid
- HEDTA hydroxyethyl ethylene
- Example 4 Stabilization of exosomes by various sugars The effects of various sugars on lyophilization of exosomes were examined.
- lyophilization buffer PBS, and PBS, lactose, fructose, methyl beta cyclodextrin (M beta CD), hydroxypropyl beta cyclodextrin (Hp beta CD), gamma cyclodextrin (gamma CD), glucose, lactitol, sorbitol, xylitol, sucrose Sugar, trehalose, mannitol, xylose are final conc. It used so that it might become 2.0 mg / mL, 10 mg / mL, and 50 mg / mL. Thereafter, the lyophilizate was dissolved in Milli Q water (manufactured by Millipore).
- the count of non-lyophilized samples was taken as 100%.
- the amount of exosome increased in the lyophilization buffer containing these saccharides (FIGS. 5A and 5B).
- lyophilization buffer containing 10 mg / mL or 50 mg / mL of sugar increased the amount of exosomes for most of the sugars examined. Therefore, it was shown that various saccharides can stabilize exosomes in lyophilization of exosomes, and that a high stabilization effect is exerted particularly when the concentration of saccharides is 10 to 50 mg / mL.
- Example 5 Stabilization of Exosome by Combination of Various Sugars and Chelating Agents The effect of the combination of various sugars and chelating agents on lyophilization of exosomes was examined.
- Example 6 Stabilization of serum-derived exosomes The effect of various sugars or chelating agents or their combination on lyophilization of serum-derived exosomes was examined.
- lyophilization buffer containing these saccharides or chelating agents increased the amount of exosome (FIG. 7). Furthermore, the amount of exosomes was further increased when using a lyophilization buffer containing both saccharides and chelating agents. Therefore, the effect of saccharides and chelating agents on the stabilization of exosomes was also shown in serum-derived exosomes.
- Example 7 Stabilization of exosomes by carboxymethylcellulose The effect of carboxymethylcellulose (CMC) on lyophilization of exosomes was examined.
- CMC carboxymethylcellulose
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Abstract
本発明は、細胞外小胞を安定化することを提供する。具体的には、本発明は、細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法などを提供する。
Description
本発明は、細胞外小胞の安定化方法などに関する。
細胞外小胞(extracellular vesicle)は、さまざまな種類の細胞から分泌される、膜構造を有する微小な小胞であり、血液などの体液中に存在する。細胞外に分泌される細胞外小胞には、エクソソーム(exosome)、エクトソーム(ectosome)、アポトーシス胞(apoptotic bleb)が含まれる。細胞外小胞は、細胞間の情報伝達等の機能を担う種々の物質を含むことから、診断、創薬等の目的のために解析されている。よって、このような解析に有用な細胞外小胞の処理方法の開発が求められている。例えば、特許文献1には、(1)約3.0mg/mL(約10μM)以下という低濃度のEDTA(キレート剤)の存在下で細胞外小胞の収量を改善できるものの、それより高濃度のEDTAの存在下では細胞外小胞の収量を改善できないこと(実施例1、図1A~1C)、(2)約2.25mg/mL(約7.7μM)という低濃度のEDTAの存在下で、所定の温度および時間において細胞外小胞を保存すること(実施例2、図2Aおよび2B、図3A~3F)、ならびに(3)約2.25mg/mL(約7.7μM)という低濃度のEDTAの存在下で細胞外小胞を凍結・融解すること(実施例3、図4Aおよび4B)が記載されている。
細胞外小胞を安定化できれば、細胞外小胞の保存性を向上でき、診断、創薬等の分野への応用に有用である。したがって、本発明の目的は、細胞外小胞を安定化できる方法を開発することである。
本発明者らは、鋭意検討した結果、細胞外小胞含有試料を糖などの所定の成分と混合することにより、細胞外小胞含有試料中の細胞外小胞を安定化できること等を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔1〕細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法。
〔2〕細胞外小胞がエクソソームである、〔1〕の方法。
〔3〕細胞外小胞含有試料が体液または培養上清である、〔1〕または〔2〕の方法。
〔4〕細胞外小胞含有試料が血液試料である、〔1〕~〔3〕のいずれかの方法。
〔5〕混合における糖の濃度が2.5~100mg/mLである、〔1〕~〔4〕のいずれかの方法。
〔6〕混合におけるキレート剤の濃度が1~200mMである、〔1〕~〔5〕のいずれかの方法。
〔7〕以下を含む、細胞外小胞の安定化方法:
(1)細胞外小胞含有試料を糖と混合すること;および
(2)細胞外小胞含有試料と糖との混合物を凍結させること。
〔8〕凍結が凍結乾燥である、〔7〕の方法。
〔9〕以下を含む、細胞外小胞の安定化方法:
(1)細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合すること;および
(2)細胞外小胞含有試料とキレート剤との混合物を凍結させること。
〔10〕凍結が凍結乾燥である、〔9〕の方法。
〔11〕糖およびキレート剤を含む、細胞外小胞安定化試薬。
〔12〕糖またはキレート剤を含む、細胞外小胞の凍結保存安定化試薬。
〔1〕細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法。
〔2〕細胞外小胞がエクソソームである、〔1〕の方法。
〔3〕細胞外小胞含有試料が体液または培養上清である、〔1〕または〔2〕の方法。
〔4〕細胞外小胞含有試料が血液試料である、〔1〕~〔3〕のいずれかの方法。
〔5〕混合における糖の濃度が2.5~100mg/mLである、〔1〕~〔4〕のいずれかの方法。
〔6〕混合におけるキレート剤の濃度が1~200mMである、〔1〕~〔5〕のいずれかの方法。
〔7〕以下を含む、細胞外小胞の安定化方法:
(1)細胞外小胞含有試料を糖と混合すること;および
(2)細胞外小胞含有試料と糖との混合物を凍結させること。
〔8〕凍結が凍結乾燥である、〔7〕の方法。
〔9〕以下を含む、細胞外小胞の安定化方法:
(1)細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合すること;および
(2)細胞外小胞含有試料とキレート剤との混合物を凍結させること。
〔10〕凍結が凍結乾燥である、〔9〕の方法。
〔11〕糖およびキレート剤を含む、細胞外小胞安定化試薬。
〔12〕糖またはキレート剤を含む、細胞外小胞の凍結保存安定化試薬。
細胞外小胞含有試料を糖と混合することにより、細胞外小胞含有試料中の細胞外小胞を安定化できる。したがって、本発明は、例えば、細胞外小胞の保存に有用である。
1.細胞外小胞の安定化方法
本発明は、細胞外小胞含有試料を糖と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する。
本発明は、細胞外小胞含有試料を糖と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する。
本発明はまた、細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する。
本発明はまた、細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する。
細胞外小胞は、さまざまな種類の細胞から分泌される、膜構造を有する微小な小胞である。細胞外小胞としては、例えば、エクソソーム、エクトソーム、およびアポトーシス胞が挙げられる。好ましくは、細胞外小胞は、エクソソームである。細胞外小胞はまた、そのサイズにより規定することができる。細胞外小胞のサイズは、例えば、30~1000nmであり、好ましくは50~300nm、より好ましくは80~200nmである。細胞外小胞のサイズの測定は、例えば、細胞外小胞のブラウン運動に基づく方法、光散乱法、および電気抵抗法などにより行うことができる。好ましくは、細胞外小胞のサイズの測定は、NanoSight LM10(Malvern Instruments社製)により行われる。NanoSight LM10を用いる場合、測定条件として、測定時間30秒、繰り返し回数3回、detection threshold 15を採用することができる。細胞外小胞はさらに、細胞外小胞マーカーにより規定することができる。細胞外小胞マーカーとしては、例えば、CD9、癌胎児性抗原(Carcinoembryonic antigen、CEA)、CD81、CD63、熱ショックタンパク質(HSP)70、HSP90、主要組織適合性複合体(MHC)I、腫瘍感受性遺伝子(TSG)101、リソソーム関連膜タンパク質(LAMP)1、細胞間接着分子(ICAM)-1、インテグリン、セラミド、コレステロール、ホスファチジルセリン、ALIX、Annexins、Caveolin-I、Flotillin-I、Rabタンパク、EpCAMが挙げられる。
細胞外小胞含有試料は、細胞外小胞を含有する任意の試料である。好ましくは、細胞外小胞含有試料は、生物学的な液体試料である。細胞外小胞含有試料は、本発明の方法に用いられる前に、他の処理に付されてもよい。このような処理としては、例えば、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、加熱、冷蔵、および攪拌が挙げられる。
一実施形態では、細胞外小胞含有試料は、培養上清である。培養上清は、細胞培養上清であっても組織培養上清であってもよい。培養される細胞または組織が由来する生物としては、例えば、哺乳動物(例、ヒト、サル等の霊長類;マウス、ラット、ウサギ等の齧歯類;ウシ、ブタ、ヤギ等の家畜;およびウマ、ヒツジ等の使役動物)、鳥類(例、ニワトリ)等の動物、昆虫、微生物(例、細菌類)、植物、および魚類が挙げられる。好ましくは、生物は、ヒト等の哺乳動物である。
別の実施形態では、細胞外小胞含有試料は、体液である。体液は、上述したような生物に由来する体液である。体液としては、例えば、血液試料(例、全血、血清および血漿)、リンパ液、組織液、脳脊髄液、腹水、唾液、膵液、胆汁、汗、精液、尿、涙液、粘液、乳汁、胸腔液、気管支肺胞洗浄液および羊水が挙げられる。好ましくは、体液は、血液である。
さらに別の実施形態では、細胞外小胞含有試料は、牛乳または果汁である。
糖は、単糖(例、アルドース、ケトース)、または2個以上の単糖がグリコシド結合により連結した多糖である。本発明において、糖には誘導体および糖アルコールも含まれる。糖の誘導体とは、糖において水素原子、水酸基、またはカルボニル基が置換基で置換された化合物をいう。糖アルコールとは、糖においてカルボニル基が還元された化合物をいう。
より具体的には、単糖としては、例えば、トリオース(例、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン)、テトロース(例、エリトロース、トレオース、エリトルロース)、ペントース(例、キシロース、リボース、アラビノース、リキソース、リブロース、キシルロース、アピオース)、ヘキソース(例、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、プシコース、ソルボース、タガトース)、ヘプトース(例、セドヘプツロース、コリオース)が挙げられる。アルドースとしては、例えば、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、グリセルアルデヒド、エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、リキソース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロースが挙げられる。ケトースとしては、例えば、フルクトース、ジヒドロキシアセトン、エリトルロース、キシルロース、リブロース、プシコース、ソルボース、タガトース、セドヘプツロース、コリオースが挙げられる。
多糖としては、例えば、上述したような単糖が2個以上連結した多糖が挙げられる。好ましくは、多糖としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロースからなる群から選ばれる1種または複数種の2個以上の単糖単位がグリコシド結合した多糖(例、1個以上のグルコースおよび1個以上のフルクトースがグリコシド結合した多糖)が挙げられる。このような多糖は、鎖状多糖または環状多糖であってもよい。鎖状多糖は、鎖状オリゴ糖または鎖状高分子多糖であってもよい。多糖が鎖状オリゴ糖である場合、多糖における単糖単位の個数の合計は、例えば2~20個、好ましくは2~10個、より好ましくは2~6個、さらにより好ましくは2~4個であってもよい。例えば、多糖が1個以上のグルコースおよび1個以上のフルクトースがグリコシド結合した多糖である場合、多糖におけるグルコースおよびフルクトースの個数は、それぞれ独立して、例えば1~10個、好ましくは1~5個、より好ましくは1~3個、さらにより好ましくは1もしくは2個であってもよい。鎖状オリゴ糖としては、例えば、二糖が挙げられる。二糖としては、例えば、ショ糖、ラクトース、トレハロースが挙げられる。特に好ましくは、二糖は、1個のグルコースおよび1個のフルクトースがグリコシド結合したショ糖である。鎖状高分子多糖としては、セルロース、アミロース、アミロペクチン、グルコマンナン、プルラン、ガラクトマンナン、イヌリン、グリコーゲン、キチン、キトサン、グルクロノキシラン、アラビノキシラン、アガロース、カラギーナン、ペクチン、ペクチン酸、アルギン酸、フコイダン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロナンが挙げられる。多糖が環状多糖である場合、多糖における単糖単位の個数の合計は、例えば5~100個、好ましくは5~20個、より好ましくは5~10個、さらにより好ましくは6~8個であってもよい。環状多糖としては、例えば、シクロデキストリン(αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、γシクロデキストリン)が挙げられる。
糖の誘導体における置換基としては、例えば、水素原子、水酸基、C1~6アルキル基、C1~6アルケニル基、C1~6アルキニル基、C1~6アルキルオキシ(アルコキシ)基、C6~14芳香族炭化水素基、C1~6アルキル-カルボニル(アシル)基、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、シアノ基が挙げられる。
C1~6アルキル基は、炭素原子数1~6個のアルキルであり、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖または分岐鎖のアルキルが好ましい。C1~6アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、iso-プロピル、ブチル、iso-ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、1-エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、1,1-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、2-エチルブチルが挙げられる。C1~6アルキル基としては、C1~4アルキル基が好ましく、C1~3アルキル基がより好ましい。
C1~6アルケニル基は、炭素原子数1~6個のアルケニル基であり、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖または分岐鎖のアルケニルが好ましい。C1~6アルケニル基としては、例えば、エテニル(ビニル)、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、へキセニルが挙げられる。C1~6アルケニル基としては、C1~4アルケニル基が好ましく、C1~3アルケニル基がより好ましい。
C1~6アルケニル基は、炭素原子数1~6個のアルケニル基であり、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖または分岐鎖のアルケニルが好ましい。C1~6アルケニル基としては、例えば、エテニル(ビニル)、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、へキセニルが挙げられる。C1~6アルケニル基としては、C1~4アルケニル基が好ましく、C1~3アルケニル基がより好ましい。
C1~6アルキニル基は、炭素原子数1~6個のアルキニル基であり、直鎖、分岐鎖、または環状のいずれであってもよいが、直鎖または分岐鎖のアルキニルが好ましい。C1~6アルキニル基としては、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、へキシニルが挙げられる。C1~6アルキニル基としては、C1~4アルキニル基が好ましく、C1~3アルキニル基がより好ましい。
C1~6アルキルオキシ基は、炭素原子数1~6個のアルキルオキシ基である。C1~6アルキルオキシ基としては、例えば、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、iso-プロピルオキシ、ブチルオキシ、iso-ブチルオキシ、sec-ブチルオキシ、tert-ブチルオキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、1-エチルプロピルオキシ、ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ、1,1-ジメチルブチルオキシ、2,2-ジメチルブチルオキシ、3,3-ジメチルブチルオキシ、2-エチルブチルオキシが挙げられる。C1~6アルキルオキシ基としては、C1~4アルキルオキシ基が好ましく、C1~3アルキルオキシ基がより好ましい。
C1~6アルキルオキシ基は、炭素原子数1~6個のアルキルオキシ基である。C1~6アルキルオキシ基としては、例えば、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、iso-プロピルオキシ、ブチルオキシ、iso-ブチルオキシ、sec-ブチルオキシ、tert-ブチルオキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、1-エチルプロピルオキシ、ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ、1,1-ジメチルブチルオキシ、2,2-ジメチルブチルオキシ、3,3-ジメチルブチルオキシ、2-エチルブチルオキシが挙げられる。C1~6アルキルオキシ基としては、C1~4アルキルオキシ基が好ましく、C1~3アルキルオキシ基がより好ましい。
C6~14芳香族炭化水素基としては、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニルが挙げられる。C6~14芳香族炭化水素基としては、フェニル、ナフチルが好ましく、フェニルがより好ましい。
C1~6アルキル-カルボニル(アシル)基としては、上述したようなC1~6アルキル基を有するカルボニル基である。C1~6アルキル-カルボニル基としては、例えば、メチルカルボニル(アセチル)、エチルカルボニル、プロピルカルボニル、iso-プロピルカルボニル、ブチルカルボニル、iso-ブチルカルボニル、sec-ブチルカルボニル、tert-ブチルカルボニル、ペンチルカルボニル、イソペンチルカルボニル、ネオペンチルカルボニル、1-エチルプロピルカルボニル、ヘキシルカルボニル、イソヘキシルカルボニル、1,1-ジメチルブチルカルボニル、2,2-ジメチルブチルカルボニル、3,3-ジメチルブチルカルボニル、2-エチルブチルカルボニルが挙げられる。C1~6アルキルカルボニル基としては、C1~4アルキルカルボニル基が好ましく、C1~3アルキルカルボニル基がより好ましい。
これらの置換基は、別の置換基でさらに置換されていてもよい。別の置換基としては、例えば、水酸基、カルボキシ基、ニトロ基、アミノ基、シアノ基が挙げられる。
置換基で置換された糖の誘導体としては、例えば、環状多糖(例、αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、またはγシクロデキストリン等のシクロデキストリン)および鎖状高分子多糖(例、セルロース)の誘導体が挙げられる。環状多糖の誘導体としては、例えば、置換されていてもよいアルキル基で置換された環状多糖(例、メチルβシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン)が挙げられる。鎖状高分子多糖の誘導体としては、例えば、セルロース誘導体が挙げられる。
セルロース誘導体とは、セルロースの少なくとも1つの水酸基の水素原子が親水性基で置換されたセルロース誘導体である。セルロース誘導体における親水性基としては、例えば、カルボキシアルキル(例、カルボキシC1~6アルキル)、ヒドロキシアルキル(例、ヒドロキシC1~6アルキル)が挙げられる。セルロース誘導体における親水性基は、カルボキシアルキルまたはヒドロキシアルキルが好ましい。
カルボキシアルキルとしては、例えば、カルボキシメチル、カルボキシエチル(1-カルボキシエチル、2-カルボキシエチル)、カルボキシプロピル(1-カルボキシプロピル、2-カルボキシプロピル、3-カルボキシプロピル)、カルボキシイソプロピル(1-カルボキシ-2-メチルエチル、2-カルボキシ-2-メチルエチル)、カルボキシブチル(1-カルボキシブチル、2-カルボキシブチル、3-カルボキシブチル、4-カルボキシブチル)、カルボキシt-ブチル、カルボキシペンチル(1-カルボキシペンチル、2-カルボキシペンチル、3-カルボキシペンチル、4-カルボキシペンチル、5-カルボキシペンチル)、カルボキシヘキシル(1-カルボキシヘキシル、2-カルボキシヘキシル、3-カルボキシヘキシル、4-カルボキシヘキシル、5-カルボキシヘキシル、6-カルボキシヘキシル)が挙げられる。
ヒドロキシアルキルとしては、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル(1-ヒドロキシエチル、2-ヒドロキシエチル)、ヒドロキシプロピル(1-ヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル)、ヒドロキシイソプロピル(1-ヒドロキシ-2-メチルエチル、2-ヒドロキシ-2-メチルエチル)、ヒドロキシブチル(1-ヒドロキシブチル、2-ヒドロキシブチル、3-ヒドロキシブチル、4-ヒドロキシブチル)、ヒドロキシt-ブチル、ヒドロキシペンチル(1-ヒドロキシペンチル、2-ヒドロキシペンチル、3-ヒドロキシペンチル、4-ヒドロキシペンチル、5-ヒドロキシペンチル)、ヒドロキシヘキシル(1-ヒドロキシヘキシル、2-ヒドロキシヘキシル、3-ヒドロキシヘキシル、4-ヒドロキシヘキシル、5-ヒドロキシヘキシル、6-ヒドロキシヘキシル)が挙げられる。
セルロース誘導体の具体例としては、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられる。
セルロース誘導体には、ナノセルロース誘導体も含まれる。ナノセルロース誘導体とは、後述するナノセルロースの誘導体である。
カルボキシアルキルとしては、例えば、カルボキシメチル、カルボキシエチル(1-カルボキシエチル、2-カルボキシエチル)、カルボキシプロピル(1-カルボキシプロピル、2-カルボキシプロピル、3-カルボキシプロピル)、カルボキシイソプロピル(1-カルボキシ-2-メチルエチル、2-カルボキシ-2-メチルエチル)、カルボキシブチル(1-カルボキシブチル、2-カルボキシブチル、3-カルボキシブチル、4-カルボキシブチル)、カルボキシt-ブチル、カルボキシペンチル(1-カルボキシペンチル、2-カルボキシペンチル、3-カルボキシペンチル、4-カルボキシペンチル、5-カルボキシペンチル)、カルボキシヘキシル(1-カルボキシヘキシル、2-カルボキシヘキシル、3-カルボキシヘキシル、4-カルボキシヘキシル、5-カルボキシヘキシル、6-カルボキシヘキシル)が挙げられる。
ヒドロキシアルキルとしては、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル(1-ヒドロキシエチル、2-ヒドロキシエチル)、ヒドロキシプロピル(1-ヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル)、ヒドロキシイソプロピル(1-ヒドロキシ-2-メチルエチル、2-ヒドロキシ-2-メチルエチル)、ヒドロキシブチル(1-ヒドロキシブチル、2-ヒドロキシブチル、3-ヒドロキシブチル、4-ヒドロキシブチル)、ヒドロキシt-ブチル、ヒドロキシペンチル(1-ヒドロキシペンチル、2-ヒドロキシペンチル、3-ヒドロキシペンチル、4-ヒドロキシペンチル、5-ヒドロキシペンチル)、ヒドロキシヘキシル(1-ヒドロキシヘキシル、2-ヒドロキシヘキシル、3-ヒドロキシヘキシル、4-ヒドロキシヘキシル、5-ヒドロキシヘキシル、6-ヒドロキシヘキシル)が挙げられる。
セルロース誘導体の具体例としては、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられる。
セルロース誘導体には、ナノセルロース誘導体も含まれる。ナノセルロース誘導体とは、後述するナノセルロースの誘導体である。
ナノセルロースとは、ナノメートルオーダーの繊維幅を有する繊維状セルロースである。ナノセルロースの繊維幅は、例えば500nm以下であり、好ましくは200nm以下、より好ましくは100nm以下、さらにより好ましくは50nm以下、なおさらにより好ましくは10nm以下、特により好ましくは5nm以下であってもよい。
セルロース誘導体には、それらの塩も含まれる。塩としては、例えば、金属(例、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、およびセシウム等の一価の金属、ならびにカルシウム、マグネシウム、および亜鉛等の二価の金属)の塩、ならびに無機塩基(例、アンモニア)の塩が挙げられる。
糖アルコールとしては、例えば、上述したような単糖においてカルボニル基が還元された単量体、これらの単量体同士が例えばグリコシド結合により結合した多量体、およびこれらの単量体と単糖を構成単位として例えばグリコシド結合により結合した多量体が挙げられる。上記の単量体としては、例えば、トリトール(例、グリセリン)、テトリトール(例、エリトリトール、トレイトール)、ペンチトール(例、キシリトール、アラビニトール、リビトール)、ヘキシトール(例、ソルビトール、マンニトール、イジトール、ガラクチトール)、ヘプチトール(例、ボレミトール、ペルセイトール)、オクチルトール(例、エリスロガラクトオクチトール)が挙げられる。糖アルコールとしては、例えば、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、フシトール、ボレミトール、アラビニトール、グリセリン、イジトール、エリトリトール、トレイトール、リビトール等の単量体、ラクチトール、マルチトール等の二量体が挙げられる。
本発明では、2種以上(例、2種、3種、4種、5種)の糖の混合物を細胞外小胞含有試料と混合してもよい。本発明では、細胞外小胞含有試料と糖との混合前に、細胞外小胞含有試料に糖を添加することを含んでいてもよい。糖は、キレート剤と同時または別々に添加されてもよい。
細胞外小胞含有試料を糖と混合する場合、混合における糖の濃度は、細胞外小胞を安定化できる限り特に限定されない。このような濃度は、糖の種類等の因子によっても異なるが、例えば、2.5mg/mL以上であってもよく、好ましくは3.0mg/mL以上、より好ましくは3.5mg/mL以上、さらにより好ましくは4.0mg/mL以上、なおさらにより好ましくは4.5mg/mL以上、特に好ましくは5.0mg/mL以上、6.0mg/mL以上、8.0mg/mL以上、または10.0mg/mL以上であってもよい。このような濃度はまた、糖の種類等の因子によっても異なるが、例えば、600mg/mL以下、400mg/mL以下、200mg/mL以下、または100mg/mL以下であってもよく、好ましくは95mg/mL以下、より好ましくは90mg/mL以下、さらにより好ましくは85mg/mL以下、なおさらにより好ましくは80mg/mL以下、特に好ましくは75mg/mL以下、70mg/mL以下、60mg/mL以下、または50mg/mL以下であってもよい。より具体的には、糖の濃度は、糖の種類等の因子によっても異なるが、例えば、2.5~800mg/mL、2.5~600mg/mL、2.5~400mg/mL、2.5~200mg/mL、または2.5~100mg/mLであってもよく、好ましくは3.0~95mg/mL、より好ましくは3.5~90mg/mL、さらにより好ましくは4.0~85mg/mL、なおさらにより好ましくは4.5~80mg/mL、特に好ましくは5.0~75mg/mL、6.0~70mg/mL、8.0~60mg/mL、または10.0~50mg/mLであってもよい。
キレート剤は、金属イオンとの配位結合が可能である配位部分を有する化合物またはその塩である。配位部分の数は、好ましくは2個以上、より好ましくは3個以上(例、3個または6個)である。配位部分としての配位原子としては、例えば、酸素原子、リン原子、窒素原子、硫黄原子、および塩素原子が挙げられる。配位原子は、好ましくは酸素原子またはリン原子であり、より好ましくは酸素原子である。配位部分としての配位基としては、例えば、上記配位原子を有する基が挙げられる。配位基は、好ましくはカルボン酸基またはリン酸基であり、より好ましくはカルボン酸基である。
キレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、グリコールエーテルジアミン四酢酸(EGTA)、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸(HEDTA)、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸(HIDA)、ニトリロ三酢酸(NTA)、シュウ酸、エチレンジアミンテトラ(メチレンホスホン酸)(EDTMP)、およびそれらの塩が挙げられる。塩としては、例えば、金属塩(例、ナトリウム塩、カリウム塩等の一価の金属塩、およびカルシウム塩、マグネシウム塩等の二価の金属塩)、無機塩(例、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物等のハロゲン化物塩、およびアンモニウム塩)、有機塩(例、アルキル基で置換されたアンモニウム塩)、および酸付加塩(例、硫酸、塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸等の無機酸との塩、および酢酸、シュウ酸、乳酸、クエン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸等の塩)が挙げられる。本発明では、2種以上(例、2種、3種、4種、5種)のキレート剤の混合物を細胞外小胞含有試料と混合してもよい。本発明では、細胞外小胞含有試料とキレート剤との混合前に、細胞外小胞含有試料にキレート剤を添加することを含んでいてもよい。
細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合する場合、混合におけるキレート剤の濃度は、細胞外小胞を安定化できる限り特に限定されない。このような濃度は、キレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば1mM以上、好ましくは5mM以上、より好ましくは10mM以上、さらにより好ましくは15mM以上、なおさらにより好ましくは20mM以上、特に好ましくは30mM以上、40mM以上、または50mM以上であってもよい。このような濃度はまた、キレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば200mM以下、好ましくは180mM以下、より好ましくは170mM以下、さらにより好ましくは160mM以下、なおさらにより好ましくは150mM以下、特に好ましくは140mM以下、120mM以下、または100mM以下であってもよい。より具体的には、キレート剤の濃度は、例えば1mM~200mM、好ましくは5~180mM、より好ましくは10~170mM、さらにより好ましくは15~160mM、なおさらにより好ましくは20~150mM、特に好ましくは30~140mM、40~120mM、または50~100mMであってもよい。
細胞外小胞含有試料は、糖およびキレート剤の双方と混合されてもよい。
本発明において糖およびキレート剤の双方が用いられる場合、混合において使用される糖およびキレート剤の濃度は、それらの比率によって規定することもできる。例えば、混合における、糖10mg/mLあたりのキレート剤の濃度は、糖およびキレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば1mM以上、好ましくは5mM以上、好ましくは10mM以上、さらにより好ましくは15mM以上、なおさらにより好ましくは20mM以上、特に好ましくは30mM以上、40mM以上、または50mM以上であってもよい。このような濃度はまた、糖およびキレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば200mM以下、好ましくは180mM以下、より好ましくは170mM以下、さらにより好ましくは160mM以下、なおさらにより好ましくは150mM以下、特に好ましくは140mM以下、120mM以下、または100mM以下であってもよい。より具体的には、キレート剤の濃度は、例えば1mM~200mM、好ましくは5~180mM、より好ましくは10~170mM、さらにより好ましくは15~160mM、なおさらにより好ましくは20~150mM、特に好ましくは30~140mM、40~120mM、または50~100mMであってもよい。
混合は、任意の様式で行うことができる。例えば、本発明において糖およびキレート剤の双方が用いられる場合、混合は、同時または別々に行うことができる。より具体的には、細胞外小胞含有試料は、(1)糖およびキレート剤と同時に混合されてもよく、(2)糖と混合された後、キレート剤と混合されてもよく、または(3)キレート剤と混合された後、糖と混合されてもよい。操作の簡便等の観点から、細胞外小胞含有試料は、好ましくは、糖およびキレート剤と同時に混合されてもよい。
混合温度は、例えば4~37℃であり、好ましくは15~30℃であってもよい。混合時間は、細胞外小胞を安定化できる限り特に限定されず、適宜設定することができる。細胞外小胞含有試料は、糖などの所定の成分との混合後に放置されてもよい。
細胞外小胞が糖などの所定の成分との混合により安定化されているか否かは、例えば、細胞外小胞と糖などの所定の成分との混合後に測定される指標値を、糖などの所定の成分の不在下における細胞外小胞について測定されるコントロール値(糖などの所定の成分の存在または非存在以外の条件は同じ)と比較し、指標値がコントロール値よりも優れているか否かを評価することにより行うことができる。例えば、凍結乾燥物の安定化を評価する場合、凍結乾燥機(東京理化器械株式会社製)を用いて、-28℃で2時間、-10℃で4時間、その後20℃のプログラムで凍結乾燥させ、糖などの所定の成分の有無における凍結乾燥物の指標値を比較してもよい。このような指標値としては、例えば、細胞外小胞マーカー量、または細胞外小胞に相当する粒子数の測定値を利用することができる。
細胞外小胞マーカー量の測定は、当該分野において公知である任意の方法により行うことができる。
細胞外小胞マーカーがタンパク質である場合、測定方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。イムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、およびサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光イムノアッセイ(CLIA)〔例、化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)〕、免疫比濁法(TIA)、酵素免疫測定法(EIA)(例、直接競合ELISA、間接競合ELISA、およびサンドイッチELISA)、放射イムノアッセイ(RIA)、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ(FIA)、およびイムノクロマトグラフィー法、ウェスタンブロッティング、免疫染色、蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting、FACS)が挙げられる。複数成分が検出される場合、プロテオーム分析が行われてもよい。
細胞外小胞マーカーが核酸である場合、測定方法としては、例えば、プローブを用いるハイブリダイゼーション法、プライマー(例、2、3、または4個のプライマー)を用いる遺伝子増幅法、質量分析法が挙げられる。
細胞外小胞マーカーがタンパク質および核酸以外の成分である場合、測定方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。複数成分が測定される場合、メタボローム分析が行われてもよい。
細胞外小胞マーカーがタンパク質である場合、測定方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。イムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、およびサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光イムノアッセイ(CLIA)〔例、化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)〕、免疫比濁法(TIA)、酵素免疫測定法(EIA)(例、直接競合ELISA、間接競合ELISA、およびサンドイッチELISA)、放射イムノアッセイ(RIA)、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ(FIA)、およびイムノクロマトグラフィー法、ウェスタンブロッティング、免疫染色、蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting、FACS)が挙げられる。複数成分が検出される場合、プロテオーム分析が行われてもよい。
細胞外小胞マーカーが核酸である場合、測定方法としては、例えば、プローブを用いるハイブリダイゼーション法、プライマー(例、2、3、または4個のプライマー)を用いる遺伝子増幅法、質量分析法が挙げられる。
細胞外小胞マーカーがタンパク質および核酸以外の成分である場合、測定方法としては、例えば、イムノアッセイ、質量分析法が挙げられる。複数成分が測定される場合、メタボローム分析が行われてもよい。
細胞外小胞に相当する粒子数の測定は、例えば、粒子分析機器、電子顕微鏡、フローサイトメーター等の機器により行うことができる。好ましくは、このような粒子数の測定は、NanoSight LM10(Malvern Instruments社製)により行うことができる。NanoSight LM10を用いる場合、測定条件として、測定時間30秒、繰り返し回数3回、detection threshold 15を採用することができる。
本発明の方法は、混合物を凍結することをさらに含んでいてもよい。
すなわち、本発明はさらに、以下を含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する:
(1)細胞外小胞含有試料を糖と混合すること;および
(2)細胞外小胞含有試料と糖との混合物を凍結させること。
(1)細胞外小胞含有試料を糖と混合すること;および
(2)細胞外小胞含有試料と糖との混合物を凍結させること。
本発明はさらに、以下を含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する:
(1)細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合すること;および
(2)細胞外小胞含有試料とキレート剤との混合物を凍結させること。
(1)細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合すること;および
(2)細胞外小胞含有試料とキレート剤との混合物を凍結させること。
本発明はさらに、以下を含む、細胞外小胞の安定化方法を提供する:
(1)細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合すること;および
(2)細胞外小胞含有試料と糖およびキレート剤との混合物を凍結させること。
(1)細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合すること;および
(2)細胞外小胞含有試料と糖およびキレート剤との混合物を凍結させること。
凍結は、凍結乾燥または溶液の凍結(非乾燥凍結)のいずれであってもよいが、より長期にわたり細胞外小胞を保存する場合、凍結乾燥が好ましい。
糖およびキレート剤の種類および混合における濃度の例は、上述したとおりである。
2.細胞外小胞安定化試薬
本発明はまた、細胞外小胞安定化試薬を提供する。本発明の試薬は、糖またはキレート剤を含む。好ましくは、本発明の試薬は、糖およびキレート剤を含んでいてもよい。糖およびキレート剤は、上述したものと同様である。本発明の試薬は、糖およびキレート剤に加えて、他の成分(例、細胞外小胞の安定化に有用な他の成分)を含んでいてもよい。
本発明はまた、細胞外小胞安定化試薬を提供する。本発明の試薬は、糖またはキレート剤を含む。好ましくは、本発明の試薬は、糖およびキレート剤を含んでいてもよい。糖およびキレート剤は、上述したものと同様である。本発明の試薬は、糖およびキレート剤に加えて、他の成分(例、細胞外小胞の安定化に有用な他の成分)を含んでいてもよい。
一実施形態では、本発明の試薬は、糖を含む細胞外小胞安定化組成物である。別の実施形態では、本発明の試薬は、キレート剤を含む細胞外小胞安定化組成物である。さらに別の実施形態では、本発明の組成物は、糖およびキレート剤の双方を含む細胞外小胞安定化組成物である。
細胞外小胞を安定化するために、本発明の試薬は、細胞外小胞含有試料と混合させて用いることができる。細胞外小胞を安定的に保存するために、細胞外小胞含有試料と本発明の試薬との混合物は、凍結されてもよい。この場合、本発明の試薬は、細胞外小胞の凍結保存安定化試薬として用いることができる。凍結は、凍結乾燥または溶液の凍結(非乾燥凍結)のいずれであってもよいが、より長期にわたり細胞外小胞を保存する場合、凍結乾燥が好ましい。
組成物中の糖の濃度は、細胞外小胞含有試料と混合された後、細胞外小胞を安定化できる限り特に限定されない。このような濃度は、糖の種類等の因子によっても異なるが、例えば、2.7mg/mL以上であってもよく、好ましくは3.0mg/mL以上、より好ましくは3.5mg/mL以上、さらにより好ましくは4.0mg/mL以上、なおさらにより好ましくは4.5mg/mL以上、特に好ましくは5.0mg/mL以上、6.0mg/mL以上、8.0mg/mL以上、または10.0mg/mL以上であってもよい。このような濃度はまた、糖の種類等の因子によっても異なるが、例えば、600mg/mL以下、400mg/mL以下、200mg/mL以下、100mg/mL以下であってもよく、好ましくは95mg/mL以下、より好ましくは90mg/mL以下、さらにより好ましくは85mg/mL以下、なおさらにより好ましくは80mg/mL以下、特に好ましくは75mg/mL以下、70mg/mL以下、60mg/mL以下、または50mg/mL以下であってもよい。より具体的には、糖の濃度は、糖の種類等の因子によっても異なるが、例えば、2.7~800mg/mL、2.7~600mg/mL、2.7~400mg/mL、2.7~200mg/mL、または2.7~100mg/mLであってもよく、好ましくは3.0~95mg/mL、より好ましくは3.5~90mg/mL、さらにより好ましくは4.0~85mg/mL、なおさらにより好ましくは4.5~80mg/mL、特に好ましくは5.0~75mg/mL、6.0~70mg/mL、8.0~60mg/mL、または10.0~50mg/mLであってもよい。
組成物中のキレート剤の濃度は、細胞外小胞含有試料と混合された後、細胞外小胞を安定化できる限り特に限定されない。このような濃度は、キレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば1.1mM以上、好ましくは5mM以上、好ましくは10mM以上、好ましくは15mM以上、より好ましくは20mM以上、さらにより好ましくは30mM以上、なおさらにより好ましくは40mM以上、特に好ましくは50mM以上であってもよい。このような濃度はまた、キレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば200mM以下、好ましくは180mM以下、より好ましくは170mM以下、さらにより好ましくは160mM以下、なおさらにより好ましくは150mM以下、特に好ましくは140mM以下、120mM以下、または100mM以下であってもよい。より具体的には、キレート剤の濃度は、例えば1.1mM~200mM、好ましくは5~180mM、より好ましくは10~170mM、さらにより好ましくは15~160mM、なおさらにより好ましくは20~150mM、特に好ましくは30~140mM、40~120mM、または50~100mMであってもよい。
本発明の組成物が糖およびキレート剤の双方を含む場合、糖およびキレート剤の濃度はまた、それらの比率によって規定することもできる。例えば、糖10mg/mLあたりのキレート剤の濃度は、糖およびキレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば1mM以上、好ましくは5mM以上、好ましくは10mM以上、好ましくは15mM以上、より好ましくは20mM以上、さらにより好ましくは30mM以上、なおさらにより好ましくは40mM以上、特に好ましくは50mM以上であってもよい。このような濃度はまた、糖およびキレート剤の種類等の因子によっても異なるが、例えば200mM以下、好ましくは180mM以下、より好ましくは170mM以下、さらにより好ましくは160mM以下、なおさらにより好ましくは150mM以下、特に好ましくは140mM以下、120mM以下、または100mM以下であってもよい。より具体的には、キレート剤の濃度は、例えば1mM~200mM、好ましくは5~180mM、より好ましくは10~170mM、さらにより好ましくは15~160mM、なおさらにより好ましくは20~150mM、特に好ましくは30~140mM、40~120mM、または50~100mMであってもよい。
本発明の組成物は、使用に際して水溶液に溶解される、糖および/またはキレート剤を含む非水性組成物(例、混合粉末)であっても、糖および/またはキレート剤を含む水溶液であってもよいが、迅速かつ簡便な使用等の観点からは、糖および/またはキレート剤を含む水溶液が好ましい。水溶液としては、例えば、水(例、蒸留水、滅菌水、滅菌蒸留水、および純水)、ならびに緩衝液が挙げられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、酒石酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グリシン緩衝液、炭酸緩衝液、2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)緩衝液、ホウ酸緩衝液、3-モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)緩衝液、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン(Bicine)緩衝液、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン(Bis-Tris)緩衝液、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)1-ピペラジニルエタンスルホン酸(HEPES)緩衝液が挙げられる。緩衝液のpHは中性が好ましい。より具体的には、このようなpHは、好ましくは5.0以上、より好ましくは5.5以上、さらにより好ましくは6.0以上であってもよい。pHはまた、好ましくは9.0以下、より好ましくは8.5以下、さらにより好ましくは8.0以下であってもよい。pHの測定は、当該分野における公知の方法を用いて行うことができる。好ましくは、pHは、ガラス電極を有するpH計を用いて25℃で測定された値を採用することができる。
本発明の組成物は、細胞外小胞含有試料と適宜混合して使用することができる。本発明の組成物と細胞外小胞含有試料との混合比率(細胞外小胞含有試料/組成物)は、例えば1/30~30、好ましくは1/20~20、より好ましくは1/10~10、さらにより好ましくは1/10~1である。
本発明の組成物が水溶液である場合、水溶液の容量は、例えば、1μL~100mLである。好ましくは、水溶液の容量は、10μL以上、100μL以上、または1000μL以上であってもよい。水溶液の容量はまた、50mL以下、10mL以下、または2mL以下であってもよい。
別の実施形態では、本発明の試薬は、糖および/またはキレート剤を含むキットである。糖および/またはキレート剤は、固体または水溶液の形態において提供することができるが、好ましくは水溶液の形態で提供される。したがって、本発明のキットは、糖を含む水溶液の形態において提供されてもよく、キレート剤を含む水溶液の形態において提供されてもよく、糖およびキレート剤を含む水溶液の形態において提供されてもよく、糖を含む第1水溶液、およびキレート剤を含む第2水溶液の形態において提供されてもよい。水溶液は、上述したとおりであるが、緩衝液が好ましい。緩衝液の例およびpHは、上述したとおりである。第1水溶液中の糖の濃度、第2水溶液中のキレート剤の濃度、ならびに第1および第2水溶液における糖およびキレート剤の濃度比率の関係は、本発明の組成物について上述したものと同様である。また、第1および第2水溶液と細胞外小胞含有試料との混合比率、ならびに第1および第2水溶液の各容量は、本発明の組成物について上述したものと同様である。
3.細胞外小胞を含む混合物
本発明はまた、糖および/またはキレート剤と、細胞外小胞とを含む混合物を提供する。本発明の混合物は、さらに水溶液(例、上述したような緩衝液)を含んでいてもよい。混合物の形態は特に限定されないが、水溶液またはその凍結物(例、凍結乾燥物)が好ましい。本発明の混合物は、細胞外小胞含有試料を、上述したような本発明の方法または試薬で処理することにより得ることができる。本発明の混合物は、例えば、細胞外小胞の保存に有用である。
本発明はまた、糖および/またはキレート剤と、細胞外小胞とを含む混合物を提供する。本発明の混合物は、さらに水溶液(例、上述したような緩衝液)を含んでいてもよい。混合物の形態は特に限定されないが、水溶液またはその凍結物(例、凍結乾燥物)が好ましい。本発明の混合物は、細胞外小胞含有試料を、上述したような本発明の方法または試薬で処理することにより得ることができる。本発明の混合物は、例えば、細胞外小胞の保存に有用である。
混合物中の糖またはキレート剤の濃度、ならびに糖およびキレート剤の濃度比率は、本発明の方法について上述したものと同様である。混合物中の細胞外小胞の濃度(粒子数/mL)は、例えば1×102~1×1015、好ましくは1×103~1×1014、より好ましくは1×104~1×1013、さらにより好ましくは1×105~1×1012、特に好ましくは1×106~1×1011である。
本発明の混合物が水溶液である場合、水溶液の容量は、例えば、1μL~100mLである。好ましくは、水溶液の容量は、10μL以上、100μL以上、または1000μL以上であってもよい。水溶液の容量はまた、50mL以下、10mL以下、または2mL以下であってもよい。
以下、実施例を参照して本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例1:キレート剤によるエクソソームの安定化
エクソソームの凍結乾燥に対するキレート剤の効果を検討した。
エクソソームの凍結乾燥に対するキレート剤の効果を検討した。
1)エクソソームの回収
3日間無血清培地で培養したヒト非小細胞肺癌細胞H1299の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、2,000×g、4℃で5分間遠心し、0.22μmフィルター(ミリポア社製)で濾過した後、Amicon Ultra-15(ミリポア社製)を用いて濃縮した。濃縮物を20,000×g、4℃で15分間遠心した。次に、上清を、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、PBS(2.9mM NaH2PO4、9.0mM Na2HPO4、137mM NaCl)または50mM EDTA/50mM EGTA/PBSを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、新たにPBSまたは50mM EDTA/50mM EGTA/PBS(回収緩衝液)を加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
3日間無血清培地で培養したヒト非小細胞肺癌細胞H1299の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、2,000×g、4℃で5分間遠心し、0.22μmフィルター(ミリポア社製)で濾過した後、Amicon Ultra-15(ミリポア社製)を用いて濃縮した。濃縮物を20,000×g、4℃で15分間遠心した。次に、上清を、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、PBS(2.9mM NaH2PO4、9.0mM Na2HPO4、137mM NaCl)または50mM EDTA/50mM EGTA/PBSを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、新たにPBSまたは50mM EDTA/50mM EGTA/PBS(回収緩衝液)を加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
2)エクソソームの凍結乾燥
回収したエクソソームをQubit(商標) Protein Assay Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々に回収緩衝液をさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム1容量に対し、凍結乾燥緩衝液24容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、凍結乾燥機(東京理化器械株式会社製)を用いて、-28℃で2時間、-10℃で4時間、その後20℃のプログラムで凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。凍結乾燥緩衝液としては、PBSまたはEDTA/EGTA/PBS(final conc.50mM EDTA/ 50mM EGTA)を用いた。用いたPBSのpHは7.4であった(実施例1~3において同様)。
その後、凍結乾燥物をミリQ水(ミリポア社製)または50mM EDTA/50mM EGTA/H2O(溶解緩衝液)に溶解させた。
回収したエクソソームをQubit(商標) Protein Assay Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々に回収緩衝液をさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム1容量に対し、凍結乾燥緩衝液24容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、凍結乾燥機(東京理化器械株式会社製)を用いて、-28℃で2時間、-10℃で4時間、その後20℃のプログラムで凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。凍結乾燥緩衝液としては、PBSまたはEDTA/EGTA/PBS(final conc.50mM EDTA/ 50mM EGTA)を用いた。用いたPBSのpHは7.4であった(実施例1~3において同様)。
その後、凍結乾燥物をミリQ水(ミリポア社製)または50mM EDTA/50mM EGTA/H2O(溶解緩衝液)に溶解させた。
3)エクソソーム特異的抗原(CD9)量の測定に基づくエクソソームの安定性評価
これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、ELISA系で評価した。具体的には、96ウェルELISAプレート(NUNC社製)に、自社製抗CD9抗体を含むPBS(pH7.4)を添加し、4℃で一晩インキュベートした。その後、各ウェルを0.05重量%Tween(登録商標)20を含むPBS(PBS-T)で3回洗浄し、0.5重量%Caseinを含むPBS200μLを添加して、室温で2時間インキュベートした。PBS-Tで洗浄後、PBSで希釈した凍結乾燥物の溶解物100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBS-Tで洗浄後、ビオチン化した同自社製抗CD9抗体と、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ(SA-ALP、GeneTex社製)とを含むPBS100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBSで洗浄し、ルミパルス(登録商標)基質液(富士レビオ社製)100μLを添加し、37℃で10分反応させた後、波長477nmの発光カウントを測定した。凍結乾燥していないサンプルのカウントを100%とした。
その結果、キレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した(図1)。
したがって、エクソソームの凍結乾燥においてキレート剤がエクソソームを安定化できることが示された。
これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、ELISA系で評価した。具体的には、96ウェルELISAプレート(NUNC社製)に、自社製抗CD9抗体を含むPBS(pH7.4)を添加し、4℃で一晩インキュベートした。その後、各ウェルを0.05重量%Tween(登録商標)20を含むPBS(PBS-T)で3回洗浄し、0.5重量%Caseinを含むPBS200μLを添加して、室温で2時間インキュベートした。PBS-Tで洗浄後、PBSで希釈した凍結乾燥物の溶解物100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBS-Tで洗浄後、ビオチン化した同自社製抗CD9抗体と、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ(SA-ALP、GeneTex社製)とを含むPBS100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBSで洗浄し、ルミパルス(登録商標)基質液(富士レビオ社製)100μLを添加し、37℃で10分反応させた後、波長477nmの発光カウントを測定した。凍結乾燥していないサンプルのカウントを100%とした。
その結果、キレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した(図1)。
したがって、エクソソームの凍結乾燥においてキレート剤がエクソソームを安定化できることが示された。
実施例2:ショ糖によるエクソソームの安定化
エクソソームの凍結乾燥に対する糖の効果を検討した。
エクソソームの凍結乾燥に対する糖の効果を検討した。
1)エクソソームの回収
3日間無血清培地で培養したヒト結腸癌細胞SW480の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、2,000×g、4℃で5分間遠心し、0.22μmフィルター(ミリポア社製)で濾過した後、Amicon Ultra-15(ミリポア社製)を用いて濃縮した。濃縮物を20,000×g、4℃で15分間遠心した。次に、上清を、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、PBSを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、新たにPBSを加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
3日間無血清培地で培養したヒト結腸癌細胞SW480の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、2,000×g、4℃で5分間遠心し、0.22μmフィルター(ミリポア社製)で濾過した後、Amicon Ultra-15(ミリポア社製)を用いて濃縮した。濃縮物を20,000×g、4℃で15分間遠心した。次に、上清を、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、PBSを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、新たにPBSを加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
2)エクソソームの凍結乾燥
回収したエクソソームをQubit(商標) Protein Assay Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々にPBSをさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム1容量に対し、凍結乾燥緩衝液24容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、上述した凍結乾燥機を用いて、-28℃で2時間、-10℃で4時間、その後20℃のプログラムで凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。なお、凍結乾燥緩衝液として、PBS、EDTA/EGTA/PBS(final conc.50mM EDTA/50mM EGTA)、ショ糖/PBS(final conc.10mg/mLショ糖)、またはEDTA/EGTA/ショ糖/PBS(final conc.50mM EDTA/50mM EGTA/10mg/mLショ糖)を用いた。
その後、凍結乾燥物をミリQ水(ミリポア社製)に溶解させた。
回収したエクソソームをQubit(商標) Protein Assay Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々にPBSをさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム1容量に対し、凍結乾燥緩衝液24容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、上述した凍結乾燥機を用いて、-28℃で2時間、-10℃で4時間、その後20℃のプログラムで凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。なお、凍結乾燥緩衝液として、PBS、EDTA/EGTA/PBS(final conc.50mM EDTA/50mM EGTA)、ショ糖/PBS(final conc.10mg/mLショ糖)、またはEDTA/EGTA/ショ糖/PBS(final conc.50mM EDTA/50mM EGTA/10mg/mLショ糖)を用いた。
その後、凍結乾燥物をミリQ水(ミリポア社製)に溶解させた。
3)エクソソーム特異的抗原(CD9)量の測定に基づくエクソソームの安定性評価
これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、ELISA系で評価した。具体的には、96ウェルELISAプレート(NUNC社製)に、自社製抗CD9抗体を含むPBS(pH7.4)を添加し、4℃で一晩インキュベートした。その後、各ウェルをPBS-Tで3回洗浄し、0.5重量%Caseinを含むPBS200μLを添加して、室温で2時間インキュベートした。PBS-Tで洗浄後、PBSで希釈した凍結乾燥物の溶解物100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBS-Tで洗浄後、ビオチン化した同自社製抗CD9抗体と、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ(SA-ALP、GeneTex社製)とを含むPBS100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBSで洗浄し、ルミパルス基質液100μLを添加し、37℃で5分反応させた後、波長477nmの発光カウントを測定した。凍結乾燥していないサンプルのカウントを100%とした。
その結果、ショ糖を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した(図2)。また、ショ糖およびキレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量がより増大した。
したがって、エクソソームの凍結乾燥において、糖がエクソソームを安定化できることが示された。また、糖によるエクソソームの安定化は、キレート剤の存在下で向上されることが示された。
これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、ELISA系で評価した。具体的には、96ウェルELISAプレート(NUNC社製)に、自社製抗CD9抗体を含むPBS(pH7.4)を添加し、4℃で一晩インキュベートした。その後、各ウェルをPBS-Tで3回洗浄し、0.5重量%Caseinを含むPBS200μLを添加して、室温で2時間インキュベートした。PBS-Tで洗浄後、PBSで希釈した凍結乾燥物の溶解物100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBS-Tで洗浄後、ビオチン化した同自社製抗CD9抗体と、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ(SA-ALP、GeneTex社製)とを含むPBS100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBSで洗浄し、ルミパルス基質液100μLを添加し、37℃で5分反応させた後、波長477nmの発光カウントを測定した。凍結乾燥していないサンプルのカウントを100%とした。
その結果、ショ糖を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した(図2)。また、ショ糖およびキレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量がより増大した。
したがって、エクソソームの凍結乾燥において、糖がエクソソームを安定化できることが示された。また、糖によるエクソソームの安定化は、キレート剤の存在下で向上されることが示された。
実施例3:粒子量測定に基づく凍結乾燥エクソソームの安定性評価
凍結乾燥を行ったサンプルをNanoSightで測定して、凍結乾燥エクソソームの粒子量に基づき安定性を評価した。
凍結乾燥を行ったサンプルをNanoSightで測定して、凍結乾燥エクソソームの粒子量に基づき安定性を評価した。
1)エクソソームの回収
3日間無血清培地で培養したヒト結腸癌細胞SW1116の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、2,000×g、4℃で5分間遠心し、0.22μmフィルター(ミリポア社製)で濾過した後、Amicon Ultra-15(ミリポア社製)を用いて濃縮した。濃縮物を20,000×g、4℃で15分間遠心した。次に、上清を、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、PBS(Control)または50mM EDTA/50mM EGTA/PBS(ED/EG)を加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、新たにPBSまたは50mM EDTA/50mM EGTA/PBS(ED/EG)を加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
3日間無血清培地で培養したヒト結腸癌細胞SW1116の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、2,000×g、4℃で5分間遠心し、0.22μmフィルター(ミリポア社製)で濾過した後、Amicon Ultra-15(ミリポア社製)を用いて濃縮した。濃縮物を20,000×g、4℃で15分間遠心した。次に、上清を、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、PBS(Control)または50mM EDTA/50mM EGTA/PBS(ED/EG)を加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、新たにPBSまたは50mM EDTA/50mM EGTA/PBS(ED/EG)を加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
2)エクソソームの凍結乾燥
回収したエクソソームをQubit(商標) Protein Assay Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々に回収緩衝液をさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム1容量に対し、凍結乾燥緩衝液24容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、上述した凍結乾燥機を用いて、-28℃で2時間、-10℃で4時間、その後20℃のプログラムで凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。なお、凍結乾燥緩衝液として、PBS、EDTA/EGTA/PBS(final conc.50mM EDTA/50mM EGTA)(ED/EG)を用いた。
その後、凍結乾燥物をミリQ水(ミリポア社製)に溶解させた。
回収したエクソソームをQubit(商標) Protein Assay Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々に回収緩衝液をさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム1容量に対し、凍結乾燥緩衝液24容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、上述した凍結乾燥機を用いて、-28℃で2時間、-10℃で4時間、その後20℃のプログラムで凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。なお、凍結乾燥緩衝液として、PBS、EDTA/EGTA/PBS(final conc.50mM EDTA/50mM EGTA)(ED/EG)を用いた。
その後、凍結乾燥物をミリQ水(ミリポア社製)に溶解させた。
3)凍結乾燥エクソソームの安定性評価
溶解した凍結乾燥エクソソームの粒子数および分布の測定をNanoSight LM10(Malvern Instruments社製)により行った。測定は測定時間30秒、繰り返し回数3回で行い、detection thresholdを15で解析した。
その結果、キレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソームに対応すると考えられる100~200nmの粒子量が、増加していた(表1および図3A~3D)。
したがって、粒子量の測定によっても、エクソソームの凍結乾燥においてキレート剤がエクソソームを安定化できることが示された。
溶解した凍結乾燥エクソソームの粒子数および分布の測定をNanoSight LM10(Malvern Instruments社製)により行った。測定は測定時間30秒、繰り返し回数3回で行い、detection thresholdを15で解析した。
その結果、キレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソームに対応すると考えられる100~200nmの粒子量が、増加していた(表1および図3A~3D)。
したがって、粒子量の測定によっても、エクソソームの凍結乾燥においてキレート剤がエクソソームを安定化できることが示された。
参考例1:各種キレート剤でのエクソソームの処理
キレート剤として、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA・2Na)、グリコールエーテルジアミン四酢酸(EGTA)、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸(HEDTA)、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸(HIDA)、ニトリロ三酢酸(NTA)、シュウ酸二水和物、エチレンジアミンテトラ(メチレンホスホン酸)(EDTMP)(EDTA・2Na、EGTAは同仁化学研究所社製、HEDTA、HIDA、NTA、EDTMPは東京化成工業社製、シュウ酸二水和物は和光純薬工業社製)を使用した。各キレート剤のエクソソームの沈降量への影響を検討した。
300μLの血清検体または血漿検体を、600μLのPBSまたは各キレート剤添加PBSと混合した。各キレート剤の濃度はそれぞれ終濃度で1、10および50mMとなるように使用した(ただし、EDTMPのみは1、10および30mM)。次いで、溶液を室温で30分放置した後、20,000×g、4℃で15分間遠心した。その上清を新しいチューブに移し、そこに、CD9を認識する自社モノクローナル抗体を2μg固定した磁性ビーズ(Protein G Dynabeads)を添加した。4℃で一晩反応させた後に、磁性ビーズをPBSで3回洗浄し、サンプルをサンプルバッファー(SDS含有)で磁性ビーズから溶出し、ウェスタンブロッティング用サンプルとした。これらのサンプルをビオチン化抗CD9抗体によるウェスタンブロッティングで分析した。
その結果、血清(図4A)および血漿(図4B)の両方において、使用したキレート剤はいずれも、免疫沈降法によるエクソソームの回収を示し、また、濃度が高くなるにつれてエクソソームの免疫沈降量が増加した。特に、30mMのEDTMP、50mMのEDTA、EGTA、HEDTA、NTA、シュウ酸で、エクソソームの免疫沈降量が大幅に増加した(図4A、4B)。
キレート剤として、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA・2Na)、グリコールエーテルジアミン四酢酸(EGTA)、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸(HEDTA)、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸(HIDA)、ニトリロ三酢酸(NTA)、シュウ酸二水和物、エチレンジアミンテトラ(メチレンホスホン酸)(EDTMP)(EDTA・2Na、EGTAは同仁化学研究所社製、HEDTA、HIDA、NTA、EDTMPは東京化成工業社製、シュウ酸二水和物は和光純薬工業社製)を使用した。各キレート剤のエクソソームの沈降量への影響を検討した。
300μLの血清検体または血漿検体を、600μLのPBSまたは各キレート剤添加PBSと混合した。各キレート剤の濃度はそれぞれ終濃度で1、10および50mMとなるように使用した(ただし、EDTMPのみは1、10および30mM)。次いで、溶液を室温で30分放置した後、20,000×g、4℃で15分間遠心した。その上清を新しいチューブに移し、そこに、CD9を認識する自社モノクローナル抗体を2μg固定した磁性ビーズ(Protein G Dynabeads)を添加した。4℃で一晩反応させた後に、磁性ビーズをPBSで3回洗浄し、サンプルをサンプルバッファー(SDS含有)で磁性ビーズから溶出し、ウェスタンブロッティング用サンプルとした。これらのサンプルをビオチン化抗CD9抗体によるウェスタンブロッティングで分析した。
その結果、血清(図4A)および血漿(図4B)の両方において、使用したキレート剤はいずれも、免疫沈降法によるエクソソームの回収を示し、また、濃度が高くなるにつれてエクソソームの免疫沈降量が増加した。特に、30mMのEDTMP、50mMのEDTA、EGTA、HEDTA、NTA、シュウ酸で、エクソソームの免疫沈降量が大幅に増加した(図4A、4B)。
実施例4:各種糖によるエクソソームの安定化
エクソソームの凍結乾燥に対する各種糖の効果を検討した。
エクソソームの凍結乾燥に対する各種糖の効果を検討した。
1)エクソソームの回収
3日間無血清培地で培養したヒト非小細胞肺癌細胞H1299の培養上清をサンプルとして用い、実施例2の回収方法にて、エクソソームを回収した。
3日間無血清培地で培養したヒト非小細胞肺癌細胞H1299の培養上清をサンプルとして用い、実施例2の回収方法にて、エクソソームを回収した。
2)エクソソームの凍結乾燥
回収したエクソソームをQubit(商標) Protein Assay Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々にPBSをさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム1容量に対し、凍結乾燥緩衝液9容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、凍結乾燥機(Genevac社製)を用いて、凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。なお、凍結乾燥緩衝液として、PBS、およびPBSにラクトース、フルクトース、メチルβシクロデキストリン(MβCD)、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン(HpβCD)、γシクロデキストリン(γCD)、グルコース、ラクチトール、ソルビトール、キシリトール、ショ糖、トレハロース、マンニトール、キシロースをfinal conc.2.0mg/mL、10mg/mL、50mg/mLとなるように用いた。
その後、凍結乾燥物をミリQ水(ミリポア社製)に溶解させた。
回収したエクソソームをQubit(商標) Protein Assay Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にてタンパク質定量を行い、回収したエクソソーム其々にPBSをさらに添加して、同濃度のタンパク質が含まれるように調製した。次に、回収したエクソソーム1容量に対し、凍結乾燥緩衝液9容量となるように、回収したエクソソームを凍結乾燥緩衝液と混合し、分注した後、凍結乾燥機(Genevac社製)を用いて、凍結乾燥させ、凍結乾燥エクソソームを含む凍結乾燥物を得た。なお、凍結乾燥緩衝液として、PBS、およびPBSにラクトース、フルクトース、メチルβシクロデキストリン(MβCD)、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン(HpβCD)、γシクロデキストリン(γCD)、グルコース、ラクチトール、ソルビトール、キシリトール、ショ糖、トレハロース、マンニトール、キシロースをfinal conc.2.0mg/mL、10mg/mL、50mg/mLとなるように用いた。
その後、凍結乾燥物をミリQ水(ミリポア社製)に溶解させた。
3)エクソソーム特異的抗原(CD9)量の測定に基づくエクソソームの安定性評価
これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、ELISA系で評価した。具体的には、96ウェルELISAプレート(NUNC社製)に、自社製抗CD9抗体を含むPBS(pH7.4)を添加し、4℃で一晩インキュベートした。その後、各ウェルをPBS-Tで3回洗浄し、0.5重量%BSAを含むPBS200μLを添加して、室温で2時間インキュベートした。PBS-Tで洗浄後、凍結乾燥物の溶解物100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBS-Tで洗浄後、ビオチン化した同自社製抗CD9抗体を含むPBS100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBS-Tで洗浄後、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ(SA-ALP、GeneTex社製)を含むPBS100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBS-Tで洗浄し、ルミパルス基質液100μLを添加し、37℃で5分反応させた後、波長480nmの発光カウントを測定した。凍結乾燥していないサンプルのカウントを100%とした。
その結果、これら糖類を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した(図5Aおよび図5B)。特に、糖を10mg/mLまたは50mg/mLで含む凍結乾燥緩衝液では、検討した大部分の糖でエクソソーム量が増大した。
したがって、エクソソームの凍結乾燥において、各種糖がエクソソームを安定化できること、および、特に糖の濃度が10~50mg/mLである場合に高い安定化効果が奏されることが示された。
これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、ELISA系で評価した。具体的には、96ウェルELISAプレート(NUNC社製)に、自社製抗CD9抗体を含むPBS(pH7.4)を添加し、4℃で一晩インキュベートした。その後、各ウェルをPBS-Tで3回洗浄し、0.5重量%BSAを含むPBS200μLを添加して、室温で2時間インキュベートした。PBS-Tで洗浄後、凍結乾燥物の溶解物100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBS-Tで洗浄後、ビオチン化した同自社製抗CD9抗体を含むPBS100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBS-Tで洗浄後、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ(SA-ALP、GeneTex社製)を含むPBS100μLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、PBS-Tで洗浄し、ルミパルス基質液100μLを添加し、37℃で5分反応させた後、波長480nmの発光カウントを測定した。凍結乾燥していないサンプルのカウントを100%とした。
その結果、これら糖類を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した(図5Aおよび図5B)。特に、糖を10mg/mLまたは50mg/mLで含む凍結乾燥緩衝液では、検討した大部分の糖でエクソソーム量が増大した。
したがって、エクソソームの凍結乾燥において、各種糖がエクソソームを安定化できること、および、特に糖の濃度が10~50mg/mLである場合に高い安定化効果が奏されることが示された。
実施例5:各種糖およびキレート剤の併用によるエクソソームの安定化
エクソソームの凍結乾燥に対する各種糖およびキレート剤の併用による効果を検討した。
エクソソームの凍結乾燥に対する各種糖およびキレート剤の併用による効果を検討した。
1)エクソソームの回収、エクソソームの凍結乾燥およびエクソソーム特異的抗原(CD9)量の測定に基づくエクソソームの安定性評価
凍結乾燥緩衝液を除き、実施例4に記載の方法にて、エクソソームの回収および凍結乾燥、並びにエクソソームの安定性評価を行った。
凍結乾燥緩衝液としては、PBSもしくはEDTA/EGTA/PBS(final conc.50mM EDTA/50mM EGTA)(ED/EG)、またはこれらのいずれかにラクトース、γシクロデキストリン(γCD)、グルコース、ラクチトールをfinal conc.10mg/mLで添加したものを用いた。
凍結乾燥緩衝液を除き、実施例4に記載の方法にて、エクソソームの回収および凍結乾燥、並びにエクソソームの安定性評価を行った。
凍結乾燥緩衝液としては、PBSもしくはEDTA/EGTA/PBS(final conc.50mM EDTA/50mM EGTA)(ED/EG)、またはこれらのいずれかにラクトース、γシクロデキストリン(γCD)、グルコース、ラクチトールをfinal conc.10mg/mLで添加したものを用いた。
その結果、これら糖類およびキレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した(図6)。
したがって、糖によるエクソソームの安定化は、キレート剤の存在下で向上されることが示された。
したがって、糖によるエクソソームの安定化は、キレート剤の存在下で向上されることが示された。
実施例6:血清由来のエクソソームの安定化
血清由来のエクソソームの凍結乾燥に対する各種糖もしくはキレート剤またはこれらの併用による効果を検討した。
血清由来のエクソソームの凍結乾燥に対する各種糖もしくはキレート剤またはこれらの併用による効果を検討した。
1)エクソソームの回収
ヒト血清をサンプルとして用いた。血清を、2,000×g、4℃で5分間遠心した後、20,000×g、4℃で15分間遠心した。次に、上清を、100,000×g、4℃で3時間遠心した。上清を捨て、PBSを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、新たにPBSを加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
ヒト血清をサンプルとして用いた。血清を、2,000×g、4℃で5分間遠心した後、20,000×g、4℃で15分間遠心した。次に、上清を、100,000×g、4℃で3時間遠心した。上清を捨て、PBSを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、新たにPBSを加えて、沈殿物を再懸濁してエクソソームを回収した。
2)エクソソームの凍結乾燥およびエクソソーム特異的抗原(CD9)量の測定に基づくエクソソームの安定性評価
エクソソームの凍結乾燥およびエクソソームの安定性評価は、凍結乾燥緩衝液を除き、実施例4に記載の方法にて行った。
凍結乾燥緩衝液としては、PBSもしくはEDTA/EGTA/PBS(final conc.50mM EDTA/50mM EGTA)(ED/EG)、またはこれらのいずれかにラクトース、グルコース、ラクチトールをfinal conc.10mg/mLもしくは50mg/mLで添加したものを用いた。
エクソソームの凍結乾燥およびエクソソームの安定性評価は、凍結乾燥緩衝液を除き、実施例4に記載の方法にて行った。
凍結乾燥緩衝液としては、PBSもしくはEDTA/EGTA/PBS(final conc.50mM EDTA/50mM EGTA)(ED/EG)、またはこれらのいずれかにラクトース、グルコース、ラクチトールをfinal conc.10mg/mLもしくは50mg/mLで添加したものを用いた。
その結果、これら糖類またはキレート剤を含む凍結乾燥緩衝液では、エクソソーム量が増大した(図7)。さらに、糖類とキレート剤の両方を含む凍結乾燥緩衝液を用いた場合は、エクソソーム量がさらに増大した。
したがって、糖類およびキレート剤によるエクソソームの安定化向上の効果は血清由来のエクソソームにも示された。
したがって、糖類およびキレート剤によるエクソソームの安定化向上の効果は血清由来のエクソソームにも示された。
実施例7:カルボキシメチルセルロースによるエクソソームの安定化
エクソソームの凍結乾燥に対するカルボキシメチルセルロース(CMC)の効果を検討した。
エクソソームの凍結乾燥に対するカルボキシメチルセルロース(CMC)の効果を検討した。
1)エクソソームの回収
3日間無血清培地で培養したヒト非小細胞肺癌細胞H1299の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、2,000×g、4℃で5分間遠心し、0.22μmフィルター(ミリポア社製)で濾過した後、Amicon Ultra-15(ミリポア社製)を用いて濃縮した。濃縮物を100,000×g、4℃で3時間遠心した。上清を捨て、PBSを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、新たにPBSを加えて、エクソソームを回収した。
3日間無血清培地で培養したヒト非小細胞肺癌細胞H1299の培養上清をサンプルとして用いた。培養上清を、2,000×g、4℃で5分間遠心し、0.22μmフィルター(ミリポア社製)で濾過した後、Amicon Ultra-15(ミリポア社製)を用いて濃縮した。濃縮物を100,000×g、4℃で3時間遠心した。上清を捨て、PBSを加えて、沈殿物を再懸濁させた。再懸濁させた後、100,000×g、4℃で1時間遠心した。上清を捨て、新たにPBSを加えて、エクソソームを回収した。
2)エクソソームの凍結乾燥
回収したエクソソームをQubit(商標) Protein Assay Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にてタンパク定量を行い、濃度を調整した。次に、回収したエクソソーム1容量に対し、等量の凍結乾燥緩衝液と混合し、-20℃で3時間凍結した後、遠心エバポレーター(スクラム社製)を用いて乾燥させた。その後、凍結乾燥物をミリQ水(ミリポア社製)で溶解させ、さらにPBSを加えて希釈した。なお、凍結乾燥緩衝液としてPBS、CMC/PBS(final conc.0.2重量%または1重量%CMC)を用いた。
回収したエクソソームをQubit(商標) Protein Assay Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にてタンパク定量を行い、濃度を調整した。次に、回収したエクソソーム1容量に対し、等量の凍結乾燥緩衝液と混合し、-20℃で3時間凍結した後、遠心エバポレーター(スクラム社製)を用いて乾燥させた。その後、凍結乾燥物をミリQ水(ミリポア社製)で溶解させ、さらにPBSを加えて希釈した。なお、凍結乾燥緩衝液としてPBS、CMC/PBS(final conc.0.2重量%または1重量%CMC)を用いた。
3)エクソソーム特異的抗原(CD9)量の測定に基づくエクソソームの安定性評価
これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、固相に自社製抗CD9抗体、検出にビオチン化した同自社製抗CD9抗体およびSA-ALP(GeneTex社製)を用いたELISA系で、凍結乾燥していないサンプルのカウントを100%として評価した。
その結果、凍結乾燥時に0.2重量%CMCまたは1重量%CMCを含む条件では、残存するエクソソームの量が増大した(図8)。
したがって、エクソソームの凍結乾燥においてCMCがエクソソームを安定化できることが示された。
これら溶解した凍結乾燥エクソソーム量を、固相に自社製抗CD9抗体、検出にビオチン化した同自社製抗CD9抗体およびSA-ALP(GeneTex社製)を用いたELISA系で、凍結乾燥していないサンプルのカウントを100%として評価した。
その結果、凍結乾燥時に0.2重量%CMCまたは1重量%CMCを含む条件では、残存するエクソソームの量が増大した(図8)。
したがって、エクソソームの凍結乾燥においてCMCがエクソソームを安定化できることが示された。
Claims (12)
- 細胞外小胞含有試料を糖およびキレート剤と混合することを含む、細胞外小胞の安定化方法。
- 細胞外小胞がエクソソームである、請求項1に記載の方法。
- 細胞外小胞含有試料が体液または培養上清である、請求項1または2に記載の方法。
- 細胞外小胞含有試料が血液試料である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 混合における糖の濃度が2.5~100mg/mLである、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 混合におけるキレート剤の濃度が1~200mMである、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 以下を含む、細胞外小胞の安定化方法:
(1)細胞外小胞含有試料を糖と混合すること;および
(2)細胞外小胞含有試料と糖との混合物を凍結させること。 - 凍結が凍結乾燥である、請求項7に記載の方法。
- 以下を含む、細胞外小胞の安定化方法:
(1)細胞外小胞含有試料をキレート剤と混合すること;および
(2)細胞外小胞含有試料とキレート剤との混合物を凍結させること。 - 凍結が凍結乾燥である、請求項9に記載の方法。
- 糖およびキレート剤を含む、細胞外小胞安定化試薬。
- 糖またはキレート剤を含む、細胞外小胞の凍結保存安定化試薬。
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