JPWO2018186421A1 - 間葉系幹細胞を含む細胞集団とその製造方法、及び医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明の課題は、細胞製剤を経静脈的に投与するのに有用な、細胞凝集性の低い間葉系細胞を含む細胞集団及びその製造方法、並びに上記細胞集団を含む医薬組成物を提供することである。本発明によれば、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、以下に示す細胞特性を有する細胞集団を取得することを含む、製造方法（前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす）が提供される。
Description
本発明は、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法に関する。さらに本発明は、間葉系幹細胞を含む細胞集団、及び上記細胞集団を含む医薬組成物に関する。
間葉系間質細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ）ともよばれる間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織、歯髄などに存在することが報告されている体性幹細胞であり、最近では、胎盤、臍帯、卵膜などの胎児付属物にも存在することが明らかになっている。間葉系幹細胞は、骨、軟骨及び脂肪などに分化する能力を有するため、再生医療における有望な細胞ソースとして注目されている。
また、間葉系幹細胞は、分化能だけでなく免疫抑制能を有するため、経静脈的に投与することにより免疫関連疾患や炎症性疾患等の治療が可能であることが報告されている。
特許文献１には、羊膜間葉系細胞組成物の製造方法及び凍結保存方法、並びに治療剤について記載されている。特に、ジメチルスルホキシドを５〜１０質量％含有し、ヒドロキシルエチルデンプンを５〜１０質量％又はデキストランを１〜５質量％含有する溶液中に羊膜間葉系細胞を含む混合物を凍結保存することによって、凍結保存された羊膜間葉系細胞を移植に至適化した細胞製剤として製造できることが記載されている。
特許文献２には、（Ｄ）哺乳動物の羊膜から間葉系細胞の細胞集団を採取するステップと、（Ｅ）前記採取された細胞集団を４００〜３５０００／ｃｍ２の細胞濃度において播種し、２〜３日間初期培養するステップと、（Ｆ）前記初期培養の１／５０００以上１／１０未満の細胞濃度において播種し、１週間に２回の培地交換を行う継代培養を３〜４回繰り返すステップと、（Ｇ）前記継代培養において紡錘状の形態を有する細胞のコロニーが形成されたとき、細胞がコンフルエントになるまで同一の培養皿で培養を維持するステップとを含む、羊膜間葉系幹細胞集団を調製する方法が記載されている。
特許文献３には、ヒト間葉系幹細胞のプロテオームの解析により、ヒト間葉系幹細胞がＣＯＬ１１Ａ１及びＣＯＬ１６Ａ１を分泌することが確認されている。
近年、胎児付属物に由来する間葉系幹細胞には、分化能や増殖能、サイトカイン産生能が異なる様々な細胞を含むヘテロな細胞集団であることが分かってきた。安定した品質の細胞製剤を製造するために、純化された均一性の高い細胞集団を調製する必要がある。また、間葉系幹細胞を含む細胞懸濁液を経静脈的に投与した場合、投与された間葉系幹細胞からなる細胞凝集塊が毛細血管やそれより太い血管に詰まることで塞栓を引き起こす危険性があると指摘されている。従って、細胞治療剤としての安全性を向上させる観点から、より細胞凝集性の低い間葉系幹細胞を取得する必要がある。
特許文献１には、羊膜間葉系細胞を含む混合物を、特定の凍結保存液にて凍結保存することにより、解凍後の羊膜間葉系細胞の生存率減少を抑制し、凍結保存された羊膜間葉系細胞を移植に至適化した細胞製剤として製造できることは記載されている。しかしながら、間葉系幹細胞の中から特定の優れた特徴を有する間葉系幹細胞を選択的に調製すること、具体的には、細胞製剤を経静脈的に投与するのに有用な細胞凝集性が低い間葉系幹細胞を多く含む細胞集団を、間葉系幹細胞の特性を指標として選択的に調製することについては、一切記載されていない。また、特許文献２には、低密度で細胞を播種することによって、高い増殖能と分化能を有する間葉系幹細胞集団を調製しているものの、間葉系幹細胞集団に含まれる間葉系幹細胞の特性を指標として、細胞凝集性が低い間葉系幹細胞を多く含む細胞集団については記載も示唆もない。
特許文献３には、間葉系幹細胞がＣＯＬ１１Ａ１及びＣＯＬ１６Ａ１を分泌することが記載されている。しかし、特許文献３には、ＣＯＬ１１Ａ１及びＣＯＬ１６Ａ１の発現強度は記載されておらず、細胞凝集性が低い間葉系幹細胞を多く含む細胞集団を間葉系幹細胞の特性を指標として選択的に調製することについては記載も示唆もない。
特許文献３には、間葉系幹細胞がＣＯＬ１１Ａ１及びＣＯＬ１６Ａ１を分泌することが記載されている。しかし、特許文献３には、ＣＯＬ１１Ａ１及びＣＯＬ１６Ａ１の発現強度は記載されておらず、細胞凝集性が低い間葉系幹細胞を多く含む細胞集団を間葉系幹細胞の特性を指標として選択的に調製することについては記載も示唆もない。
本発明は、細胞製剤を経静脈的に投与するのに有用な、細胞凝集性の低い間葉系細胞を含む細胞集団及びその製造方法、並びに上記細胞集団を含む医薬組成物を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、胎児付属物から採取した細胞を含む細胞集団に中にＣＯＬ１１Ａ１遺伝子及びＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の発現量が少ない間葉系幹細胞が含まれていることを見出し、さらに、上記した細胞特性を有する間葉系幹細胞を含む細胞集団は、細胞凝集が抑制されていることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
すなわち、本明細書によれば、以下の発明が提供される。
［１］ 間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、以下に示す細胞特性を有する細胞集団を取得することを含む、製造方法：
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
［２］ 間葉系幹細胞を含む細胞集団であって、以下に示す細胞特性を有する細胞集団：
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
［３］ 前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ４Ａ５遺伝子の相対発現量が０．４以下であることを満たす［２］に記載の細胞集団。
［４］ 前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＶＣＡＮ遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＤＣＮ遺伝子の相対発現量が３．０以下であること、又はＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＬＵＭ遺伝子の相対発現量が６．０以下であることの何れか一以上を満たす、［２］又は［３］に記載の細胞集団。
［５］ 前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＧＰＣ４遺伝子の相対発現量が０．５以下であることを満たす、［２］から［４］の何れか一に記載の細胞集団。
［６］ 前記細胞集団において、ＣＤＨ６が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上である、［２］から［５］の何れか一に記載の細胞集団。
［７］ 前記間葉系幹細胞が、胎児付属物に由来するものである、［２］から［６］の何れか一に記載の細胞集団。
［８］ ［２］から［７］の何れか一に記載の細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物。
［９］ ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量が１０９個／ｋｇ体重以下である、［８］に記載の医薬組成物。
［１０］ 前記医薬組成物が、液剤である、［８］又は［９］に記載の医薬組成物。
［１１］ 前記医薬組成物が、注射用液剤である、［８］から［１０］の何れか一に記載の医薬組成物。
［１２］ 免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、及び癌から選択される疾患の治療剤である、［８］から［１１］の何れか一に記載の医薬組成物。
［１］ 間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、以下に示す細胞特性を有する細胞集団を取得することを含む、製造方法：
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
［２］ 間葉系幹細胞を含む細胞集団であって、以下に示す細胞特性を有する細胞集団：
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
［３］ 前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ４Ａ５遺伝子の相対発現量が０．４以下であることを満たす［２］に記載の細胞集団。
［４］ 前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＶＣＡＮ遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＤＣＮ遺伝子の相対発現量が３．０以下であること、又はＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＬＵＭ遺伝子の相対発現量が６．０以下であることの何れか一以上を満たす、［２］又は［３］に記載の細胞集団。
［５］ 前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＧＰＣ４遺伝子の相対発現量が０．５以下であることを満たす、［２］から［４］の何れか一に記載の細胞集団。
［６］ 前記細胞集団において、ＣＤＨ６が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上である、［２］から［５］の何れか一に記載の細胞集団。
［７］ 前記間葉系幹細胞が、胎児付属物に由来するものである、［２］から［６］の何れか一に記載の細胞集団。
［８］ ［２］から［７］の何れか一に記載の細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物。
［９］ ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量が１０９個／ｋｇ体重以下である、［８］に記載の医薬組成物。
［１０］ 前記医薬組成物が、液剤である、［８］又は［９］に記載の医薬組成物。
［１１］ 前記医薬組成物が、注射用液剤である、［８］から［１０］の何れか一に記載の医薬組成物。
［１２］ 免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、及び癌から選択される疾患の治療剤である、［８］から［１１］の何れか一に記載の医薬組成物。
［１３］ ［１］に記載の製造方法により得られる、細胞集団。
［１４］ 医薬組成物の製造のための、［２］から［７］の何れか一に記載の細胞集団の使用。
［１５］ 前記医薬組成物が、ヒトへの間葉系幹細胞の１回の用量が１０９個／ｋｇ体重以下である医薬組成物である、［１４］に記載の使用。
［１６］ 前記医薬組成物が、液剤である、［１４］又は［１５］に記載の使用。
［１７］ 前記医薬組成物が、注射用液剤である、［１４］から［１６］の何れか一に記載の使用。
［１８］ 免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、及び癌から選択される疾患の治療剤である、［１４］から［１７］の何れか一に記載の使用。
［１４］ 医薬組成物の製造のための、［２］から［７］の何れか一に記載の細胞集団の使用。
［１５］ 前記医薬組成物が、ヒトへの間葉系幹細胞の１回の用量が１０９個／ｋｇ体重以下である医薬組成物である、［１４］に記載の使用。
［１６］ 前記医薬組成物が、液剤である、［１４］又は［１５］に記載の使用。
［１７］ 前記医薬組成物が、注射用液剤である、［１４］から［１６］の何れか一に記載の使用。
［１８］ 免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、及び癌から選択される疾患の治療剤である、［１４］から［１７］の何れか一に記載の使用。
［１９］ 疾患の治療において使用するための、［２］から［７］の何れか一に記載の細胞集団。
［２０］ ヒトへの間葉系幹細胞の１回の用量が１０９個／ｋｇ体重以下である、［１９］に記載の細胞集団。
［２１］ 液剤である、［１９］又は［２０］に記載の細胞集団。
［２２］ 注射用液剤である、［１９］から［２１］の何れか一に記載の細胞集団。
［２３］ 疾患が、免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、及び癌から選択される疾患である、［１９］から［２２］の何れか一に記載の細胞集団。
［２０］ ヒトへの間葉系幹細胞の１回の用量が１０９個／ｋｇ体重以下である、［１９］に記載の細胞集団。
［２１］ 液剤である、［１９］又は［２０］に記載の細胞集団。
［２２］ 注射用液剤である、［１９］から［２１］の何れか一に記載の細胞集団。
［２３］ 疾患が、免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、及び癌から選択される疾患である、［１９］から［２２］の何れか一に記載の細胞集団。
［２４］ ［２］から［７］の何れか一に記載の細胞集団を、治療を必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療方法。
［２５］ ヒトへの間葉系幹細胞の１回の用量が１０９個／ｋｇ体重以下である、［２４］に記載の疾患の治療方法。
［２６］ 液剤である、［２４］又は［２５］に記載の疾患の治療方法。
［２７］ 注射用液剤である、［２４］から［２６］の何れか一に記載の疾患の治療方法。
［２８］ 疾患が、免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、及び癌から選択される疾患である、［２４］から［２７］の何れか一に記載の疾患の治療方法。
［２５］ ヒトへの間葉系幹細胞の１回の用量が１０９個／ｋｇ体重以下である、［２４］に記載の疾患の治療方法。
［２６］ 液剤である、［２４］又は［２５］に記載の疾患の治療方法。
［２７］ 注射用液剤である、［２４］から［２６］の何れか一に記載の疾患の治療方法。
［２８］ 疾患が、免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、及び癌から選択される疾患である、［２４］から［２７］の何れか一に記載の疾患の治療方法。
［２９］ ［２］から［７］の何れか一に記載の細胞集団と、媒体とを含む、組成物。
［３０］ 間葉系幹細胞を含む細胞集団において、
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量を測定し、以下に示す細胞特性を指標として間葉系幹細胞の細胞凝集性を評価する方法。
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
［３１］ ドナーから間葉系幹細胞を含む細胞集団を採取し、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量を測定し、以下に示す細胞特性を指標として評価する、ドナー及び／又はドナーから採取した試料の評価方法。
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
［３２］ ドナーから採取した試料を酵素処理して得られた細胞集団に対して、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量を測定し、以下に示す細胞特性を指標として評価する、前記試料の最適な酵素処理条件を判断及び／又は予測する方法。
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量を測定し、以下に示す細胞特性を指標として間葉系幹細胞の細胞凝集性を評価する方法。
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
［３１］ ドナーから間葉系幹細胞を含む細胞集団を採取し、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量を測定し、以下に示す細胞特性を指標として評価する、ドナー及び／又はドナーから採取した試料の評価方法。
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
［３２］ ドナーから採取した試料を酵素処理して得られた細胞集団に対して、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量を測定し、以下に示す細胞特性を指標として評価する、前記試料の最適な酵素処理条件を判断及び／又は予測する方法。
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
本発明によれば、細胞凝集性の低い間葉系細胞を含む細胞集団を取得することができる。また、本発明によれば、細胞凝集性の低い間葉系幹細胞を含む細胞集団形成の指標として、各種遺伝子のハウスキーピング遺伝子に対する相対発現量を使用することができる。これにより、経静脈的に投与するのに有用な細胞製剤（医薬組成物）を効率的に製造することができる。
以下、本発明の実施形態について具体的に説明するが、下記の説明は本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が下記の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も本発明の範囲に含まれる。
［１］用語の説明
本明細書における「胎児付属物」は、卵膜、胎盤、臍帯及び羊水を指す。さらに「卵膜」は、胎児の羊水を含む胎嚢であり、内側から羊膜、絨毛膜及び脱落膜からなる。このうち、羊膜と絨毛膜は胎児を起源とする。「羊膜」は、卵膜の最内層にある血管に乏しい透明薄膜を指す。羊膜の内層（上皮細胞層ともよばれる）は分泌機能のある一層の上皮細胞で覆われ羊水を分泌し、羊膜の外層（細胞外基質層ともよばれ、間質に相当する）は間葉系幹細胞を含む。
本明細書における「胎児付属物」は、卵膜、胎盤、臍帯及び羊水を指す。さらに「卵膜」は、胎児の羊水を含む胎嚢であり、内側から羊膜、絨毛膜及び脱落膜からなる。このうち、羊膜と絨毛膜は胎児を起源とする。「羊膜」は、卵膜の最内層にある血管に乏しい透明薄膜を指す。羊膜の内層（上皮細胞層ともよばれる）は分泌機能のある一層の上皮細胞で覆われ羊水を分泌し、羊膜の外層（細胞外基質層ともよばれ、間質に相当する）は間葉系幹細胞を含む。
本明細書における「間葉系幹細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ)」は、下記の定義を満たす幹細胞を指し、「間葉系間質細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ)」と区別なく用いられる。本明細書において、「間葉系幹細胞」は「ＭＳＣ」と記載されることがある。
間葉系幹細胞の定義
i)標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す。
ii)表面抗原ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９ａｌｐｈａ、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲが陰性。
i)標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す。
ii)表面抗原ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９ａｌｐｈａ、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲが陰性。
本明細書における「間葉系幹細胞集団」は、間葉系幹細胞を含む細胞集団を意味し、その形態は特に限定されず、例えば、細胞ペレット、細胞凝集塊、細胞浮遊液又は細胞懸濁液などが挙げられる。
本明細書における「羊膜間葉系幹細胞」は、羊膜に由来する間葉系幹細胞を指し、「羊膜間葉系間質細胞」と区別なく用いられる。本明細書において、「羊膜間葉系幹細胞」は「羊膜ＭＳＣ」と記載されることがある。
本明細書における「細胞凝集」とは、複数の単細胞同士が付着して一群となることをいう。細胞凝集は、例えば、顕微鏡を用いた観察、又はセルカウンターを用いた細胞計数、凝集率測定、サイズ分布測定等により評価することができる。
本明細書における「ＣＤＨ６が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率」とは、後記する実施例に記載の通り、フローサイトメトリーによって解析した上記表面抗原について陽性である細胞の比率を示す。本明細書において、「ＣＤＨ６が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率」は「陽性率」と記載されることがある。
［２］間葉系幹細胞を含む細胞集団
本発明により提供される間葉系幹細胞を含む細胞集団は、以下に示す細胞特性を有する細胞集団である：
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
上記の条件を満たすと、細胞凝集性の低い間葉系細胞を含む細胞集団を形成する。そのため、本発明においては、前記条件を細胞凝集性の低い細胞集団形成の指標とすることができる。
本発明により提供される間葉系幹細胞を含む細胞集団は、以下に示す細胞特性を有する細胞集団である：
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
上記の条件を満たすと、細胞凝集性の低い間葉系細胞を含む細胞集団を形成する。そのため、本発明においては、前記条件を細胞凝集性の低い細胞集団形成の指標とすることができる。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量の上限は、５．５以下、５．０以下、４．５以下、４．０以下、３．５以下、３．０以下、２．９以下、２．８以下、２．７以下、２．６以下、２．５以下、２．４以下、２．３以下、２．２以下、２．１以下、２．０以下、１．９以下、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下、１．４以下、１．３以下又は１．２以下でもよい。また、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量の下限は、０．１以上、０．２以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．９以上又は１．０以上でもよい。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量の上限は、１．４以下、１．３以下、１．２以下、１．１以下、１．０以下、０．９以下、０．８以下、０．７以下、０．６以下、０．５以下、０．４以下、０．３以下又は０．２以下でもよい。また、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量の下限は、０．０２以上、０．０４以上、０．０６以上又は０．０８以上でもよい。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量の上限は、１．４以下、１．３以下、１．２以下、１．１以下、１．０以下、０．９以下、０．８以下、０．７以下、０．６以下、０．５以下、０．４以下、０．３以下又は０．２以下でもよい。また、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量の下限は、０．０２以上、０．０４以上、０．０６以上又は０．０８以上でもよい。
本発明の一態様によれば、本発明により提供される間葉系幹細胞を含む細胞集団においては、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ４Ａ５遺伝子の相対発現量が０．４以下であることを満たしていてもよい。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ４Ａ５遺伝子の相対発現量の上限は、０．３８以下、０．３６以下、０．３４以下、０．３２以下、０．３０以下、０．３０以下、０．２８以下、０．２６以下、０．２４以下又は０．２２以下でもよい。また、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ４Ａ５遺伝子の相対発現量の下限は、０．０２以上、０．０４以上、０．０６以上、０．０８以上又は０．１０以上でもよい。
本発明の一態様によれば、本発明により提供される間葉系幹細胞を含む細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＶＣＡＮ遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＤＣＮ遺伝子の相対発現量が３．０以下であること、又はＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＬＵＭ遺伝子の相対発現量が６．０以下であることの何れか一以上を満たし、好ましくは上記の何れか二以上を満たし、より好ましくは上記の全てを満たす。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＶＣＡＮ遺伝子の相対発現量の上限は、５．５以下、５．０以下、４．５以下、４．０以下、３．９以下、３．８以下、３．７以下、又は３．６以下でもよい。ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＶＣＡＮ遺伝子の相対発現量の下限は、１．０以上、１．５以上、２．０以上、２．５以上、又は３．０以上でもよい。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＤＣＮ遺伝子の相対発現量の上限は、２．９以下、２．８以下、２．７以下、２．６以下、２．５以下、２．４以下、２．３以下、２．２以下、２．１以下、２．０以下、又は１．９以下でもよい。ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＤＣＮ遺伝子の相対発現量の下限は、１．０以上、１．１以上、１．２以上、１．３以上、１．４以上、１．５以上、１．６以上、又は１．７以上でもよい。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＬＵＭ遺伝子の相対発現量の上限は、５.５以下、５.０以下、４.５以下、４.０以下、３.５以下、３.０以下、又は２.５以下でもよい。ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＬＵＭ遺伝子の相対発現量の下限は、１．０以上、１．１以上、１．２以上、１．３以上、１．４以上、１．５以上、１．６以上、１．７以上、１．８以上、１．９以上、２．０以上、又は２．１以上でもよい。
本発明の一態様によれば、本発明により提供される間葉系幹細胞を含む細胞集団においては、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＧＰＣ４遺伝子の相対発現量が０．５以下であることを満たしていてもよい。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＧＰＣ４遺伝子の相対発現量の上限は、０．４５以下、０．４０以下、０．３５以下、０．３０以下、０．２５以下、０．２０以下又は０．１５以下でもよい。また、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＧＰＣ４遺伝子の相対発現量の下限は、０．０２以上、０．０４以上、０．０６以上又は０．０８以上でもよい。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対する各遺伝子の相対発現量の測定方法としては、マイクロアレイを用いた測定を使用することができる。マイクロアレイは、具体的には、以下の手順（１）〜（５）にて行なうことができる。なお、以下の手順（３）〜（５）は、株式会社理研ジェネシスに委託して実施することができる。
（１）対象となる細胞が接着細胞の場合、プラスチック製培養容器から、セルスクレーパー（コーニング社製）を用いて非酵素的に接着細胞を剥離し、遠心分離により細胞を回収する。対象となる細胞が非接着細胞の場合、遠心分離により細胞を回収する。
（２）ＲＮＡ安定化試薬（ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））を用いて細胞を安定保存した後、ＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製））を用いてトータルＲＮＡを抽出、精製する。
（３）精製したトータルＲＮＡを鋳型として用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、さらに合成されたｃＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによりｃＲＮＡに転写してビオチン標識を行う。
（４）ビオチン標識ｃＲＮＡをハイブリダイゼーションバッファーに加え、Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＧｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ ２．０ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）上で１６時間のハイブリダイゼーションを行う。ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて洗浄し、フィコエリスリン染色後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にてスキャンを行い、ＡＧＣＣ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｃｏｍｍａｎｄ Ｃｏｎｓｏｌｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて画像解析し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて数値化する。
（５）数値データファイルを、解析ソフトＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ（アジレント・テクノロジー社製）を用いて比較解析する。各細胞におけるＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対する各遺伝子の相対発現量を算出する。
（１）対象となる細胞が接着細胞の場合、プラスチック製培養容器から、セルスクレーパー（コーニング社製）を用いて非酵素的に接着細胞を剥離し、遠心分離により細胞を回収する。対象となる細胞が非接着細胞の場合、遠心分離により細胞を回収する。
（２）ＲＮＡ安定化試薬（ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製））を用いて細胞を安定保存した後、ＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製））を用いてトータルＲＮＡを抽出、精製する。
（３）精製したトータルＲＮＡを鋳型として用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、さらに合成されたｃＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによりｃＲＮＡに転写してビオチン標識を行う。
（４）ビオチン標識ｃＲＮＡをハイブリダイゼーションバッファーに加え、Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＧｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ ２．０ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）上で１６時間のハイブリダイゼーションを行う。ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて洗浄し、フィコエリスリン染色後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にてスキャンを行い、ＡＧＣＣ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｃｏｍｍａｎｄ Ｃｏｎｓｏｌｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて画像解析し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて数値化する。
（５）数値データファイルを、解析ソフトＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ（アジレント・テクノロジー社製）を用いて比較解析する。各細胞におけるＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対する各遺伝子の相対発現量を算出する。
ＳＤＨＡ（Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ，ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ）遺伝子の配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：６３８９として登録されている。
ＶＣＡＮ（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）遺伝子のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：１４６２として登録されている。
ＤＣＮ（Ｄｅｃｏｒｉｎ）遺伝子のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：１６３４として登録されている。
ＬＵＭ（Ｌｕｍｉｃａｎ）遺伝子のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：４０６０として登録されている。
ＶＣＡＮ（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）遺伝子のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：１４６２として登録されている。
ＤＣＮ（Ｄｅｃｏｒｉｎ）遺伝子のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：１６３４として登録されている。
ＬＵＭ（Ｌｕｍｉｃａｎ）遺伝子のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：４０６０として登録されている。
ＧＰＣ４（Ｇｌｙｐｉｃａｎ−４）遺伝子のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：２２３９として登録されている。
ＣＯＬ１１Ａ１（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＸＩ ａｌｐｈａ １ ｃｈａｉｎ）遺伝子のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：１３０１として登録されている。
ＣＯＬ１６Ａ１（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＸＶＩ ａｌｐｈａ １ ｃｈａｉｎ）遺伝子のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：１３０７として登録されている。
ＣＯＬ４Ａ５（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ ＩＶ Ａｌｐｈａ ５ Ｃｈａｉｎ）遺伝子のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：１２８７として登録されている。
ＣＯＬ１６Ａ１（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＸＶＩ ａｌｐｈａ １ ｃｈａｉｎ）遺伝子のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：１３０７として登録されている。
ＣＯＬ４Ａ５（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ ＩＶ Ａｌｐｈａ ５ Ｃｈａｉｎ）遺伝子のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：１２８７として登録されている。
上記した遺伝子発現量を測定するタイミングは、特に限定されないが、例えば、生体試料から細胞を分離した直後、培養工程の途中、培養工程における純化後、Ｎ回継代した直後（Ｎは１以上の整数を示す）、維持培養の途中、凍結保存前、解凍後、製剤化する前、又は製剤化した後などが挙げられる。
本発明の一態様によれば、本発明により提供される間葉系幹細胞を含む細胞集団は、ＣＤＨ６が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上である。
ＣＤＨ６は、Ｃａｄｈｅｒｉｎ６を意味し、カドヘリンスーパーファミリーの一員である。ＶＣＡＮは、Ｖｅｒｓｉｃａｎを意味する。ＤＣＮは、Ｄｅｃｏｒｉｎを意味する。ＬＵＭは、Ｌｕｍｉｃａｎを意味する。
細胞集団においてＣＤＨ６が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率は、３１％以上、３２％以上、３３％以上、３４％以上、３５％以上、３６％以上、３７％以上、３８％以上、３９％以上、又は４０％以上でもよい。
各表面抗原マーカーは、当該技術分野において公知の任意の検出方法により検出することができる。表面抗原マーカーを検出する方法としては、例えばフローサイトメトリー又は細胞染色が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光標識抗体を用いるフローサイトメトリーにおいて、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。細胞染色において、着色するか若しくは蛍光を発する細胞が顕微鏡下にて観察された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。細胞染色は、抗体を使用する免疫細胞染色であってもよく、抗体を使用しない非免疫細胞染色であってもよい。
各表面抗原マーカーに対して陽性である細胞の比率（陽性率）は、具体的には、フローサイトメトリーのドットプロット展開解析を用いて、以下の手順（１）〜（８）にて測定することができる。
（１）対象となる細胞が接着細胞の場合、プラスチック製培養容器から、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて接着細胞を剥離し、遠心分離により細胞を回収する。対象となる細胞が非接着細胞の場合、遠心分離により細胞を回収する。
（２）４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定した後、リン酸バッファー（ＰＢＳ）にて細胞を洗浄し、２％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１．０×１０６個／ｍＬとなるように細胞懸濁液を調製する。前記細胞懸濁液を１００μＬずつ分注する。
（３）分注した細胞懸濁液を遠心分離し、得られた細胞ペレットに０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを１００μＬずつ添加する。次いで、各表面抗原マーカーに対応する抗体、又はそのアイソタイプコントロール用抗体を添加する。なお、表面抗原マーカーであるＣＤＨ６を解析する場合は、次いで２次抗体としてＭｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を添加する。各反応液をＶｏｌｔｅｘにて混和した後、４℃にて２０分間静置する。
（４）０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを添加し、遠心分離により細胞を洗浄した後、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳにて細胞を懸濁し、セルストレーナー（３５μｍナイロンメッシュフィルター）（コーニング社／品番：３５２２３５）にてフィルターろ過する。
（５）フィルターろ過により得られた細胞懸濁液を、ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ベクトン・ディッキンソン社）にてＡＬＬ Ｅｖｅｎｔ １００００で解析する。
（６）測定結果を、縦軸にＳＳＣ（側方散乱光）（数値範囲：０以上１６７７７２１５以下）、横軸を抗体に標識された色素の蛍光強度（数値範囲：１０１以上１０７．２以下）としたドットプロットで展開する。
（７）ドットプロット展開図において、アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が１．０％以下となる全ての領域（ゲート）を選択する。
（８）表面抗原マーカーに対応する抗体で測定した総細胞のうち、（７）で選択したゲート内に含まれる細胞の割合を算出する。
（１）対象となる細胞が接着細胞の場合、プラスチック製培養容器から、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて接着細胞を剥離し、遠心分離により細胞を回収する。対象となる細胞が非接着細胞の場合、遠心分離により細胞を回収する。
（２）４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定した後、リン酸バッファー（ＰＢＳ）にて細胞を洗浄し、２％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１．０×１０６個／ｍＬとなるように細胞懸濁液を調製する。前記細胞懸濁液を１００μＬずつ分注する。
（３）分注した細胞懸濁液を遠心分離し、得られた細胞ペレットに０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを１００μＬずつ添加する。次いで、各表面抗原マーカーに対応する抗体、又はそのアイソタイプコントロール用抗体を添加する。なお、表面抗原マーカーであるＣＤＨ６を解析する場合は、次いで２次抗体としてＭｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を添加する。各反応液をＶｏｌｔｅｘにて混和した後、４℃にて２０分間静置する。
（４）０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを添加し、遠心分離により細胞を洗浄した後、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳにて細胞を懸濁し、セルストレーナー（３５μｍナイロンメッシュフィルター）（コーニング社／品番：３５２２３５）にてフィルターろ過する。
（５）フィルターろ過により得られた細胞懸濁液を、ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ベクトン・ディッキンソン社）にてＡＬＬ Ｅｖｅｎｔ １００００で解析する。
（６）測定結果を、縦軸にＳＳＣ（側方散乱光）（数値範囲：０以上１６７７７２１５以下）、横軸を抗体に標識された色素の蛍光強度（数値範囲：１０１以上１０７．２以下）としたドットプロットで展開する。
（７）ドットプロット展開図において、アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が１．０％以下となる全ての領域（ゲート）を選択する。
（８）表面抗原マーカーに対応する抗体で測定した総細胞のうち、（７）で選択したゲート内に含まれる細胞の割合を算出する。
なお、各表面抗原に対して陰性である細胞の比率（陰性率）は、以下の式により算出する。
陰性率（％）＝１００−陽性率
陰性率（％）＝１００−陽性率
上記した表面抗原マーカーを検出するタイミングは、特に限定されないが、例えば、生体試料から細胞を分離した直後、培養工程の途中、培養工程における純化後、Ｎ回継代した直後（Ｎは１以上の整数を示す）、維持培養の途中、凍結保存前、解凍後、製剤化する前、又は製剤化した後などが挙げられる。
細胞集団の細胞凝集性は、以下の手順（１）〜（６）にて細胞凝集率を算出することにより評価することができる。
（１）細胞集団を、２．０×１０５個／ｍＬとなるように培地（例えば、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（非働化済み）及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ））にて懸濁し、細胞懸濁液を調製する。
（２）調製した細胞懸濁液を、浮遊培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社／品番：ＭＳ−８００６Ｒ）に４ｍＬずつ播種する。
（３）浮遊培養用６ウェルプレートを、インキュベーター内用シェーカーＯｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒ ＯＳ−７６２（オプティマ社）の上に設置し、３％以上５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境、９０ｒｐｍの条件下にて２４時間旋回培養（浮遊培養）を行う。
（４）旋回培養により得られた細胞懸濁液を回収し、セルストレーナー（３５μｍナイロンメッシュフィルター）（コーニング社／品番：３５２２３５）にてフィルターろ過し、細胞凝集塊をメッシュ上にトラップする。
（５）フィルターろ過していない細胞懸濁液（すなわち、細胞凝集塊とシングル細胞とを含む）と、フィルターろ過により得られた細胞懸濁液（細胞凝集塊を含まない）とを、トリパンブルーにて染色し、自動セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓ II ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて細胞計数を行う。
（６）以下の式により、細胞凝集率を算出する。
細胞凝集率（％）＝１００−（フィルターろ過により得られた細胞懸濁液１ｍＬあたりの細胞数／フィルターろ過していない細胞懸濁液１ｍＬあたりの全細胞数）
（１）細胞集団を、２．０×１０５個／ｍＬとなるように培地（例えば、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（非働化済み）及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ））にて懸濁し、細胞懸濁液を調製する。
（２）調製した細胞懸濁液を、浮遊培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社／品番：ＭＳ−８００６Ｒ）に４ｍＬずつ播種する。
（３）浮遊培養用６ウェルプレートを、インキュベーター内用シェーカーＯｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒ ＯＳ−７６２（オプティマ社）の上に設置し、３％以上５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境、９０ｒｐｍの条件下にて２４時間旋回培養（浮遊培養）を行う。
（４）旋回培養により得られた細胞懸濁液を回収し、セルストレーナー（３５μｍナイロンメッシュフィルター）（コーニング社／品番：３５２２３５）にてフィルターろ過し、細胞凝集塊をメッシュ上にトラップする。
（５）フィルターろ過していない細胞懸濁液（すなわち、細胞凝集塊とシングル細胞とを含む）と、フィルターろ過により得られた細胞懸濁液（細胞凝集塊を含まない）とを、トリパンブルーにて染色し、自動セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓ II ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて細胞計数を行う。
（６）以下の式により、細胞凝集率を算出する。
細胞凝集率（％）＝１００−（フィルターろ過により得られた細胞懸濁液１ｍＬあたりの細胞数／フィルターろ過していない細胞懸濁液１ｍＬあたりの全細胞数）
上記した細胞凝集性を評価するタイミングは、特に限定されないが、例えば、生体試料から細胞を分離した直後、培養工程の途中、培養工程における純化後、Ｎ回継代した直後（Ｎは１以上の整数を示す）、維持培養の途中、凍結保存前、解凍後、製剤化する前、又は製剤化した後などが挙げられる。
本発明により提供される間葉系幹細胞を含む細胞集団は、継代されていてもよい。継代回数の下限は、好ましくは１回以上、さらに好ましくは２回以上、さらに好ましくは３回以上、さらに好ましくは４回以上、さらに好ましくは５回以上である。また、継代回数の上限は、好ましくは２５回以下、さらに好ましくは２０回以下、さらに好ましくは１５回以下、さらに好ましくは１０回以下である。
本発明により提供される間葉系幹細胞を含む細胞集団は、集団倍加されていてもよい。集団倍加回数の下限は、好ましくは５回以上、さらに好ましくは１０回以上、さらに好ましくは１５回以上、さらに好ましくは２０回以上、さらに好ましくは２５回以上、さらに好ましくは３０回以上である。また、集団倍加回数の上限は、好ましくは６０回以下、さらに好ましくは５５回以下、さらに好ましくは５０回以下である。
集団倍加回数とは、ある一定の培養期間において細胞集団が分裂した回数であり、[ｌｏｇ１０（培養終了時の細胞数）−ｌｏｇ１０（培養開始時の細胞数）]／ｌｏｇ１０（２）の計算式にて算出される。継代培養を行った場合は、継代毎の集団倍加回数を上記の式で計算した後、累積することによって、総集団倍加回数が算出される。
間葉系幹細胞の由来は特に限定されないが、例えば、胎児付属物、骨髄、脂肪、又は歯髄に由来する間葉系幹細胞を使用することができる。間葉系幹細胞は、好ましくは、胎児付属物に由来する間葉系幹細胞であり、より好ましくは、羊膜に由来する間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞は、自己、同種異系又は異種の生体試料から単離された間葉系幹細胞であり、好ましくは、同種異系の生体試料から単離された間葉系幹細胞である。
間葉系幹細胞は、遺伝子組み換えされた又は遺伝子組み換えされていない間葉系幹細胞であり、好ましくは、遺伝子組み換えされていない間葉系幹細胞である。
本発明の細胞集団は、任意の数の間葉系幹細胞を含むことができる。本発明の細胞集団は、例えば、１．０×１０１個、１．０×１０２個、１．０×１０３個、１．０×１０４個、１．０×１０５個、１．０×１０６個、１．０×１０７個、１．０×１０８個、１．０×１０９個、１．０×１０１０個、１．０×１０１１個、１．０×１０１２個、１．０×１０１３個以上又は以下の間葉系幹細胞を含むことができるが、これらに限定されない。
本発明の細胞集団は、間葉系幹細胞以外に、任意の成分を含んでもよい。上記の成分としては、例えば、塩類、多糖類（例えば、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）、デキストランなど）、タンパク質（例えば、アルブミンなど）、ＤＭＳＯ、アミノ酸、培地成分（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に含まれる成分など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。
本発明の細胞集団は、使用直前まで凍結状態にて保存することができる。上記の細胞集団は、間葉系幹細胞以外に、凍結保存液を含んでもよい。上記の凍結保存液としては、市販の凍結保存液を用いてもよい。例えば、ＣＰ−１（登録商標）（極東製薬工業社製）、ＢＡＭＢＡＮＫＥＲ（リンフォテック社製）、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（日本全薬工業社製）、ＲｅｐｒｏＣｒｙｏ ＲＭ（リプロセル社製）、ＣｒｙｏＮｏｖｏ（Ａｋｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ＭＳＣ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（ＨｅｍａＣａｒｅ社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の細胞集団は、媒体と組み合わせた組成物として提供してもよい。媒体としては、好ましくは液体媒体（例えば、培地、ＤＭＳＯ、凍結保存液、又は後記する製薬上許容し得る媒体など）を使用することができる。
本発明の細胞集団と媒体とを含む組成物は、任意の細胞濃度とすることができる。本発明の細胞集団と媒体とを含む組成物の細胞濃度は、例えば、１．０×１０１個／ｍＬ、１．０×１０２個／ｍＬ、１．０×１０３個／ｍＬ、１．０×１０４個／ｍＬ、１．０×１０５個／ｍＬ、１．０×１０６個／ｍＬ、１．０×１０７個／ｍＬ、１．０×１０８個／ｍＬ、１．０×１０９個／ｍＬ、１．０×１０１０個／ｍＬ以上又は以下の細胞濃度とすることができるが、これらに限定されない。
［３］間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法
本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法は、以下に示す細胞特性を有する細胞集団を取得することを含む方法である：
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法は、以下に示す細胞特性を有する細胞集団を取得することを含む方法である：
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
即ち、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法は、間葉系幹細胞を含む細胞集団を、上記の細胞特性（間葉系幹細胞を含む細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たすという条件）を維持する条件下において調製する工程を含む方法である。上記の条件は、細胞凝集性の低い間葉系幹細胞を含む細胞集団形成の指標であり、本発明の製造方法は、前記指標を満たせば特に制限されない。
本発明の製造方法は、間葉系幹細胞を含む試料（例えば、羊膜などの胎児付属物など）を酵素処理することにより、間葉系幹細胞を含む細胞集団を取得する細胞集団取得工程を含むものでもよい。上記の細胞集団取得工程は、羊膜を帝王切開により得る工程を含む工程でもよい。また、上記の細胞集団取得工程は、間葉系幹細胞を含む試料を洗浄する工程を含むものでもよい。
羊膜は、上皮細胞層と細胞外基質層からなり、後者には羊膜間葉系幹細胞が含まれている。羊膜上皮細胞は、他の上皮細胞同様、特徴として上皮カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ：ＣＤ３２４）及び上皮接着因子（ＥｐＣＡＭ：ＣＤ３２６）を発現しているのに対し、羊膜ＭＳＣはこれら上皮特異的表面抗原マーカーを発現しておらず、フローサイトメトリーで容易に区別可能である。
本発明における間葉系幹細胞を含む細胞集団は、好ましくは胎児付属物から採取した上皮細胞層と細胞外基質層とを含む試料を少なくともコラゲナーゼで処理して得た細胞集団である。
胎児付属物から採取した試料（好ましくは上皮細胞層と細胞外基質層とを含む試料）の酵素処理は、好ましくは、胎児付属物の細胞外基質層に含まれる間葉系幹細胞を遊離することができ、かつ上皮細胞層を分解しない酵素（又はその組み合わせ）による処理である。かかる酵素としては、特に限定されないが、例えば、コラゲナーゼ及び／又は金属プロテイナーゼを挙げることができる。金属プロテイナーゼとしては、非極性アミノ酸のＮ末端側を切断する金属プロテイナーゼであるサーモリシン及び／又はディスパーゼを挙げることができるが、特に限定されない。
コラゲナーゼの活性濃度は、好ましくは５０ＰＵ／ｍｌ以上、より好ましくは１００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは２００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは３００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは４００ＰＵ／ｍｌ以上である。また、コラゲナーゼの活性濃度は、特に限定されないが、例えば、１０００ＰＵ／ｍｌ以下、９００ＰＵ／ｍｌ以下、８００ＰＵ／ｍｌ以下、７００ＰＵ／ｍｌ以下、６００ＰＵ／ｍｌ以下、５００ＰＵ／ｍｌ以下である。ここで、ＰＵ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｕｎｉｔ）とは、ｐＨ７．５、３０℃において、ＦＩＴＣ−ｃｏｌｌａｇｅｎ １ｕｇを１分間で分解する酵素量と定義する。
金属プロテイナーゼ（例えば、サーモリシン及び／又はディスパーゼ）の活性濃度は、好ましくは５０ＰＵ／ｍｌ以上、より好ましくは１００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは２００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは３００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは４００ＰＵ／ｍｌ以上である。また、金属プロテイナーゼの活性濃度は、好ましくは１０００ＰＵ／ｍｌ以下、より好ましくは９００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは８００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは７００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは６００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは５００ＰＵ／ｍｌ以下である。ここで、金属プロテイナーゼとしてディスパーゼを用いた態様において、ＰＵ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｕｎｉｔ）とは、ｐＨ７．５、３０℃において、乳酸カゼインから１分間に１ｕｇのチロシンに相当するアミノ酸を遊離する酵素量と定義される。上記の酵素濃度の範囲において、胎児付属物の上皮細胞層に含まれる上皮細胞の混入を防止しながら、細胞外基質層に含まれる間葉系幹細胞を効率よく遊離させることができる。コラゲナーゼ及び／又は金属プロテイナーゼの好ましい濃度の組み合わせは、酵素処理後の胎児付属物の顕微鏡観察や、取得した細胞のフローサイトメトリーにより決定することができる。
生細胞を効率的に回収する観点から、コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼを組み合わせて胎児付属物を同時一括に処理することが好ましい。この場合の金属プロテイナーゼとしては、サーモリシン及び／又はディスパーゼを使用することができるが、これらに限定されない。コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼを含有する酵素液を用いて胎児付属物を一回のみ処理することにより、間葉系幹細胞を簡便に取得することができる。また、同時一括に処理することにより、細菌やウィルス等のコンタミネーションのリスクを低減することができる。
胎児付属物の酵素処理は、生理食塩水やハンクス平衡塩溶液等の洗浄液を用いて洗浄した羊膜を酵素液に浸漬し、撹拌手段によって撹拌しながら処理することが好ましい。かかる撹拌手段としては、胎児付属物の細胞外基質層に含まれる間葉系幹細胞を効率よく遊離させる観点から、例えば、スターラー又はシェーカーを使用することができるが、これらに限定されない。撹拌速度は、特に限定されないが、スターラー又はシェーカーを用いた場合、例えば、５ｒｐｍ以上、１０ｒｐｍ以上、２０ｒｐｍ以上、３０ｒｐｍ以上、４０ｒｐｍ以上又は５０ｒｐｍ以上である。また、撹拌速度は、特に限定されないが、スターラー又はシェーカーを用いた場合、例えば、１００ｒｐｍ以下、９０ｒｐｍ以下、８０ｒｐｍ以下、７０ｒｐｍ以下又は６０ｒｐｍ以下である。酵素処理時間は、特に限定されないが、例えば、１０分以上、２０分以上、３０分以上、４０分以上、５０分以上、６０分以上、７０分以上、８０分以上又は９０分以上である。また、酵素処理時間は、特に限定されないが、例えば、６時間以下、５時間以下、４時間以下、３時間以下、２時間以下、１１０分以下、１００分以下である。酵素処理温度は、特に限定されないが、例えば、１５℃以上、１６℃以上、１７℃以上、１８℃以上、１９℃以上、２０℃以上、２１℃以上、２２℃以上、２３℃以上、２４℃以上、２５℃以上、２６℃以上、２７℃以上、２８℃以上、２９℃以上、３０℃以上、３１℃以上、３２℃以上、３３℃以上、３４℃以上、３５℃以上又は３６℃以上である。また、酵素処理温度は、特に限定されないが、例えば、４０℃以下、３９℃以下、３８℃以下又は３７℃以下である。
本発明の製造方法において、所望により、遊離した間葉系幹細胞を含む酵素溶液からフィルター、遠心分離や中空糸分離膜、セルソーター等の公知の方法により遊離した間葉系幹細胞を分離及び／又は回収することができる。好ましくは、フィルターによって遊離した間葉系幹細胞を含む酵素溶液を濾過する。前記酵素溶液をフィルターによって濾過する態様においては、遊離した細胞のみがフィルターを通過し、分解されなかった上皮細胞層はフィルターを通過できずにフィルター上に残るため、遊離した間葉系幹細胞を容易に分離及び／又は回収することができるだけでなく、細菌やウィルス等のコンタミネーションのリスクも低減することができる。フィルターとしては、特に限定されないが、例えば、メッシュフィルターを挙げることができる。メッシュフィルターのポアサイズ（メッシュの大きさ）は、特に限定されないが、例えば、４０μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、又は９０μｍ以上である。また、メッシュフィルターのポアサイズは、特に限定されないが、例えば、２００μｍ以下、１９０μｍ以下、１８０μｍ以下、１７０μｍ以下、１６０μｍ以下、１５０μｍ以下、１４０μｍ以下、１３０μｍ以下、１２０μｍ以下、１１０μｍ以下、又は１００μｍ以下である。濾過速度に関しては特に限定されないが、メッシュフィルターのポアサイズを上記の範囲とすることにより、間葉系幹細胞を含む酵素溶液を自然落下により濾過することができ、これにより細胞生存率の低下を防止することができる。
メッシュフィルターの材質としては、ナイロンが好ましく用いられる。研究用として汎用されるＦａｌｃｏｎセルストレーナーなどの４０μｍ、７０μｍ、９５μｍ又は１００μｍのナイロンメッシュフィルターを含有するチューブが利用可能である。また、血液透析などで使用されている医療用メッシュクロス（ナイロン及びポリエステル）が利用できる。さらに、体外循環時に使用される動脈フィルター（ポリエステルメッシュフィルター、ポアサイズ：４０μｍ以上１２０μｍ以下）も利用可能である。他の材質、例えば、ステンレスメッシュフィルター等も用いることが可能である。
間葉系幹細胞をフィルター通過させる場合、自然落下（自由落下）が好ましい。ポンプ等を用いた吸引など強制的なフィルター通過も可能であるが、細胞に損傷を与えることを避けるため、できるだけ弱い圧力とすることが望ましい。
フィルターを通した間葉系幹細胞は、倍量又はそれ以上の培地又は平衡塩緩衝液で濾液を希釈した後、遠心分離により回収することができる。平衡塩緩衝液としては、ダルベッコリン酸バッファー（ＤＰＢＳ）、アール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸バッファー（ＰＢＳ）等を用いることができるが、これらに限定されない。
上記の細胞集団取得工程で得られた細胞集団は、
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たすという条件下において調製する。前記条件は、細胞凝集性の低い間葉系幹細胞を含む細胞集団を取得する際の指標として有用である。調製方法としては、前記指標を満たすものであれば、特に限定されない。そのような方法としては、例えば、セルソーターにてＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であることを満たす細胞集団を分取し、次いで、得られた細胞集団について、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす細胞集団を選択してもよいし、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす細胞集団を選択し、次いで、得られた細胞集団について、セルソーターにてＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であることを満たす細胞集団を分取してもよい。また、前記指標を満たす細胞集団の他の調製方法としては、細胞集団を、上記の２つの条件（前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であること）を満たす条件下において培養することが挙げられる。
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たすという条件下において調製する。前記条件は、細胞凝集性の低い間葉系幹細胞を含む細胞集団を取得する際の指標として有用である。調製方法としては、前記指標を満たすものであれば、特に限定されない。そのような方法としては、例えば、セルソーターにてＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であることを満たす細胞集団を分取し、次いで、得られた細胞集団について、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす細胞集団を選択してもよいし、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす細胞集団を選択し、次いで、得られた細胞集団について、セルソーターにてＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であることを満たす細胞集団を分取してもよい。また、前記指標を満たす細胞集団の他の調製方法としては、細胞集団を、上記の２つの条件（前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であること）を満たす条件下において培養することが挙げられる。
前記指標を満たす培養方法としては、例えば、細胞集団を、コーティングしていないプラスチック製培養容器に４００〜５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、培養することを複数回繰り返す工程を挙げることができる。細胞集団を播種する際の密度はさらに好ましくは５００細胞／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは６００細胞／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは７００細胞／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは８００細胞／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは９００細胞／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは１０００細胞／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは１１００細胞／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは１２００細胞／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは１３００細胞／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは１４００細胞／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは１５００細胞／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは１６００細胞／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは１７００細胞／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは１８００細胞／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは１９００細胞／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは２０００細胞／ｃｍ２以上である。細胞集団を播種する際の密度はさらに好ましくは４８００細胞／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは４６００細胞／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは４４００細胞／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは４２００細胞／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは４０００細胞／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは３８００細胞／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは３６００細胞／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは３４００細胞／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは３２００細胞／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは３０００細胞／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは２８００細胞／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは２６００細胞／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは２４００細胞／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは２２００細胞／ｃｍ２以下である。
前記指標を満たす他の培養方法としては、例えば、細胞集団を、コーティング剤によりコーティングしたプラスチック製培養容器に４００〜５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、培養することを複数回繰り返す工程を挙げることができる。細胞集団を播種する際の密度の好ましい条件は、上記した条件と同様である。
コーティング剤としては、例えば、細胞外基質、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、ラミニン、エンタクチン、コラーゲンI、コラーゲンII、コラーゲンIII、コラーゲンIV、コラーゲンV、コラーゲンVI、ゼラチン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｄ−リジン、マトリゲル（登録商標）マトリックスを挙げることができるが、これらに限定されない。
前記指標を満たすさらに他の培養方法としては、例えば、培養に用いる基礎培地に、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加して培養することが挙げられる。塩基性線維芽細胞増殖因子の濃度は、好ましくは２ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは４ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは６ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは８ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ以上である。塩基性線維芽細胞増殖因子の濃度は、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは１８ｎｇ／ｍＬ以下であり、１６ｎｇ／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは１４ｎｇ／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは１２ｎｇ／ｍＬ以下である。塩基性線維芽細胞増殖因子を添加するタイミングは、特に限定されないが、例えば、培養工程の最初、培養工程の途中、培養工程における純化後、Ｎ回継代した直後（Ｎは１以上の整数を示す）、維持培養の途中、凍結保存前、又は解凍後などが挙げられる。
上記の１回の培養の培養期間としては、例えば４〜１０日間を挙げることができ、より具体的には、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間又は１０日間を挙げることができる。
上記の培養に用いる培地は、任意の動物細胞培養用液体培地を基礎培地とし、必要に応じて他の成分（血清、血清代替試薬、増殖因子など）を適宜添加することにより調製することができる。
基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２ Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。
また、上記の培養に用いる培地は、一般的に市販されている無血清培地を用いても良い。例えば、ＳＴＫ１やＳＴＫ２（ＤＳファーマバイオメディカル社）、ＥＸＰＲＥＰ ＭＳＣ Ｍｅｄｉｕｍ（バイオミメティクスシンパシーズ社）、Ｃｏｒｎｉｎｇ ｓｔｅｍｇｒo ヒト間葉系幹細胞培地（コーニング社）などが挙げられるが、特に限定されない。
前記基礎培地に対して添加する他の成分としては、例えば、アルブミン、血清、血清代替試薬又は増殖因子などが挙げられる。前記基礎培地にアルブミンを添加する態様においては、アルブミンの濃度は０．０５％より多く５％以下が好ましい。また、前記基礎培地に血清を添加する態様においては、血清の濃度は５％以上が好ましい。増殖因子を添加する態様においては、増殖因子を培地中で安定化させるための試薬（ヘパリンなど）を、増殖因子に加えてさらに添加してもよいし、増殖因子をあらかじめゲルや多糖類などで安定化しておき、その後、安定化した増殖因子を前記基礎培地に対して添加してもよい。
間葉系幹細胞の培養は、例えば、以下のような工程にて行うことができる。まず、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。次に、コーティングしていないプラスチック製培養容器に細胞を播種し、３％以上５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境にて、培地を用いてコンフルエント率９５％以下となるように培養する。上記の培地としては、例えば、αＭＥＭ、Ｍ１９９、或いはこれらを基礎とする培地を挙げることができるが、これらに限定されない。上記のような培養により取得した細胞は、１回培養した細胞である。
上記の１回培養した細胞は、例えば、以下のようにさらに継代し、培養することができる。まず、１回培養した細胞を、細胞剥離手段にて処理した後にトリプシンにて処理してプラスチック製培養容器から剥離させる。次に、得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。最後に、コーティングしていないプラスチック製培養容器に細胞を播種し、３％以上５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境にて、培地を用いてコンフルエント率９５％以下となるように培養する。上記の培地としては、例えば、αＭＥＭ、Ｍ１９９、或いはこれらを基礎とする培地を挙げることができるが、これらに限定されない。上記のような継代及び培養により取得した細胞は、１回継代した細胞である。同様の継代及び培養を行うことにより、Ｎ回継代した細胞を取得することができる（Ｎは１以上の整数を示す）。継代回数Ｎの下限は、細胞を大量に製造する観点から、例えば、１回以上、好ましくは２回以上、より好ましくは３回以上、さらに好ましくは４回以上、さらに好ましくは５回以上、さらに好ましくは６回以上、さらに好ましくは７回以上、さらに好ましくは８回以上、さらに好ましくは９回以上、さらに好ましくは１０回以上、さらに好ましくは１１回以上、さらに好ましくは１２回以上、さらに好ましくは１３回以上、さらに好ましくは１４回以上、さらに好ましくは１５回以上、さらに好ましくは１６回以上、さらに好ましくは１７回以上、さらに好ましくは１８回以上、さらに好ましくは１９回以上、さらに好ましくは２０回以上、さらに好ましくは２５回以上である。また、継代回数Ｎの上限は、細胞の老化を抑える観点から、例えば、５０回以下、４５回以下、４０回以下、３５回以下、３０回以下であることが好ましい。
上記の細胞剥離手段として、例えば、細胞剥離剤を使用してもよい。細胞剥離剤としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等を使用することができるが、特に限定されない。細胞剥離剤として、市販の細胞剥離剤を用いてもよい。例えば、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。また、細胞剥離手段として、物理的な細胞剥離手段を使用してもよく、例えば、セルスクレーパー（コーニング社製）を使用することができるが、これに限定されない。細胞剥離手段は、単独で使用してもよく、複数を組み合わせて使用してもよい。
本発明の製造方法によれば、細胞凝集性の低い間葉系幹細胞を含む細胞集団を得ることができ、これにより経静脈的に投与するのに有用な細胞製剤（医薬組成物）を製造することができる。培養１バッチあたりの取得細胞数（単位表面積あたり、単位培養日数あたりの得られる細胞数）の下限は、播種細胞数、播種密度等によって異なるが、例えば、１．０×１０５（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、２．０×１０５（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、３．０×１０５（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、４．０×１０５（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、５．０×１０５（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、６．０×１０５（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、７．０×１０５（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、８．０×１０５（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、９．０×１０５（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上又は１０．０×１０５（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上である。また、培養１バッチあたりの取得細胞数の上限は、特に限定されないが、例えば、１０．０×１０８（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下、９．０×１０８（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下、８．０×１０８（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下、７．０×１０８（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下、６．０×１０８（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下、５．０×１０８（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下、４．０×１０８（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下、３．０×１０８（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下、２．０×１０８（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下又は１．０×１０８（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下である。
本発明の製造方法によれば、細胞凝集性の低い間葉系幹細胞を含む細胞集団を得ることができる。また、本発明の製造方法によって得られる間葉系幹細胞は、生体外での培養開始後、好ましくは４０日以降まで、さらに好ましくは４５日以降まで、５０日以降まで、５５日以降まで、６０日以降まで、６５日以降まで、７０日以降まで、７５日以降まで、８０日以降まで、８５日以降まで、９０日以降まで、９５日以降まで、１００日以降まで、１０５日以降まで、又は１１０日以降まで、培養することが可能である。
また、本発明の製造方法によって得られる間葉系幹細胞は、生体外での培養開始後、倍加回数が好ましくは１０回以上、さらに好ましくは１５回以上、２０回以上、２５回以上、３０回以上、３５回以上、４０回以上、４５回以上、又は５０回以上になるまで培養することが可能である。
本発明の製造方法は、前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たすという条件を指標として、細胞凝集性の低い間葉系細胞を含む細胞集団を識別する識別工程を含むものでもよい。
前記間葉系幹細胞を含む細胞集団を識別するための手段は、好ましくは、フローサイトメトリー、マイクロアレイ及び／又は定量ＲＴ−ＰＣＲである。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子及びＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量は、マイクロアレイを用いて、本明細書中において上記で述べた手順に従って測定することができる。
上記した識別を行うタイミングは、特に限定されないが、例えば、生体試料から細胞を分離した直後、培養工程の途中、培養工程における純化後、Ｎ回継代した直後（Ｎは１以上の整数を示す）、維持培養の途中、凍結保存前、解凍後、製剤化する前、又は製剤化した後などが挙げられる。
また、本発明の製造方法は、上記の条件を指標として前記間葉系幹細胞を含む細胞集団を識別した後に、識別した細胞集団を選択的に分離する工程を含むことができる。前記識別した細胞集団を選択的に分離するための手段は、特に限定されないが、例えば、セルソーターによる細胞集団の分取、培養による細胞集団の純化などが挙げられる。
また、本発明の製造方法は、前記間葉系幹細胞を含む細胞集団を凍結保存する工程を含むことができる。前記細胞集団を凍結保存する工程を含む態様においては、前記細胞集団を解凍後、必要に応じて前記細胞集団を識別、分離、回収及び／又は培養してもよい。また、前記細胞集団を解凍後、そのまま使用してもよい。
前記間葉系幹細胞を含む細胞集団を凍結保存するための手段は、特に限定されないが、例えば、プログラムフリーザー、ディープフリーザー、液体窒素への浸漬などが挙げられる。プログラムフリーザーを用いた場合、凍結する際の温度は、好ましくは−３０℃以下、−４０℃以下、−５０℃以下、−６０℃以下、−７０℃以下、−８０℃以下、−９０℃以下、−１００℃以下、−１１０℃以下、−１２０℃以下、−１３０℃以下、−１４０℃以下、−１５０℃以下、−１６０℃以下、−１７０℃以下、−１８０℃以下、−１９０℃以下、又は−１９６℃（液体窒素温度）以下である。プログラムフリーザーを用いた場合、凍結する際の好ましい凍結速度は、例えば、−１℃／分、−２℃／分、−３℃／分、−４℃／分、−５℃／分、−６℃／分、−７℃／分、−８℃／分、−９℃／分、−１０℃／分、−１１℃／分、−１２℃／分、−１３℃／分、−１４℃／分又は−１５℃／分である。かかる凍結手段としてプログラムフリーザーを用いた場合、例えば、−２℃／分以上−１℃／分以下の凍結速度で−５０℃以上−３０℃以下の間の温度（例えば、−４０℃）まで温度を下げ、さらに−１１℃／分以上−９℃／分以下（例えば、−１０℃／分）の凍結速度で−１００℃以上−８０℃以下の温度（例えば、−９０℃）まで温度を下げることができる。また、かかる凍結手段として液体窒素への浸漬を用いた場合、例えば、−１９６℃まで急速に温度を下げて凍結させた後、液体窒素（気相）中で凍結保存することができる。
上記の凍結手段により凍結する際、上記の細胞集団は、任意の保存容器に入った状態で凍結されてもよい。かかる保存容器としては、例えば、クライオチューブ、クライオバイアル、凍結用バッグ、輸注バッグなどが挙げられるが、これらに限定されない。
上記の凍結手段により凍結する際、上記の細胞集団は、任意の凍結保存液中で凍結されてもよい。かかる凍結保存液として、市販されている凍結保存液を用いても良く、例えば、ＢＡＭＢＡＮＫＥＲ（リンフォテック社製）、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（日本全薬工業社製）、ＲｅｐｒｏＣｒｙｏ ＲＭ（リプロセル社製）、ＣｒｙｏＮｏｖｏ（Ａｋｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ＭＳＣ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（ＨｅｍａＣａｒｅ社）などが挙げられるが、これらに限定されない。
上記の凍結保存液は、所定濃度の多糖類を含有することができる。多糖類の好ましい濃度は、例えば、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、４質量％以上、５質量％以上、６質量％以上、７質量％以上、８質量％以上、９質量％以上、１０質量％以上、１１質量％以上又は１２質量％以上である。また、多糖類の好ましい濃度は、例えば、４０質量％以下、３５質量％以下、３０質量％以下、２５質量％以下、２０質量％以下、１９質量％以下、１８質量％以下、１７質量％以下、１６質量％以下、１５質量％以下、１４質量％以下又は１３質量％以下である。多糖類としては、例えば、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）又はデキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ４０など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。
上記の凍結保存液は、所定濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有することができる。ＤＭＳＯの好ましい濃度は、例えば、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、４質量％以上、５質量％以上、６質量％以上、７質量％以上、８質量％以上又は９質量％以上である。また、ＤＭＳＯの好ましい濃度は、例えば、２０質量％以下、１９質量％以下、１８質量％以下、１７質量％以下、１６質量％以下、１５質量％以下、１４質量％以下、１３質量％以下、１２質量％以下、１１質量％以下又は１０質量％以下である。
上記の凍結保存液は、０質量％より多い所定濃度のアルブミンを含有するものでもよい。アルブミンの好ましい濃度は、例えば、０．５質量％以上、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、４質量％以上、５質量％以上、６質量％以上、７質量％以上又は８質量％以上である。また、アルブミンの好ましい濃度は、例えば、４０質量％以下、３５質量％以下、３０質量％以下、２５質量％以下、２０質量％以下、１５質量％以下、１０質量％以下又は９質量％以下である。アルブミンとしては、例えば、ウシ血清アルブミン、マウスアルブミン、ヒトアルブミン等を挙げることができるが、これに限定されない。
本発明の製造方法は、前記間葉系幹細胞を含む細胞集団を洗浄する工程を含むことができる。上記の間葉系幹細胞を含む細胞集団を洗浄する工程において使用される洗浄液としては、例えば、生理食塩液、ダルベッコリン酸バッファー（ＤＰＢＳ）、アール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸バッファー（ＰＢＳ）等を挙げることができるが、これらに限定されない。細胞集団を洗浄することにより、アレルゲン、エンドトキシン等を低減又は除去することができる。上記のアレルゲンとしては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ブタトリプシン、ブタヘパリンなどを挙げることができるが、これらに限定されない。
本発明の製造方法は、前記間葉系幹細胞を含む細胞集団を保存容器に充填する工程を含むことができる。上記の保存容器としては、例えば、クライオチューブ、クライオバイアル、凍結用バッグ、輸注バッグなどが挙げられるが、これらに限定されない。
［４］間葉系幹細胞の細胞凝集性を評価する方法、ドナー及び／又はドナーから採取した試料の評価方法、並びに最適な酵素処理条件の判断及び／又は予測方法
本発明においては、間葉系幹細胞を含む細胞集団において、前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下である、という条件を指標として測定することによって（好ましくは経時的に測定することによって）、間葉系幹細胞の細胞凝集性を評価することができる。前記評価が必要な工程としては、例えば、培養する工程、凍結保存する工程、及び／又は製剤化する工程である。
例えば培養する工程においては、指標を経時的に測定することで、間葉系幹細胞の細胞凝集性の変化を迅速かつ簡便に把握且つ予測することができる。上記指標を満たす間葉系幹細胞を含む細胞集団においては、間葉系幹細胞が低い細胞凝集性を維持することが分かる。一方、上記指標から値が逸脱した培養状態が継続している場合には、間葉系幹細胞の細胞凝集性が増加しつつあることが予測できる。細胞凝集性が増加しつつあることを指標から読み取った場合には、培養条件（播種密度、培地、増殖因子、血清の変更など）を必要に応じて適切に変更することによって、細胞凝集を抑制することができる。また、上記指標を満たさない場合には、例えばセルソーティング技術を利用することによって、上記指標を満たす間葉系幹細胞を含む細胞集団のみを分取することができる。その後、前記細胞集団における間葉系幹細胞を再度播種して継代培養することによって、細胞凝集を抑制することができる。なお、培養初期段階においては、その工程の最終段階において前記指標を満たすように培養条件（播種密度、培地、増殖因子、血清の変更など）を設計して、少なくとも最終段階においては、上記指標を満たすことができればよい。
本発明においては、ドナーから間葉系幹細胞を含む細胞集団を取得し、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量を測定し、前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下である、という条件を指標として測定することによって、当該ドナー自体及び／又はドナーから採取した試料の品質を評価することができる。上記指標を満たす間葉系幹細胞を含む細胞集団が得られる場合（好ましくは容易に得られる場合）には、前記ドナー及び／又はドナーから採取した試料の品質が良好であることを確認できる。一方、前記間葉系幹細胞を含む細胞集団における上記相対発現量が、上記指標から逸脱している場合には、ドナーから採取した試料に含まれる細胞集団が細胞凝集を起こしやすい可能性が高いため、培養条件（播種密度、培地、増殖因子、血清の変更など）を適切に変更することによって、細胞凝集を抑制することができる。また、前記間葉系幹細胞を含む細胞集団における上記相対発現量が、上記指標から逸脱している場合には、例えばセルソーティング技術を利用することによって、上記指標を満たす間葉系幹細胞を含む細胞集団を分取し、前記細胞集団における間葉系幹細胞を播種して培養することによって、細胞凝集を抑制することができる。培養初期段階においては、その工程の最終段階において前記指標を満たすように培養条件（播種密度、培地、増殖因子、血清の変更など）を設計して、少なくとも最終段階においては、上記指標を満たすことができればよい。なお、ドナーから採取した試料の品質を確認する場合については、試料の調製及び処理方法、細胞集団の培養方法は特に限定されず、任意の方法を採用することができる。
本発明においては、ドナーから採取した試料を酵素処理して得られた細胞集団に対して、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量を測定し、前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下である、という条件を指標として評価することで、前記試料の最適な酵素処理条件を判断及び／又は予測することができる。上記指標を満たす間葉系幹細胞を含む細胞集団が得られる場合（好ましくは容易に得られる場合）には、ドナーから採取した試料の酵素処理方法が適切であることを判断及び／又は予測することができる。一方、上記指標から値が逸脱した培養状態が継続している場合には、ドナーから採取した試料の酵素処理方法が不適切であることを判断及び／又は予測することができる。なお、最適な酵素処理方法を判断及び／又は予測する場合については、試料の調製及び処理方法、細胞集団の培養方法は特に限定されず、任意の方法を採用することができる。
上記の指標は必要なタイミングで測定すればよく、特に限定されないが、生体試料から細胞を分離した直後、培養工程の途中、培養工程における純化後、Ｎ回継代した直後（Ｎは１以上の整数を示す）、維持培養の途中、凍結保存前、解凍後、製剤化する前、又は製剤化した後などが挙げられる。
［５］医薬組成物
本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団は、医薬組成物として使用することができる。即ち、本発明によれば、本発明による細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物が提供される。
本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団は、医薬組成物として使用することができる。即ち、本発明によれば、本発明による細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物が提供される。
本発明の医薬組成物は、好ましくは液剤であり、より好ましくは注射用液剤である。
本発明の医薬組成物は、細胞治療剤、例えば、難治性疾患治療剤として使用することができる。
本発明の医薬組成物は、免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、及び癌から選択される疾患の治療剤として使用することができる。本発明の医薬組成物を治療部位に効果が計測できる量投与することで、上記疾患を治療することができる。
本発明の医薬組成物は、細胞治療剤、例えば、難治性疾患治療剤として使用することができる。
本発明の医薬組成物は、免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、及び癌から選択される疾患の治療剤として使用することができる。本発明の医薬組成物を治療部位に効果が計測できる量投与することで、上記疾患を治療することができる。
本発明によれば、医薬組成物のために使用される、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団が提供される。
本発明によれば、細胞治療剤のために使用される、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団が提供される。
本発明によれば、細胞治療剤のために使用される、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団が提供される。
本発明によれば、免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、及び癌から選択される疾患の治療のために使用される、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団が提供される。
本発明によれば、患者又は被験者に投与して、心筋の再生、心筋細胞の産生、血管新生、血管の修復、又は、免疫応答の抑制のために使用される、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団が提供される。
本発明によれば、患者又は被験者に、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団の治療有効量を投与する工程を含む、患者又は被験者に細胞を移植する方法、並びに患者又は被験者の疾患の治療方法が提供される。
本発明によれば、医薬組成物の製造のための、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団の使用が提供される。
本発明によれば、細胞治療剤の製造のための、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団の使用が提供される。
本発明によれば、細胞治療剤の製造のための、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団の使用が提供される。
本発明によれば、免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、及び癌から選択される疾患の治療剤の製造のための、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団の使用が提供される。
本発明によれば、患者又は被験者に投与して、心筋の再生、心筋細胞の産生、血管新生、血管の修復、又は、免疫応答の抑制に必要な治療剤の製造のための、本発明による間葉系幹細胞を含む細胞集団の使用が提供される。
本発明の医薬組成物は、間葉系幹細胞を含む細胞集団を、製薬上許容し得る媒体により希釈したものでもよい。上記の製薬上許容し得る媒体は、患者又は被験者に投与し得る溶液であれば特に限定されない。製薬上許容し得る媒体は、輸液製剤であってもよく、例えば、注射用水、生理食塩液、５％ブドウ糖液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液、アミノ酸液、開始液（１号液）、脱水補給液（２号液）、維持輸液（３号液）、術後回復液（４号液）、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ Ａ（登録商標）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
本明細書における「患者又は被験者」とは、典型的にはヒトであるが、他の動物であってもよい。他の動物としては、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、サル（カニクイザル、アカゲザル、コモンマーモセット、ニホンザル）、フェレット、ウサギ、げっ歯類（マウス、ラット、スナネズミ、モルモット、ハムスター）等の哺乳動物、ニワトリ、ウズラ等の鳥類が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書における「免疫関連疾患」としては、患者又は被験者の免疫応答が関わる疾患であれば特に限定されないが、例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、糖尿病、全身性エリテマトーデス、膠原病、菌状息肉症、多発性硬化症、乾癬、自己免疫性水疱症、関節リウマチ等を挙げることができる。
本発明の医薬組成物は、患者又は被験者の治療の際に用いられる任意の成分を含んでもよい。上記の成分としては、例えば、塩類、多糖類（例えば、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）、デキストランなど）、タンパク質（例えば、アルブミンなど）、ＤＭＳＯ、アミノ酸、培地成分（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に含まれる成分など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。
本発明の医薬組成物は、保存安定性、等張性、吸収性、及び／又は粘性を増加するための種々の添加剤、例えば、乳化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、湿潤剤、抗酸化剤、キレート剤、増粘剤、ゲル化剤、ｐＨ調整剤等を含んでもよい。前記増粘剤としては、例えば、ＨＥＳ、デキストラン、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。増粘剤の濃度は、選択される増粘剤によるが、患者又は被験者に投与した場合に安全であり、かつ所望の粘性を達成する濃度の範囲で、任意に設定することができる。
発明の医薬組成物のｐＨは、中性付近のｐＨであれば特に限定されないが、例えば、ｐＨ６．５以上又はｐＨ７．０以上とすることができ、またｐＨ８．５以下又はｐＨ８．０以下とすることができる。
本発明の医薬組成物は、好ましくは液剤であり、より好ましくは注射用液剤である。注射用液剤としては、例えば、国際公開ＷＯ２０１１／０４３１３６号公報、特開２０１３−２５６５１０号公報などにおいて、注射に適した液体調製物が知られている。本発明の医薬組成物も、上記文献に記載されている注射用液剤とすることができる。
また、本発明の一態様によれば、本発明の医薬組成物は、他の疾患治療目的に、細胞塊又はシート状構造の移植用製剤、或いは任意のゲルと混合したゲル製剤として用いることも可能である。
本発明の医薬組成物の投与量としては、患者又は被験者に投与した場合に、投与していない患者又は被験者と比較して疾患に対して治療効果を得ることができるような細胞の量である。具体的な投与量は、投与形態、投与方法、使用目的、及び患者又は被験者の年齢、体重及び症状等によって適宜決定することができる。ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量は、特に限定されないが、例えば、１０４個／ｋｇ体重以上、１０５個／ｋｇ体重以上又は１０６個／ｋｇ体重以上である。また、ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量は、特に限定されないが、例えば、１０９個／ｋｇ体重以下、１０８個／ｋｇ体重以下又は１０７個／ｋｇ体重以下である。
本発明の医薬組成物の投与方法は、特に限定されないが、例えば、皮下注射、リンパ節内注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、胸腔内注射又は局所への直接注射、又は局所に直接移植することなどが挙げられる。医薬組成物の投与方法については、例えば、特開２０１５−６１５２０号公報、Ｏｎｋｅｎ ＪＥ， ｔ ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ２００６Ｌａｓ Ｖｅｇａｓ，ＮＶ， Ａｂｓｔｒａｃｔ １２１．、Ｇａｒｃｉａ−Ｏｌｍｏ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓ Ｃｏｌｏｎ Ｒｅｃｔｕｍ ２００５；４８：１４１６−２３．などにおいて、静脈内注射、点滴静脈注射、局所への直接注射、局所への直接移植などが知られている。本発明の医薬組成物も、上記文献に記載されている各種方法により投与することができる。
本発明の医薬組成物は、使用直前まで凍結状態にて保存することができる。凍結保存の温度は、好ましくは−３０℃以下、−４０℃以下、−５０℃以下、−８０℃以下、−９０℃以下、−１００℃以下、−１５０℃以下、−１８０℃以下、又は−１９６℃（液体窒素温度）以下である。本発明の医薬組成物を患者又は被験者に投与する際には、３７℃で急速に解凍して使用することができる。
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
＜比較例１＞
（工程１：羊膜の採取）
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦（ドナー）から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）にて洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した。
（工程１：羊膜の採取）
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦（ドナー）から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）にて洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した。
（工程２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収）
上皮細胞層と細胞外基質層とを含む羊膜を、３００ＰＵ／ｍＬコラゲナーゼと２００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩとを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）に浸し、３７℃にて９０分間、５０ｒｐｍの条件にて振盪攪拌することにより羊膜を酵素処理した。酵素処理後の溶液を目開き９５μｍのナイロンメッシュでろ過することにより羊膜の未消化物を取り除き、羊膜ＭＳＣを含む細胞懸濁液を回収した。得られた細胞懸濁液に関し、フローサイトメーターを用いて、ＭＳＣの代表的な陽性マーカーとして知られている表面抗原の一つであるＣＤ９０の発現が陽性である細胞の比率を解析し、高純度で羊膜から羊膜ＭＳＣを分離できていることを確認した。
上皮細胞層と細胞外基質層とを含む羊膜を、３００ＰＵ／ｍＬコラゲナーゼと２００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩとを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）に浸し、３７℃にて９０分間、５０ｒｐｍの条件にて振盪攪拌することにより羊膜を酵素処理した。酵素処理後の溶液を目開き９５μｍのナイロンメッシュでろ過することにより羊膜の未消化物を取り除き、羊膜ＭＳＣを含む細胞懸濁液を回収した。得られた細胞懸濁液に関し、フローサイトメーターを用いて、ＭＳＣの代表的な陽性マーカーとして知られている表面抗原の一つであるＣＤ９０の発現が陽性である細胞の比率を解析し、高純度で羊膜から羊膜ＭＳＣを分離できていることを確認した。
表面抗原解析は、ベクトン・ディッキンソン（ＢＤ）社のＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用い、測定条件は解析細胞数：１０，０００ｃｅｌｌｓ、流速設定：Ｓｌｏｗ（１４μＬ／ｍｉｎ）とした。ＣＤ９０抗原に対応する抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ９０（ＢＤ社／型番：５６１９６９）を、そのアイソタイプコントロール用抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１, κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ社／型番：３４９０４１）を使用した。
（工程３：羊膜ＭＳＣの凍結保存）
上記の「工程２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収」で得られた細胞集団を、１．０×１０７個／ｍＬとなるようにバンバンカー（リンフォテック社）に懸濁し、クライオチューブに分注した。クライオチューブをバイセル（凍結処理容器）（日本フリーザー社）に入れ、−８０℃にて１２時間保存の後、液体窒素温度にて凍結保存した。
上記の「工程２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収」で得られた細胞集団を、１．０×１０７個／ｍＬとなるようにバンバンカー（リンフォテック社）に懸濁し、クライオチューブに分注した。クライオチューブをバイセル（凍結処理容器）（日本フリーザー社）に入れ、−８０℃にて１２時間保存の後、液体窒素温度にて凍結保存した。
（工程４：羊膜ＭＳＣの培養）
上記の「工程３：羊膜ＭＳＣの凍結保存」で得られた細胞集団を、コーティングしていないプラスチック製培養容器に播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（非働化済み）及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。その後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（１×）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて細胞を剥離し、１／４量の細胞を先の培養と同じスケールのコーティングしていないプラスチック製培養容器に播種することにより、継代培養を行った。培地交換は週２回の頻度で実施した。このようにして継代培養を続けた。
上記の「工程３：羊膜ＭＳＣの凍結保存」で得られた細胞集団を、コーティングしていないプラスチック製培養容器に播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（非働化済み）及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。その後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（１×）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて細胞を剥離し、１／４量の細胞を先の培養と同じスケールのコーティングしていないプラスチック製培養容器に播種することにより、継代培養を行った。培地交換は週２回の頻度で実施した。このようにして継代培養を続けた。
＜実施例１＞
（工程１：羊膜の採取）
比較例１におけるドナーとは異なるドナーから、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した以外は、比較例１の工程１と同様の手法にて羊膜を取得した。
（工程１：羊膜の採取）
比較例１におけるドナーとは異なるドナーから、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した以外は、比較例１の工程１と同様の手法にて羊膜を取得した。
（工程２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収）
比較例１の工程２と同様の手法にて羊膜ＭＳＣを含む細胞懸濁液を回収した。得られた細胞懸濁液に関し、フローサイトメーターを用いて比較例１と同様にして、ＭＳＣの代表的な陽性マーカーとして知られている表面抗原の一つであるＣＤ９０の発現が陽性である細胞の比率を解析し、高純度で羊膜から羊膜ＭＳＣを分離できていることを確認した。
比較例１の工程２と同様の手法にて羊膜ＭＳＣを含む細胞懸濁液を回収した。得られた細胞懸濁液に関し、フローサイトメーターを用いて比較例１と同様にして、ＭＳＣの代表的な陽性マーカーとして知られている表面抗原の一つであるＣＤ９０の発現が陽性である細胞の比率を解析し、高純度で羊膜から羊膜ＭＳＣを分離できていることを確認した。
（工程３：羊膜ＭＳＣの凍結保存）
上記の「工程２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収」で得られた細胞集団を、比較例１の工程３と同様の手法にて凍結保存した。
上記の「工程２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収」で得られた細胞集団を、比較例１の工程３と同様の手法にて凍結保存した。
（工程４：羊膜ＭＳＣの培養）
上記の「工程３：羊膜ＭＳＣの凍結保存」で得られた細胞集団を、比較例１の工程４と同様の手法にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。継代培養は、比較例１の工程４と同様の手法にて行った。
上記の「工程３：羊膜ＭＳＣの凍結保存」で得られた細胞集団を、比較例１の工程４と同様の手法にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。継代培養は、比較例１の工程４と同様の手法にて行った。
＜ＣＤＨ６発現の解析＞
比較例１及び実施例１で培養した６継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いてＣＤＨ６に対して陽性となる細胞の比率を測定した。
比較例１及び実施例１で培養した６継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いてＣＤＨ６に対して陽性となる細胞の比率を測定した。
本測定では、ＣＤＨ６抗原に対応する１次抗体としてＡｎｔｉ−ＣＤＨ６−Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏ ＩｇＧ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社／型番：ＭＡＢ２７１５）、アイソタイプコントロール用抗体としてＭｏｕｓｅ Ｍｏｎｏ ＩｇＧ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社／型番：ＭＡＢ００２）、ＣＤＨ６抗原に対応する１次抗体及びそのアイソタイプコントロール用抗体に対応する２次抗体としてＭｏｕｓｅ Ｆ（ａｂ）２ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） ＡＰＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社／型番：Ｆ０１０１Ｂ）を使用した。
解析の結果を図１及び図２に示す。比較例１の細胞集団と比べて、実施例１の細胞集団ではＣＤＨ６の陽性率が向上した。また、比較例１の細胞集団では、ＣＤＨ６が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％未満（具体的には２０．１％）であるのに対して、実施例１の細胞集団では、ＣＤＨ６が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上（具体的には４０．２％）であった。
＜遺伝子発現の解析＞
比較例１及び実施例１で培養した６継代目の細胞集団に関し、マイクロアレイ解析により、ＶＣＡＮ遺伝子、ＤＣＮ遺伝子、ＬＵＭ遺伝子、ＧＰＣ４遺伝子、ＣＯＬ１１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ１６Ａ１遺伝子、ＣＯＬ４Ａ５遺伝子及びＳＤＨＡ遺伝子の発現を解析した。
比較例１及び実施例１で培養した６継代目の細胞集団に関し、マイクロアレイ解析により、ＶＣＡＮ遺伝子、ＤＣＮ遺伝子、ＬＵＭ遺伝子、ＧＰＣ４遺伝子、ＣＯＬ１１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ１６Ａ１遺伝子、ＣＯＬ４Ａ５遺伝子及びＳＤＨＡ遺伝子の発現を解析した。
以下の手順（１）〜（５）によりマイクロアレイ解析を実施した。なお、以下の手順（３）〜（５）は、株式会社理研ジェネシスに委託して実施した。
（１）比較例１及び実施例１で培養した６継代目の細胞集団を、セルスクレーパー（コーニング社製）を用いてプラスチック製培養容器から剥離し、遠心分離により回収した。
（２）得られた細胞ペレットにＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加してＲＮＡを安定保存した後、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出、精製した。
（３）１００ｎｇのトータルＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによりｃＲＮＡに転写してビオチン標識を行った（３’ＩＶＴ ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを使用）。
（４）１０．０μｇの標識ｃＲＮＡをハイブリダイゼーションバッファーに加え、Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＧｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ ２．０ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）上で１６時間のハイブリダイゼーションを行った。ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて洗浄、フィコエリスリン染色後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にてスキャンを行い、ＡＧＣＣ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｃｏｍｍａｎｄ Ｃｏｎｓｏｌｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて画像解析し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて数値化した。
（５）数値データファイルを、解析ソフトＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ（アジレント・テクノロジー社製）を用いて解析した。
（１）比較例１及び実施例１で培養した６継代目の細胞集団を、セルスクレーパー（コーニング社製）を用いてプラスチック製培養容器から剥離し、遠心分離により回収した。
（２）得られた細胞ペレットにＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加してＲＮＡを安定保存した後、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出、精製した。
（３）１００ｎｇのトータルＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによりｃＲＮＡに転写してビオチン標識を行った（３’ＩＶＴ ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを使用）。
（４）１０．０μｇの標識ｃＲＮＡをハイブリダイゼーションバッファーに加え、Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＧｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ ２．０ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）上で１６時間のハイブリダイゼーションを行った。ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて洗浄、フィコエリスリン染色後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にてスキャンを行い、ＡＧＣＣ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｃｏｍｍａｎｄ Ｃｏｎｓｏｌｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて画像解析し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて数値化した。
（５）数値データファイルを、解析ソフトＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ（アジレント・テクノロジー社製）を用いて解析した。
各遺伝子の発現レベルを、ＳＤＨＡ遺伝子の発現レベルに対する相対発現量として求めた。結果を下記表に示す。
表１より、比較例１の細胞集団と比べて、実施例１の細胞集団は、ＣＯＬ１１Ａ１遺伝子及びＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が少ないことが分かり、具体的には、実施例１の細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であり、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることが分かった。一方、比較例１の細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下より多く、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５より多いことが分かった。
また、表１より、比較例１の細胞集団と比べて、実施例１の細胞集団は、ＣＯＬ４Ａ５遺伝子の相対発現量が少ないことが分かり、具体的には、実施例１の細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ４Ａ５遺伝子の相対発現量が０．４以下であることが分かった。一方、比較例１の細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ４Ａ５遺伝子の相対発現量が０．４より多いことが分かった。
また、表１より、比較例１の細胞集団と比べて、実施例１の細胞集団は、ＶＣＡＮ遺伝子、ＤＣＮ遺伝子及びＬＵＭ遺伝子の相対発現量が少ないことが分かり、具体的には、実施例１の細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＶＣＡＮ遺伝子の相対発現量が６．０以下であり、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＤＣＮ遺伝子の相対発現量が３．０以下であり、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＬＵＭ遺伝子の相対発現量が６．０以下であることが分かった。一方、比較例１の細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＶＣＡＮ遺伝子の相対発現量が６．０より多く、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＤＣＮ遺伝子の相対発現量が３．０より多く、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＬＵＭ遺伝子の相対発現量が６．０より多いことが分かった。
また、表１より、比較例１の細胞集団と比べて、実施例１の細胞集団は、ＧＰＣ４遺伝子の相対発現量が少ないことが分かり、具体的には、実施例１の細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＧＰＣ４遺伝子の相対発現量が０．５以下であることが分かった。一方、比較例１の細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＧＰＣ４遺伝子の相対発現量が０．５より多いことが分かった。
＜細胞凝集性の評価＞
細胞凝集性を以下の手順（１）〜（６）により評価した。
（１）比較例１及び実施例１で培養した６継代目の細胞集団を、２．０×１０５個／ｍＬとなるように、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（非働化済み）及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にて懸濁し、細胞懸濁液を調製した。
（２）調製した細胞懸濁液を、浮遊培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社／品番：ＭＳ−８００６Ｒ）に４ｍＬずつ播種した。
（３）浮遊培養用６ウェルプレートを、インキュベーター内用シェーカーＯｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒ ＯＳ−７６２（オプティマ社）の上に設置し、３％以上５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境、９０ｒｐｍの条件下にて２４時間旋回培養（浮遊培養）を行った。
（４）旋回培養により得られた細胞懸濁液を顕微鏡にて観察し、細胞凝集塊が形成されていることを確認した。旋回培養により得られた細胞懸濁液を回収し、セルストレーナー（３５μｍナイロンメッシュフィルター）（コーニング社／品番：３５２２３５）にてフィルターろ過し、細胞凝集塊をメッシュ上にトラップした。
（５）フィルターろ過していない細胞懸濁液（すなわち、細胞凝集塊とシングル細胞とを含む）と、フィルターろ過により得られた細胞懸濁液（細胞凝集塊を含まない）とを、トリパンブルーにて染色し、自動セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓ II ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて細胞計数を行った。
（６）以下の式により、細胞凝集率を算出した。
細胞凝集率（％）＝１００−（フィルターろ過により得られた細胞懸濁液１ｍＬあたりの細胞数／フィルターろ過していない細胞懸濁液１ｍＬあたりの全細胞数）
細胞凝集性を以下の手順（１）〜（６）により評価した。
（１）比較例１及び実施例１で培養した６継代目の細胞集団を、２．０×１０５個／ｍＬとなるように、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（非働化済み）及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）にて懸濁し、細胞懸濁液を調製した。
（２）調製した細胞懸濁液を、浮遊培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社／品番：ＭＳ−８００６Ｒ）に４ｍＬずつ播種した。
（３）浮遊培養用６ウェルプレートを、インキュベーター内用シェーカーＯｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒ ＯＳ−７６２（オプティマ社）の上に設置し、３％以上５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境、９０ｒｐｍの条件下にて２４時間旋回培養（浮遊培養）を行った。
（４）旋回培養により得られた細胞懸濁液を顕微鏡にて観察し、細胞凝集塊が形成されていることを確認した。旋回培養により得られた細胞懸濁液を回収し、セルストレーナー（３５μｍナイロンメッシュフィルター）（コーニング社／品番：３５２２３５）にてフィルターろ過し、細胞凝集塊をメッシュ上にトラップした。
（５）フィルターろ過していない細胞懸濁液（すなわち、細胞凝集塊とシングル細胞とを含む）と、フィルターろ過により得られた細胞懸濁液（細胞凝集塊を含まない）とを、トリパンブルーにて染色し、自動セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓ II ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて細胞計数を行った。
（６）以下の式により、細胞凝集率を算出した。
細胞凝集率（％）＝１００−（フィルターろ過により得られた細胞懸濁液１ｍＬあたりの細胞数／フィルターろ過していない細胞懸濁液１ｍＬあたりの全細胞数）
測定結果を下記表に示す。
表２より、比較例１の細胞集団の細胞凝集率は６５．１％、実施例１の細胞集団の細胞凝集率は４７．７％であった。以上より、比較例１の細胞集団と比べて、実施例１の細胞集団は、細胞凝集性が低いことが明らかになった。
よって、以下に示す細胞特性を有する細胞集団は、細胞凝集性が低いことが分かった。
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
さらに、細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ４Ａ５遺伝子の相対発現量が０．４以下であることを満たす場合も、細胞凝集性が低いことが分かった。
さらに、細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＶＣＡＮ遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＤＣＮ遺伝子の相対発現量が３．０以下であること、又はＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＬＵＭ遺伝子の相対発現量が６．０以下であることの何れか一以上を満たす場合も、細胞凝集性が低いことが分かった。
さらに、細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＧＰＣ４遺伝子の相対発現量が０．５以下であることを満たす場合も、細胞凝集性が低いことが分かった。
さらに、細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＶＣＡＮ遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＤＣＮ遺伝子の相対発現量が３．０以下であること、又はＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＬＵＭ遺伝子の相対発現量が６．０以下であることの何れか一以上を満たす場合も、細胞凝集性が低いことが分かった。
さらに、細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＧＰＣ４遺伝子の相対発現量が０．５以下であることを満たす場合も、細胞凝集性が低いことが分かった。
つまり、細胞凝集性の低い細胞集団を取得するための指標として、少なくとも上記の条件（ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であること）を満たすことが有効であり、上記の条件を指標とすることによって、細胞凝集性の低い間葉系幹細胞を含む細胞集団を取得することができることが明らかとなった。これにより、本発明により得られた細胞凝集性の低い間葉系幹細胞を含む細胞集団により細胞製剤を製造すれば、塞栓を引き起こす危険性を低減した安全性の高い細胞製剤を製造することができる。
＜実施例２＞
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦（比較例１及び実施例１とは異なるドナー）から、実施例１と同様に、「工程１：羊膜の採取」、「工程２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収」、「工程３：羊膜ＭＳＣの凍結保存」及び「工程４：羊膜ＭＳＣの培養」を行った。羊膜ＭＳＣの培養においては、継代ごとに細胞集団の一部を採取し、採取したそれぞれの細胞集団について下記（ａ）及び（ｂ）の条件を評価した。前記条件の評価は、上記「ＣＤＨ６発現の解析」及び「遺伝子発現の解析」と同様の手法を使用した。
（ａ）前記細胞集団において、ＣＤＨ６が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上であり、かつ
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＶＣＡＮ遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＤＣＮ遺伝子の相対発現量が３．０以下であること、又はＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＬＵＭ遺伝子の相対発現量が６．０以下であることの何れか一以上を満たす。
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦（比較例１及び実施例１とは異なるドナー）から、実施例１と同様に、「工程１：羊膜の採取」、「工程２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収」、「工程３：羊膜ＭＳＣの凍結保存」及び「工程４：羊膜ＭＳＣの培養」を行った。羊膜ＭＳＣの培養においては、継代ごとに細胞集団の一部を採取し、採取したそれぞれの細胞集団について下記（ａ）及び（ｂ）の条件を評価した。前記条件の評価は、上記「ＣＤＨ６発現の解析」及び「遺伝子発現の解析」と同様の手法を使用した。
（ａ）前記細胞集団において、ＣＤＨ６が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上であり、かつ
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＶＣＡＮ遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＤＣＮ遺伝子の相対発現量が３．０以下であること、又はＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＬＵＭ遺伝子の相対発現量が６．０以下であることの何れか一以上を満たす。
採取した細胞集団には、（ａ）及び（ｂ）の条件を満たす細胞集団と満たさない細胞集団が存在したため、前記２種類の細胞集団について段落０１５３に記載の「細胞凝集性の評価」と同様の手法にて細胞凝集性を評価した。
評価結果を下記表に示す。
表３より、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を満たさない細胞集団の細胞凝集率は６９．０％、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を満たす細胞集団の細胞凝集率は４３．７％であった。上記（ａ）及び（ｂ）の条件を満たさない細胞集団と比べて、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を満たす細胞集団は、細胞凝集性が低いことから、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を指標とすれば、細胞凝集性の低い細胞集団を選択的に取得することができる。
また、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を満たす細胞集団と満たさない細胞集団について、下記（ｃ）及び（ｄ）の条件についても評価を実施した。
（ｃ）間葉系幹細胞を含む細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及び
（ｄ）ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
（ａ）及び（ｂ）の条件を満たす細胞集団については、（ｃ）及び（ｄ）の条件を満たし、一方、（ａ）及び（ｂ）の条件を満たさない細胞集団については、（ｃ）及び（ｄ）の条件を満たさなかった。
また、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を満たす細胞集団と満たさない細胞集団について、下記（ｃ）及び（ｄ）の条件についても評価を実施した。
（ｃ）間葉系幹細胞を含む細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及び
（ｄ）ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
（ａ）及び（ｂ）の条件を満たす細胞集団については、（ｃ）及び（ｄ）の条件を満たし、一方、（ａ）及び（ｂ）の条件を満たさない細胞集団については、（ｃ）及び（ｄ）の条件を満たさなかった。
以上より、培養工程においてＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であるという条件を満たす細胞集団は、上記条件を満たさない細胞集団と比較して細胞凝集性が低いことから、前記条件を指標とすることによって、間葉系幹細胞の細胞凝集性を評価することができる。また、上記条件を指標とすれば、細胞凝集性の低い細胞集団を選択的に取得することができる。さらに、本発明によれば、前記指標を測定することによって（あるいは経時的に測定することによって）、間葉系幹細胞の細胞凝集性の変化を迅速に把握し、予測することができる。これにより、経静脈的に投与するのに有用な細胞製剤を製造することができる。
＜実施例３：医薬組成物の製造＞
上記の実施例１で得られた細胞集団の一部を医薬組成物の調製に供する。羊膜ＭＳＣ４．０×１０８個、ＨＥＳ８００ｍｇ、ＤＭＳＯ０．７ｍＬ及びヒト血清アルブミン８００ｍｇを含有するＲＰＭＩ１６４０培地２０ｍＬからなる医薬組成物（細胞製剤）を調製する。当該医薬組成物を凍結用バッグに封入し、凍結状態で保存する。尚、使用時に医薬組成物を解凍し、患者に供することができる。
上記の実施例１で得られた細胞集団の一部を医薬組成物の調製に供する。羊膜ＭＳＣ４．０×１０８個、ＨＥＳ８００ｍｇ、ＤＭＳＯ０．７ｍＬ及びヒト血清アルブミン８００ｍｇを含有するＲＰＭＩ１６４０培地２０ｍＬからなる医薬組成物（細胞製剤）を調製する。当該医薬組成物を凍結用バッグに封入し、凍結状態で保存する。尚、使用時に医薬組成物を解凍し、患者に供することができる。
＜実施例４＞
（工程１：羊膜の採取及び羊膜ＭＳＣの取得）
比較例１、実施例１及び実施例２とは異なるドナー２名（ドナーＸ、Ｙ）から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した以外は、比較例１、実施例１及び実施例２の工程１と同様の手法にて羊膜を取得した。２名の胎児付属物から得られた羊膜ＭＳＣはそれぞれ＃Ｘ、＃Ｙとする。
上記で得られる＃Ｘ、＃Ｙの羊膜ＭＳＣを含む細胞集団を比較例１、実施例１及び実施例２の工程３と同様の手法にて凍結保存し、下記の方法で培養した。
（工程１：羊膜の採取及び羊膜ＭＳＣの取得）
比較例１、実施例１及び実施例２とは異なるドナー２名（ドナーＸ、Ｙ）から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した以外は、比較例１、実施例１及び実施例２の工程１と同様の手法にて羊膜を取得した。２名の胎児付属物から得られた羊膜ＭＳＣはそれぞれ＃Ｘ、＃Ｙとする。
上記で得られる＃Ｘ、＃Ｙの羊膜ＭＳＣを含む細胞集団を比較例１、実施例１及び実施例２の工程３と同様の手法にて凍結保存し、下記の方法で培養した。
（工程２：羊膜ＭＳＣの培養）
上記で得られた細胞集団を、コーティングしていないプラスチック製培養容器に播種し、１０％のＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。継代培養は、比較例１、実施例１及び実施例２の工程４と同様の手法にて行った。
上記で得られた細胞集団を、コーティングしていないプラスチック製培養容器に播種し、１０％のＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。継代培養は、比較例１、実施例１及び実施例２の工程４と同様の手法にて行った。
（遺伝子発現解析）
上記の「工程２：羊膜ＭＳＣの培養」で得られた６継代目の細胞集団の一部を採取し、マイクロアレイ解析に供して下記の条件を満たすか確認するとともに、残りの細胞集団をマイクロアレイ解析の結果が得られるまで凍結保存した。
間葉系幹細胞を含む細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
上記の「工程２：羊膜ＭＳＣの培養」で得られた６継代目の細胞集団の一部を採取し、マイクロアレイ解析に供して下記の条件を満たすか確認するとともに、残りの細胞集団をマイクロアレイ解析の結果が得られるまで凍結保存した。
間葉系幹細胞を含む細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。
＜遺伝子発現解析＞
６継代目の細胞集団における各遺伝子の解析結果を表４に示す。
６継代目の細胞集団における各遺伝子の解析結果を表４に示す。
表４に示すように、ドナーＸに由来する細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が２．６、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が０．４であった。また、ドナーＹに由来する細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が２．９、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が０．１であった。
よって、ドナーＸ及びＹに由来する細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であり、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であることが分かった。具体的には、本実施例における細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が０．５以下であり、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が３．０以下であることが分かった。
また、表４より、ドナーＸに由来する細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＶＣＡＮ遺伝子の相対発現量が５．５、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＤＣＮ遺伝子の相対発現量が２．０、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＬＵＭ遺伝子の相対発現量が２．４であった。また、ドナーＹに由来する細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＶＣＡＮ遺伝子の相対発現量が４．９、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＤＣＮ遺伝子の相対発現量が２．３、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＬＵＭ遺伝子の相対発現量が３．０であった。
よって、ドナーＸ及びＹに由来する細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＶＣＡＮ遺伝子の相対発現量が６．０以下であり、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＤＣＮ遺伝子の相対発現量が３．０以下であり、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＬＵＭ遺伝子の相対発現量が６．０以下であることが分かった。具体的には、本実施例における細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＶＣＡＮ遺伝子の相対発現量が５．５以下であり、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＤＣＮ遺伝子の相対発現量が２．５以下であり、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＬＵＭ遺伝子の相対発現量が４．０以下であることが分かった。
さらに、表４より、ドナーＸに由来する細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＧＰＣ４遺伝子の相対発現量が０．１であった。また、ドナーＹに由来する細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＧＰＣ４遺伝子の相対発現量が０．２であった。
よって、ドナーＸ及びＹに由来する細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＧＰＣ４遺伝子の相対発現量が０．５以下であることが分かった。具体的には、本実施例における細胞集団は、ＧＰＣ４遺伝子の相対発現量が０．３以下であることが分かった。
以上より、比較例１、実施例１及び実施例２とは異なるドナーから取得した細胞集団においても、上記の細胞特性を有する細胞集団を取得できることが確認された。実施例１及び実施例２において、上記の細胞特性を有する細胞集団は細胞凝集性が低いことが示されていることから、本実施例（実施例４）において得られた細胞集団も細胞凝集性が低いことが推測できる。
Claims (12)
- 間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、以下に示す細胞特性を有する細胞集団を取得することを含む、製造方法：
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。 - 間葉系幹細胞を含む細胞集団であって、以下に示す細胞特性を有する細胞集団：
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１１Ａ１遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ１６Ａ１遺伝子の相対発現量が１．５以下であることを満たす。 - 前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＣＯＬ４Ａ５遺伝子の相対発現量が０．４以下であることを満たす、請求項２に記載の細胞集団。
- 前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＶＣＡＮ遺伝子の相対発現量が６．０以下であること、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＤＣＮ遺伝子の相対発現量が３．０以下であること、又はＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＬＵＭ遺伝子の相対発現量が６．０以下であることの何れか一以上を満たす、請求項２又は３に記載の細胞集団。
- 前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＧＰＣ４遺伝子の相対発現量が０．５以下であることを満たす、請求項２から４の何れか一項に記載の細胞集団。
- 前記細胞集団において、ＣＤＨ６が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が３０％以上である、請求項２から５の何れか一項に記載の細胞集団。
- 前記間葉系幹細胞が、胎児付属物に由来するものである、請求項２から６の何れか一項に記載の細胞集団。
- 請求項２から７の何れか一項に記載の細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物。
- ヒトへの間葉系幹細胞の１回の投与量が１０９個／ｋｇ体重以下である、請求項８に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、液剤である、請求項８又は９に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、注射用液剤である、請求項８から１０の何れか一項に記載の医薬組成物。
- 免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、及び癌から選択される疾患の治療剤である、請求項８から１１の何れか一項に記載の医薬組成物。
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