JPWO2018021200A1 - Ｒｕｎｘ阻害剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＤＮＡ上のＲＵＮＸ結合配列に結合して、ＲＵＮＸファミリーメンバーの該結合配列への結合を阻害するＲＵＮＸ阻害剤、および該ＲＵＮＸ阻害剤を含む抗腫瘍剤、および該ＲＵＮＸ阻害剤を含む抗アレルギー剤を提供する。

Description

本発明は、ＲＵＮＸ阻害剤、およびＲＵＮＸ阻害剤を含む医薬組成物に関する。

ラント関連転写因子（Runt-related transcription factor：以下、「ＲＵＮＸ」と略す）ファミリーは、血液関連遺伝子および造血幹細胞関連遺伝子の発現を制御する重要な転写因子である。ＲＵＮＸファミリーのメンバーには、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、およびＲＵＮＸ３があり、ＲＵＮＸ１は二次造血等、ＲＵＮＸ２は骨の発達等、ＲＵＮＸ３は神経発生、胸腺細胞増殖等に関与することが知られている。ＲＵＮＸファミリーの各メンバーは、コア結合因子βサブユニット（ＣＢＦβ）とヘテロ二量体複合体を形成する。ＲＵＮＸは、ラントドメインを介して、標的遺伝子の転写調節領域中にあるコンセンサス結合配列５’−ＴＧＴＧＧＴ−３’、および非常に稀には５’−ＴＧＣＧＧＴ−３’を認識し、結合することにより、標的遺伝子の発現を制御する。一方、ＣＢＦβは、非ＤＮＡ結合調節サブユニットである。ＣＢＦβは、アロステリックにＲＵＮＸのＤＮＡ結合能を増強する。

ＲＵＮＸ１は、急性骨髄性白血病１タンパク質（ＡＭＬ１）としても知られ、白血病発症における腫瘍抑制因子と考えられている。一方、近年の研究では、ＲＵＮＸ１が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の発症において腫瘍形成特性を有することが示唆され、白血病の治療を目的に、ＲＵＮＸ１とＣＢＦβ間の結合を阻害する低分子化合物の研究が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、今までに、白血病をはじめ種々の癌治療のために、ゲノムＤＮＡ上のＲＵＮＸファミリー結合部位を標的とする試みは報告されていない。

一方、ピロール−イミダゾールポリアミド（以下、「ＰＩポリアミド」と略す）は、合成オリゴマーであり、ヘアピン連結によって対面するピロール（Ｐ）およびイミダゾール（Ｉ）対により、ＤＮＡの副溝内に結合して特定の配列を認識することが知られている。ＰＩポリアミドは、Ｐ／Ｉ対がＣ・Ｇ塩基対を、Ｐ／Ｐ対がＡ・ＴまたはＴ・Ａ塩基対を、Ｉ／Ｐ対がＧ・Ｃ塩基対を認識し、これにより任意の二重鎖ＤＮＡ配列に特異的に結合することができる。したがって、様々な順序のＰ／Ｉ対を設計することにより、所望のゲノム上の標的部位へのＰＩポリアミドのインビボデリバリーが可能になる。

ＰＩポリアミドは、その比較的大きい分子量にもかかわらず、細胞膜透過性であり、細胞の核に局在し、ナノモルレベルで内在性遺伝子発現に影響を及ぼす。標的遺伝子に結合したＰＩポリアミドは、転写因子のＤＮＡへの結合を阻害し、特定の遺伝子発現を制御する遺伝子スイッチとして研究されている。近年の研究では、強力なヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤であるスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）とコンジュゲートしたＰＩポリアミドが合成された（非特許文献２、非特許文献３）。該ＳＡＨＡコンジュゲートＰＩポリアミドは、標的遺伝子の調節領域のアセチル化により、該標的遺伝子の発現を特異的にアップレギュレートすることができる。また、ナイトロジェンマスタード系アルキル化剤であるクロラムブシル（chlorambucil）をＰＩポリアミドにコンジュゲートすることにも成功した（非特許文献４、非特許文献５）。該コンジュゲートは、ゲノム配列に対する結合能を強化しており、標的遺伝子発現の強力なダウンレギュレーションをもたらすことが分かった。また、ヒストンＨ４ｃ遺伝子を標的とするＰＩポリアミドとクロラムブシルのコンジュゲートが結腸癌細胞の増殖を阻害したという報告もある（非特許文献６）。

しかしながら、現在までに、ＲＵＮＸファミリーを標的としたＰＩポリアミドとアルキル化剤等の化合物とのコンジュゲートや、該コンジュゲートを利用した抗腫瘍剤についての報告はない。さらに、特定の癌だけでなく、様々な癌に効果のある抗腫瘍剤は未だ開発されていない。

Cunningham, L et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2012 Sep 4; 109(36), 14592-7 Pandian, G. N. et al., Sci Rep 4, 3843, doi:10.1038/srep03843 (2014) Saha, A. et al., Bioorg Med Chem 21, 4201-4209, doi:10.1016/j.bmc.2013.05.002 (2013) Bando, T. et al., Acc Chem Res 39, 935-944, doi:10.1021/ar030287f (2006) Minoshima, M. et al., Nucleic Acids Symp Ser (Oxf), 69-70, doi:10.1093/nass/nrp035 (2009) Dickinson, A. et al., Chem Biol, Vol. 11, 1583-1594, 2004

従来の、ＲＵＮＸ１とＣＢＦβ間の結合のような蛋白−蛋白結合を阻害する低分子化合物は、核内移行能が低く、効果が弱い。また、従来型の分子標的剤は、蛋白−蛋白結合阻害やキナーゼ活性阻害など、原因蛋白のポケットにはまり込んで作用するため、原因蛋白の変異により耐性が誘導される。したがって、このような欠点を克服する新規な抗腫瘍剤が求められている。そこで、本発明は、腫瘍の原因蛋白の発現を転写レベルで抑制する抗腫瘍剤を開発することを目的とした。

上記のような状況下、本発明者らは、ＲＵＮＸファミリーの活性を阻害することにより、癌、特に白血病の発症に影響をもたらすことを期待して、ＲＵＮＸファミリー阻害剤について研究した。その結果、本発明者らは、ゲノムＤＮＡ上のＲＵＮＸ結合部位を標的とするＲＵＮＸ阻害剤が白血病をはじめ種々の癌に対して効果があることを見出した。本発明者らは、ゲノム上のＲＵＮＸコンセンサス結合部位を標的とするＰＩポリアミドの合成に成功し、該ＰＩポリアミドとアルキル化剤との複合体を用いて、標的遺伝子の発現をダウンレギュレーションできることを見出した。さらに驚くべきことに、該複合体がＡＭＬ細胞だけでなく、種々の器官に由来する腫瘍に対してインビボで抑制効果があることを見出した。

本発明は、限定するものではないが、下記の態様を提供する。
［１］ＤＮＡ上のＲＵＮＸ結合配列に結合して、ＲＵＮＸファミリーメンバーの該結合配列への結合を阻害する、ＲＵＮＸ阻害剤、
［２］ＲＵＮＸ結合配列に結合するＰＩポリアミドを含む、［１］記載のＲＵＮＸ阻害剤、
［３］作用剤およびＰＩポリアミドの複合体を含むＲＵＮＸ阻害剤であって、該ＰＩポリアミドがＲＵＮＸ結合配列に結合する、［２］記載のＲＵＮＸ阻害剤、
［４］作用剤およびＰＩポリアミドの複合体が式Ｉ：

または式ＩＩ：

［式Ｉおよび式ＩＩ中、
Ｘ_１はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_２はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_３はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_４はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_５はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_６はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_７はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_８はＣＨまたはＮを示し、
Ｒ_１はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_２はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_３はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_４はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_５はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_６はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_７はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_８はＨまたはアルキル基を示し、
Ｒ_９はＨまたはＮＨＲ_１１を示し、Ｒ_１０はＨまたはＮＨＲ_１１を示し、
Ｒ_１１はＨ、ビオチン、または蛍光基を示し、
Ｒは作用剤を示し、
Ｙは、アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、またはエーテル結合そのものを示すか、あるいはこれらの結合の１種類以上を形成する官能基を含む部分を示し、ｍは０〜５の整数を示す。］
によって示される化合物からなる群から選ばれる、［３］記載のＲＵＮＸ阻害剤、
［５］作用剤がアルキル化剤である、［３］または［４］記載のＲＵＮＸ阻害剤、
［６］アルキル化剤がクロラムブシル(chlorambucil)、デュオカルマイシン(duocarmycin)、ｓｅｃｏ−ＣＢＩ（１−クロロメチル−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール）、ピロロベンゾジアゼピン、およびナイトロジェンマスタードからなる群から選択される、［５］記載のＲＵＮＸ阻害剤、
［７］アルキル化剤がクロラムブシルである、［６］記載のＲＵＮＸ阻害剤、
［８］クロラムブシルおよびＰＩポリアミドの複合体が式：

によって示される化合物からなる群から選ばれる、［７］記載のＲＵＮＸ阻害剤、
［９］ＲＵＮＸファミリーの全てのメンバーのＲＵＮＸ結合配列への結合を阻害する、［１］〜［８］のいずれかに記載のＲＵＮＸ阻害剤、
［１０］［１］〜［９］のいずれかに記載のＲＵＮＸ阻害剤を含む、医薬組成物、
［１１］抗腫瘍剤である、［１０］記載の医薬組成物、
［１２］抗アレルギー剤である、［１０］記載の医薬組成物、
［１３］他の抗腫瘍剤と組み合わせて使用される、［１１］記載の医薬組成物、
［１４］白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、腎細胞癌、神経芽細胞腫、皮膚癌、乳癌、前立腺癌および脳腫瘍からなる群から選択される１以上を予防または治療するための、［１１］または［１３］記載の医薬組成物、
［１５］［１０］記載の医薬組成物を対象に投与することを特徴とする、癌の予防または治療方法、
［１６］［１０］記載の医薬組成物と他の抗腫瘍剤と組み合わせて投与することを特徴とする、癌の予防または治療方法、
［１７］癌が白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、腎細胞癌、神経芽細胞腫、皮膚癌、乳癌、前立腺癌および脳腫瘍からなる群から選択される、［１５］または［１６］記載の予防または治療方法、
［１８］抗腫瘍剤を製造するための、［１］〜［９］のいずれかに記載のＲＵＮＸ阻害剤の使用、
［１９］抗アレルギー剤を製造するための、［１］〜［９］のいずれかに記載のＲＵＮＸ阻害剤の使用、
［２０］癌の予防または治療に使用するための、［１］〜［９］のいずれかに記載のＲＵＮＸ阻害剤、
［２１］癌が白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、腎細胞癌、神経芽細胞腫、皮膚癌、乳癌、前立腺癌および脳腫瘍からなる群から選択される、［２０］記載のＲＵＮＸ阻害剤、
［２２］ＤＮＡ上のＲＵＮＸ結合配列に対するＲＵＮＸファミリーメンバーの結合を阻害することを含む、癌の予防または治療方法、
［２３］癌が白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、腎細胞癌、神経芽細胞腫、皮膚癌、乳癌、前立腺癌および脳腫瘍からなる群から選択される、［２２］記載の予防または治療方法。

本発明のＲＵＮＸ阻害剤は、ＲＵＮＸファミリーの全てのメンバーのＲＵＮＸ結合配列への結合を阻害して、その活性を阻害することができる。したがって、本発明のＲＵＮＸ阻害剤は、ＲＵＮＸファミリーメンバーが関与するあらゆる疾患および症状に効果を示すことができる。本発明のＲＵＮＸ阻害剤を含む抗腫瘍剤は、白血病をはじめ、様々な種類の癌に対して抗腫瘍効果を有する。本発明の抗腫瘍剤は、他の分子標的治療薬に対して耐性を示す腫瘍に対しても効果を示す。さらに、本発明のＲＵＮＸ阻害剤は、抗アレルギー剤としても使用できる。

実施例で使用したＰＩポリアミド−クロラムブシルコンジュゲートを表す化学式を示す。 各ＰＩポリアミド−クロラムブシルコンジュゲートで処理したヒト骨髄性白血病細胞ＭＶ４−１１におけるＩＬ３、ＣＳＦ２およびＣＳＦ２ＲＢ遺伝子の発現レベルを示す。ＤＭＳＯ処理細胞での各遺伝子の発現量を１として、各ＰＩポリアミド−クロラムブシルコンジュゲート処理細胞で得られた値をＤＭＳＯ処理細胞に対する相対値として示す。図中、データは平均±ＳＥＭ値で示し、「＊」はＰ＜０．０５を示す。 各ＰＩポリアミド−クロラムブシルコンジュゲートで処理したヒト骨髄性白血病細胞ＭＶ４−１１における、ＢＣＬ１１Ａ、ＴＲＩＭ２４、ｐ２１、ＢＡＸ、ＰＵＭＡ、およびＭＤＭ２遺伝子の発現レベルを示す。ＤＭＳＯ処理細胞での各遺伝子の発現量を１として、各ＰＩポリアミド−クロラムブシルコンジュゲート処理細胞で得られた値をＤＭＳＯ処理細胞に対する相対値として示す。図中、「Ｎ．Ｓ．」は、有意差がないことを示す。図中、データは平均±ＳＥＭ値で示し、「＊」はＰ＜０．０５を示す。 各ＰＩポリアミド−クロラムブシルコンジュゲートで処理したヒト骨髄性白血病細胞ＭＶ４−１１における、ＢＣＬ１１Ａ、ＴＲＩＭ２４、ｐ２１、ＢＡＸ、ＰＵＭＡ、ＭＤＭ２、ＰＡＲＰ、ＰＡＲＰの切断型、および切断型カスパーゼ−３タンパク質のイムノブロッティングの結果を示す。 ＡＭＬ細胞（ＭＶ４−１１、ＯＣＩ−ＡＭＬ２、ＯＣＩ−ＡＭＬ３、およびＭＯＬＭ−１３細胞）におけるＣｈｂ−Ｍ’の用量応答曲線を示す。 様々な起源のヒト癌細胞系統に対するＣｈｂ−Ｍ’のＩＣ５０値を示す。図中、「ｐ５３ＷＴ」は野生型ｐ５３を発現する細胞株を示し、「ｐ５３変異（＋）」は変異型ｐ５３を発現するか、またはｐ５３を発現しない細胞株を示す。 様々な起源のヒト癌細胞系統に対するＣｈｂ−５０のＩＣ５０値を示す。図中、「ｐ５３ＷＴ」は野生型ｐ５３を発現する細胞株を示し、「ｐ５３変異（＋）」は変異型ｐ５３を発現するか、またはｐ５３を発現しない細胞株を示す。 ｐ５３機能不全ＡＭＬ細胞におけるＣｈｂ−Ｍ’とＰＲＩＭＡ−１との併用係数プロットを示す。 ＮＯＧマウスにおける種々の濃度のＣｈｂ−Ｍ’の急性毒性試験の結果を示す。全血球計算（ａ）、血液生化学（ｂ）、および体重（ｃ）の結果を示す（ｎ＝５）。データは、平均±ＳＥＭ値である。 ＭＶ４−１１細胞を移植したＮＯＧマウスの、ＤＭＳＯ、Ａｒａ−Ｃ、Ｃｈｂ−Ｓ、Ｃｈｂ−Ｍ’またはＣｈｂ−５０処理後の全生存率を示す（ｎ＝７）。 ＭＶ４−１１細胞を移植したＡＭＬマウス由来の骨髄の顕微鏡画像を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン染色（ＨＥ）および抗−ヒトＣＤ４５抗体での免疫組織化学染色（ｈＣＤ４５）を各スライドで行った。「ＤＭＳＯ」はＤＭＳＯ処理マウス由来の組織染色、「ＡｒａＣ」はシタラビン処理マウス由来の組織染色、「Ｃｈｂ−Ｍ’」はＣｈｂ−Ｍ’処理マウス由来の組織染色を示す。 ＭＶ４−１１細胞を移植したＡＭＬマウス由来の骨髄の顕微鏡画像を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン染色（上段の２段）および抗−ヒトＣＤ４５抗体での免疫組織化学染色（下段の２段）を各スライドで行った。「ＷＴ」は癌細胞を移植していないマウス由来の組織染色、「Ｃｈｂ−Ｓ」はＣｈｂ−Ｓ処理マウス由来の組織染色を示す。 ＳＵ／ＳＲ細胞を移植したＮＯＧマウスの、ＤＭＳＯ、イマチニブ、またはＣｈｂ−Ｍ’処理後の全生存率を示す（ｎ＝５）。 ＳＵ／ＳＲ細胞を移植したＡＬＬマウス由来の骨髄の顕微鏡画像を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン染色（ＨＥ）および抗−ヒトＣＤ４５抗体での免疫組織化学染色（ｈＣＤ４５）を各スライドで行った。「ＤＭＳＯ」はＤＭＳＯ処理マウス由来の組織染色、「イマチニブ」はイマニチブ処理マウス由来の組織染色、「Ｃｈｂ−Ｍ’」はＣｈｂ−Ｍ’処理マウス由来の組織染色を示す。 ＳＵ／ＳＲ細胞を移植したＡＬＬマウス由来の肝臓の顕微鏡画像を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン染色（上の２段）および抗−ヒトＣＤ４５抗体での免疫組織化学染色（下の２段）を各スライドで行った。「ＷＴ」は癌細胞を移植していないマウス由来の組織染色、「ＤＭＳＯ」はＤＭＳＯ処理マウス由来の組織染色、「イマチニブ」はイマニチブ処理マウス由来の組織染色、「Ｃｈｂ−Ｍ’」はＣｈｂ−Ｍ’処理マウス由来の組織染色を示す。 ＳＵ／ＳＲ細胞を移植したＡＬＬマウス由来の脾臓の顕微鏡画像を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン染色（上の２段）および抗−ヒトＣＤ４５抗体での免疫組織化学染色（下の２段）を各スライドで行った。「ＷＴ」は癌細胞を移植していないマウス由来の組織染色、「ＤＭＳＯ」はＤＭＳＯ処理マウス由来の組織染色、「Ｉｍａｔｉｎｉｂ」はイマニチブ処理マウス由来の組織染色、「Ｃｈｂ−Ｍ’」はＣｈｂ−Ｍ’処理マウス由来の組織染色を示す。 Ａ５４９細胞を移植したヒト肺癌異種移植マウスの、ＤＭＳＯ、ゲフィチニブ、またはＣｈｂ−Ｍ’処理後の全生存率を示す（ｎ＝５）。 ＤＭＳＯ、ゲフィチニブ、またはＣｈｂ−Ｍ’処理後の、Ａ５４９細胞を移植したヒト肺癌異種移植マウスの、移植後７日目（薬剤投与前）、１４日目（薬剤２回投与後）、および２１日目（薬剤投与合計４回）の生物発光した生存動物画像を示す。レインボースケールは、相対的な光単位を示す。 ＤＭＳＯ、ゲフィチニブ、またはＣｈｂ−Ｍ’処理後の、Ａ５４９細胞を移植したヒト肺癌異種移植マウスの、移植後２１日目における、生物発光シグナル強度の量を示す（ｎ＝５）。 Ａ５４９細胞を移植した肺癌異種移植マウス由来の肺の顕微鏡画像を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン染色（上の２段）および抗−ヒトＫｉ−６７抗体での免疫組織化学染色（下の２段）を各スライドで行った。「ＷＴ」は癌細胞を移植していないマウス由来の組織染色、「ＤＭＳＯ」はＤＭＳＯ処理マウス由来の組織染色、「ゲフィチニブ」はゲフィチニブ処理マウス由来の組織染色、「Ｃｈｂ−Ｍ’」はＣｈｂ−Ｍ’処理マウス由来の組織染色を示す。 ＭＫＮ４５細胞を移植したヒト胃癌異種移植マウスの、ＤＭＳＯまたはＣｈｂ−Ｍ’処理後の腫瘍体積曲線を示す（ｎ＝８）。図中、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜１０^−４を示す。 ＤＭＳＯまたはＣｈｂ−Ｍ’処理後の、ＭＫＮ４５細胞を移植したヒト胃癌異種移植マウスの、移植後７日目（薬剤投与前）、２１日目（薬剤投与合計４回）、および３５日目（薬剤投与合計８回）の生物発光した生存動物画像を示す。レインボースケールは、相対的な光単位を示す。 ＤＭＳＯまたはＣｈｂ−Ｍ’処理後の、ＭＫＮ４５細胞を移植したヒト胃癌異種移植マウスの、移植後３５日目における、腫瘍の顕微鏡画像を示す。 ＣＢＦβ遺伝子の発現とＲＵＮＸ１＋ＲＵＮＸ２＋ＲＵＮＸ３（Ｐａｎ＿ＲＵＮＸ）遺伝子の発現との相関関係を示す（ｎ＝９）。 ＡＭＬ細胞系統における、ＣＢＦβタンパク質の発現とＲＵＮＸ１＋ＲＵＮＸ２＋ＲＵＮＸ３タンパク質の発現との相関関係を示す（ｎ＝９）。 Ｃｈｂ−Ｍ’で処理したＭＹＬ細胞におけるＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の発現レベルを示す。ＤＭＳＯ（対照）処理細胞での発現量を１とした相対値を示す。 Ｃｈｂ−Ｍ’で処理したＳＵ−Ｐｈ２細胞およびＳＵ／ＳＲ細胞におけるＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の発現レベルを示す。ＤＭＳＯ（対照）処理細胞での発現量を１とした相対値を示す。 Ｃｈｂ−Ｍ’で処理したＭＹＬ細胞におけるＢＣＲ−ＡＢＬヒュージョン蛋白のイムノブロッティングの結果を示す。 Ｃｈｂ−Ｍ’で処理したＳＵ−Ｐｈ２細胞およびＳＵ／ＳＲ細胞におけるＢＣＲ−ＡＢＬヒュージョン蛋白のイムノブロッティングの結果を示す。 Ｃｈｂ−Ｍ’で処理したＭＹＬ細胞におけるＢｃｌ２およびＣ−Ｍｙｃのイムノブロッティングの結果を示す。 Ｃｈｂ−Ｍ’で処理したＭＹＬ細胞における、４８時間後のアポトーシス誘導の結果を示す。 ＭＹＬ細胞における、Ｃｈｂ−Ｍ’の用量応答曲線を示す。 ＳＵ−Ｐｈ２細胞およびＳＵ／ＳＲ細胞における、Ｃｈｂ−５０、Ｃｈｂ−Ｍ’、およびイマチニブの用量応答曲線、およびＩＣ５０値を示す。 種々の濃度のＣｈｂ−Ｍ’で処理したＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞株）における、各種遺伝子の発現レベルを示す。Ｃｈｂ−Ｍ’０μＭ（ＤＭＳＯ）で処理した場合の各種遺伝子の発現量を１とした相対発現度を示す。図中、各濃度において、左から、Ｅ−セレクチン−１、Ｅ−セレクチン−２、Ｐ−セレクチン、Ｔｉｅ２、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、およびＪａｇｇｅｄ−１の結果を示す。 Ｃｈｂ−Ｍ’で処理したＨＵＶＥＣ（上図）およびＲＵＮＸ１遺伝子発現をノックダウンしたＨＵＶＥＣ（下図）におけるＥ−セレクチンの発現量をＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）で解析した結果を示す。 Ｃｈｂ−Ｍ’投与による骨髄内皮細胞におけるＥ−セレクチン発現量の変化を調べるためのイン・ビボ実験スキームの概略図である。 Ｃｈｂ−Ｍ’を投与したマウスの内皮細胞におけるＥ−セレクチンの発現量をＦＡＣＳで解析した結果を示す。 実施例で行ったホーミングアッセイの概略図である。 白血病細胞（ＭＬＬ−ＥＮＬ）を尾静脈より移植したＣｈｂ−Ｍ’処理マウスの骨髄および脾臓における、移植２４時間後の白血病細胞数を示す。 Ｃｈｂ−Ｍ’で処理したＭＫＮ４５胃癌細胞（Ｈｅｒ２阻害剤耐性細胞）における、Ｈｅｒ２、ｐ−ＥＲＫ、ＥＲＫ、ｐ−ＡＫＴ、およびＡＫＴのイムノブロッティングの結果を示す。 Ｃｈｂ−Ｍ’で処理したＭＫＮ４５胃癌細胞における、ＳＯＳ１、ｐ−Ｈｅｒ２（リン酸化型Ｈｅｒ２）、およびＨｅｒ２のイムノブロッティングの結果を示す。 Ｃｈｂ−Ｍ’で処理したＭＫＮ４５胃癌細胞におけるＳＯＳ１遺伝子の発現レベルを示す。ＤＭＳＯ（対照）処理細胞での発現量を１とした相対値を示す。 ＥＧＦＲ野生型ｐ５３野生型肺腺癌細胞（Ａ５４９およびＬＵ９９Ａ）における、Ｃｈｂ−Ｍ’、ゲフィチニブ、およびクロラムブシルの用量応答曲線、およびＩＣ５０値を示す。 ＥＧＦＲ野生型ｐ５３変異型肺腺癌細胞株（ＡＢＣ−１およびＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ）における、Ｃｈｂ−Ｍ’、ゲフィチニブ、クロラムブシル、およびＣｈｂ−Ｓの用量応答曲線、およびＩＣ５０値を示す。 Ｃｈｂ−Ｍ’で処理したＬＵ９９Ａ細胞およびＡ５４９細胞における、Ｍｉｇ６のイムノブロッティングの結果を示す。 Ｃｈｂ−Ｍ’で処理したＬＵ９９Ａ細胞およびＡ５４９細胞における、各種アポトーシス関連因子（ｐ５３、ｐ２１、ＰＵＭＡ、およびＢＡＸ）のイムノブロッティングの結果を示す。図中、「Ｃ−Ｍ」は、Ｃｈｂ−Ｍ’投与群を示す。 Ｃｈｂ−Ｍ’で処理したＬＡＤ２細胞およびＨＭＣ−１．２細胞におけるＫＩＴの表面発現量をＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）で解析した結果を示す。 Ｃｈｂ−Ｍ’で処理したＬＡＤ２細胞およびＨＭＣ−１．２細胞における、ＫＩＴ、ｐＫＩＴ、ＡＫＴ、ｐＡＫＴ、Ｍｉｔｆ、およびＧＡＰＤＨのイムノブロッティングの結果を示す。 ｐ５３変異型大腸癌細胞ＨＴ２９における、Ｃｈｂ−Ｍ’およびクロラムブシル（Ｃｈｂ）の用量応答曲線を示す。 前立腺癌細胞（ＰＣ−３、ＤＵ−１４５、ＬＮＣａＰ）における、Ｃｈｂ−Ｍ’、Ｃｈ−Ｓ、クロラムブシル、およびエンタルザミドの用量応答曲線、およびＩＣ５０値を示す。 Ｃｈｂ−Ｍ’で処理した前立腺癌細胞ＰＣ−３におけるＧＡＴＡ２、Ｅ２Ｆ５、およびＡＲ遺伝子の発現レベルを示す。ＤＭＳＯ（対照）処理細胞での発現量を１とした相対値を示す。 Ｃｈｂ−Ｍ’で処理した前立腺癌細胞における、４８および７２時間後のアポトーシス誘導の結果を示す。 髄芽腫細胞における、Ｃｈｂ−Ｍ’、Ｃｈ−Ｓ、およびクロラムブシルの用量応答曲線、およびＩＣ５０値を示す。 Ｃｈｂ−Ｍ’で処理した髄芽腫細胞ＤＡＯＹにおけるＲＯＲ１およびＲＯＲ２遺伝子の発現レベルを示す。ＤＭＳＯ（対照）処理細胞での発現量を１とした相対値を示す。 Ｃｈｂ−Ｍ’で処理したＤＡＯＹ細胞におけるＲＯＲ１およびＲＯＲ２タンパク質のイムノブロッティングの結果を示す。 ＡＰＬ細胞株（ＮＢ４およびＵＦ１）における、Ｃｈｂ−Ｍ’の用量応答曲線、およびＩＣ５０値を示す。 ＡＰＬ細胞株（ＮＢ４およびＵＦ１）における、ＡＴＲＡの用量応答曲線、およびＩＣ５０値を示す。

１．ＲＵＮＸ阻害剤
本発明のＲＵＮＸ阻害剤は、ＤＮＡ上のＲＵＮＸ結合配列に結合して、ＲＵＮＸファミリーメンバーの該結合配列への結合を阻害し、それにより、ＲＵＮＸファミリーの活性を阻害する。

本発明のＲＵＮＸ阻害剤の例としては、限定するものではないが、ＲＵＮＸ結合配列に結合するように設計・作成された、ＰＩポリアミド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、三重鎖ＤＮＡ、ＴＡＬエフェクター蛋白、架橋化核酸（ＢＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ジンクフィンガー等のＤＮＡ結合化合物を含むものが挙げられる。

本発明のＲＵＮＸ阻害剤は、好ましくは、ＲＵＮＸ結合配列に結合するＰＩポリアミドを含む。ＰＩポリアミドは、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐ）とＮ−メチルイミダゾール単位（Ｉ）と、γ−アミノ酪酸部分とを含むポリアミドであり、ＰとＩとγ−アミノ酪酸部分とは互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結される（Trauger et al, Nature, 382, 559-61(1996); White et al, Chem.Biol., 4,569-78(1997);およびDervan, Bioorg. Med. Chem., 9, 2215-35(2001)）。ＰＩポリアミドは、γ−アミノ酪酸部分がリンカー（γ−リンカー）となって全体が折りたたまれてＵ字型のコンフォメーション（ヘアピン型）をとる。Ｕ字型のコンフォメーションにおいては、リンカーを挟んでＰとＩとを含む２本の鎖が並列に並ぶ。この２本の鎖の間のＰとＩの対が特定の組み合わせ（Ｐ／Ｉ対、Ｉ／Ｐ対またはＰ／Ｐ対）のときに、ＤＮＡ中の特定の塩基対に高い親和性で結合することができる。例えば、Ｐ／Ｉ対はＣ・Ｇ塩基対に結合することができ、Ｉ／Ｐ対はＧ・Ｃ塩基対に結合することができる。また、Ｐ／Ｐ対はＡ・Ｔ塩基対およびＴ・Ａ塩基対の両方に結合することができる（White et al,Chem.Biol.,4,569-78(1997); Dervan: Bioorg. Med. Chem., 9, 2215-35 (2001)）。また、ＰＩポリアミドには、ＰおよびＩの他に、３−ヒドロキシピロール（Ｈｐ）、またはβアラニンが含まれていてもよい。Ｈｐ／Ｐ対は、Ｔ−Ａ塩基対に結合することができる（White at al., Nature, 391, 468-71 (1998)）。βアラニン／βアラニン対は、Ｔ・Ａ塩基対もしくはＡ・Ｔ塩基対に結合することができる。そして、標的のＤＮＡ配列に合わせてＰとＩの対の組み合わせ等を変更することにより、標的遺伝子の調節領域を認識するＰＩポリアミドを設計することができる。

ＰＩポリアミドにおいて、ＰまたはＩの１位の窒素上のメチル基は、水素あるいはメチル基以外のアルキル基で置き換わっていてもよい。また、γ−リンカーは、アミノ基を持つＮ−α−Ｎ−γ−アミノ酪酸およびＮ−β−Ｎ−γ−アミノ酪酸のような側鎖を持っていてもよく、またこれらが蛍光基やビオチン等の分子で修飾されていてもよい。また、ＰＩポリアミドのＮ末端はアセチル基だけでなく、蛍光基やビオチン等の分子で修飾されていてもよい。本願明細書において、蛍光基としては、限定するものではないが、例えば、フルオレセイン、ローダミン系色素、シアニン系色素、ＡＴＴＯ系色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ系色素、ＢＯＤＩＰＹが挙げられる。フルオレセインには、フルオレセイン誘導体（例えば、フルオレセインイソチオシアネート等）も含まれる。

ＰＩポリアミドの設計方法および製造方法は公知である（例えば、特許第３０４５７０６号、特開２００１−１３６９７４号、ＷＯ０３／０００６８３号、特開２０１３−２３４１３５号、特開２０１４−１７３０３２号参照）。例えば、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）を用いた固相合成法（Ｆｍｏｃ固相合成法）による自動合成法によって簡便に製造することができる。

また、ＰＩポリアミドは、ＤＮＡに対する結合能力を維持または向上するように修飾されたＰＩポリアミド修飾物であってもよい。該ＰＩポリアミド修飾物としては、例えば、ＰＩポリアミドのγ−アミノ酪酸のα位またはβ位にアミンを付加した修飾物、Ｎ−α−Ｎ−γ−アミノ酪酸、Ｎ−β−Ｎ−γ−アミノ酪酸の置換された側鎖を有する修飾物、該修飾物を蛍光基やビオチン等の分子で修飾した修飾物、ＰＩポリアミドのＮ末端を蛍光基やビオチン等の分子で修飾した修飾物、およびＰＩポリアミドのＣ末端をイソフタル酸等の分子で修飾した修飾物等が挙げられる。

本発明において使用されるＰＩポリアミドは、ゲノム上のＲＵＮＸ結合部位のコンセンサス配列を認識し、該結合部位に結合するＰＩポリアミドである。該ＲＵＮＸコンセンサス配列は、５’−ＴＧＴＧＧＴ−３’または５’−ＴＧＣＧＧＴ−３’であることが知られている。したがって、該ＲＵＮＸコンセンサス結合配列に基づいて、上記したＰＩポリアミドのＰとＩ、および／またはＨｐもしくはβアラニンの対の組み合わせを決定すればよい。該ＰＩポリアミドは、ゲノム上のＲＵＮＸ結合配列へのＲＵＮＸファミリーの結合を強力に阻害することができる。

本発明のＲＵＮＸ阻害剤は、好ましくは、ＲＵＮＸ結合配列に結合する上記ＤＮＡ結合化合物と、作用剤との複合体を含んでいてもよい。本発明のＲＵＮＸ阻害剤のさらに好ましい例は、ＲＵＮＸ結合配列に結合するＰＩポリアミドと、作用剤との複合体を含んでいる。作用剤とは、ＤＮＡおよびその周囲のクロマチン状態に影響を与える物質であり、例えば、限定するものではないが、アルキル化剤、クロマチン修飾酵素制御剤等が挙げられる。クロマチン修飾酵素制御剤の例としては、限定するものではないが、ヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）制御剤、例えば、ＨＡＴ阻害剤（例えば、Ｃ６４６等）、またはＨＡＴ活性化剤（例えば、Ｎ−（４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−２−エトキシベンズアミド（ＣＴＢ）等）、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）制御剤、例えば、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、スベロイルアニリドヒドロキサム酸等）、またはＨＤＡＣ活性化剤、ヒストンメチル化酵素制御剤、ヒストン脱メチル化酵素制御剤等が挙げられる。本発明のＲＵＮＸ阻害剤のさらに好ましい例は、ＲＵＮＸ結合配列に結合するＰＩポリアミドと、アルキル化剤との複合体を含んでいる。

アルキル化剤とは、ＤＮＡと共有結合を作る官能基を有する化合物である。本発明において使用されるアルキル化剤としては、特に限定されないが、後述する医薬組成物における使用を考慮して、細胞毒性が低いまたは無いものが好ましい。アルキル化剤の例としては、限定するものではないが、クロラムブシル（chlorambucil）、デュオカルマイシン（duocarmycin）、ｓｅｃｏ−ＣＢＩ（１−クロロメチル−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール）、ピロロベンゾジアゼピン、ナイトロジェンマスタード等が挙げられる。

上記作用剤と、上記ＤＮＡ結合化合物とを結合（以下、「コンジュゲート」ともいう）すること等により複合体を合成する。本明細書においては、該複合体を「コンジュゲート」ともいう。合成方法は公知の方法によって行うことができる（例えば、J. Am. Chem. SOC. 1995, 117, 2479-2490参照）。ＤＮＡ結合化合物がＰＩポリアミドである場合、作用剤は、ＰＩポリアミドのＮ末端、Ｃ末端、またはγリンカー部位に結合される。例えば、作用剤は、ＰＩポリアミドのＮ末端またはＣ末端に結合される。ここで、「結合」様式は、直接結合してもよいし、リンカーを介して結合してもよい。リンカーとしては、作用剤の作用を妨げず、かつＲＵＮＸ結合部位の認識を妨げないものであれば特に限定されないが、例えば、アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、またはエーテル結合等そのもの、あるいはこれらの結合の１種類以上を形成する官能基を含む分子を例示することができる。「これらの結合の１種類以上を形成する官能基を含む分子」は、ＰＩポリアミドおよび／または作用剤の末端部分と共に、アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、およびエーテル結合等からなる群から選択される１種類以上の結合を形成する官能基を含む分子である。「これらの結合の１種類以上を形成する官能基を含む分子」はまた、アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、およびエーテル結合等からなる群から選択される１種類以上の結合を１個以上含む分子であってもよい。好ましいリンカーとしては、アミド結合、またはアミド結合を形成する官能基を含む分子が挙げられる。

本発明における作用剤とＰＩポリアミドの複合体の例としては、式Ｉ：

または式ＩＩ：

［式中、
Ｘ_１はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_２はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_３はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_４はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_５はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_６はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_７はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_８はＣＨまたはＮを示し、ここに、Ｘ_１〜Ｘ_８は、ＰＩポリアミドがＲＵＮＸコンセンサス配列を認識可能になる組み合わせで選択される、
Ｒ_１はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_２はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_３はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_４はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_５はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_６はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_７はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_８はＨまたはアルキル基を示し、
Ｒ_９はＨまたはＮＨＲ_１１を示し、Ｒ_１０はＨまたはＮＨＲ_１１を示し、
Ｒ_１１はＨ、またはビオチン、蛍光基等の分子を示し、
Ｒは作用剤を示し、好ましくは、アルキル化剤、さらに好ましくは、クロラムブシル、デュオカルマイシン、ｓｅｃｏ−ＣＢＩ、ピロロベンゾジアゼピン、およびナイトロジェンマスタードからなる群から選択されるアルキル化剤を示し、
Ｙは、リンカー部分を示し、
ｍは０〜５の整数を示し、好ましくは０〜３の整数を示し、より好ましくは０または１を示す。］
によって示される化合物、ならびにその修飾物が挙げられる。

上記式ＩおよびＩＩにおいて、Ｙは、例えば、アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、エーテル結合等を示すか、あるいはこれらの結合の１種類以上を形成する官能基を含む部分を示す。ここで、「これらの結合の１種類以上を形成する官能基を含む部分」とは、ＰＩポリアミドおよび／または作用剤の末端部分と共に、アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、およびエーテル結合等からなる群から選択される１種類以上の結合を形成する官能基を含む部分である。また、「これらの結合の１種類以上を形成する官能基を含む部分」は、アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、およびエーテル結合等からなる群から選択される１種類以上の結合を１個以上含んでいてもよい。

一実施態様において、上記式ＩおよびＩＩにおいて、Ｙは「これらの結合の１種類以上を形成する官能基を含む部分」であり、その一例としては、式ＩＩＩ：

［式中、
Ａは、カルボニル［−Ｃ（＝Ｏ）−］またはイミノ（−ＮＨ−）であり、
Ｂは、エーテル結合（−Ｏ−）またはイミノ（−ＮＨ−）もしくはメチルイミノ［−Ｎ（−ＣＨ_３）−］であり、
ｇおよびｋは各々独立して、１〜３の整数を示し、
ｈおよびｊは各々独立して、０〜５の整数を示し、
ｉは、０〜２の整数を示す］
で示される構造が挙げられる。例えば、ｈおよびｊは各々独立して、０〜３の整数であることが好ましい。また、上記の式ＩＩＩ中、エステル結合の位置と、Ｂで表されるエーテル結合またはイミノ結合の位置は入れ替わっていてもよい。上記式ＩＩＩで示されるリンカー部分において、例えば、右端の位置は作用剤と連結し、左端の位置はＰＩポリアミドと連結するが、該連結位置は逆であってもよい。例えば、上記式ＩＩＩで示されるリンカー部分の左端の位置がＰＩポリアミドのＣ末端と連結する場合、Ａはイミノであることが好ましい。

式ＩＩＩで示されるＹの一例として、式ＩＶ：

で示される構造が挙げられる。

式ＩＩＩで示されるＹの別の例として、式Ｖ：

［式中、ｌは１〜５の整数を示す］
で示される構造が挙げられる。例えば、ｌは１〜３の整数であり、好ましくは、ｌは１である。

式ＩＩＩで示されるＹの別の例として、式ＶＩ：

で示される構造が挙げられる。好ましくは、式ＶＩで表されるリンカー部分は、作用剤がＰＩポリアミドのＣ末端側に結合される場合に用いられる。

上記式ＩＶ〜式ＶＩで示されるリンカー部分において、例えば、右端の位置は作用剤と連結し、左端の位置はＰＩポリアミドと連結するが、該連結位置は逆であってもよい。

本明細書において、アルキル基の例としては、炭素数１〜１０個の直鎖、分枝鎖または環状の飽和または不飽和アルキル基、好ましくは、炭素数１〜５個の直鎖、分枝鎖直鎖、分枝鎖または環状の飽和または不飽和アルキル基が挙げられ、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等が挙げられる。また、アルキル基は置換されていてもよく、例えば、アルキル基中のメチレンは、酸素等で置換されていてもよい。

本発明における作用剤とＰＩポリアミドの複合体の好ましい例としては、下式：

［式中、
Ｒは作用剤を示し、好ましくは、アルキル化剤を示し、さらに好ましくは、クロラムブシル、デュオカルマイシン、ｓｅｃｏ−ＣＢＩ、ピロロベンゾジアゼピン、およびナイトロジェンマスタードからなる群から選択されるアルキル化剤を示し、
ｎは０、１、２、３、４、または５を示し、好ましくは１、２、または３を示し、さらに好ましくはｎは１を示す。］
によって示される化合物、ならびにその修飾物が挙げられる。

本発明におけるアルキル化剤とＰＩポリアミドの複合体の別の好ましい例としては、下式によって示されるクロラムブシルとＰＩポリアミドとの複合体、ならびにその修飾物が挙げられる。

［式中、
Ｘ_１はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_２はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_３はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_４はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_５はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_６はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_７はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_８はＣＨまたはＮを示し、ここに、Ｘ_１〜Ｘ_８は、ＰＩポリアミドがＲＵＮＸコンセンサス配列を認識可能になる組み合わせで選択される、
Ｒ_１はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_２はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_３はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_４はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_５はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_６はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_７はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_８はＨまたはアルキル基を示し、
Ｒ_９はＨまたはＮＨＲ_１１を示し、Ｒ_１０はＨまたはＮＨＲ_１１を示し、
Ｒ_１１はＨ、またはビオチン、蛍光基等の分子を示し、
ｎは、０、１、２、３、４、または５を示し、好ましくは１、２、または３を示し、さらに好ましくはｎは１を示す。］

さらに、本発明における上記複合体の別の好ましい例としては、下式によって示されるクロラムブシルとＰＩポリアミドとの複合体、ならびにその修飾物が挙げられる。

［式中、ｎは、０、１、２、３、４、または５を示し、好ましくは１、２、または３を示し、さらに好ましくはｎは１を示す。］

作用剤とＤＮＡ結合化合物、例えばＰＩポリアミド、との複合体は、薬理学的に許容し得る塩の形態であってもよい。例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩もしくは臭化水素酸塩等の無機酸塩、または酢酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩もしくはトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。

上記複合体は、作用剤、ＤＮＡ結合化合物、および／または作用剤とＤＮＡ結合化合物とを連結するリンカー部分の少なくとも１つ以上の部分または分子が、エナンチオマーもしくはジアステレオマーの形態またはこれらの混合物で存在し得る。上記複合体は、立体異性体の混合物またはそれぞれ純粋なもしくは実質的に純粋な異性体を包含する。上記複合体がジアステレオマーまたはエナンチオマーの形態で得られる場合、これらを当該技術で周知の慣用方法、例えば、クロマトグラフィーまたは分別結晶法等で分離することができる。

また、上記複合体は、作用剤、ＤＮＡ結合化合物、および／または作用剤とＤＮＡ結合化合物とを連結するリンカー部分の少なくとも１つ以上の部分または分子上で、同位元素（例えば、^３Ｈ、^１３Ｃ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^１８Ｆ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ等）等で標識されていてもよく、または重水素変換体であってもよい。

本発明のＲＵＮＸ阻害剤は、使用目的に応じ、上記ＤＮＡ結合化合物、またはＤＮＡ結合化合物と作用剤との複合体そのものであってもよく、あるいは上記化合物または複合体に加えて、担体や添加物を含んでいてもよい。該担体および添加物としては、限定するものではないが、例えば、水、酢酸、有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられる。本発明のＲＵＮＸ阻害剤における上記化合物または複合体の含有量は、使用目的に応じて適宜調節することができる。

本発明のＲＵＮＸ阻害剤は、ゲノム上のＲＵＮＸコンセンサス結合配列を認識し、結合する。該ＲＵＮＸコンセンサス結合配列は、ＲＵＮＸファミリーの各メンバーで共通の結合配列である。したがって、本発明のＲＵＮＸ阻害剤は、ＲＵＮＸファミリーのメンバー全体を阻害する。すなわち、本発明のＲＵＮＸ阻害剤がゲノム上のＲＵＮＸコンセンサス結合配列に結合することにより、ＲＵＮＸファミリーの全てのメンバーのゲノム上のＲＵＮＸ結合配列への結合が阻害され、延いては、ＤＮＡへのＲＵＮＸファミリーの各メンバーの結合によって引き起こされるあらゆる活性が阻害される。ＲＵＮＸファミリーが関与する活性としては様々なものがあり、限定するものではないが、例えば、ｐ５３抑制因子（ＢＣＬ１１、ＴＲＩＭ２４など）を転写制御して活性化させる（すなわち癌では、ＲＵＮＸファミリーにより腫瘍抑制因子ｐ５３が恒常的に抑制されている）、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病（ＰｈＡＬＬ）の原因蛋白であるＢＣＲ−ＡＢＬを転写制御して増強させる、ＭＬＬ−ＡＦ４＋ＦＬＴ３−ＩＴＤ急性骨髄性白血病においてＭＬＬ−ＡＦ４を転写亢進させる、癌遺伝子ｃ−Ｍｙｃを転写制御して増強させる等が挙げられる。

本発明は、さらに、本発明のＲＵＮＸ阻害剤を用いることにより、ＲＵＮＸファミリーの活性を阻害する方法を提供する。本発明のＲＵＮＸファミリー阻害方法は、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、またはＲＵＮＸ３だけでなく、ＲＵＮＸファミリーの全てのメンバーが制御する遺伝子クラスター（標的遺伝子群）を一度に阻害することができる。

本発明のＲＵＮＸ阻害剤の使用量は、使用目的によって適宜調節することができる。

２．医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本発明のＲＵＮＸ阻害剤を含む組成物である。好ましくは、本発明の医薬組成物は、ＰＩポリアミドまたはＰＩポリアミドと作用剤との複合体を含むＲＵＮＸ阻害剤を含む。上記のとおり、本発明のＲＵＮＸ阻害剤は、ゲノム上のＲＵＮＸコンセンサス結合配列を認識し、結合する。ＲＵＮＸコンセンサス配列（ＲＵＮＸファミリー蛋白結合配列）は、様々な遺伝子の調節領域中に存在する。ＲＵＮＸファミリーメンバーは、調節領域中にあるコンセンサス配列に結合することによって、様々な標的遺伝子の発現を制御する。本発明の医薬組成物は、ＲＵＮＸコンセンサス配列に結合することによって、各ＲＵＮＸファミリーメンバーが標的とする様々な遺伝子の発現をダウンレギュレートする。このような標的遺伝子の例としては、限定するものではないが、ＣＢＦ白血病において高発現する遺伝子（例えば、ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＣＳＦ２ＲＢ等）、ＲＵＮＸファミリー自身（ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、ＲＵＮＸ３）、ｐ５３抑制因子（例えば、ＢＣＬ１１、ＴＲＩＭ２４等）、ｃ−ｋｉｔ遺伝子等が挙げられる。

本発明の医薬組成物を生体内に投与することにより、種々の疾患を治療および予防をすることができる。本発明の医薬組成物は、二本鎖ＤＮＡを生体制御に利用するあらゆる生物、特に哺乳動物（例、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に使用することができる。

本発明の医薬組成物の対象疾患は、ＲＵＮＸファミリーメンバーが関与するあらゆる疾患である。本発明の医薬組成物の対象疾患の例としては、癌が挙げられ、例えば、限定するものではないが、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病）、骨髄異形成症候群由来白血病、リンパ腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、腎細胞癌、神経芽細胞腫、乳癌、皮膚癌（例えば、メラノーマ）、卵巣癌、肝芽腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌、肝芽腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、卵巣癌、子宮癌、脳腫瘍等を挙げることができる。下記の実施例において示すように、本発明のＲＵＮＸ阻害剤は、ｐ５３の抑制因子の転写を制御することによりｐ５３経路を活性化するので、本発明の医薬組成物は、理論上全ての癌を抑制、治療、または予防することができる。ｐ５３変異を有する癌については、本願発明の医薬組成物が単独では十分な抗腫瘍効果を発揮しない場合があるが、ｐ５３誘導剤と併用することにより、相乗的な抗腫瘍効果を発揮することができる。このようなｐ５３誘導剤としては、例えば、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクタン−３−オン（ＰＲＩＭＡ−１）、１−［（１−オキソプロポキシ）メチル］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（ＭＩＲＡ−１）、Ｎｕｔｌｉｎ３等が挙げられる。

本発明の医薬組成物は、例えば、抗腫瘍剤、または分化誘導剤として使用することができる。

本発明の医薬組成物の対象疾患の例として、さらに、マスト細胞腫瘍、および肥満細胞症（Mastocytosis）（例えば、マスト細胞増加症、重症アレルギー疾患、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシーショック、重症気管支喘息発作、重症薬剤性皮膚炎など）等のマスト細胞疾患、各種アレルギー、および免疫疾患が挙げられる。マスト細胞は、アレルギーと関係の深いＩｇＥ抗体に対する特異的な受容体ＦｃｅＲＩと、幹細胞因子（ＳＣＦ）というサイトカインの受容体であるｃ−ｋｉｔの両方を細胞表面に発現する細胞として定義される。マスト細胞は、機械的または化学的な刺激を受けたり、異種タンパクなどのアレルギー物質に触れたりすると、脱顆粒により顆粒内容物（ヒスタミン、ヘパリン等）を細胞外へ放出し、アレルギー反応を引き惹起することが知られている。下記の実施例において示すように、本発明のＲＵＮＸ阻害剤は、マスト細胞においてｃ−ｋｉｔ（幹細胞因子受容体チロシンキナーゼ）の発現を抑制するので、本発明の医薬組成物は、マスト細胞の活性化によって引き起こされる全ての症状または疾患を抑制、治療、または予防することができる。

本発明の医薬組成物は、経口投与および非経口投与のいずれの剤形でもよい。これらの剤形は常法にしたがって製剤化することができ、医薬的に許容される担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体および添加物として、水、酢酸、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。

上記添加物は、本発明の医薬組成物の剤型に応じて上記の中から単独でまたは適宜組み合わせから選ばれる。剤形としては、経口投与の場合は、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤、噴霧剤、塗布剤、点眼剤、外用剤等として、または適当な剤型により投与が可能である。非経口投与の場合は、注射剤型等が挙げられる。注射剤型の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、腫瘍内注射等により全身または局部的に投与することができる。

例えば、注射用製剤として使用する場合、本発明の医薬組成物を溶剤（例えば、生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液、０．１％酢酸等）に溶解し、これに適当な添加剤（ヒト血清アルブミン、ＰＥＧ、マンノース修飾デンドリマー、シクロデキストリン結合体等）を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。

本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる。投与量は、例えば成人（６０ｋｇ）の場合、１日当たり０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ、より好ましくは１〜３０ｍｇである。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。投与は、例えば数日間隔に１回、１日当たり、１回または２〜４回に分けてもよい。

本発明の医薬組成物は、他の抗腫瘍剤と併用することができる。他の抗腫瘍剤としては、特定の癌を治療するために使用されるいずれかの抗腫瘍剤、またはｐ５３誘導剤が挙げられる。他の抗腫瘍剤としては、既知のいずれの抗腫瘍剤を使用してもよく、例えば、シタラビン（Cytarabine）、イマチニブ（Imatinib）、ゲフィチニブ（Gefitinib）、ＰＲＩＭＡ−１、ＭＩＲＡ−１、Ｎｕｔｌｉｎ３等が挙げられる。本発明の医薬組成物と他の抗腫瘍剤との投与比率は、特に限定されず、所望の抗腫瘍効果が得られるように当業者が適宜決定すればよい。

発明者らは、今回、ｓｈＲＮＡを用いてＲＵＮＸ１ノックダウンマウスを作成し、ＲＵＮＸ１のみを阻害した場合の他のＲＵＮＸファミリーメンバーの役割について研究した。その結果、ＲＵＮＸ１が阻害された場合、その作用が他のＲＵＮＸファミリーメンバーによって補われることを見出した。したがって、ＲＵＮＸファミリーメンバー全体を阻害できる本発明のＲＵＮＸ阻害剤および医薬組成物は、各ＲＵＮＸメンバーの発現を個々に減弱させた場合より、強い抗腫瘍効果を発揮することができる。

また、本発明は、本発明のＲＵＮＸ阻害剤を含むキットも提供する。該キットは、本発明のＲＵＮＸ阻害剤の他、医薬的に許容される担体や添加物、試薬類、補助剤、専用容器、その他の必要なアクセサリー、説明書等を含み得る。本発明のキットは、例えば、癌治療用キット、研究試薬キットとして使用することができる。

さらに、本発明は、癌マーカーとしてのＣＢＦβの使用を提供する。発明者らは、今回、ＣＢＦβが様々な癌において発現し、ＲＵＮＸファミリーの発現に相関することを見出した（実施例３）。したがって、ＣＢＦβは、様々な癌の検出に使用可能な万能癌マーカーとして使用することができ、対象由来のサンプル中のＣＢＦβを検出することにより、癌の有無を判断することができる。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例で使用された材料および方法を下記する。
材料および方法
細胞系統
ＴＨＰ−１およびＫＧ−１ａのＡＭＬ細胞系統、Ｋ５６２のＣＭＬ細胞系統、Ａ５４９の肺癌細胞系統、およびＴＥ−１、ＴＥ−５およびＴＥ−１１の食道癌細胞系統は、理研バイオリソースセンター（RIKEN biological resource center (BRC), Japan）から購入した。Ｋａｓｕｍｉ−１およびＨＬ６０のＡＭＬ細胞系統、ＬＵ９９Ａ、ＡＢＣ−１、およびＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳの肺癌細胞系統、ＭＫＮ７およびＭＫＮ４５の胃癌細胞系統、Ｃ３２ＴＧおよびＭｅｗｏのメラノーマ細胞系統、Ｃａｋｉ−１の腎癌細胞系統、ＨＣＴ１１６およびＬＯＶＯの直腸癌細胞系統、およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞の胚性腎癌細胞系統は、ＪＣＲＢ（Japanese Collection of Research Bioresources , Japan）より入手した。ＯＣＩ−ＡＭＬ２、ＯＣＩ−ＡＭＬ３およびＭＯＬＭ１３のＡＭＬ細胞系統は、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH , Germany）から購入し、ＭＶ４−１１およびＫＧ−１ａのＡＭＬ細胞系統、ＲＳ４；１１のＡＬＬ細胞系統、ＳＵ−ＤＨＬ−５、ＲａｊｉおよびＤａｕｊｉのリンパ腫細胞系統、ＫＭＳ−１２−ＢＭの骨髄腫細胞系統、ＮＣＩ−Ｈ２２２８の肺癌細胞系統、およびＤＵ４４７５、ＭＣＦ７、ＨＣＣ１９３７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨＴＢ−２７の乳癌細胞系統は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection, USA）から入手した。ＳＵ−Ｐｈ２およびＳＵ／ＳＲ細胞のＡＬＬ細胞系統は、Ａ．Ｋａｎａｍａｒｕ博士（Department of Internal Medicine, Kinki University School of Medicine, Osaka, Japan）から提供された。ＫＯＣＬ−４５のＡＬＬ細胞系統は、Ｋ．Ｓｕｇｉｔａ博士（Department of Pediatrics, Yamanashi University, Yamanashi, Japan）から提供された。ＴＰ５３ Ｒ２４８Ｗ変異を有するＭＶ４−１１ＮＲ細胞のＡＭＬ細胞系統は、Ｔ．Ｉｋｅｚｏｅ博士（Department of Hematology and Respiratory Medicine, Kochi University, Kochi, Japan）から提供された。Ｃａｋｉ−１およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％熱不活性化胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ）を補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ_２下で維持した。他の細胞系統は、１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳを含有するＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial Institute）１６４０培地中、３７℃、５％ＣＯ_２下で培養した。

細胞成長曲線
細胞増殖を評価するために、１×１０^５細胞のＡＭＬ細胞系統を、５ｍＬ培地を含有する６ウェルプレートに移した。テトラサイクリン誘導遺伝子またはｓｈＲＮＡ発現のために、ドキシサイクリン（doxycycline）を３μＭ加えた。一日おきに、トリパンブルーで細胞数をカウントした。

リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Qiagen）で単離し、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｃｒｉｐｔキット（TOYOBO）で逆転写してｃＤＮＡを生成した。リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、７５００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Applied Biosystems）を用いて、製造者の指示書にしたがって実施した。結果は、ＧＡＰＤＨレベルに対して標準化した。相対的発現レベルは、２−ΔΔＣｔ法を用いて算出した。ｑＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーを表１に示す。

イムノブロッティング
細胞を氷冷したリン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）で２回洗浄し、タンパク質溶解バッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭデニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭ β−グリセロホスフェート、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１ｘプロテアーゼ阻害剤（Roche）およびＰｈｏｓＳＴＯＰ（Roche）］中に回収した。全細胞抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜上に転移させた。膜を以下の抗体：抗−Ｃｔｉｐ１抗体（ａｂ１９４８７）（abcam）、抗−ＴＲＩＭ２４抗体（Bethyl Laboratories, Inc）、抗−ＲＵＮＸ１抗体（Ａ−２）、抗−ＧＡＰＤＨ（ＦＬ−３３５）、抗−ｐ２１（Ｃ−１９）、抗−Ｂａｘ（Ｎ−２０）抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）、抗−ＲＵＮＸ２、抗−ＲＵＮＸ３抗−ｐ５３抗体（Cell Signaling Technology）、抗−ＣＢＦβ（FL-182, Santa Cruz Biotechnology, Inc.)、抗−Ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ−３（5A1E, Cell Signaling Technology)、抗−ＰＡＲＰ（46D11, Cell Signaling Technology)でプローブした。二次抗体に、抗−ウサギＩｇＧまたは抗−マウスＩｇＧ ＨＲＰ結合抗体（Cell Signaling Technology）を用いた。Ｃｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉ Ｏｎｅ Ｓｕｐｅｒ（nacalai tesque, Inc.）およびＣｈｅｍｉＤｏｃ^ＴＭ ＸＲＳ＋ Ｉｍａｇｅｒ（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を用いて、製造者の推奨にしたがって、ブロットを検出した。タンパク質レベルは、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を用いて定量した。

遺伝子発現マイクロアレイ分析
全ＲＮＡを単離する前に、ＭＶ４−１１細胞を１μＭのＣｈｂ−Ｍ’、Ｃｈｂ−５０またはＤＭＳＯで６時間処理した。対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈ＿Ｌｕｃ．）またはＲＵＮＸ１（ｓｈ＿Ｒｘ１ ＃１および＃２）、ＲＵＮＸ２（ｓｈ＿Ｒｘ２）およびＲＵＮＸ３（ｓｈ＿Ｒｘ３）を標的とするｓｈＲＮＡ（下記「ｓｉＲＮＡ干渉」参照）が導入されたＭＶ４−１１細胞を、３μＭドキシサイクリンと共に２４時間インキュベートした。次いで、細胞から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ ＭＩＮＩキット（Qiagen, CA, USA）を用いて、製造者の指示書にしたがって行った。ＲＮＡ試料のクオリティは、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Agilent Technologies, USA）を用いて調べた。全ＲＮＡ試料由来のｍＲＮＡをｄｓＤＮＡに増幅した。Ｔ７ポリメラーゼを用いて、シアニン３−標識ｃＲＮＡを生成した。該標識ｃＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットを用いて精製し、濃縮物をＮａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ１０００ ｖ３．５．２（Thermo Scientific）を用いて測定した。ｃＲＮＡ（８２５ｎｇ）を断片化し、次いで、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ ２．１ ＳＴ Ａｒｒａｙ Ｓｔｒｉｐ（Affymetrix, USA）にハイブリダイズした。生データおよび付随する試料情報は、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ ｖ１２．１．０（Agilent Technologies, USA）によって処理した。マイクロアレイデータは、ＮＣＢＩのＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓに寄託し、ＧＥＯ Ｓｅｒｉｅｓアクセッション番号によってアクセス可能である。得られたマイクロアレイデータの解釈は、Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）（Subramanian, A. et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 15545-15550, doi:10.1073/pnas.0506580102 (2005)）によって行う。遺伝子オントロジー強化分析（Gene ontology enrichment analysis）は、ＤＡＶＩＤ（Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery）バイオインフォマティクス・リソース６．７ソフトウェアにより、提供元の指示にしたがって行った（Huang da, W., Sherman, B. T. & Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc 4, 44-57, doi:10.1038/nprot.2008.211 (2009)、およびHuang da, W., Sherman, B. T. & Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res 37, 1-13, doi:10.1093/nar/gkn923 (2009)参照）。

ｓｉＲＮＡ干渉
ヒトＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、およびＲＵＮＸ３を標的とする特異的ｓｈＲＮＡ（テトラサイクリン誘導性ショートヘアピンＲＮＡ）を設計し、ｐＥＮＴＲ４−Ｈ１ｔｅｔＯｘ１、ＣＳ−ＲｆＡ−ＥＴＢｓｄ、ＣＳ−ＲｆＡ−ＥＴＶ、ＣＳ−ＲｆＡ−ＥＴＲベクター（RIKEN BRC）中でクローニングした。対照ｓｈＲＮＡは、ルシフェラーゼを標的とする非機能的構築物（ｓｈ＿Ｌｕｃ．）とした。標的配列を表２に示す。

統計
群間の統計学的有意差は、対応のない両側スチューデントｔ検定で評価した。２集団における等分散性は、Ｆ検定で算出した。差は、０．０５未満のＰ値で統計学的に有意とみなされた。結果は、３つの独立した実験由来の平均±ＳＥＭ値で表した。移植実験において、動物は無作為に、各実験群に割り当て、盲検で処理した。マウスの全生存は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線によって描いた。群間の生存は、ログランク検定で比較した。癌患者の全生存を分析するために、データ抽出および最小Ｐ値の計算にＰｒｏｇｎｏＳｃａｎソフトウェアを利用した（Mizuno, H., Kitada, K., Nakai, K. & Sarai, A., BMC Med Genomics 2, 18, doi:10.1186/1755-8794-2-18 (2009)参照）。ｍＲＮＡまたはタンパク質発現間の相関測定のために、スピアマンの順位相関係数を用いた。

マウス
ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ＲγＫＯ（ＮＯＧ）マウスは、公益財団法人 実験動物研究所（Central Institute for Experimental Animals, Japan）から購入した。全実験において、対照として同腹子を用いた。

実施例１：ＰＩポリアミドおよびコンジュゲートの合成
４つのピロール−イミダゾール対の連続的な結合により、５’−ＴＧＴＧＧＴ−３’および５’−ＴＧＣＧＧＴ−３’のＲＵＮＸコンセンサス結合配列を特異的に認識するＰＩポリアミドを設計し、合成した（図１）。Ｃｈｂ−Ｍ’は、５’−ＴＧＴＧＧＴ−３’を標的とし、Ｃｈｂ−５０は、５’−ＴＧＣＧＧＴ−３’を標的とする。また、対照として、５’−ＷＧＧＣＣＷ−３’配列を標的とするＰＩポリアミド（Ｃｈｂ−Ｓ）を合成した（図１）。ここで、ＷはＡもしくはＴのいずれかである。

一般的記載
試薬および溶媒は、標準的な供給元から入手し、さらに精製することなく使用した。フラッシュカラム精製は、Ｃ１８ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆフラッシュカラムを用いてＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ Ｒｆ（Teledyne Isco, Inc.）によって行った。ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ（Electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry）は、Ｂｉｏ−ＴＯＦ ＩＩ（Bruker Daltonics）マススペクトロメ−ターで、陽イオン化モードを用いて行った。機械によるポリアミド合成は、コンピューター制御されたＰＳＳＭ−８（Shimadzu）システムで行った。プロトン核磁気共鳴（^１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルは、６００ＭＨｚで作動しているＪＥＯＬ ＪＮＭ ＥＣＡ−６００スペクトロメーターで、内部標準として使用されるテトラメチルシランと比べて低磁場側への百万分率（ｐｐｍ）として記録された。下記の略語は、スピン多重度：ｓ（シングレット）、ｄ（ダブレット）、ｔ（トリプレット）、ｑ（カルテット）、ｑｕｉｎｔ（クインテット）、ｍ（マルチプレット）を示す。

Ｃｈｂ−Ｍ’の合成
Ｆｍｏｃ固相合成法による段階的反応によって、オキシム樹脂によって担持されたＰＩポリアミドを調製した。オキシム樹脂を有する生産物に、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（１．０ｍＬ）を加え、４５℃で３時間処理して、切り出しを行った。ろ過により樹脂を除き、残留物を最少量のジクロロメタン中に溶解し、ジエチルエーテルで洗浄して、５９．６ｍｇを得た。この粗化合物（５９．６ｍｇ、４８．１μｍｏｌ）に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３００μＬ）中のクロラムブシル（３２．６ｍｇ、１０７μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）（１０１ｍｇ、１９５μｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１００μＬ、５８１μｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１．５時間インキュベートし、ジエチルエーテルおよびＤＭＦで３回洗浄し、真空乾燥させた。該粗生成物を逆相フラッシュカラムクロマトグラフィー（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液／ＭｅＣＮ）で精製した。凍結乾燥後、生成物を得た（３０．２ｍｇ、１９．８μｍｏｌ）。アルキル化剤クロラムブシルは、ＰＩポリアミドに、より強力かつ不可逆性のＤＮＡ結合能を付与した。

他のコンジュゲートについても、同じ手法で調製した。

Chb-M'
¹H NMR (600 MHz, DMSO (ジメチルスルホキシド)-d6)：δ＝10.43 (s, 1H), 10.30 (s, 1H), 9.92 (s, 1H), 9.90 (s, 1H), 9.894 (s, 1H), 9.890 (s, 1H), 9.83 (s, 1H), 9.44 (s, 1H), 8.30 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 8.15 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 7.86 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.44 (s, 1H), 7.39 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 1.4 Hz, 2H), 7.18 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.073 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.066 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 4.01 (s, 3H), 3.96 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.84 (s, 6H), 3.83 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.67 (m, 8H), 3.32-3.23 (m, 6H), 3.07 (m, 2H), 2.79 (d, J = 4.8 Hz, 6H), 2.52 (m, 2H), 2.40 (apparent t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.28 (apparent t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.04 (apparent t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.82 (m, 4H), 1.70 (m, 2H)
ESI-TOF-MS m/z C₇₁H₉₀Cl₂N₂₄O₁₁ ²⁺ [M + 2H]²⁺ 計算値762.3293, 763.3279, 測定値 762.3277, 763.3244

Chb-50
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d6)：δ＝10.38 (s, 1H), 10.29 (s, 1H), 10.22 (s, 1H), 9.99 (s, 1H), 9.920 (s, 1H), 9.916 (s, 1H), 9.86 (s, 1H), 9.42 (s, 1H), 8.48 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 8.06 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.87 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.545 (s, 1H), 7.538 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.37 (s, 1H), 7.32 (s, 1H), 7.21 (s, 1H), 7.19 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.08 (s, 1H), 6.99 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 6.98 (s, 1H), 6.89 (s, 1H), 6.63 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 4.01 (s, 3H), 3.98 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 3.96 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.68 (m, 8H), 3.30 (apparent quint, J = 6.2 Hz, 4H), 3.21 (apparent q, J = 6.2 Hz, 2H), 3.07 (m, 2H), 2.78 (d, J = 4.8 Hz, 6H), 2.43-2.34 (m, 6H), 2.05 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.86 (quint, J = 7.6 Hz, 2H), 1.80 (quint, J = 7.6 Hz, 2H), 1.71 (quint, J = 7.6 Hz, 2H)
ESI-TOF-MS m/z C₇₀H₈₉Cl₂N₂₅O₁₁ ²⁺ [M + 2H]²⁺ 計算値762.8270, 763.8255, 測定値762.8247, 763.8251

Chb-S
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d6)：δ＝10.34 (s, 2H), 10.33 (s, 1H), 10.32 (s, 1H), 9.93 (s, 2H), 9.33 (s, 1H), 9.31 (s, 1H), 8.15 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.04 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 7.89 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.58 (s, 2H), 7.55 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.26 (s, 2H), 7.17 (s, 4H), 6.97 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 6.95 (s, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.61 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 4.01 (s, 6H), 3.99 (s, 3H), 3.98 (s, 3H), 3.85 (s, 6H), 3.813 (s, 3H), 3.807 (s, 3H), 3.66 (m, 8H), 3.32 (q, J = 6.2 Hz, 2H), 3.23 (m, 4H), 3.06 (m, 2H), 2.79 (d, J = 3.4 Hz, 6H), 2.52 (m, 2H), 2.38 (m, 4H), 2.04 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.82 (m, 4H), 1.70 (m, 2H).
ESI-TOF-MS m/z C₇₀H₈₉Cl₂N₂₅O₁₁ ²⁺ [M + 2H]²⁺ 計算値762.8270, 763.8255, 測定値762.8247, 763.8230

実施例２：ＰＩポリアミドコンジュゲートによるＲＵＮＸファミリーのクラスター制御
（１）ＲＵＮＸ１標的遺伝子の発現阻害
アルキル化剤クロラムブシルにコンジュゲートしたＰＩポリアミド（Ｃｈｂ−Ｍ’およびＣｈｂ−５０）を用いて、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）法により、ｍＲＮＡレベルでのＲＵＮＸ標的遺伝子の発現抑制を確認した。簡単に言うと、ＭＶ４−１１細胞を５μＭのＣｈｂ−Ｍ’またはＣｈｂ−５０で６時間処理した。処理後の細胞から全ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲ（上記「リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）」参照）により、ＲＵＮＸ１の標的遺伝子であるＩＬ３、ＣＳＦ２およびＣＳＦ２ＲＢの発現量を定量した。対照としてＤＭＳＯで処理した細胞を用い、各処理細胞で得られた値を対照細胞の値に対して標準化した（ｎ＝３）。

結果を図２に示す。Ｃｈｂ−Ｍ’およびＣｈｂ−５０は、ＲＵＮＸ１標的遺伝子（ＩＬ３、ＣＳＦ２ＲＢ、およびＣＳＦ２）の発現を効果的に抑制した（図２）。

（２）ＢＣＬ１１ＡおよびＴＲＩＭ２４の発現阻害
ｐ５３の抑制因子として知られているＢＣＬ１１ＡおよびＴＲＩＭ２４（どちらも、直接または間接的にｐ５３を分解することが報告されている）、ならびにｐ５３の下流標的遺伝子ｐ２１、ＢＡＸ、ＰＵＭＡ、およびＭＤＭ２ついて、上記（１）と同様の方法で、ｍＲＮＡレベルでの発現抑制を確認した。但し、１μＭのＣｈｂ−Ｍ’およびＣｈｂ−５０を使用した。結果を図３に示す。

さらに、ウェスタンブロット法（上記「イムノブロッティング」参照）で、ＢＣＬ１１Ａ、ＴＲＩＭ２４、ｐ２１、ＢＡＸ、ＰＵＭＡ、およびＭＤＭ２、ならびにＰＡＲＰ、ＰＡＲＰの切断型および切断型カスパーゼ−３のタンパク質レベルでの発現抑制を確認した。簡単に言うと、ＭＶ４−１１細胞を１μＭのＣｈｂ−Ｍ’またはＣｈｂ−５０で２４時間処理した。処理後の細胞をタンパク質溶解バッファー中で溶解し、全細胞抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜上に転移させた。膜を各種抗体でプローブし、ブロットを検出し、定量した。対照として、ＤＭＳＯで処理した細胞を用いた。結果を図４に示す。

その結果、Ｃｈｂ−Ｍ’およびＣｈｂ−５０での処理により、ｐ５３の抑制因子ＢＣＬ１１ＡおよびＴＲＩＭ２４の遺伝子発現がダウンレギュレートされた（図３）。一方、ｐ５３のｍＲＮＡ発現量には変化がなかったが、ｐ２１（細胞周期チェックポイント遺伝子）およびＰＵＭＡ（アポトーシス因子）のｍＲＮＡ発現量が増加した（図３）。タンパク質レベルでは、Ｃｈｂ−Ｍ’およびＣｈｂ−５０での処理により、ｐ５３タンパク質、およびｐ５３下流タンパク質（ｐ２１、ＢＡＸ）の発現量が増加し、ｐ５３抑制因子（ＢＣＬ１１Ａ、ＴＲＩＭ２４）の発現量が減少した（図４）。このことから、Ｃｈｂ−Ｍ’およびＣｈｂ−５０によるｐ５３タンパク質の発現量の増強は、転写の亢進によるものではなく、ｐ５３タンパク質の安定性亢進によるものであることが分かった。さらに、切断型ＰＡＲＰおよび切断型カスパーゼ−３が出現したことから（図４）、ｐ５３の発現量増強によりアポトーシスが誘導されることが示された。

（３）ＲＵＮＸファミリー制御による遺伝子発現パターンの解析
アルキル化剤クロラムブシルにコンジュゲートしたＰＩポリアミド（Ｃｈｂ−Ｍ’およびＣｈｂ−５０）を用いて、マイクロアレイ分析（上記「遺伝子発現マイクロアレイ分析」参照）にて、ゲノムレベルでの遺伝子発現パターンを確認した。簡単に言うと、ＭＶ４−１１細胞を１μＭのＣｈｂ−Ｍ’またはＣｈｂ−５０で６時間処理し、該細胞においてアップレギュレートされた上位５００個の遺伝子およびダウンレギュレートされた上位５００個の遺伝子を、ＲＵＮＸ遺伝子ファミリーをノックダウンしたＭＶ４−１１細胞での転写産物と比較した。その結果、Ｃｈｂ−Ｍ’またはＣｈｂ−５０で処理した細胞における遺伝子発現パターンは、ＲＵＮＸファミリーの全メンバー（ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、ＲＵＮＸ３）の遺伝子発現をノックダウンした場合に有意に相関していた。

（４）癌細胞増殖阻害アッセイ
機能的ｐ５３発現を有するいくつかのＡＭＬ細胞系統（ＭＶ４−１１、ＯＣＩ−ＡＭＬ２、ＯＣＩ−ＡＭＬ３、およびＭＯＬＭ−１３）に対する、種々の濃度のＰＩポリアミドコンジュゲートによる増殖阻害を試験した。簡単に言うと、細胞を１×１０^５細胞／ｍＬ密度にし、種々の濃度のＰＩポリアミドコンジュゲート（Ｃｈｂ−Ｍ’またはＣｈｂ−５０）を培地に加え、４８時間インキュベートした（ｎ＝３）。ＰＩポリアミドコンジュゲート非添加時（ＤＭＳＯコントロール）の細胞生存数を対照として、細胞生存率を、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ（nacalai tesque, Inc.）およびＩｎｆｉｎｉｔｅ^{（登録商標）}２００ ＰＲＯマルチモードリーダー（TECAN）を用いて、製造者の指示書にしたがって、生存細胞をカウントすることによって評価した。得られた用量応答曲線を図５に示す。その結果、Ｃｈｂ−Ｍ’およびＣｈｂ−５０は、上記ＡＭＬ細胞に対し、ナノモルないし低マイクロモルレベルで大いに有効であった。

（５）種々の癌細胞に対する阻害効果
多様な起源の癌細胞に対するＣｈｂ−Ｍ’およびＣｈｂ−５０の効果を調べた。具体的には、機能的ｐ５３発現を有する以下の癌細胞：ＡＭＬ細胞（ＭＶ４−１１、ＯＣＩ−ＡＭＬ２、ＯＣＩ−ＡＭＬ３、ＭＯＬＭ−１３）、ＡＬＬ細胞（ＳＵ−Ｐｈ２、ＳＵ／ＳＲ、ＲＳ４−１１）、リンパ腫細胞（ＳＵ−ＤＨＬ−５）、骨髄腫細胞（ＫＭＳ−１２−ＢＭ）、肺癌細胞（Ａ５４９、ＬＵ９９Ａ、ＮＣＩ−Ｈ２２２８）、胃癌細胞（ＭＫＮ４５）、食道癌細胞（ＴＥ１）、乳癌細胞（ＨＴＢ−２７、ＤＵ４４７５、ＭＣＦ７）、メラノーマ細胞（Ｃ３２ＴＧ）、腎癌細胞（Ｃａｋｉ−１）、および直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６、ＬＯＶＯ）に対する、Ｃｈｂ−Ｍ’およびＣｈｂ−５０の５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）を求めた。簡単に言うと、細胞を１×１０^５細胞／ｍＬ密度に培養し、種々の濃度のＣｈｂ−Ｍ’またはＣｈｂ−５０を培地に加え、４８時間インキュベートした（ｎ＝３）。細胞生存率を、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ（nacalai tesque, Inc.）およびＩｎｆｉｎｉｔｅ^{（登録商標）}２００ ＰＲＯマルチモードリーダー（TECAN）を用いて、製造者の指示書にしたがって、生存細胞をカウントすることによって評価した。増殖を５０％阻害する用量（ＩＣ_５０）は、median-effect法によって分析した（Chou, T. C. & Talalay, P., Adv Enzyme Regul 22, 27-55 (1984)）。また、変異型ｐ５３を有するか、またはｐ５３を持たない種々の癌細胞（以下、まとめて「ｐ５３変異癌細胞」という）についても同様に試験した。ｐ５３変異癌細胞として、ＡＭＬ細胞（ＭＶ４−１１ＮＲ、ＨＬ６０、ＭＥ１、ＫＧ１ａ、ＴＨＰ１、Ｋａｓｕｍｉ−１、ＮＢ４、Ｋ５６２）、ＡＬＬ細胞（ＫＯＣＬ−４５）、リンパ腫細胞（Ｒａｊｉ、Ｄａｕｊｉ）、肺癌細胞（ＡＢＣ−１）、胃癌細胞（ＭＫＮ７）、メラノーマ細胞（Ｍｅｗｏ）、乳癌細胞（ＨＣＣ１９３７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、および食道癌細胞（ＴＥ５、ＴＥ１１）を使用した。

結果を図６（Ｃｈｂ−Ｍ’について）および図７（Ｃｈｂ−５０について）に示す。図６および図７から明らかなように、これらのＰＩポリアミドコンジュゲートは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、リンパ腫、骨髄腫、肺癌、胃癌、食道癌、乳癌、メラノーマ、腎癌、および直腸癌を包含する多様な起源の癌細胞に対して驚くべき程有効であった。特に、野生型ｐ５３を発現する癌細胞の多くおよびｐ５３変異型細胞の一部において、Ｃｈｂ−Ｍ’またはＣｈｂ−５０を投与すると、５μＭ以下のＩＣ_５０値で増殖が抑制された。Ｃｈｂ−Ｍ’は、一般に、Ｃｈｂ−５０よりも強力であった。これは、おそらく、Ｃｈｂ−Ｍ’はＲＵＮＸの主要な結合配列を標的とするが、Ｃｈｂ−５０は、少数の結合配列を標的とするためであると考えられる。

（５）ｐ５３誘導剤との併用効果
これらのＰＩポリアミドコンジュゲートは、機能的ｐ５３発現を有する癌細胞の場合と比べて、試験したｐ５３変異癌細胞の多くにおいて効力が減少した（図６および図７）。そこで、ｐ５３誘導剤との併用効果を調べた。具体的には、ＭＶ４−１１ＮＲ、ＨＬ６０、ＫＧ１ａ、ＴＨＰ１、およびＫａｓｕｍｉ−１細胞を、種々の濃度のＣｈｂ−Ｍ’またはｐ５３誘導剤ＰＲＩＭＡ−１の単剤存在下、あるいは種々の濃度のＣｈｂ−Ｍ’および５μＭのＰＲＩＭＡ−１の両剤存在下で４８時間培養し（ｎ＝３）、ＩＣ_５０値を求めた。ＫＧ１ａおよびＨＬ６０細胞はｐ５３を持たない細胞（ｐ５３ｎｕｌｌ細胞株）であり、ＭＶ４−１１ＮＲ、Ｋａｓｕｍｉ−１およびＴＨＰ−１は、変異したｐ５３を有する細胞（ｐ５３ｍｕｔ（＋）株）である。各細胞において得られたＩＣ_５０値を表３に示す。

ＫＧ１ａおよびＨＬ６０では、ＰＲＩＭＡ−１の併用によってＣｈｂ−Ｍ’のＩＣ_５０値に変化はなく、併用効果が認められなかった。一方、Ｋａｓｕｍｉ−１、ＴＨＰ−１およびＭＶ４−１１ＮＲでは、ＰＲＩＭＡ−１の併用によってＣｈｂ−Ｍ’の必要量が劇的に減少した。

次に、Ｃｈｂ−Ｍ’およびＰＲＩＭＡ−１の併用効果を定量するために、Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙの併用係数ＣＩ（Combination index）を、ＣＯＭＰＵＳＹＮソフトウェア用いて計算した（Chou, T. C., Pharmacol. Rev. 58, 621-681, doi:10.1124/pr.58.3.10 (2006)参照）。ＣＩ値＜１は、統計学的に有意とみなされ、相乗効果があることを示す。ＣＩ値を抑制細胞率Ｆａ（Fraction affected）に対してプロットした結果を図８に示す。また、Ｆａが０．５の時の各細胞のＣＩ値を表１に示す。

上記の結果から明らかなように、ｐ５３誘導剤ＰＲＩＭＡ−１とＣｈｂ−Ｍ’を併用すると、ｐ５３誘導剤単剤またはＣｈｂ−Ｍ’単剤の場合より癌細胞増殖阻害効果が強く、しかも、相乗的な増殖阻害効果が示された。さらに、ｐ５３誘導剤ＭＩＲＡ−１を用いて同様に試験し、同様の結果が得られた。本願発明のＰＩポリアミドコンジュゲートは、ｐ５３変異癌細胞（ｐ５３に変異がある、またはｐ５３が無い癌細胞）に対して著しく効果が減弱する場合があるが、ｐ５３誘導剤と併用することにより、このようなｐ５３変異癌細胞も抑制することができる。またこの結果より、Ｃｈｂ−Ｍ’が抗腫瘍効果を発現する機序がｐ５３誘導剤とは異なることも示唆される。

（６）インビボでの抗腫瘍効果
１．ＰＩポリアミドコンジュゲートの安全性試験
まず、ＰＩポリアミドコンジュゲートのインビボでの薬理学的安全性をチェックするために、マウスにおけるＣｈｂ−Ｍ’の急性毒性試験を行った。ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ＲγＫＯ（ＮＯＧ）マウスに、種々の濃度のＣｈｂ−Ｍ’を注射し、全血球計算、血液生化学、および体重を測定した（ｎ＝５）。結果を図９に示す。体重１ｋｇあたり１０ｍｇのＣｈｂ−Ｍ’注射でわずかな血小板数の減少がもたらされた（図９（ａ））。この用量は、ＰＩポリアミドコンジュゲートの薬物学的効果を得る量の３０倍以上であり、該分子がインビボで非常に許容可能であることが確証された。

２．異種移植マウスモデルの作成
Ｃｈｂ−Ｍ’およびＣｈｂ−５０のインビボでの抗腫瘍効果を調べるために、ＮＯＧマウスを用いて、ヒト癌細胞系統の異種移植マウスモデルを作成した。白血病マウスモデルの場合、マウス１個体あたり２．５×１０^６細胞のＭＶ４−１１またはＳＵ／ＳＲ細胞を静脈内注射した。末梢血（ＰＢ）を毎週収集し、抗−ヒトＣＤ４５抗体（BD Biosciences）を用いて、キメラ現象をチェックした。７日目に、各処理を開始した。肺癌マウスモデルを作成する場合、マウス１個体あたり１×１０^６細胞のＡ５４９細胞を眼窩後静脈より注射した。該肺癌細胞は、細胞トラフィッキングのために、ｐＬｅｎｔｉ−ルシフェラーゼベクター（addgene）によって生産されたルシフェラーゼ発現レンチウイルスを形質導入した。１５０ｍｇ／ｋｇ体重のＤ−ルシフェリン（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）を腹膜内注射し、腫瘍体積の量をＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（PerkinElmer）で毎週評価した。胃癌異種移植マウスモデルを作成する場合、マウス１個体あたり１×１０^６細胞のＭＫＮ４５細胞を右背部側面に皮下注射した。該胃癌細胞はルシフェラーゼでマーキングされ、腫瘍成長はＩＶＩＳによってモニターされた。

３．ＡＭＬマウスモデルにおける抗腫瘍効果
上記２で作成した異種移植ＡＭＬマウスモデルに、移植後７日目に、３２０μｇ／ｋｇ体重のＣｈｂ−Ｍ’またはＣｈｂ−５０を週２回静脈内注射し、その効力を試験した（ｎ＝７）。対照として、溶媒（ジメチルスルホキシド：ＤＭＳＯ）（３２０μｇ／ｋｇ体重を週に２回静脈内注射）、クロラムブシル（３２０μｇ／ｋｇ体重を週に２回静脈内注射）、Ｃｈｂ−Ｓ（３２０μｇ／ｋｇ体重を週に２回静脈内注射）、およびシタラビン（Ａｒａ−Ｃ）（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）（１００ｍｇ／ｋｇ体重を５日間連続（７日目から１１日目まで）腹腔内注射）処理を用いた。１４日目に、ＡＭＬマウスから骨髄、肝臓、および脾臓組織を採取し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色（以下、「ＨＥ染色」ともいう）および抗−ヒトＣＤ４５抗体での免疫組織化学染色（以下、「ｈＣＤ４５染色」ともいう）を行い、顕微鏡画像を撮影した。ＨＥ染色は造血系組織を染色する。ｈＣＤ４５染色はヒトの造血細胞を茶色に染色し、マウス組織を染色しない。

各処理によるマウスの生存試験の結果を図１０に示す。図１０から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’またはＣｈｂ−５０処理は、該ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）変異陽性予後不良ＡＭＬモデルにおいて、全生存期間を強力に（約２倍以上）延長した。

また、ＭＶ４−１１細胞を移植したマウス由来の骨髄組織のＨＥ染色は、ＤＭＳＯ投与、シタラビン投与、およびＣｈｂ−Ｓ投与ではほとんど変化はなく、均一な白血病細胞が充満していたが（４倍、２０倍率）、Ｃｈｂ−Ｍ’投与では、その均一性がなくなり、正常骨髄像（ＷＴ）に近づいていた（図１１−１および図１１−２）。ｈＣＤ４５染色では、白血病細胞（ヒト細胞なので、ｈＣＤ４５では茶色に染まる）が、ＤＭＳＯ投与、シタラビン投与、およびＣｈｂ−Ｓ投与マウス由来の骨髄組織に充満していた（図１１−１および図１１−２）。一方、Ｃｈｂ−Ｍ’投与では、その茶色が大部分消失しており、染まらない細胞（マウスの骨髄細胞）が大半を占めていた（図１１−１および図１１−２）。したがって、Ｃｈｂ−Ｍ’投与により、ヒト由来ＡＭＬ細胞が消失されることが分かった。

ＭＶ４−１１細胞を移植したマウス由来の肝臓組織のｈＣＤ４５染色では、ＤＭＳＯ投与、シタラビン投与、Ｃｈｂ−Ｓ投与、およびＣｈｂ−Ｍ’投与のいずれの組織も、無移植マウス由来の組織（ＷＴ）と同様に、茶色に染まっていなかった。したがって、ＡＭＬ細胞が肝臓へほとんど浸潤していないことが分かる。脾臓組織でも同様の結果が観察された。

ＭＶ４−１１細胞は、現在使用されている抗癌剤シタラビンに対する耐性を示す。本発明のＰＩポリアミドコンジュゲートは、このような従来の抗癌剤に耐性のある癌にもインビボで有効であった。

４．ＡＬＬマウスモデルにおける抗腫瘍効果
上記２で作成した異種移植ＡＬＬマウスモデルに、３２０μｇ／ｋｇ体重のＣｈｂ−Ｍ’を週２回静脈内注射し、その効力を試験した（ｎ＝５）。対照として、ＤＭＳＯ（３２０μｇ／ｋｇ体重を週に２回静脈内注射）、およびイマチニブ処理を用いた。イマチニブ処理は、１００ｍｇ／ｋｇ体重のイマチニブメシラート（imatinib mesylate）（Focus Biomolecules）を、レシピエントマウスが該疾患で死亡するまで、７日目から１日２回経口投与することにより行った。上記３と同様に、ＡＬＬマウスから骨髄、肝臓、および脾臓組織を採取し、ＨＥ染色およびｈＣＤ４５染色を行い、顕微鏡画像を撮影した。各処理によるマウスの生存試験の結果を図１２に示す。各処理によるＡＬＬマウス由来の各組織の顕微鏡画像を図１３（骨髄）、図１４（肝臓）および図１５（脾臓）に示す。

図１２から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’処理は、フィラデルフィア染色体陽性（Ｐｈ＋）細胞（ＳＵ／ＳＲ細胞）による異種移植ＡＬＬマウスに対しても、全生存期間を強力に（約１．８倍）延長した。

また、異種移植ＡＬＬマウス由来の骨髄組織のＨＥ染色では、ＤＭＳＯ投与とイマチニブ投与ではほとんど変化はなく、均一に白血病細胞が充満していた（４倍、２０倍率）が、Ｃｈｂ−Ｍ’投与では、その均一性がなくなり、正常骨髄像に近づいていた（図１３）。ｈＣＤ４５染色では、白血病細胞（ヒトの細胞なので、ｈＣＤ４５では茶色に染まる）が、ＤＭＳＯ投与とイマチニブ投与では充満していたが、Ｃｈｂ−Ｍ’投与では、その茶色が大部分消失しており、染まらない細胞（マウスの骨髄細胞）が大半を占めていた（図１３）。すなわちＣｈｂ−Ｍ’投与により、ヒト由来ＰｈＡＬＬ細胞が消失傾向にあることが分かる。

異種移植ＡＬＬマウス由来の肝臓組織のｈＣＤ４５染色では、ＤＭＳＯ投与群において組織が茶色に染まっていた（図１４）。このことは、移植したヒト白血病細胞が肝臓に浸潤していることを示す。イマチニブ投与マウス由来の組織もまた、ｈＣＤ４５染色により茶色に染まっていたことから、移植したヒトｐｈＡＬＬ細胞の肝臓への浸潤がイマチニブによって抑制されないことが分かる。一方、Ｃｈｂ−Ｍ’投与マウス由来の組織のｈＣＤ４５染色では、茶色のＰｈＡＬＬ細胞が減少していた。したがって、Ｃｈｂ−Ｍ’投与により、癌細胞の肝臓への浸潤が減少したことが分かった（図１４）。当然ながら、ヒト癌細胞を移植していないマウス（ＷＴ）由来の組織では茶色の染色が観察されなかった。脾臓組織でも同様の結果が観察された（図１５）。

ＳＵ／ＳＲ細胞は、現在使用されているチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ）に対する耐性をデリバリーするＴ３１５Ｉ変異を有する。本発明のＰＩポリアミドコンジュゲートは、このような従来の抗癌剤に耐性のある癌にもインビボで有効であった。

５．肺癌マウスモデルにおける抗腫瘍効果
上記２で作成した異種移植肺癌マウスモデルに、移植後７日目に、Ｃｈｂ−Ｍ’（３２０μｇ／ｋｇ体重、週に２回静脈内注射）、ＤＭＳＯ（３２０μｇ／ｋｇ体重、週に２回静脈内注射）、またはゲフィチニブ（gefitinib）（１００ｍｇ／ｋｇ体重を週に５回経口注入）処理を開始した（ｎ＝５）。移植後７日目から毎週、ルシフェリンを腹腔内注射し、ＩＶＩＳで撮影して肺癌細胞の生着をチェックした。また、移植後１４日目に、肺癌マウスから肺組織を採取し、ＨＥ染色および抗−ヒトＫｉ−６７抗体での免疫組織化学染色を行い、顕微鏡画像を撮影した。結果を図１６〜１９に示す。

図１６から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’処理は、ゲフィチニブ耐性肺腺癌細胞株（Ａ５４９細胞）による異種移植肺癌マウスに対しても、全生存期間を強力に（約２倍）延長した。

また、各処理による肺癌マウスのＩＶＩＳ画像から明らかなように、ヒト肺癌細胞移植後７日目（各薬剤投与前）の段階で、癌細胞の肺への生着が確認された（図１７上段）。ヒト肺癌細胞移植後１４日目（各薬剤を２回投与後）のマウスでは、ＤＭＳＯ投与群およびゲフィチニブ投与群において、肺癌細胞が肺にぎっしり増殖しており、ルシフェラーゼの輝度が増加していた（図１７中段）。一方、移植後１４日目のＣｈｂ−Ｍ’投与マウスでは、ルシフェラーゼの輝度は、移植後７日目よりむしろ減弱していた（図１７中段）。移植後２１日目（薬剤投与合計４回）のマウスでは、ＤＭＳＯ投与群およびゲフィチニブ投与群において、さらに肺癌細胞が増殖しており、ルシフェラーゼの輝度が増加していた（すなわち、腫瘍の肺での総体積が増加している）（図１７下段）。一方、Ｃｈｂ−Ｍ’投与マウスでは、ルシフェラーゼの輝度がさらに減弱していた（図１７下段）。また、移植後２１日目における、ＩＶＩＳ画像での生物発光シグナル強度の定量では、ＤＭＳＯまたはゲフィチニブ投与マウスに比べて、Ｃｈｂ−Ｍ’処理マウスにおいて遙かに小さいことが示された（図１８）。

また、ヒト肺癌移植マウス由来の肺組織のＨＥ染色では、ＤＭＳＯ投与群およびゲフィチニブ投与群は、肺胞が肺癌細胞でぎっしり占められており、肺胞の換気ができない程、肺胞に空気が入っていない（ぎっしり肺癌が詰まっている）状態であった（図１９の上の２段）。Ｃｈｂ−Ｍ’投与群では、そのぎっしり詰まった肺癌細胞が消失傾向にあり、肺胞に含気がある（非移植正常肺胞像（ＷＴ）に近い）状態であった（図１９の上の２段）。

Ａ５４９は、ゲフィチニブおよびエルロチニブ（erlotinib）等の、現在臨床上入手可能な標準的な上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対するチロシンキナーゼ阻害剤に耐性のヒト肺癌細胞系統である。実際、ゲフィチニブは、該肺癌モデルにおいて効果がなかった（図１６〜図１９）。対照的に、Ｃｈｂ−Ｍ’は、肺癌細胞の成長をインビボで抑制し、最終的に、ＤＭＳＯまたはゲフィチニブ投与群と比べて、全生存期間を延長した（図１６）。したがって、Ｃｈｂ−Ｍ’による抗腫瘍効果が大きく、ゲフィチニブ耐性肺癌に奏功していることが示された。

６．胃癌マウスモデルにおける抗腫瘍効果
上記２で作成した異種移植胃癌マウスモデルに、移植後７日目に、Ｃｈｂ−Ｍ’（３２０μｇ／ｋｇ体重、週に２回静脈内注射）または等量のＤＭＳＯの処理を開始した（ｎ＝８）。移植後７日目から３５日目まで週２回、ルシフェリンを腹腔内注射し、ＩＶＩＳで撮影し、腫瘍成長をモニターした。また、移植後３５日目に、胃癌マウスから移植した腫瘍片を取り出し、縦、横、奥行きの長さより胃癌ボリュームを測定した。結果を図２０〜２２に示す。

図２０から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’投与群では、腫瘍成長が抑制され、腫瘍サイズは移植直後からほとんど変化しなかった。このことは、移植後３５日目にマウスから取り出した腫瘍片の大きさからも確認できた（図２２）。また、ＩＶＩＳ撮影画像では、移植後７日目（薬剤投与前）に移植した癌細胞の生着を確認した（図２１上段）。移植後２１日目（薬剤合計４回投与）には、ＤＭＳＯ投与群で胃癌が増大したが、Ｃｈｂ−Ｍ’投与群では縮小していた（図２１中段）。移植後３５日目（薬剤合計８回投与）には、ＤＭＳＯ投与群では、さらに胃癌が増大しており、一方、Ｃｈｂ−Ｍ’投与群では、胃癌は少し増大傾向にはあるが、ＤＭＳＯ投与群と比べるとその増殖は遙かに小さかった（図２１下段）。

ＭＫＮ４５細胞は、Ｈｅｒ２抑制剤（Ｈｅｒ２陽性胃癌に適応症が獲られている薬剤）耐性ヒト胃癌細胞系統である。本願発明のＰＩポリアミドコンジュゲートは、このような従来の抗癌剤に耐性のある癌にもインビボで有効であった。

実施例３：全ＲＵＮＸ量を反映する新規な万能癌マーカーとしてのＣＢＦβ
全ＲＵＮＸファミリーメンバーを癌治療の標的とするために、癌組織およびその対応する正常組織におけるＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、ＲＵＮＸ３およびＣＢＦβの発現をチェックした。以前に報告されたアレイデータセット（Reference database for gene Expression Analysis; RefExA）に基づくと（Ge, X. et al., Genomics 86, 127-141, doi:10.1016/j.ygeno.2005.04.008 (2005)）、ＣＢＦβの発現は、正常組織に比べて癌組織において一貫して高く、各ＲＵＮＸ発現は癌とその正常組織との間で様々であった。しかしながら、興味深いことに、上記「リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）」法により、ＲＵＮＸ１−３の共通領域を検出するプライマーを用いて、ＡＭＬ細胞（ＭＶ４−１１、ＭＯＬＭ−１３、ＯＣＩ−ＡＭＬ２、ＯＣＩ−ＡＭＬ３、ＭＶ４−１１ＮＲ、ＨＬ６０、ＴＨＰ−１、ＫＧ１ａ、Ｋａｓｕｍｉ−１）における全ＲＵＮＸ発現（ＲＵＮＸ１＋ＲＵＮＸ２＋ＲＵＮＸ３）を定量したところ、ＣＢＦβの発現に正に相関した（図２３）。該現象はまた、上記「イムノブロッティング」法により、タンパク質レベルでも観察された（図２４）。したがって、ＣＢＦβ発現が、本発明のＰＩポリアミドコンジュゲートの標的である全てのＲＵＮＸファミリーメンバーの発現の代理マーカーとなり得ることが示された。ＣＢＦβは、実際、種々の癌組織においてｍＲＮＡレベルで最もアップレギュレートされた遺伝子の一つであり、幅広い種類の癌の腫瘍マーカーとして特徴を有する。

次に、種々の起源の癌細胞系統およびその正常組織におけるＣＢＦβのタンパク質発現を調べた。ＡＭＬ細胞（ＭＶ４−１１、ＭＯＬＭ−１３、ＯＣＩ−ＡＭＬ２、ＯＣＩ−ＡＭＬ３、ＭＶ４−１１ＮＲ、ＨＬ６０、ＴＨＰ−１、ＫＧ１ａ、Ｋａｓｕｍｉ−１）、ＡＬＬ細胞（ＳＵ−Ｐｈ２、ＳＵ／ＳＲ、ＲＳ４；１１、ＫＯＣＬ−４５）、肺癌細胞（ＰＣ−３、Ｌｕ９９ａ、Ａ５４９）、乳癌細胞（ＤＵ４４７５、ＭＣＦ−７、ＨＴＢ−２７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＣＣ１９３７）、腎癌細胞（Ａ４９８、７８６Ｏ、Ｃａｋｉ−１）、およびメラノーマ細胞（Ｃ３２ＴＧ、Ｍｅｗｏ）を使用した。ＣＢＦβのイムノブロッティングにより、ＣＢＦβの発現が、タンパク質レベルでも、正常組織よりも癌細胞において一貫して高いことが分かった。さらに、ＡＭＬ、多発性骨髄腫、乳癌、肺癌、直腸癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、およびメラノーマ患者において、ＣＢＦβの発現量が低い患者よりも、ＣＢＦβの発現量が高い患者の全生存率が低いことが分かった。したがって、ＣＢＦβの発現は、ＡＭＬ、多発性骨髄腫、乳癌、肺癌、直腸癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、およびメラノーマを包含する種々の癌にわたる新規な予後マーカーになり得ることが示された。

実施例４：ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病）およびＰｈＡＬＬ（フィラデルフィア染色体陽性急性Ｂ細胞性白血病）に対する阻害効果
ＣＭＬおよびＰｈＡＬＬは、ＢＣＲ−ＡＢＬヒュージョン蛋白が原因となる白血病である。そこで、ＣＭＬおよびＰｈＡＬＬ細胞に対するＣｈｂ−Ｍ’およびＣｈｂ−５０の効果を調べた。ＣＭＬ細胞として、ＢＶ１７３細胞株およびＭＹＬ細胞株（佐賀医大血液呼吸器内科より供与）を用いた。ＢＶ１７３およびＭＹＬはどちらも、野生型ｐ５３及び野生型ｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬを有する細胞株である。ＰｈＡＬＬ細胞として、ＳＵ−Ｐｈ２細胞株およびＳＵ／ＳＲ細胞株を用いた。ＳＵ−Ｐｈ２は、野生型のｐ１９０ＢＣＲ−ＡＢＬを有する細胞株である。ＳＵ／ＳＲは、Ｔ３５１Ｉポイントミューテーションを有する変異型のｐ１９０ＢＣＲ−ＡＢＬを有するチロシンキナーゼ阻害剤耐性株である。

（１）ＢＣＲ−ＡＢＬヒュージョン蛋白の発現阻害
ＢＶ１７３細胞、ＭＹＬ細胞、ＳＵ−Ｐｈ２細胞、およびＳＵ／ＳＲ細胞に３μＭまたは１μＭのＣｈｂ−Ｍ’を投与した。６時間後、細胞から全ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲ（上記「リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）」参照）により、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の発現量を定量した。対照として、ＤＭＳＯを投与した。ＭＹＬ細胞ならびにＳＵ−Ｐｈ２細胞およびＳＵ／ＳＲ細胞の結果を図２５−１および図２５−２に示す。図中、ＤＭＳＯ（対照）投与群でのｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬ ｍＲＮＡ量またはｐ１９０ＢＣＲ−ＡＢＬ ｍＲＮＡ量を１とした場合の相対値を示す。

また、ＢＶ１７３細胞、ＭＹＬ細胞、ＳＵ−Ｐｈ２細胞、およびＳＵ／ＳＲ細胞に３μＭまたは１μＭのＣｈｂ−Ｍ’を投与し、２４時間後にタンパク質を抽出し、ＡＢＬ抗体を用いて、ウェスタンブロット法（上記「イムノブロッティング」参照）で、ＢＣＲ−ＡＢＬヒュージョン蛋白のタンパク質レベルでの発現を確認した。対照として、ＤＭＳＯを投与した。ＭＹＬ細胞ならびにＳＵ−Ｐｈ２細胞およびＳＵ／ＳＲ細胞の結果を図２６−１および図２６−２に示す。

図２５−２から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’で処理されたＳＵ−Ｐｈ２およびＳＵ／ＳＲは共に、ｐ１９０ＢＣＲ−ＡＢＬのｍＲＮＡ量が減少した。図２５−１から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’で処理されたＭＹＬでは、ｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬのｍＲＮＡ量が減少した。同様に、Ｃｈｂ−Ｍ’で処理されたＢＶ１７３でも、ｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬのｍＲＮＡ量が減少した。したがって、Ｃｈｂ−Ｍ’は、ＢＣＲ−ＡＢＬヒュージョン蛋白を転写レベルで抑制した。また、図２６−２から明らかなように、ｐ１９０ＢＣＲ−ＡＢＬヒュージョン蛋白は、ＤＭＳＯ（対照）を投与した細胞と比べて、Ｃｈｂ−Ｍ’投与細胞において消失していた。図２６−１から明らかなように、ｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬヒュージョン蛋白は、ＤＭＳＯ（対照）を投与した細胞と比べて、Ｃｈｂ−Ｍ’投与細胞において消失していた。ＢＶ１７３のＣｈｂ−Ｍ’投与群においても同様に、ＤＭＳＯ（対照）を投与した細胞と比べて、ｐ２１０ＢＣＲ−ＡＢＬヒュージョン蛋白が消失していた。したがって、Ｃｈｂ−Ｍ’は、ＢＣＲ−ＡＢＬヒュージョン蛋白をタンパク質レベルで抑制した。

さらに、ＣｈＩＰ（クロマチン免疫沈降）アッセイにより、ＲＵＮＸ１がＢＣＲのプロモーター領域に結合することを確認した。したがって、Ｃｈｂ−Ｍ’は、ＢＣＲのプロモーター領域に存在するＲＵＮＸコンセンサス配列に結合し、ＢＣＲ−ＡＢＬヒュージョン蛋白を転写レベルで抑制することが分かった。

さらに、Ｃｈｂ−Ｍ’で処理したＭＹＬ細胞において、ウェスタンブロット法（上記「イムノブロッティング」参照）により、Ｂｃｌ２およびＣ−Ｍｙｃのタンパク質レベルでの発現を確認した。Ｂｃｌ２は、ＢＣＲ−ＡＢＬヒュージョン蛋白の最下流のアポトーシス抑制因子である。Ｃ−Ｍｙｃは、癌遺伝子ｃ−Ｍｙｃの発現産物であり、ＣＭＬにおいて、Ｃ−Ｍｙｃが転写誘導されることが知られている。結果を図２６−３に示す。

さらに、１．５μＭまたは３μＭのＣｈｂ−Ｍ’をＭＹＬ細胞に投与し、４８時間後にＰＩ−ＡｎｎｅｘｉｎＶアポトーシス染色にて、アポトーシスのパーセントを調べた。その結果、Ｃｈｂ−Ｍ’の濃度依存的に早期アポトーシス比率が増大した（図２６−４）。

（２）細胞増殖阻害試験
種々の濃度のＣｈｂ−Ｍ’を培地に加え、ＭＹＬ細胞を４８時間インキュベートした。また、種々の濃度の各種薬剤（Ｃｈｂ−５０、Ｃｈｂ−Ｍ’、またはイマチニブ）を培地に加え、ＳＵ−Ｐｈ２細胞およびＳＵ／ＳＲ細胞を４８時間インキュベートした。Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ（nacalai tesque, Inc.）およびＩｎｆｉｎｉｔｅ^{（登録商標）}２００ ＰＲＯマルチモードリーダー（TECAN）を用いて、４８時間の細胞生存率を計測し、ＩＣ５０値（５０％生存率）を計測した（ＳＦ試薬を用いたＭＴＳアッセイ）。結果を図２７−１および図２７−２に示す。

図２７−１および図２７−２から明らかなように、本発明のＰＩポリアミドコンジュゲートによるＣＭＬ細胞およびＰｈＡＬＬ細胞の増殖抑制効果が示された。さらに、図２７−２から明らかなように、Ｃｈｂ５０およびＣｈｂ−Ｍ’は、ＳＵ／Ｐｈ２およびＳＵ／ＳＲの両方で、イマチニブ（チロシンキナーゼ阻害剤）よりＩＣ５０値が低かった。特にＳＵ／ＳＲ細胞株は、イマチニブ耐性株であるため、イマチニブのＩＣ５０値は、１４．７６μＭと高かったが、Ｃｈｂ−５０では１．４２μM、Ｃｈｂ−Ｍ’では０．０４４μMという小さい値を示した。したがって、Ｃｈｂ−５０およびＣｈｂ−Ｍ’は共に、チロシンキナーゼ耐性株を劇的に抑制した。

以上の結果から、本発明のＲＵＮＸ阻害剤が、ＢＣＲ−ＡＢＬヒュージョン蛋白が原因となる白血病に有効であることが確認された。

実施例５：骨髄ニッチに対する効果
骨髄ニッチは、白血病細胞が、潜む（ホーミングする：Homing）ための重要な部位である。骨髄ニッチには、血管内皮と骨芽ニッチの２つが重要である。Ｅ−セレクチン（E-Selectin）は、骨髄の血管内皮ニッチのみに発現する重要因子である。

（１）Ｅ−セレクチンの発現阻害
０μＭ、０．５μＭ、１μＭ、または５μＭの各濃度のＣｈｂ−Ｍ’でＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞株）（ＡＴＣＣカタログナンバー：ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７３０）を６時間処理した。ＨＵＶＥＣは、Ｃｈｂ−Ｍ’によって増殖が阻害されない細胞株である（ＩＣ５０値は５０μＭ以上）。６時間後、細胞から全ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲ（上記「リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）」参照）により、Ｅ−セレクチン遺伝子の発現量を定量した。また、対照として、Ｐ−セレクチン、Ｔｉｅ２、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、およびＪａｇｇｅｄ−１も定量した。結果を図２８に示す。図中、Ｃｈｂ−Ｍ’０μＭ：対照（ＤＭＳＯ）での各種遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを１とした時の相対発現度をグラフとした。Ｅ−セレクチン１とＥ−セレクチン２は、ＲＥ−セレクチン用のＲＴ−ＰＣＲプライマー２種によって定量した。

図２８から明らかなように、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、およびＶＣＡＭ−１が、Ｃｈｂ−Ｍ’により、ｍＲＮＡレベルで著明に抑制された。

（２）Ｅ−セレクチンの発現量のイン・ビトロでの変化
ＨＵＶＥＣを用いて、ＲＵＮＸ阻害剤およびＲＵＮＸノックダウンによる、Ｅ−セレクチンの発現量の変化をＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）で解析した。ＨＵＶＥＣに１μＭのＣｈｂ−Ｍ’を投与し、２４時間後に各種抗体を用いて免疫染色し、ＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）の細胞表面での発現変化を計測した。対照として、ＤＭＳＯを投与した。また、ｓｈ＿ＲＵＮＸ１ ＃２によりＲＵＮＸ１遺伝子発現をノックダウンしたＨＵＶＥＣを、各種抗体を用いて免疫染色し、ＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）の細胞表面での発現変化を計測した。対照として、細胞を、ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｈ＿Ｌｕｃ．）でノックダウンした。抗体として、抗−ヒトＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）抗体（eBioscience製）、および抗−ヒトＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）抗体のアイソタイプ抗体（マウスＩｇＧ１）（eBioscience製）を使用した。

結果を図２９に示す。図２９の上図は、Ｃｈｂ−Ｍ’による結果を示し、下図は、ＲＵＮＸ１ノックダウンによる結果を示す。上図中、「ＤＭＳＯ」は、ＤＭＳＯ処理細胞を抗−ヒトＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）抗体で染色した結果を示し、「Ｃｈｂ−Ｍ’」は、Ｃｈｂ−Ｍ’処理細胞を抗−ヒトＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）抗体で染色した結果を示し、「Ｉｓｏｔｙｐｅ ＤＭＳＯ」または「アイソタイプＤＭＳＯ」は、抗−ヒトＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）抗体のアイソタイプ抗体（マウスＩｇＧ１）で染色した、ＤＭＳＯ処理細胞における陰性対照を示し、「Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｈｂ−Ｍ’」または「アイソタイプＣｈｂ−Ｍ’」は、抗−ヒトＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）抗体のアイソタイプ抗体（マウスＩｇＧ１）で染色した、Ｃｈｂ−Ｍ’処理細胞における陰性対照を示す。また、下図中、「ｓｈ．Ｌｕｃ Ｅ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ」または「ｓｈ．Ｌｕｃ Ｅ−セレクチン」は、対照Ｌｕｃ ｓｈＲＮＡｉ細胞を抗−ヒトＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）抗体で染色した、陰性対照を示し、「ｓｈ．Ｒｘ１＃２ Ｅ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ」または「ｓｈ．Ｒｘ１＃２ Ｅ−セレクチン」は、ｓｈ＿ＲＵＮＸ１処理細胞を抗−ヒトＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）抗体で染色した結果を示し、「ｓｈ．Ｌｕｃ Ｉｓｏｔｙｐｅ」または「ｓｈ．Ｌｕｃアイソタイプ」は、抗−ヒトＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）抗体のアイソタイプ抗体（マウスＩｇＧ１）で染色した、陰性対照を示し、「ｓｈ．Ｒｘ１＃２＿Ｉｓｏｔｙｐｅ」または「ｓｈ．Ｒｘ１＃２＿アイソタイプ」は、抗−ヒトＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）抗体のアイソタイプ抗体（マウスＩｇＧ１）で染色した、陰性対照を示す。

図２９から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’処理およびｓｈ＿ＲＵＮＸ１処理のどちらの結果も、対照に比べてＥ−セレクチンの発現が減少した。さらに、ＣｈＩＰアッセイにより、ＥーセレクチンのＳＥＬＥプロモーターにＲＵＮＸコンセンサス配列が存在することを確認した。したがって、Ｃｈｂ−Ｍ’は、Ｅ−セレクチン遺伝子であるＳＥＬＥプロモーターへのＲＵＮＸ１の結合を阻害することによって、血管ニッチに存在する接着因子であるＥ−セレクチンの発現量を減少させることが分かった。

（３）Ｅ−セレクチンの発現量のイン・ビボでの変化
Ｃｈｂ−Ｍ’投与による骨髄内皮細胞に発現するＥ−セレクチンの発現量の変化をイン・ビボで調べた。正常マウスに、ＤＭＳＯ（対照）またはＣｈｂ−Ｍ’を２週間で６回投与（１回 ３２０μｇ／ｋｇ）し、最終投与の２４時間後（Ｃｈｂ−Ｍ’がマウス体内より消失した状態）に、大腿骨と脛骨を採取し、骨髄造血細胞を除いたうえ、内皮細胞を取り出してＦＡＣＳ解析に付した。ＣＤ４５陰性細胞（骨髄造血細胞が除去された骨髄細胞）をゲーティング（gating）し、ＣＤ３１陽性細胞（血管内皮マーカー陽性）Ｌｉｎ陰性ＣＤ４５陰性ＣＤ３１陽性Ｅ−セレクチン陽性細胞（Ｅ−セレクチンが陽性の骨髄血管内皮細胞）の比率をＦＡＣＳで計測した。実験スキームの概略を図３０に示す。結果を図３１に示す。

図３１から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’投与群において、内皮細胞でのＥ−セレクチン発現量が有意に減少した。すなわち、Ｃｈｂ−Ｍ’は、骨髄血管内皮細胞におけるＥ−セレクチン発現を生体内で抑制した。

（４）ホーミングアッセイ
白血病幹細胞がある特定の離れた場所に移動することをホーミング効果という。本実験では、静脈注射により移植した白血病幹細胞が骨髄へと移動し、微小環境に生着する個数を測定した。

ＭＬＬ−ＥＮＬ白血病ヒュージョン遺伝子を、レトロウイルスベクターを用いてマウス骨髄（Ｂ６）に感染させて、継代を繰り返すことにより不死化させたマウス白血病細胞（ＧＦＰで標識したＭＬＬ−ＥＮＬ白血病細胞）を作成した。正常Ｂ６マウスに、ＤＭＳＯ（対照）またはＣｈｂ−Ｍ’を２週間で６回投与（１回 ３２０μｇ／ｋｇ）し、最終投与の２４時間後（Ｃｈｂ−Ｍ’が生体内より完全に消失した状態：ポリアミドの半減期は約５時間）、放射線照射し、１×１０^７個のＭＬＬ−ＥＮＬ白血病細胞を尾静脈より注入した。２４時間後に、右大腿骨および左大腿骨から骨髄細胞、および脾臓を回収し、ＦＡＣＳにより、骨髄および脾臓に存在するＭＬＬ−ＥＮＬ細胞数を計測した。実験スキームの概略を図３２に示す。結果を図３３に示す。

図３３から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’処理群では、骨髄でのＭＬＬ−ＥＮＬ細胞数が対照群に比べて少なかった。すなわち、Ｅ−セレクチンが減少すると、白血病幹細胞（ＭＬＬ−ＥＮＬ−ＧＦＰ）が骨髄に生着しにくくなることが分かった。一方、Ｃｈｂ−Ｍ’処理群では、脾臓において白血病細胞数が増加しており、その結果、骨髄に白血病細胞が存在しにくくなることが分かった。

以上の結果から、本発明のＲＵＮＸ阻害剤は、白血病細胞のみではなく、白血病細胞が結合する微小環境（ニッチ）側にも効果があることが分かった。したがって、本発明のＲＵＮＸ阻害剤は、抗癌剤の効果を増強し、骨髄ニッチでの微小残存病変の駆逐に有効であることが示唆される。

実施例６：Ｈｅｒ２陽性胃癌に対する効果
Ｈｅｒ２陽性胃癌では、ＲＴＫ（Receptor Tyrosine Kinase）であるＨｅｒ２により、ＰＩ３−ＡＫＴシグナルおよびＭＡＰＫ−ＥＲＫシグナルが増強し、細胞増殖が亢進している。Ｈｅｒ２は、細胞膜下のＧＲＢ２−ＳＯＳ１アダプター蛋白で制御されており、該アダプター蛋白が増強、活性化することにより、Ｈｅｒ２がリン酸化され、活性化が維持される。

ＭＫＮ４５胃癌細胞株（Ｈｅｒ２阻害剤耐性細胞株）に、１μＭのＣｈｂ−Ｍ’を投与し、４８時間後、Ｈｅｒ２、ｐ−ＥＲＫ、ＥＲＫ、ｐ−ＡＫＴ、およびＡＫＴのタンパク質発現をウェスタンブロット法（上記「イムノブロッティング」参照）にて評価した。対照としてＤＭＳＯを投与した。結果を図３４に示す。

また、ＭＫＮ４５胃癌細胞株に、０．１μＭ、１μＭ、または１０μＭのＣｈｂ−Ｍ’を投与し、４８時間後、ＳＯＳ１、ｐ−Ｈｅｒ２（リン酸化型Ｈｅｒ２）、およびＨｅｒ２のタンパク質発現をウェスタンブロット法（上記「イムノブロッティング」参照）にて評価した。対照としてＤＭＳＯを投与した。結果を図３５に示す。

また、ＭＫＮ４５胃癌細胞株に、１μＭのＣｈｂ−Ｍ’を投与し、６時間後、ｑＲＴ−ＰＣＲ（上記「リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）」参照）により、ＳＯＳ１のｍＲＮＡ量をＲＴ−ＰＣＲ法で評価した。対照としてＤＭＳＯを投与した。結果を図３６に示す。図中、ＤＭＳＯ処理群でのＳＯＳ１のｍＲＮＡ発現量を１とした場合の相対値を示す。

図３４から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’によりＨｅｒ２蛋白発現が抑制されたが、ＥＲＫ蛋白およびＡＫＴ蛋白の総量に変化はなかった。一方、ＥＲＫ蛋白およびＡＫＴ蛋白の各リン酸化型は、Ｃｈｂ−Ｍ’により抑制され、ｐ−ＥＲＫ（リン酸化ＥＲＫ）およびｐ−ＡＫＴ（リン酸化ＡＫＴ）はシグナルが減弱していた。また、図３５および図３６から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’は、ＳＯＳ１の発現およびＨｅｒ２のリン酸化を減少させた。したがって、Ｃｈｂ−Ｍ’は、ＲＵＮＸ１を抑制することによりＨｅｒ２蛋白発現を抑制し、さらに、ＳＯＳ１アダプター蛋白の発現を抑制することにより、Ｈｅｒ２のリン酸化も抑制することが分かった。

実施例７：ＥＧＦＲ野生型肺腺癌［ＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）抵抗性肺癌細胞株］に対する効果
（１）ＥＧＦＲ野生型ｐ５３野生型肺腺癌細胞株に対する効果
種々の濃度の各種薬剤（Ｃｈｂ−Ｍ’、ゲフィチニブ、またはクロラムブシル）を培地に加え、ＥＧＦＲ野生型ｐ５３野生型肺腺癌細胞株（Ａ５４９およびＬＵ９９Ａ）を４８時間インキュベートした。Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ（nacalai tesque, Inc.）およびＩｎｆｉｎｉｔｅ^{（登録商標）}２００ ＰＲＯマルチモードリーダー（TECAN）を用いて、４８時間の細胞生存率を計測し、ＩＣ５０値（５０％生存率）を計測した（ＳＦ試薬を用いたＭＴＳアッセイ）。結果を図３７に示す。

図３７から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’は、Ａ５４９細胞株およびＬＵ９９Ａ細胞株の両方で、ＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）よりＩＣ５０値が低かった。したがって、本発明のＲＵＮＸ阻害剤は、ＥＧＦＲ野生型の非小細胞肺癌に有効であることが示された。

（２）ＥＧＦＲ野生型ｐ５３変異型肺腺癌細胞株に対する効果
種々の濃度の各種薬剤（Ｃｈｂ−Ｍ’、ゲフィチニブ、クロラムブシル、またはＣｈｂ−Ｓ）を培地に加え、ＥＧＦＲ野生型ｐ５３変異型肺腺癌細胞株（ＡＢＣ−１およびＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ）を４８時間インキュベートした。Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ（nacalai tesque, Inc.）およびＩｎｆｉｎｉｔｅ^{（登録商標）}２００ ＰＲＯマルチモードリーダー（TECAN）を用いて、４８時間の細胞生存率を計測し、ＩＣ５０値（５０％生存率）を計測した（ＳＦ試薬を用いたＭＴＳアッセイ）。結果を図３８に示す。

図３８から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’は、ＡＢＣ−１細胞株およびＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ細胞株の両方で、ＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブ）よりＩＣ５０値が低かった。しかし、ｐ５３野生型肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞およびＬＵ９９Ａ細胞に対する効果（図３７）と比べて、抗腫瘍活性はやや減弱した。

（３）ＥＧＦＲシグナルに対する効果
ＬＵ９９Ａ細胞およびＡ５４９細胞に、１μＭのＣｈｂ−Ｍ’を投与し、２４時間後、ウェスタンブロット法（上記「イムノブロッティング」参照）により、Ｍｉｇ６のタンパク質発現を評価した。対照としてＤＭＳＯを投与した。結果を図３９に示す。

図３９から明らかなように、ＬＵ９９Ａ細胞およびＡ５４９細胞の両方において、Ｃｈｂ−Ｍ’により、Ｍｉｇ６の発現量が増強した。Ｍｉｇ６は、ＥＧＦＲシグナルを負に制御する因子として知られている。したがって、本発明のＲＵＮＸ阻害剤は、Ｍｉｇ６の増強を介して、ＥＧＦＲ野生型肺腺癌を阻害すると考えられる。

（４）アポトーシス誘導効果
Ａ５４９細胞およびＬＵ９９Ａ細胞に、１μＭのＣｈｂ−Ｍ’を投与し、２４時間後、ウェスタンブロット法（上記「イムノブロッティング」参照）により、アポトーシス関連因子（ｐ５３、ｐ２１、ＰＵＭＡ、およびＢＡＸ）の発現量を評価した。対照として、ＤＭＳＯを投与した。結果を図４０に示す。図中、「Ｃ−Ｍ」は、Ｃｈｂ−Ｍ’投与群を示す。

図４０から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’により、ｐ５３およびｐ２１が増強し、ＰＵＭＡ、ＢＡＸなどアポトーシス因子が増強した。したがって、本発明のＲＵＮＸ阻害剤は、肺癌細胞においてアポトーシスを誘導することが示された。

実施例８：ヒトマスト細胞に対する効果
マスト細胞は、受容体を介して活性化することにより、アレルギー反応等の症状または疾患を引き起こす。さらに、ｃ−ｋｉｔシグナル伝達は、刺激されたマスト細胞からの化学メディエーターの放出を増強する。そこで、ヒトマスト細胞に対するＲＵＮＸ阻害剤の効果を調べた。ヒトマスト細胞として、ＬＡＤ２細胞株（野生型ｃ−ｋｉｔを発現している）およびＨＭＣ−１．２細胞株（変異型ｃ−ｋｉｔを発現している）を用いた。なお、ＨＭＣ−１．２細胞株は、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ変異およびＶ５６０Ｇ変異を有する。野生型ｃ−ｋｉｔはＳＣＦの受容体であり、ＳＣＦ依存的な細胞増殖であるため、ＬＡＤ２細胞株には、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを投与して以下の実験を行った。ＨＭＣ−１．２細胞株はｃ−ｋｉｔに変異を有し、ＳＣＦ非依存的な細胞増殖であるため、ＨＭＣ−１．２細胞株にはＳＣＦを投与せずに以下の実験を行った。ＲＵＮＸ阻害剤として、Ｃｈｂ−Ｍ’を用いた。ＬＡＤ２細胞株は、Kirshenbaum AS博士およびMetcalfe DD博士（ともに、Laboratory of Allergic Diseases, NIAID, NIH）から分与された。ＨＭＣ−１．２細胞株は、Nilsson G博士（Department of Genetics and Pathology, Uppsala University）が樹立したものを、Metcalfe DD博士（Laboratory of Allergic Diseases, NIAID, NIH）から分与された。

（１）ＫＩＴ細胞表面発現に対する効果
ＬＡＤ２細胞株に、１０μＭのＣｈｂ−Ｍ’を投与し、３時間後および１８時間後に各種抗体を用いて細胞表面に表出するｃ−ｋｉｔを免疫染色し、発現量をＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）によって計測した。ＨＭＣ−１．２細胞株に、１０μＭのＣｈｂ−Ｍ’を投与し、１８時間後に各種抗体を用いて細胞表面に表出するｃ−ｋｉｔを免疫染色し、発現量をＦＡＣＳによって計測した。対照として、Ｃｈｂ−Ｍ’の代わりにＤＭＳＯを投与して同様の実験を行った。抗体として、抗−ヒトＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）抗体（クローン１０４Ｄ２，BioLegend製）、およびマウスＩｇＧ１，κアイソタイプＣｔｒｌ（ＦＣ）抗体（クローンＭＯＰＣ−２１，BioLegend製）を使用した。

結果を図４１に示す。図中、「ＤＭＳＯ」は、ＤＭＳＯ処理細胞を抗−ヒトｃ−ｋｉｔ抗体で染色した結果を示し、「Ｃｈｂ−Ｍ’」は、Ｃｈｂ−Ｍ’処理細胞を抗−ヒトｃ−ｋｉｔ抗体で染色した結果を示し、「アイソタイプ対照，ＤＭＳＯ」は、抗−ヒトｃ−ｋｉｔ抗体のアイソタイプ抗体で染色した、ＤＭＳＯ処理細胞における陰性対照を示し、「アイソタイプ対照，Ｃｈｂ−Ｍ’」は、抗−ｃ−ｋｉｔ抗体のアイソタイプ抗体で染色した、Ｃｈｂ−Ｍ’処理細胞における陰性対照を示す。「ＭＦＩ」は、平均蛍光強度を示す。

図４１から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’処理は、１８時間処理後、ＬＡＤ２細胞株（野生型ｃ−ｋｉｔ）およびＨＭＣ−１．２細胞株（変異型ｃ−ｋｉｔ）の両方において、ｃ−ｋｉｔの表面発現量を減少させた。すなわち、ＬＡＤ２細胞株において、ＤＭＳＯ１８時間処理後のＭＦＩが６８．３であったのに対し、Ｃｈｂ−Ｍ’１８時間処理後のＭＦＩは４８．８であった。また、ＨＭＣ−１．２細胞株において、ＤＭＳＯ１８時間処理後のＭＦＩが１１３であったのに対し、Ｃｈｂ−Ｍ’１８時間処理後のＭＦＩは１００であった。これらの実験により、Ｃｈｂ−Ｍ’がマスト細胞におけるｃ−ｋｉｔ（野生型ｃ−ｋｉｔおよび変異型ｃ−ｋｉｔの両方）の細胞表面発現を抑制することが判明した。

（２）ＫＩＴ総量に対する効果
ＬＡＤ２細胞株およびＨＭＣ−１．２細胞株に１０μＭのＣｈｂ−Ｍ’を投与し、１８時間培養した後、該細胞から抽出液を得、ｃ−ｋｉｔ、リン酸化ｃ−ｋｉｔ、ＡＫＴ、リン酸化ＡＫＴ、Ｍｉｔｆ、およびＧＡＰＤＨのタンパク質発現量について、各種抗体を用いてウェスタンブロット解析を行った（上記「イムノブロッティング」参照）。ＡＫＴは、ｃ−ｋｉｔ下流の重要なシグナル蛋白である。Ｍｉｔｆは、ｃ−ｋｉｔの代表的な転写ドライバーである。対照としてＤＭＳＯを投与した。結果を図４２に示す。図中、「ＫＩＴ」はｃ−ｋｉｔを示し、「ｐＫＩＴ」はリン酸化ｃ−ｋｉｔを示し、「ｐＡＫＴ」はリン酸化ＡＫＴを示す。なお、一次抗体として、抗−ｃ−Ｋｉｔ抗体（Ａｂ８１，Cell Signaling Technology製)、抗−ホスホｃ−Ｋｉｔ（Ｔｙｒ７１９）抗体（Cell Signaling Technology製）、抗−Ａｋｔ抗体（Cell Signaling Technology製）、抗−ホスホ−Ａｋｔ抗体（Ｓｅｒ４７３）（Cell Signaling Technology製）、抗−Ｍｉｔｆ抗体（Cosmo Bio製）、抗−ＧＡＰＤＨ抗体（０４１１，Santa Cruz Biotechnology, Inc.製）を用いた。二次抗体として、ＥＣＬ^ＴＭ抗−マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合whole抗体（GE Healthcare製）、ＥＣＬ^ＴＭ抗−ウサギＩｇＧ結合whole抗体（GE Healthcare製）を用いた。

図４２から明らかなように、ＬＡＤ２細胞株では、Ｃｈｂ−Ｍ’により、ｃ−ｋｉｔ蛋白発現が抑制され、ｃ−ｋｉｔの活性型であるリン酸化ｃ−ｋｉｔ蛋白も抑制された。Ｃｈｂ−Ｍ’により、ＡＫＴの総量に大きな変化はなかったが、リン酸化ＡＫＴの蛋白量は減弱していた。Ｍｉｔｆの蛋白発現レベルには、Ｃｈｂ−Ｍ’による影響はなかった。

ＨＭＣ−１．２細胞株では、Ｃｈｂ−Ｍ’により、ｃ−ｋｉｔおよびリン酸化ｃ−ｋｉｔの発現量が抑制された。一般的に、変異型ｃ−ｋｉｔは、細胞膜ではなく、エンドリソソーム（endolysosomes）に輸送され、Ａｋｔを活性化することが報告されている。ＨＭＣ−１．２細胞株については、上記（１）に示したＦＡＣＳの結果を踏まえると、細胞質内のｃ−ｋｉｔが優位に減少していると考えられた。実際、図４２に示されるように、Ｃｈｂ−Ｍ’処理されたＨＭＣ−１．２細胞株はｃ−ｋｉｔの総量を明らかに減少させたので、ＨＭＣ−１．２細胞株では、Ｃｈｂ−Ｍ’により細胞内のｃ−ｋｉｔが抑制されたことが分かった。さらに、ｐＡＫＴについてはわずかであるが、蛋白の減弱が観察された。

以上から、Ｃｈｂ−Ｍ’は、野生型ｃ−ｋｉｔについては、ｃ−ｋｉｔ総量を著明に減少させ、その下流シグナルを抑制することが分かった。一方、変異型ｃ−ｋｉｔについては、Ｃｈｂ−Ｍ’は、細胞表面より細胞質内のｃ−ｋｉｔ蛋白を有意に抑制することが確認された。これらの実験より、Ｃｈｂ−Ｍ’がマスト細胞におけるｃ−ｋｉｔ（野生型ｃ−ｋｉｔおよび変異型ｃ−ｋｉｔの両方）の総量を減少させることが判明した。

さらに、ＣｈＩＰアッセイにより、ＲＵＮＸ１がマスト細胞（ＨＭＣ−１．２細胞株）においてｃ−ｋｉｔのイントロン１に結合することを確認した。したがって、Ｃｈｂ−Ｍ’は、マスト細胞における細胞増殖に必須のｃ−ｋｉｔ蛋白を転写レベルで抑制することが分かった。故に、Ｃｈｂ−Ｍ’は、マスト細胞におけるアレルギー反応を制御可能と考えられる。さらに、Ｃｈｂ−Ｍ’は、変異型ｃ−ｋｉｔを有するマスト細胞（ＨＭＣ−１．２細胞株）のｃ−ｋｉｔ発現を減少させ、細胞増殖抑制をもたらした。

以上の結果から、ＲＵＮＸ１がｃ−ｋｉｔ発現を調節すること、およびヒトマスト細胞疾患における新規な治療ターゲットとなり得ることが示唆された。

実施例９：大腸癌に対する効果
種々の濃度の各種薬剤（Ｃｈｂ−Ｍ’、またはクロラムブシル）を培地に加え、ｐ５３変異型大腸癌細胞株ＨＴ２９（ＪＣＲＢ細胞バンクより購入）を７２時間インキュベートした。Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ（nacalai tesque, Inc.）およびＩｎｆｉｎｉｔｅ^{（登録商標）}２００ ＰＲＯマルチモードリーダー（TECAN）を用いて、７２時間の細胞生存率を計測し（図４３）、ＩＣ５０値（５０％生存率）を計測した（ＳＦ試薬を用いたＭＴＳアッセイ）（表５）。図４３から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’は、ＨＴ２９細胞の増殖を抑制した。

実施例１０：前立腺癌に対する効果
（１）細胞増殖阻害試験
種々の濃度の各種薬剤（Ｃｈｂ−Ｍ’、Ｃｈｂ−Ｓ、クロラムブシル、またはエンタルザミド（Entaluzamide））を培地に加え、前立腺癌細胞株ＰＣ−３（ｐ５３ｎｕｌｌ／ＰＴＥＮ ｄｅｌ／アンドロゲン非依存性）（ＡＴＣＣより購入）、ＤＵ−１４５（アンドロゲン非依存性）（ＪＣＲＢ細胞バンクより購入）、およびＬＮＣａＰ（アンドロゲン依存性）（ＡＴＣＣより購入）を４８時間インキュベートした。Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ（nacalai tesque, Inc.）およびＩｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００ ＰＲＯマルチモードリーダー（TECAN）を用いて、４８時間の細胞生存率を計測し、ＩＣ５０値（５０％生存率）を計測した（ＳＦ試薬を用いたＭＴＳアッセイ）。結果を図４４および表６に示す。

図４４から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’は、アンドロゲン依存性および非依存性の両方の前立腺癌細胞株の増殖を劇的に抑制した。また、Ｃｈｂ−Ｍ’は他の試薬と比べて遙かに小さいＩＣ５０値（ＰＣ−３において０．６２μＭ、ＤＵ−１４５において１．８２μＭ、またはＬＮＣａＰにおいて０．６８μＭ）を示した。

（２）前立腺癌関連因子の発現阻害
前立腺癌細胞株ＰＣ−３に、５μＭのＣｈｂ−Ｍ’を投与し、６時間後、ｑＲＴ−ＰＣＲ（上記「リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）」参照）により、前立腺癌細胞増殖に重要な遺伝子であるＧＡＴＡ２、Ｅ２Ｆ５、およびＡＲ（アンドロゲン受容体）のｍＲＮＡ量を評価した。対照としてＤＭＳＯを投与した。結果を図４５に示す。図中、ＤＭＳＯ処理群でのＧＡＴＡ２、Ｅ２Ｆ５、およびＡＲのｍＲＮＡ発現量を１とした場合の相対値を示す。図４５から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’により、ＧＡＴＡ２、Ｅ２Ｆ５、およびＡＲの発現が転写レベルで抑制された。

（３）アポトーシス誘導効果
ＰＣ−３細胞に、３μＭのＣｈｂ−Ｍ’を投与し、４８時間後および７２時間後に、ＰＩ−ＡｎｎｅｘｉｎＶアポトーシス染色にて、アポトーシスのパーセントを調べた。対照として、ＤＭＳＯを投与した。その結果、Ｃｈｂ−Ｍ’の濃度依存的にアポトーシスの比率が増大した（図４６）。

実施例１１：脳腫瘍に対する効果
（１）細胞増殖試験
種々の濃度の各種薬剤（Ｃｈｂ−Ｍ’、Ｃｈｂ−Ｓ、またはクロラムブシル）を培地に加え、髄芽腫細胞株ＤＡＯＹ（ＳＨＨ，ＴＰ５３変異型）を４８時間インキュベートした。Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ（nacalai tesque, Inc.）およびＩｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００ ＰＲＯマルチモードリーダー（TECAN）を用いて、４８時間の細胞生存率を計測し、ＩＣ５０値（５０％生存率）を計測した（ＳＦ試薬を用いたＭＴＳアッセイ）。結果を図４７および表７に示す。図４７から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’は、髄芽腫細胞株の増殖を劇的に抑制した。また、Ｃｈｂ−Ｍ’は他の試薬と比べて遙かに小さいＩＣ５０値（０．８１２μＭ）を示した。

（２）髄芽腫関連因子の発現阻害
髄芽腫細胞株ＤＡＯＹに、１μＭのＣｈｂ−Ｍ’を投与し、６時間後、ｑＲＴ−ＰＣＲ（上記「リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）」参照）により、髄芽腫瘍に重要な癌促進因子ＲＯＲ１およびＲＯＲ２のｍＲＮＡ量を評価した。対照としてＤＭＳＯを投与した。結果を図４８に示す。図中、ＤＭＳＯ処理群でのＲＯＲ１およびＲＯＲ２のｍＲＮＡ発現量を１とした場合の相対値を示す。図４８から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’により、ＲＯＲファミリーの発現が転写レベルで抑制された。

ＤＡＯＹ細胞に１μＭのＣｈｂ−Ｍ’を投与し、２４時間後にタンパク質を抽出し、抗−ＲＯＲ１抗体および抗−ＲＯＲ２抗体を用いて、ウェスタンブロット法（上記「イムノブロッティング」参照）で、ＲＯＲ１およびＲＯＲ２のタンパク質レベルでの発現を確認した。対照として、ＤＭＳＯを投与した。結果を図４９に示す。図４９から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’は、ＲＯＲ２の発現をタンパク質レベルで抑制した。ＲＯＲ１の発現は極めて弱いため、検出できなかった。

実施例１２：骨髄前骨髄球性白血病（ＡＰＬ：ａｃｕｔｅ ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）に対する効果
Ｃｈｂ−Ｍ’、またはＡＴＲＡ（ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸：ビタミンＡ誘導体）を培地に加え、ｐ５３変異型ＡＰＬ細胞株 ＮＢ４（ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）より購入）またはｐ５３−ｎｕｌｌ ＡＰＬ細胞株 ＵＦ１（慶応大学医学部血液・腫瘍内科より供与）を４８時間または７２時間インキュベートした。Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ（nacalai tesque, Inc.）およびＩｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００ ＰＲＯマルチモードリーダー（TECAN）を用いて、細胞生存率を計測し、ＩＣ５０値（５０％生存率）を計測した（ＳＦ試薬を用いたＭＴＳアッセイ）。結果を図５０−１および図５０−２ならびに表８に示す。なお、ＡＴＲＡは、ＡＰＬの一般臨床においてファーストラインで使用される治療薬である。

図５０−１および図５０−２ならびに表８から明らかなように、Ｃｈｂ−Ｍ’はＡＰＬ細胞株の増殖を劇的に抑制した。Ｃｈｂ−Ｍ’は、ｐ５３変異型細胞株であるＮＢ４においても顕著な細胞増殖抑制を示した（図５０−１、表８）。ＵＦ１の方がＮＢ４に比べてＡＴＲＡがやや有効であるものの、ＮＢ４およびＵＦ１は共にＡＴＲＡ耐性である（図５０−２、表８）。Ｃｈｂ−Ｍ’は、ＡＴＲＡ耐性ＡＰＬ細胞株に対して細胞増殖抑制効果を示した（図５０−１、表８）。

本発明のＲＵＮＸ阻害剤は、ＲＵＮＸファミリーの全てのメンバーの活性を阻害することができる。本発明のＲＵＮＸ阻害剤を含む抗腫瘍剤は、ＲＵＮＸファミリーのクラスター制御によって白血病をはじめ、様々な種類の癌を標的とすることができる。本発明の抗腫瘍剤は、他の分子標的治療薬に対して耐性を示す腫瘍に対しても効果を示す。特に、本発明の抗腫瘍剤は、現在臨床で使用されている分子標的治療薬では効果がない癌に対しても効果を示すため、難治療性と言われる癌にも効果がある万能抗癌剤としての利用が期待される。さらに、本発明のＲＵＮＸ阻害剤は、抗アレルギー剤として使用することができる。

SEQ ID NO:1: Forward primer for amplification of GAPDH gene
SEQ ID NO:2: Reverse primer for amplification of GAPDH gene
SEQ ID NO:3: Forward primer for amplification of BCL11A gene
SEQ ID NO:4: Reverse primer for amplification of BCL11A gene
SEQ ID NO:5: Forward primer for amplification of TRIM24 gene
SEQ ID NO:6: Reverse primer for amplification of TRIM24 gene
SEQ ID NO:7: Forward primer for amplification of IL3 gene
SEQ ID NO:8: Reverse primer for amplification of IL3 gene
SEQ ID NO:9: Forward primer for amplification of CSF2RB gene
SEQ ID NO:10: Reverse primer for amplification of CSF2RB gene
SEQ ID NO:11: Forward primer for amplification of p53 gene
SEQ ID NO:12: Reverse primer for amplification of p53 gene
SEQ ID NO:13: Forward primer for amplification of CSF2 gene
SEQ ID NO:14: Reverse primer for amplification of CSF2 gene
SEQ ID NO:15: Forward primer for amplification of p21 gene
SEQ ID NO:16: Reverse primer for amplification of p21 gene
SEQ ID NO:17: Forward primer for amplification of BAX gene
SEQ ID NO:18: Reverse primer for amplification of BAX gene
SEQ ID NO:19: Forward primer for amplification of PUMA gene
SEQ ID NO:20: Reverse primer for amplification of PUMA gene
SEQ ID NO:21: Forward primer for amplification of MDM2 gene
SEQ ID NO:22: Reverse primer for amplification of MDM2 gene
SEQ ID NO:23: Forward primer for amplification of RUNX1 gene
SEQ ID NO:24: Reverse primer for amplification of RUNX1 gene
SEQ ID NO:25: Forward primer for amplification of RUNX2 gene
SEQ ID NO:26: Reverse primer for amplification of RUNX2 gene
SEQ ID NO:27: Forward primer for amplification of RUNX3 gene
SEQ ID NO:28: Reverse primer for amplification of RUNX3 gene
SEQ ID NO:29: Forward primer for amplification of Pan RUNX gene
SEQ ID NO:30: Reverse primer for amplification of Pan RUNX gene
SEQ ID NO:31: Forward primer for amplification of CBFB gene
SEQ ID NO:32: Reverse primer for amplification of CBFB gene

Claims (14)

1. ＤＮＡ上のＲＵＮＸ結合配列に結合して、ＲＵＮＸファミリーメンバーの該結合配列への結合を阻害する、ＲＵＮＸ阻害剤。
2. ＲＵＮＸ結合配列に結合するピロール−イミダゾールポリアミドを含む、請求項１記載のＲＵＮＸ阻害剤。
3. 作用剤およびピロール−イミダゾールポリアミドの複合体を含むＲＵＮＸ阻害剤であって、該ピロール−イミダゾールポリアミドがＲＵＮＸ結合配列に結合する、請求項２記載のＲＵＮＸ阻害剤。
4. 作用剤およびピロール−イミダゾールポリアミドの複合体が式Ｉ：
   

   

   または
   式ＩＩ：
   

   

   ［式Ｉおよび式ＩＩ中、
   Ｘ_１はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_２はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_３はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_４はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_５はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_６はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_７はＣＨまたはＮを示し、Ｘ_８はＣＨまたはＮを示し、
   Ｙは、アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、またはエーテル結合を示すか、あるいはこれらの結合の１種類以上を形成する官能基を含む部分を示し、ｍは０〜５の整数を示し、
   Ｒ_１はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_２はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_３はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_４はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_５はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_６はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_７はＨまたはアルキル基を示し、Ｒ_８はＨまたはアルキル基を示し、
   Ｒ_９はＨまたはＮＨＲ_１１を示し、Ｒ_１０はＨまたはＮＨＲ_１１を示し、
   Ｒ_１１はＨ、ビオチン、または蛍光基を示し、
   Ｒは作用剤を示し、
   ｎは、０、１、２、３、４、または５を示す。］
   によって示される化合物からなる群から選ばれる、請求項３記載のＲＵＮＸ阻害剤。
5. 作用剤がアルキル化剤である、請求項３または４記載のＲＵＮＸ阻害剤。
6. アルキル化剤がクロラムブシル、デュオカルマイシン、ｓｅｃｏ−ＣＢＩ（１−クロロメチル−５−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール）、ピロロベンゾジアゼピン、およびナイトロジェンマスタードからなる群から選択される、請求項５記載のＲＵＮＸ阻害剤。
7. アルキル化剤がクロラムブシルである、請求項６記載のＲＵＮＸ阻害剤。
8. クロラムブシルおよびピロール−イミダゾールポリアミドの複合体が式：
   

   

   によって示される化合物からなる群から選ばれる、請求項７記載のＲＵＮＸ阻害剤。
9. ＲＵＮＸファミリーの全てのメンバーのＲＵＮＸ結合配列への結合を阻害する、請求項１〜８のいずれか１項記載のＲＵＮＸ阻害剤。
10. 請求項１〜９のいずれか１項記載のＲＵＮＸ阻害剤を含む、医薬組成物。
11. 抗腫瘍剤である、請求項１０記載の医薬組成物。
12. 抗アレルギー剤である、請求項１０記載の医薬組成物。
13. 他の抗腫瘍剤と組み合わせて使用される、請求項１１記載の医薬組成物。
14. 白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、腎細胞癌、神経芽細胞腫、皮膚癌、乳癌、前立腺癌および脳腫瘍からなる群から選択される１以上を予防または治療するための、請求項１１または１３記載の医薬組成物。

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