CN109789158B - Runx抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供结合至DNA上的RUNX结合序列并因此抑制RUNX家族成员对该结合序列的结合的RUNX抑制剂；包含该RUNX抑制剂的抗肿瘤剂；和包含该RUNX抑制剂的抗过敏剂。

Description

RUNX抑制剂
技术领域
本发明涉及RUNX抑制剂和包含RUNX抑制剂的药物组合物。
背景技术
Runt相关转录因子(Runt-related transcription factor：以下简称为“RUNX”)家族是调控血液相关基因和造血干细胞相关基因的表达的重要转录因子。RUNX家族的成员包括RUNX1、RUNX2和RUNX3。已知，RUNX1参与永久造血等，RUNX2参与骨发育等，RUNX3参与神经发生、胸腺生成等。RUNX家族的各成员与核心结合因子β亚基(CBFβ)形成异源二聚体复合物。尽管RUNX经由Runt结构域而识别并结合靶向基因的转录调控区域中的核心共有结合序列5'-TGTGGT-3'、和非常罕见的5'-TGCGGT-3'，从而调控靶向基因的表达，但CBFβ是非DNA结合调节亚基。CBFβ别构地增强RUNX的DNA结合能力。
RUNX1也已知作为急性骨髄性白血病1蛋白质(AML1)，被认为是白血病发病中的肿瘤抑制因子。另一方面，最近的报道暗示RUNX1在急性骨髄性白血病(AML)的发病中具有促致癌特性；并且小分子化合物据报道抑制RUNX1与CBFβ的结合以治疗白血病(参见非专利文献1)。然而，尚未为了治疗包括白血病在内的各种癌症而尝试以基因组DNA上的RUNX家族结合位点为靶向。
吡咯-咪唑聚酰胺(以下简称为“PI聚酰胺”)是合成低聚物，其借助通过发夹连接而连接的吡咯(P)和咪唑(I)对而识别位于小沟内的特定DNA序列。PI聚酰胺中的P/I对识别C-G碱基对，P/P对识别A-T或T-A碱基对，I/P对识别G-C碱基对。PI聚酰胺可以特异性地结合至任意的双链DNA序列。因此，设计P/I对的顺序使得在体内将PI聚酰胺递送至基因组中的靶向位点变得可能。
尽管其分子量较大，但PI聚酰胺是膜透过性的，集中于细胞核，然后以纳摩尔水平影响内源性基因表达。靶向基因结合的PI聚酰胺已作为抑制转录因子对DNA的结合并调控基因表达的基因开关而被研究。我们最近已成功地产生了强力的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、即辛二酰苯胺异羟肟酸缀合(SAHA-conjugated)的PI聚酰胺；并且证明了该SAHA缀合的PI聚酰胺具有通过增强其调节区域的乙酰化而特异性刺激靶向基因的表达的能力(参见非专利文献2和3)。我们还成功地将氮芥烷基化剂苯丁酸氮芥(chlorambucil)与PI聚酰胺缀合；并且表明了其具有强得多的序列特异性基因组DNA结合能力，并且减少靶向基因表达(参见非专利文献4和5)。还报道了靶向组蛋白H4c基因的苯丁酸氮芥缀合的PI聚酰胺抑制结肠癌细胞的增殖(参见非专利文献6)。
然而，迄今为止尚无报道研究靶向RUNX家族的烷基化剂缀合的PI聚酰胺和基于PI聚酰胺缀合物的抗肿瘤制剂。因此，没有开发其用于治疗癌症的特定或广泛用途的应用。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Cunningham, L等人，Proc Natl Acad Sci USA, 2012年9月4日;109(36), 14592-7
非专利文献2：Pandian, G. N.等人, Sci Rep 4, 3843, doi:10.1038/srep03843 (2014)
非专利文献3：Saha, A.等人, Bioorg Med Chem 21, 4201-4209, doi:10.1016/j.bmc.2013.05.002 (2013)
非专利文献4：Bando, T.等人, Acc Chem Res 39, 935-944, doi:10.1021/ar030287f (2006)
非专利文献5：Minoshima, M.等人, Nucleic Acids Symp Ser (Oxf), 69-70,doi:10.1093/nass/nrp035 (2009)
非专利文献6：Dickinson, A.等人, Chem Biol, Vol. 11, 1583-1594, 2004。
发明内容
发明要解决的课题
抑制蛋白质-蛋白质结合、例如RUNX1与CBFβ间的结合的常规小分子化合物移动至核内的能力弱，并且效果弱。此外，常规的分子靶向药通过卡在致病蛋白的口袋中而提供例如抑制蛋白质-蛋白质结合和抑制激酶活性的作用，因此致病蛋白的突变诱导对分子靶向剂的耐性。因此，需要克服这样的缺陷的新型抗肿瘤剂。因此，本发明的目的在于，开发在转录水平上抑制肿瘤致病蛋白的表达的抗肿瘤剂。
用于解决问题的手段
在上述情况下，本发明人在期待癌、特别是白血病的发病可能通过抑制RUNX家族的活性而受到影响的同时对RUNX家族抑制剂进行了研究。结果本发明人发现，靶向基因组DNA上的RUNX结合位点的RUNX抑制剂对包括白血病在内的各种癌有效。本发明人成功地合成了靶向基因组上的RUNX共有结合位点的PI聚酰胺，并且发现该PI聚酰胺与烷基化剂的缀合物可以用于下调靶基因的表达。出人意料地，发现该缀合物不仅对AML细胞而且对来自多种器官的肿瘤也具有体内抑制效果。
本发明提供下述方面，其不限于：
[1]RUNX抑制剂，其结合至DNA上的RUNX结合序列以抑制RUNX家族成员对该结合序列的结合；
[2]根据[1]所述的RUNX抑制剂，其包含结合至RUNX结合序列的PI聚酰胺；
[3]根据[2]所述的RUNX抑制剂，其包含作用剂与PI聚酰胺的缀合物，并且其中该吡咯-咪唑聚酰胺结合至RUNX结合序列；
[4]根据[3]所述的RUNX抑制剂，其中，作用剂与PI聚酰胺的缀合物选自式I或式II所示的化合物：
[化学式1]
Figure 454700DEST_PATH_IMAGE001
[化学式2]
Figure 191712DEST_PATH_IMAGE002
其中，式I或式II中，
X1表示CH或N，X2表示CH或N，X3表示CH或N，X4表示CH或N，X5表示CH或N，X6表示CH或N，X7表示CH或N，X8表示CH或N，
R1表示H或烷基，R2表示H或烷基，R3表示H或烷基，R4表示H或烷基，R5表示H或烷基，R6表示H或烷基，R7表示H或烷基，R8表示H或烷基，
R9表示H或NHR11，R10表示H或NHR11，
R11表示H、生物素或荧光基团，
R表示作用剂，
Y表示酰胺键、磷酰二硫键、酯键、配位键或醚键、或者表示含有形成选自这些键中的至少1种的官能团的部分，并且m表示0~5的整数；
[5]根据[3]或[4]所述的RUNX抑制剂，其中，作用剂是烷基化剂；
[6]根据[5]所述的RUNX抑制剂，其中，烷基化剂选自苯丁酸氮芥(chlorambucil)、倍癌霉素、seco-CBI(1-氯甲基-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚)、吡咯并苯并二氮杂䓬和氮芥；
[7]根据[6]所述的RUNX抑制剂，其中，烷基化剂是苯丁酸氮芥；
[8]根据[7]所述的RUNX抑制剂，其中，苯丁酸氮芥与PI聚酰胺的缀合物选自下述式所示的化合物：
[化学式3]
Figure 715097DEST_PATH_IMAGE003
；
[9]根据[1]~[8]中任一项所述的RUNX抑制剂，其抑制RUNX家族的所有成员对RUNX结合序列的结合；
[10]药物组合物，其包含根据[1]~[9]中任一项所述的RUNX抑制剂；
[11]根据[10]所述的药物组合物，其是抗肿瘤剂；
[12]根据[10]所述的药物组合物，其是抗过敏剂；
[13]根据[11]所述的药物组合物，其与另一种抗肿瘤剂组合使用；
[14]根据[11]或[13]所述的药物组合物，其用于预防或治疗选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肺癌、食管癌、胃癌、结肠癌、肾细胞癌、神经母细胞瘤、皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌和脑瘤中的至少一种；
[15]癌的预防或治疗方法，其包括向对象给药根据[10]所述的药物组合物；
[16]癌的预防或治疗方法，其包括向对象组合给药根据[10]所述的药物组合物和另一种抗肿瘤剂；
[17]根据[15]或[16]所述的预防或治疗方法，其中，癌选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肺癌、食管癌、胃癌、结肠癌、肾细胞癌、神经母细胞瘤、皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌和脑瘤；
[18]根据[1]~[9]中任一项所述的RUNX抑制剂用于制造抗肿瘤剂的用途；
[19]根据[1]~[9]中任一项所述的RUNX抑制剂用于制造抗过敏剂的用途；
[20]根据[1]~[9]中任一项所述的RUNX抑制剂，其用于预防或治疗癌；
[21]根据[20]所述的RUNX抑制剂，其中，癌选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肺癌、食管癌、胃癌、结肠癌、肾细胞癌、神经母细胞瘤、皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌和脑瘤；
[22]癌的预防或治疗方法，其包括抑制RUNX家族成员对DNA上的RUNX结合序列的结合；
[23]根据[22]所述的预防或治疗方法，其中，癌选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肺癌、食管癌、胃癌、结肠癌、肾细胞癌、神经母细胞瘤、皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌和脑瘤。
发明的效果
本发明的RUNX抑制剂可以抑制RUNX家族的所有成员对RUNX结合序列的结合，从而抑制RUNX家族的活性。因此，本发明的RUNX抑制剂可以对任何RUNX家族成员参与的任何疾病和症状发挥其效果。本发明的包含RUNX抑制剂的抗肿瘤剂对包括白血病在内的各种癌具有抗肿瘤效果。本发明的抗肿瘤剂甚至对耐受其他分子靶向药的肿瘤也发挥其效果。另外，本发明的RUNX抑制剂还可以用作抗过敏剂。
附图说明
图1示出表示实施例中使用的苯丁酸氮芥/PI聚酰胺缀合物的化学式。
图2示出用苯丁酸氮芥/PI聚酰胺缀合物处理的人骨髄性白血病细胞MV4-11中的IL3、CSF2和CSF2RB基因的表达水平。苯丁酸氮芥/PI聚酰胺缀合物处理的细胞的各基因的表达值相对于DMSO处理的细胞的值进行归一化。图中，数据是平均±SEM值。*P＜0.05。
图3示出用苯丁酸氮芥/PI聚酰胺缀合物处理的人骨髄性白血病细胞MV4-11中的BCL11A、TRIM24、p21、BAX、PUMA和MDM2基因的表达水平。苯丁酸氮芥/PI聚酰胺缀合物处理的细胞的各基因的表达值相对于DMSO处理的细胞的值进行归一化。图中，“N.S.”表示不显著；图中，数据是平均±SEM值。*P＜0.05。
图4示出用苯丁酸氮芥/PI聚酰胺缀合物处理的人骨髄性白血病细胞MV4-11中的BCL11A、TRIM24、p21、BAX、PUMA、MDM2、PARP、PARP的裂解形式、和裂解半胱天冬蛋白酶-3蛋白的免疫印迹的结果。
图5示出AML细胞(MV4-11、OCI-AML2、OCI-AML3和MOLM-13细胞)中的Chb-M'的剂量-应答曲线。
图6示出Chb-M'对由各种起源建立的人癌细胞系的IC50值。图中，“p53WT”表示野生型p53细胞系；并且“p53突变(+)”表示p53突变型或p53缺失型细胞系。
图7示出Chb-50对由各种起源建立的人癌细胞系的IC50值。图中，“p53WT”表示野生型p53细胞系；并且“p53变异(+)”表示p53变异型或p53缺失型细胞系。
图8示出Chb-M'和PRIMA-1在p53功能障碍的AML细胞中的联合指数描点。
图9示出NOG小鼠中使用不同浓度的Chb-M'的急性毒理学试验的结果。示出全血细胞计数(a)、血液生物化学(b)、和体重(c)的结果(n=5)。数据是平均±SEM值。
图10示出移植有MV4-11细胞的NOG小鼠的DMSO、Ara-C、Chb-S、Chb-M'或Chb-50处理后的总体存活率(n=7)。
图11-1示出来自移植有MV4-11细胞的AML小鼠的骨髄的显微镜图像。对各切片实施苏木精和伊红染色(H&E)和用抗-人CD45抗体的免疫组织化学染色(hCD45)。“DMSO”、“AraC”和“Chb-M'”表示来自DMSO处理的、阿糖胞苷处理的、和Chb-M’处理的小鼠的组织染色。
图11-2示出来自移植有MV4-11细胞的AML小鼠的骨髄的显微镜图像。对各切片实施苏木精和伊红染色(上2行)和用抗-人CD45抗体的免疫组织化学染色(下2行)。“WT”表示来自未移植癌细胞的小鼠的组织染色，“Chb-S”表示来自Chb-S处理的小鼠的组织染色。
图12示出经过SU/SR细胞移植然后用DMSO、伊马替尼、或Chb-M'处理的NOG小鼠的总体存活率(n=5)。
图13示出来自移植有SU/SR细胞的ALL小鼠的骨髄的显微镜图像。对各切片实施苏木精和伊红染色(HE)和用抗-人CD45抗体的免疫组织化学染色(hCD45)。“DMSO”、“伊马替尼”和“Chb-M'”表示来自DMSO处理的、伊马替尼处理的、和Chb-M'处理的小鼠的组织染色。
图14示出来自移植有SU/SR细胞的ALL小鼠的肝脏的显微镜图像。对各切片实施苏木精和伊红染色(上2行)和用抗-人CD45抗体的免疫组织化学染色(下2行)。“WT”表示来自未移植癌细胞的小鼠的组织染色，“DMSO”、“伊马替尼”和“Chb-M'”表示来自DMSO处理的、伊马替尼处理的、和Chb-M'处理的小鼠的组织染色。
图15示出来自移植有SU/SR细胞的ALL小鼠的脾脏的显微镜图像。对各切片实施苏木精和伊红染色(上2行)和用抗-人CD45抗体的免疫组织化学染色(下2行)。“WT”表示来自未移植癌细胞的小鼠的组织染色，“DMSO”、“伊马替尼”和“Chb-M'”表示来自DMSO处理的、伊马替尼处理的、和Chb-M'处理的小鼠的组织染色。
图16示出经过A549细胞移植然后用DSMO、吉非替尼、或Chb-M'处理的人肺癌异种移植小鼠的总体存活率(n=5)。
图17示出在小鼠中移植A549细胞后7、14、和21天的活生物发光图像，其中人肺癌异种移植小鼠经过每周两次DMSO、吉非替尼、或Chb-M'处理，即在移植后14天和21天分别进行第2次给药和第4次给药，而在移植后7天小鼠没有接受药物给药。彩虹比例尺表示相对光单位。
图18示出在小鼠中移植A549细胞后21天的生物发光信号强度的定量，其中人肺癌异种移植小鼠经DMSO、吉非替尼、或Chb-M'处理(n=5)。
图19示出来自移植有A549细胞的肺癌异种移植小鼠的肺的显微镜图像。对各切片实施苏木精和伊红染色(上2行)和用抗-人Ki-67抗体的免疫组织化学染色(下2行)。“WT”表示来自未移植癌细胞的小鼠的组织染色，“DMSO”、“吉非替尼”和“Chb-M'”表示来自DMSO处理的、吉非替尼处理的、和Chb-M'处理的小鼠的组织染色。
图20示出经过MKN45细胞移植然后用DMSO或Chb-M'处理的人胃癌异种移植小鼠的肿瘤体积曲线(n=8)。图中，*p＜0.05，**p＜0.01，并且***p＜10-4。
图21示出在小鼠中移植MKN45细胞后7、21、和35天的活生物发光图像，其中人胃癌异种移植小鼠经过每周两次DMSO或Chb-M'处理，即在移植后21天和35天分别进行第4次给药和第8次给药，而在移植后7天小鼠没有接受药物给药。彩虹比例尺表示相对光单位。
图22示出在小鼠中移植MKN45细胞后35天的肿瘤的显微镜图像，其中人胃癌异种移植小鼠在移植后35天经过DMSO或Chb-M'处理。
图23示出CBFβ基因与RUNX1+RUNX2+RUNX3(Pan_RUNX)基因的表达水平之间的相关性(n=9)。
图24示出AML细胞系中的CBFβ蛋白与RUNX1+RUNX2+RUNX3蛋白的表达水平之间的相关性(n=9)。
图25-1示出用Chb-M'处理的MYL细胞中的BCR-ABL基因的表达水平。用Chb-M'处理的细胞的值相对于用DMSO(对照)处理的细胞的值进行归一化。
图25-2示出用Chb-M'处理的SU-Ph2细胞和SU/SR细胞中的BCR-ABL基因的表达水平。用Chb-M'处理的细胞的值相对于用DMSO(对照)处理的细胞的值进行归一化。
图26-1示出用Chb-M'处理的MYL细胞中的BCR-ABL融合蛋白的免疫印迹。
图26-2示出用Chb-M'处理的SU-Ph2细胞和SU/SR细胞中的BCR-ABL融合蛋白的免疫印迹。
图26-3示出用Chb-M'处理的MYL细胞中的Bcl2和C-Myc的免疫印迹。
图26-4示出用Chb-M'处理的MYL细胞中的处理后48小时的凋亡诱导的结果。
图27-1示出MYL细胞中的Chb-M'的剂量-应答曲线。
图27-2示出SU-Ph2细胞和SU/SR细胞中的Chb-50、Chb-M'、和伊马替尼的剂量-应答曲线和IC50值。
图28示出用不同浓度的Chb-M'处理的HUVEC(人脐带静脉内皮细胞系)中的不同基因的表达水平。表达水平被示为相对于用0μM Chb-M'(DMSO)处理的细胞中的各基因的表达水平而言的表达水平。图中，不同浓度下，从左至右示出E-选择素-1、E-选择素-2、P-选择素、Tie2、ICAM-1、VCAM-1、和Jagged-1的结果。
图29示出来自用Chb-M'处理的HUVEC(上图)和将RUNX1基因表达敲减的HUVEC(下图)中的E-选择素的表达量水平的FACS(荧光活化细胞分选仪)分析的结果。
图30是通过Chb-M'给药而分析骨髄内皮细胞中的E-选择素表达量的变化的体内实验方案的示意图。
图31示出来自用Chb-M'给药处理的小鼠的内皮细胞中的E-选择素的表达水平的FACS分析的结果。
图32是实施例中实施的归巢测定的示意图。
图33示出经由尾静脉移植了白血病细胞(MLL-ENL)的Chb-M'处理的小鼠的骨髄和脾脏中移植后24小时的白血病细胞数。
图34示出用Chb-M'处理的MKN45胃癌细胞(Her2抑制剂耐性细胞)中的Her2、p-ERK、ERK、p-AKT、和AKT的免疫印迹的结果。
图35示出用Chb-M'处理的MKN45胃癌细胞中的SOS1、p-Her2(磷酸化Her2)、和Her2的免疫印迹的结果。
图36示出用Chb-M'处理的MKN45胃癌细胞中的SOS1基因的表达水平。表达水平被示为相对于用DMSO(对照)处理的细胞的值而言的值。
图37示出EGFR野生型p53野生型肺腺癌细胞(A549和LU99A)中的Chb-M'、吉非替尼、和苯丁酸氮芥的剂量-应答曲线、和IC50值。
图38示出EGFR野生型p53突变型肺腺癌细胞系(ABC-1和RERF-LC-MS)中的Chb-M'、吉非替尼、苯丁酸氮芥、和Chb-S的剂量-应答曲线和IC50值。
图39示出用Chb-M'处理的LU99A细胞和A549细胞中的Mig6的免疫印迹的结果。
图40示出用Chb-M'处理的LU99A细胞和A549细胞中的各种凋亡相关因子(p53、p21、PUMA、和BAX)的免疫印迹的结果。图中，“C-M”表示Chb-M'给药组。
图41示出来自用Chb-M'处理的LAD2细胞和HMC-1.2细胞中的KIT的表面表达水平的FACS(荧光活化细胞分选仪)分析的结果。
图42示出用Chb-M'处理的LAD2细胞和HMC-1.2细胞中的KIT、pKIT、AKT、pAKT、Mitf、和GAPDH的免疫印迹的结果。
图43示出p53突变型结肠癌细胞HT29中的Chb-M'和苯丁酸氮芥(Chb)的剂量-应答曲线。
图44示出前列腺癌细胞(PC-3、DU-145和LNCaP)中的Chb-M'、Ch-S、苯丁酸氮芥、和恩杂鲁胺的剂量-应答曲线和IC50值。
图45示出用Chb-M'处理的前列腺癌细胞PC-3中的GATA2、E2F5、和AR基因的表达水平。用Chb-M'处理的细胞的值相对于用DMSO(对照)处理的细胞的值进行归一化。
图46示出用Chb-M'处理48和72小时后的前列腺癌细胞中的凋亡诱导的结果。
图47示出髓母细胞瘤细胞中的Chb-M'、Ch-S、和苯丁酸氮芥的剂量-应答曲线和IC50值。
图48示出用Chb-M'处理的髓母细胞瘤细胞DAOY中的ROR1和ROR2基因的表达水平。用Chb-M'处理的细胞的值相对于用DMSO(对照)处理的细胞的值进行归一化。
图49示出用Chb-M'处理的DAOY细胞中的ROR1和ROR2蛋白质的免疫印迹的结果。
图50-1示出APL细胞系(NB4和UF1)中的Chb-M'的剂量-应答曲线和IC50值。
图50-2示出APL细胞系(NB4和UF1)中的ATRA的剂量-应答曲线和IC50值。
具体实施方式
1.RUNX抑制剂
本发明的RUNX抑制剂结合至DNA上的RUNX结合序列，导致抑制RUNX家族成员对该结合序列的结合，由此抑制RUNX家族的活性。
本发明的RUNX抑制剂的实例包括但不限于：包含设计为结合至RUNX结合序列的DNA结合化合物的合成抑制剂；并且该DNA结合化合物包括PI聚酰胺、肽核酸(PNA)、三链DNA、TAL效应蛋白、桥接核酸(BNA)、锁核酸(LNA)和锌指等。
本发明的RUNX抑制剂优选包含结合至RUNX结合序列的PI聚酰胺。PI聚酰胺是含有N-甲基吡咯单元(P)、N-甲基咪唑单元(I)、和γ-氨基丁酸部分的聚酰胺，其中，P、I和γ-氨基丁酸部分彼此经由酰胺键(-C(=O)-NH-)连接(Trauger等人, Nature, 382, 559-61(1996); White等人, Chem.Biol., 4,569-78(1997);和Dervan, Bioorg. Med. Chem.,9, 2215-35(2001))。PI聚酰胺通过γ-氨基丁酸部分发挥接头(γ-接头)作用而整体折叠为U字型的构象(发夹型)。U字型的构象中，包含P和I的2根链被并列排布并夹持接头。该2根链之间形成的包含P和I的对是特定的P和I的组合(P/I对、I/P对或P/P对)时，其可以以高亲和性结合至DNA中的特定碱基对。例如，P/I对可以结合至C·G碱基对，并且I/P对可以结合至G·C碱基对。P/P对可以结合至A·T碱基对和T·A碱基对两者(White等人,Chem.Biol.,4,569-78(1997); Dervan: Bioorg. Med. Chem., 9, 2215-35 (2001))。PI聚酰胺在含有P和I之外，还可以含有3-羟基吡咯(Hp)、或β-丙氨酸。Hp/P对可以结合至T-A碱基对(White等人, Nature, 391, 468-71 (1998))。β-丙氨酸/β-丙氨酸对可以结合至T·A碱基对和A·T碱基对。可以通过根据靶向的DNA序列而改变P和I的对组合，从而设计识别靶向基因的调节区域的PI聚酰胺。
PI聚酰胺中，P或I的1位的氮上的甲基可以被氢或者除了甲基之外的烷基替代。γ-接头可以是具有侧链、例如具有氨基的N-α-N-γ-氨基丁酸和N-β-N-γ-氨基丁酸的接头，并且侧链可以用分子、例如荧光基团或生物素进行修饰。PI聚酰胺在N末端可以不仅用乙酰基进行修饰，而且可以用分子、例如荧光基团或生物素进行修饰。如本文中使用的，荧光基团的实例包括但不限于荧光素、罗丹明染料、花青染料、ATTO染料、Alexa Fluor染料、和BODIPY。荧光素包括荧光素衍生物(例如荧光素异硫氰酸酯)。
用于设计和制造PI聚酰胺的方法是已知的(参见例如JP-B 3045706、JP-A 2001-136974、WO 03/000683、JP-A 2013-234135、JP-A 2014-173032)。例如，可以通过包括使用Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)的固相合成法(Fmoc固相合成法)的自动合成法而方便地制造PI聚酰胺。
PI聚酰胺可以是被修饰以维持或提高结合至DNA的能力的PI聚酰胺的修饰形式。PI聚酰胺的修饰形式的实例包括含有加成于PI聚酰胺的γ-氨基丁酸的α位或β位的胺的修饰形式、具有N-α-N-γ-氨基丁酸、N-β-N-γ-氨基丁酸的取代侧链的修饰形式、以及进一步用分子例如荧光基团、生物素进行了修饰的修饰形式、在PI聚酰胺的N末端用分子例如荧光基团、生物素进行了修饰的修饰形式、和在PI聚酰胺的C末端用分子例如间苯二甲酸进行了修饰的修饰形式。
如在本发明中使用的，PI聚酰胺识别并且结合至基因组中的RUNX共有结合序列。RUNX共有结合序列已知为5'-TGTGGT-3'或5'-TGCGGT-3'。因此，根据该RUNX共有结合序列，可以确定上述PI聚酰胺中的P、I、和/或Hp和β-丙氨酸的对组合。该PI聚酰胺可以强力地抑制RUNX家族对基因组上的RUNX结合序列的结合。
本发明的RUNX抑制剂可以优选地包含结合至RUNX结合序列的上述DNA结合化合物与作用剂的缀合物。本发明的RUNX抑制剂的更优选的实例包含结合至RUNX结合序列的PI聚酰胺与作用剂的缀合物。作用剂是影响DNA和DNA周围的染色质状态的物质。作用剂的实例包括但不限于烷基化剂和染色质修饰酶调节剂。染色质修饰酶调节剂的实例包括但不限于组蛋白乙酰化酶(HAT)调节剂例如HAT抑制剂(例如C646)、和HAT活化剂(例如N-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-2-乙氧基苯甲酰胺(CTB))；组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)调节剂例如HDAC抑制剂(例如辛二酰苯胺异羟肟酸)、和HDAC活化剂；组蛋白甲基化酶调节剂；和组蛋白脱甲基化酶调节剂。本发明的RUNX抑制剂的更优选的实例包含结合至RUNX结合序列的PI聚酰胺与烷基化剂的缀合物。
烷基化剂是具有与DNA形成共价键的官能团的化合物。本发明中使用的烷基化剂没有特别限定，但考虑到应用于后述药物组合物，优选为具有低细胞毒性或无细胞毒性的烷基化剂。烷基化剂的实例包括但不限于苯丁酸氮芥(chlorambucil)、倍癌霉素、seco-CBI(1-氯甲基-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚)、吡咯并苯并二氮杂䓬和氮芥。
通过上述作用剂与上述DNA结合化合物之间的结合(以下也称为“缀合”)等来合成复合物。如本文中使用的，该复合物也称为“缀合物”。合成方法可以通过已知的方法实施(参见例如J. Am. Chem. SOC. 1995, 117, 2479-2490)。DNA结合化合物是PI聚酰胺时，作用剂结合至PI聚酰胺的N末端、C末端、或γ接头部分。例如，作用剂结合至PI聚酰胺的N末端或C末端。在此，“结合”方式可以是直接结合或经由接头结合。接头只要不影响作用剂的作用也不影响RUNX结合位点的识别，则没有特别限定。接头的实例包括键本身，例如酰胺键、磷酰二硫键、酯键、配位键或醚键等，以及含有形成这些键中的至少一种的官能团的分子。“含有形成这些键中的至少一种的官能团的分子”是含有与PI聚酰胺和/或作用剂的末端部分一起形成选自酰胺键、磷酰二硫键、酯键、配位键、和醚键等中的至少一种键的官能团的分子。“含有形成这些键中的至少一种的官能团的分子”可以是含有作为选自酰胺键、磷酰二硫键、酯键、配位键、和醚键等中的至少一种的键的一种或多种键的分子。接头的优选实例包括酰胺键、和含有形成酰胺键的官能团的分子。
本发明中的作用剂与PI聚酰胺的缀合物的实例包括式I或式II所示的化合物：
[化学式4]
Figure 207259DEST_PATH_IMAGE004
[化学式5]
Figure 448884DEST_PATH_IMAGE005
其中，
X1表示CH或N，X2表示CH或N，X3表示CH或N，X4表示CH或N，X5表示CH或N，X6表示CH或N，X7表示CH或N，X8表示CH或N，其中，X1~X8在能够使PI聚酰胺识别RUNX共有序列的组合中进行选择，
R1表示H或烷基，R2表示H或烷基，R3表示H或烷基，R4表示H或烷基，R5表示H或烷基，R6表示H或烷基，R7表示H或烷基，R8表示H或烷基，
R9表示H或NHR11，R10表示H或NHR11，
R11表示H、或者分子例如生物素或荧光基团，
R表示作用剂，优选烷基化剂，进一步优选选自苯丁酸氮芥、倍癌霉素、seco-CBI、吡咯并苯并二氮杂䓬和氮芥中的烷基化剂，
Y表示接头部分，并且
m表示0~5的整数、优选0~3的整数、更优选0或1；以及
所述化合物的修饰形式。
上述式I和II中，Y表示例如酰胺键、磷酰二硫键、酯键、配位键、醚键等，或者含有形成这些键中的至少一种的官能团的部分。该上下文中，“含有形成这些键中的至少一种的官能团的部分”是含有与PI聚酰胺和/或作用剂的末端部分一起形成选自酰胺键、磷酰二硫键、酯键、配位键、醚键等中的至少一种键的官能团的部分。“含有形成这些键中的至少一种的官能团的部分”可以含有作为选自酰胺键、磷酰二硫键、酯键、配位键、醚键等中的至少一种键的一种或多种键。
一个实施方式中，上述式I和II中，Y是“含有形成这些键中的至少一种的官能团的部分”，并且其实例包括式III所示的结构：
[化学式6]
Figure 724008DEST_PATH_IMAGE006
其中，
A是羰基[-C(=O)-]或亚氨基(-NH-)，
B是醚键(-O-)、亚氨基(-NH-)或甲基亚氨基[-N(-CH3)-]，
g和k独立地表示1~3的整数，
h和j独立地表示0~5的整数，并且
i表示0~2的整数。
例如，优选h和j独立地表示0~3的整数。上述式III中，酯键的位置与B所示的醚键或亚氨基键的位置可以彼此替换。例如，上述式III所示的接头部分在最右端的位置与作用剂连接，并且在最左端的位置与PI聚酰胺连接。但该连接位置可以颠倒。例如，上述式III所示的接头部分在最左端的位置与PI聚酰胺的C末端连接时，A优选为亚氨基。
式III所示的Y的实例包括式IV所示的结构
[化学式7]
Figure 101899DEST_PATH_IMAGE007
式III所示的Y的另一个实例包括式V所示的结构：
[化学式8]
Figure 437066DEST_PATH_IMAGE008
其中，l表示1~5的整数。例如，l是1~3的整数，并且优选l为1。
式III所示的Y的另一个实例包括式VI所示的结构：
[化学式9]
Figure 165987DEST_PATH_IMAGE009
。优选在作用剂与PI聚酰胺的C末端侧连接时，使用式VI所示的接头部分。
例如，上述IV~式VI所示的接头部分在最右端的位置与作用剂连接，并且在最左端的位置与PI聚酰胺连接。但该连接位置可以颠倒。
如本文中使用的，烷基的实例包括C1-C10直链、支链或环状的饱和或不饱和烷基，优选为C1-C5直链、支链或环状的饱和或不饱和烷基，并且包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基等。烷基可以被取代。例如，烷基中的亚甲基可以被氧等取代。
本发明中的作用剂与PI聚酰胺的缀合物的优选实例包括下式所示的化合物：
[化学式10]
Figure 244802DEST_PATH_IMAGE010
其中，
R表示作用剂，优选烷基化剂，并且更优选选自苯丁酸氮芥、倍癌霉素、seco-CBI、吡咯并苯并二氮杂䓬和氮芥中的烷基化剂，并且
n表示0、1、2、3、4或5，优选1、2或3，并且更优选n表示1；以及
所述化合物的修饰形式。
本发明中的烷基化剂与PI聚酰胺的缀合物的其它优选实例包括下式所示的苯丁酸氮芥与PI聚酰胺的缀合物：
[化学式11]
Figure 742779DEST_PATH_IMAGE011
其中，
X1表示CH或N，X2表示CH或N，X3表示CH或N，X4表示CH或N，X5表示CH或N，X6表示CH或N，X7表示CH或N，X8表示CH或N，其中，X1~X8在能够使PI聚酰胺识别RUNX共有序列的组合中进行选择，
R1表示H或烷基，R2表示H或烷基，R3表示H或烷基，R4表示H或烷基，R5表示H或烷基，R6表示H或烷基，R7表示H或烷基，R8表示H或烷基，
R9表示H或NHR11，R10表示H或NHR11，
R11表示H、或者分子例如生物素或荧光基团，
n表示0、1、2、3、4或5，优选1、2或3，并且更优选n表示1；以及所述缀合物的修饰形式。
本发明中的上述缀合物的其它优选实例包括下式所示的苯丁酸氮芥与PI聚酰胺的缀合物：
[化学式12]
Figure 61896DEST_PATH_IMAGE012
其中，n表示0、1、2、3、4或5，优选1、2或3，并且更优选n表示1；以及所述缀合物的修饰形式。
作用剂与DNA结合化合物例如PI聚酰胺的缀合物可以为药理学可接受的盐的形式。药理学可接受的盐的实例包括无机酸盐例如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐和氢溴酸盐；和有机酸盐例如乙酸盐、富马酸盐、马来酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐和甲苯磺酸盐。
上述缀合物中，作用剂、DNA结合化合物和/或连接作用剂与DNA结合化合物的接头部分中的至少1种以上的部分或分子可以以对映异构体或非对映异构体的形式或它们的混合物形式存在。缀合物包括立体异构体的混合物、或它们的纯的或实质上纯的异构体。缀合物以非对映异构体或对映异构体的形式获得时，这些非对映异构体或对映异构体可以通过本领域公知的常规方法例如色谱法或分级结晶法而分离。
缀合物可以用放射性同位素(例如3H、13C、14C、15N、18F、32P、35S、125I等)等在作用剂、DNA结合化合物和/或连接作用剂与DNA结合化合物的接头部分中的至少1种部分或分子上进行标记，或者可以进行氘代。
本发明的RUNX抑制剂根据意图的目的，可以是上述DNA结合化合物本身或上述DNA结合化合物与作用剂的缀合物本身，或者除了上述化合物或缀合物之外，还可以包含载体或添加剂。该载体和添加剂的实例包括但不限于水、乙酸、有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二丙三醇、丙三醇、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露醇、山梨糖醇、乳糖和表面活性剂。本发明的RUNX抑制剂中含有的DNA结合化合物或缀合物的含量可以根据意图的目的而任意调节。
本发明的RUNX抑制剂识别并结合至基因组上的RUNX共有结合序列。该RUNX共有结合序列是在RUNX家族的成员中共同的结合序列。因此，本发明的RUNX抑制剂抑制RUNX家族的所有成员。即，本发明的RUNX抑制剂结合至基因组上的RUNX共有结合序列时，RUNX家族的所有成员对基因组上的RUNX结合序列的结合被抑制，导致所有因RUNX家族的成员对DNA的结合而引起的活性被抑制。RUNX家族参与的活性的实例包括各种类型，例如但不限于通过p53抑制因子(BCL11和TRIM24)的转录调控而进行的活化(即，在癌中，肿瘤抑制因子p53一直被RUNX家族抑制)、通过作为费城染色体阳性急性淋巴性白血病(PhALL)的致病蛋白的BCR-ABL的转录调控而进行的增强、MLL-AF4+FLT3-ITD急性骨髄性白血病中的MLL-AF4的转录增强、和通过癌基因c-Myc的转录调控而进行的增强。
本发明还提供用于抑制RUNX家族的活性的方法，其包括使用本发明的RUNX抑制剂。本发明的RUNX家族抑制方法不仅可以抑制由RUNX1、RUNX2或RUNX3调控的靶向基因，而且可以总体地抑制由RUNX家族的所有成员调控的基因簇(靶向基因组)。
本发明的RUNX抑制剂的使用量可以根据意图的目的而适当确定。
2.药物组合物
本发明的药物组合物是包含本发明的RUNX抑制剂的组合物。本发明的药物组合物优选包含RUNX抑制剂，所述RUNX抑制剂包含PI聚酰胺或PI聚酰胺与作用剂的缀合物。如上所述，本发明的RUNX抑制剂识别并结合至基因组上的RUNX共有结合序列。RUNX共有序列(RUNX家族蛋白结合序列)存在于各种基因的调控区域中。RUNX家族成员通过结合至调控区域中的共有序列，从而调控各种靶向基因的表达。本发明的药物组合物通过结合至RUNX共有序列，从而下调各RUNX家族成员所靶向的各种基因的表达。靶向基因的实例包括但不限于CBF白血病中高表达的基因(例如IL3、CSF2、CSF2RB等)、RUNX家族本身(RUNX1、RUNX2和RUNX3)、p53抑制因子(例如BCL11、TRIM24等)和c-kit基因。
通过体内给药本发明的药物组合物，能够治疗和预防各种疾病。本发明的药物组合物可以用于在生物防治（biocontrol）中利用双链DNA的生物，特别是哺乳动物(例如人、大鼠、兔、羊、猪、牛、猫、犬、猴等)。
本发明的药物组合物的对象疾病是RUNX家族成员参与的所有疾病。本发明的药物组合物的对象疾病的实例包括癌，并且其实例包括但不限于白血病(例如急性骨髄性白血病、急性淋巴性白血病和慢性骨髄性白血病)、骨髄增生异常综合征来源的白血病、淋巴瘤、骨髄瘤、多发性骨髓瘤、肺癌、食管癌、胃癌、结肠癌、肾细胞癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、皮肤癌(例如黑素瘤)、卵巢癌、肝母细胞癌、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、肝母细胞癌、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、卵巢癌、子宫癌和脑瘤。如下述实施例中所示，本发明的RUNX抑制剂通过调控p53的抑制因子的转录而激活p53通路，因此本发明的药物组合物理论上可以抑制、治疗或预防癌。尽管在单独使用时本发明的药物组合物对具有p53突变的癌可能无法发挥充分的抗肿瘤效果，但本发明的药物组合物与p53诱导剂组合使用时，对具有p53突变的癌发挥出协同的抗肿瘤效果。p53诱导剂的实例包括2,2-双(羟基甲基)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-酮(PRIMA-1)、1-[(1-氧代丙氧基)甲基]-1H-吡咯-2,5-二酮(MIRA-1)和Nutlin3。
本发明的药物组合物可以用作例如抗肿瘤剂或分化诱导剂。
本发明的药物组合物的对象疾病的另外的实例包括肥大细胞疾病例如肥大细胞肿瘤、和肥大细胞症(Mastocytosis)(例如肥大细胞增加症、重症过敏疾病、特应性皮炎、过敏性休克、重症支气管哮喘发作和重症药物性皮炎)；各种过敏和免疫疾病。肥大细胞被定义为在细胞表面表达对与过敏深度相关的IgE抗体而言特异性的受体FceRI、和被称为干细胞因子(SCF)的细胞因子的受体c-kit两者的细胞。已知肥大细胞被机械或化学刺激时，或与过敏物质例如异种蛋白质接触时，肥大细胞脱颗粒并由此将储存在颗粒中的内容物(例如组胺、肝素等)释放至细胞外环境，引起过敏反应。如下述实施例中所示，本发明的RUNX抑制剂抑制肥大细胞中c-kit(干细胞因子受体酪氨酸激酶)的表达，因此本发明的药物组合物可以抑制、治疗或预防因肥大细胞的活化而引起的所有症状或疾病。
本发明的药物组合物可以为用于口服给药和肠胃外给药的任意剂型。这些剂型可以根据常规方法配制，并且可以含有药学可接受的载体或添加剂。这样的载体和添加剂的实例包括水、乙酸、药学可接受的有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二丙三醇、丙三醇、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、作为药物添加剂而可接受的表面活性剂。
上述添加剂可以根据本发明的药物组合物的剂型而从上述那些之中选择单独或适当的组合。用于口服给药的剂型的实例包括片剂、胶囊剂、细粒剂、粉末剂、颗粒剂、液体剂、糖浆剂、喷雾剂、涂剂、滴眼剂和外用剂。替代地，可以以适当的剂型实施口服给药。用于肠胃外给药的剂型的实例包括注射剂。注射剂可以通过例如静脉内注射(例如点滴)、皮下注射、腹腔内注射或肿瘤内注射而全身或局部给药。
例如，为了用作注射用制剂，将本发明的药物组合物溶解在溶剂(例如盐水、缓冲液、葡萄糖溶液、0.1%乙酸等)中，并且可以向该溶液中补充适当的添加剂(人血清白蛋白、PEG、甘露糖修饰树状体、环糊精缀合物等)并使用。替代地，本发明的药物组合物可以被冻干以用于在使用前溶解的剂型。例如，糖醇或糖类，例如甘露醇、葡萄糖可以被用作冷冻干燥用赋形剂。
本发明的药物组合物的给药量可以取决于年龄、性別、症状、给药途径、给药次数和剂型而不同。给药量例如对于成人(60kg)而言为每日0.01~1000mg、优选0.1~100mg、更优选1~30mg。给药方法根据患者的年龄和症状而适当选择。本发明的药物组合物可以例如每数天1次、每天1次、或每天2次至4次给药。
本发明的药物组合物可以与其他抗肿瘤剂组合使用。其他抗肿瘤剂的实例包括用于治疗特定的癌的任意抗肿瘤剂、和p53诱导剂。作为其他抗肿瘤剂，可以使用任意已知的抗肿瘤剂。已知的抗肿瘤剂的实例包括阿糖胞苷(Cytarabine)、伊马替尼(Imatinib)、吉非替尼(Gefitinib)、PRIMA-1、MIRA-1和Nutlin3。本发明的药物组合物与其他抗肿瘤剂的给药比率没有特别限定，并且可以由本领域技术人员适当确定以使得可以实现期望的抗肿瘤效果。
本发明人已使用shRNA制作了RUNX1敲减小鼠，以研究仅抑制RUNX1时的其他RUNX家族成员的作用。结果发现，当RUNX1被抑制时，活性被其他RUNX家族成员补偿。因此，可以抑制RUNX家族所有成员的本发明的RUNX抑制剂和药物组合物与单独减少各RUNX成员的表达时相比，能够发挥更强的抗肿瘤效果。
此外，本发明还提供包含本发明的RUNX抑制剂的试剂盒。该试剂盒除了本发明的RUNX抑制剂之外，还可以含有药学可接受的载体或添加剂、试剂、辅剂、专用容器、其他必要附件、说明书等。本发明的试剂盒可以例如用作癌治疗用试剂盒、或研究试剂盒。
本发明还提供作为癌标志物的CBFβ的用途。本发明人已发现，CBFβ在各种癌中表达，并且表达水平与RUNX家族的表达相关(实施例3)。因此，CBFβ可以被用作能够用于检测各种癌的万能癌标志物，并且可以通过在来自受试者的样品中检测CBFβ而确定癌的存在。
以下，以实施例的方式进一步具体说明本发明，但本发明不限于所述实施例。
实施例
实施例中使用的材料和方法如下所述。
材料和方法
细胞系
THP-1和KG-1a的AML细胞系、K562的CML细胞系、A549的肺癌细胞系、以及TE-1、TE-5和TE-11的食管癌细胞系由RIKEN biological resource center (BRC), Japan购买。Kasumi-1和HL60的AML细胞系、LU99A、ABC-1、和RERF-LC-MS的肺癌细胞系、MKN7和MKN45的胃癌细胞系、C32TG和Mewo的黑素瘤细胞系、Caki-1的肾癌细胞系、HCT116和LOVO的结肠癌细胞系、以及H&EK293T细胞的胚性肾癌细胞系由Japanese Collection of ResearchBioresources(JCRB), Japan获得。OCI-AML2、OCI-AML3和MOLM13的AML细胞系由DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ), Germany购买。MV4-11和KG-1a的AML细胞系、RS4；11的ALL细胞系、SU-DHL-5、Raji和Dauji的淋巴瘤细胞系、KMS-12-BM的骨髄瘤细胞系、NCI-H2228的肺癌细胞系、以及DU4475、MCF7、HCC1937、MDA-MB-231和HTB-27的乳腺癌细胞系由American Type Culture Collection(ATCC), USA获得。SU-Ph2和SU/SR细胞的ALL细胞系由Dr. A. Kanamaru(Department of Internal Medicine,Kinki University School of Medicine, Osaka, Japan)提供。KOCL-45的ALL细胞系由Dr. K. Sugita(Department of Pediatrics, Yamanashi University, Yamanashi,Japan)提供。具有TP53 R248W突变的MV4-11NR细胞的AML细胞系由Dr. T. Ikezoe(Department of Hematology and Respiratory Medicine, Kochi University, Kochi,Japan)提供。Caki-1和H&EK293T细胞在37℃、5%CO2下被保持在添加了10%热灭活胎牛血清(FBS)和1%青霉素-链霉素(PS)的杜氏改良Eagle培养基(DMEM)中。其他细胞系在37℃、5%CO2下在含有10%FBS和1%PS的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基中培养。
细胞生长曲线
为了评价细胞增殖，将1×105细胞的AML细胞系转移至含有5mL培养基的6孔板中。为了四环素诱导基因或shRNA的表达，以3μM添加强力霉素(doxycycline)。每隔一天实施台盼蓝拒染测定以对细胞数进行计数。
实时定量PCR(qRT-PCR)
用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)分离总RNA，并用逆转录试剂盒(TOYOBO)逆转录，以生成cDNA。实时定量聚合酶链式反应(PCR)用7500 Real-Time PCR System(AppliedBiosystems)，按照生产商的说明书来实施。结果相对于GAPDH水平进行归一化。相对表达水平使用2-ΔΔCt法而计算。用于qRT-PCR的引物示于表1。
[表1]
Figure 12535DEST_PATH_IMAGE013
免疫印迹
将细胞用冰冷的磷酸缓冲盐水(PBS)清洗2次，并且在蛋白质裂解缓冲液[50mMTris(pH7.4)，100mM NaCl，0.1mM EDTA，1mM苯基甲基磺酰氟，1mM β-甘油磷酸酯、2.5mM焦磷酸钠，1mM Na3VO4，1x蛋白酶抑制剂(Roche)和PhosSTOP(Roche)]中回收。将全细胞提取物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，并电转移至聚偏二氟乙烯膜上。用以下的抗体探测膜：抗-Ctip1抗体 (Abcam, ab19487)、抗-TRIM24抗体(Bethyl Laboratories,Inc)、抗-RUNX1抗体(A-2)、抗-GAPDH(FL-335)、抗-p21(C-19)、抗-Bax(N-20)抗体(SantaCruz Biotechnology, Inc.)、抗-RUNX2、抗-RUNX3、抗-p53抗体(Cell SignalingTechnology)、抗-CBFβ抗体(FL-182, Santa Cruz Biotechnology, Inc.)、抗-裂解半胱天冬蛋白酶-3抗体(5A1E, Cell Signaling Technology)、抗-PARP抗体(46D11, CellSignaling Technology)。对于二次抗体，使用抗-兔IgG或抗-小鼠IgG HRP连接抗体(CellSignaling Technology)。使用Chemi-Lumi One Super(nacalai tesque, Inc.)和ChemiDoc TM XRS+ Imager(Bio-Rad Laboratories, Inc.)，如生产商推荐那样，检测印迹。蛋白质水平用Image Lab Software(Bio-Rad Laboratories, Inc.)进行定量。
基因表达微阵列分析
在总RNA分离前，将MV4-11细胞用1μM的Chb-M'、Chb-50或DMSO处理6小时。将转导了对照shRNA(sh_Luc.)或靶向RUNX1(sh_Rx1 #1和#2)、RUNX2(sh_Rx2)和RUNX3(sh_Rx3)的shRNA(参照下述“siRNA干扰”)的MV4-11细胞与3μM强力霉素一起温育24小时。然后，从细胞中分离总RNA。RNA提取使用RNeasy MINI试剂盒(Qiagen, CA, USA)，按照生产商的说明书进行。RNA试样的品质使用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, USA)来检验。将来自总RNA试样的mRNA扩增为dsDNA。在T7聚合酶的存在下，生成花青3-标记的cRNA，使用RNeasy Mini试剂盒提纯，并使用Nanodrop ND1000 v3.5.2(Thermo Scientific)测定其浓度。将所得cRNA(825ng)片段化，然后与Human Gene 2.1 ST Array Strip(Affymetrix, USA)杂交。原始数据连同相关样品信息通过GeneSpring GXv12.1.0(Agilent Technologies, USA)进行处理。微阵列数据保存于NCBI的Gene ExpressionOmnibus，并且可以通过GEO Series登录号访问。利用基因集富集分析(Gene SetEnrichment Analysis，GSEA)来分析在本研究中获得的微阵列数据(Subramanian, A.等人. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpretinggenome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 15545-15550,doi:10.1073/pnas.0506580102 (2005))。基因本体富集分析(Gene ontology enrichmentanalysis)通过Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery(DAVID) Bioinformatics Resources 6.7软件，根据提供商的说明而进行(参见Huang da,W., Sherman, B. T. & Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis oflarge gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc 4, 44-57,doi:10.1038/nprot.2008.211 (2009)、和Huang da, W., Sherman, B. T. & Lempicki,R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensivefunctional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res 37, 1-13, doi:10.1093/nar/gkn923 (2009))。
siRNA干扰
设计靶向人RUNX1、RUNX2、和RUNX3的特异性shRNA(四环素诱导性短发夹RNA)，并克隆到pENTR4-H1tetOx1、CS-RfA-ETBsd、CS-RfA-ETV、CS-RfA-ETR载体(RIKEN BRC)中。非靶向对照shRNA被设计为针对荧光素酶(sh_Luc.)。靶向序列示于表2。
[表2]
Figure 895040DEST_PATH_IMAGE014
统计
组间的统计学差异显著性用双侧非配对Student's t检验评价。2个种群中的方差齐性用F检验计算。差异在小于0.05的P值下被认为是统计学显著的。结果被表示为来自3个独立实验的平均±SEM值。移植实验中，动物被随机分配到各实验组，并且用盲检处理。小鼠的总体存活示于Kaplan-Meier曲线。所示的组间的存活使用对数秩检验来比较。为了分析癌患者的总体存活，将PrognoScan软件用于数据提取和最小P值的计算(参照Mizuno, H.,Kitada, K., Nakai, K. & Sarai, A., BMC Med Genomics 2, 18, doi:10.1186/1755-8794-2-18 (2009))。为了测量mRNA或蛋白质表达间的相关性，使用Spearman等级相关系数。
小鼠
NOD/Shi-scid,IL-2RγKO(NOG)小鼠由Central Institute for ExperimentalAnimals, Japan购买。所有实验中，将同窝仔用作对照。
实施例1：PI聚酰胺和缀合物的合成
通过连续连接4种吡咯-咪唑对，设计并合成特异性地识别RUNX共有结合序列5'-TGTGGT-3'和5'-TGCGGT-3'的PI聚酰胺(图1)。Chb-M'靶向5'-TGTGGT-3'，Chb-50靶向5'-TGCGGT-3'。作为对照，合成靶向5'-WGGCCW-3'序列的PI聚酰胺(Chb-S)(图1)。在此，W是指A或T。
总述
试剂和溶剂由标准供应商购买并且无需进一步提纯即使用。快速柱纯化通过使用C18 RediSep Rf Flash Column的CombiFlash Rf(Teledyne Isco, Inc.)实施。在Bio-TOFII(Bruker Daltonics)质谱仪上使用正离子模式实施电喷雾电离飞行时间质谱(ESI-TOFMS)。机器辅助的聚酰胺合成在用计算机辅助操作的PSSM-8(Shimadzu)系统上进行。质子核磁共振(1H NMR)谱用在600MHz下操作的JEOL JNM ECA-600波谱仪，以相对于被用作内部标准的四甲基硅烷的低场百万分数(ppm)进行记录。下述的缩写适用于自旋多重态：s(单重峰)、d(双重峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、quint(五重峰)、m(多重峰)。
Chb-M'的合成
通过Fmoc固相合成法，以分步反应制备肟树脂负载的PI聚酰胺。具有肟树脂的产物用N,N-二甲基-1,3-丙二胺(1.0mL)在45℃下裂解3小时。通过过滤去除树脂。将残留物溶解在最少量的二氯甲烷中，并且用二乙基醚清洗以生成59.6mg。向该粗化合物(59.6mg，48.1μmol)，添加N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(300μL)中的苯丁酸氮芥(32.6mg、107μmol)、PyBOP(苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷子基-磷鎓六氟磷酸盐)(101mg，195μmol)、和N,N-二异丙基乙基胺(100μL、581μmol)的溶液。将反应混合物在室温下温育1.5小时，用二乙基醚和DMF清洗3次，并且真空干燥。将该粗产物通过反相快速柱色谱(0.1%三氟乙酸水溶液/MeCN)提纯。冻干后，得到产物(30.2mg，19.8μmol)。烷基化剂苯丁酸氮芥对PI聚酰胺赋予更强力且不可逆的DNA结合能力。
通过相同的流程制备其他缀合物。
Figure 247524DEST_PATH_IMAGE015
Figure 190072DEST_PATH_IMAGE016
Figure 690324DEST_PATH_IMAGE017
Figure 110941DEST_PATH_IMAGE018
实施例2：利用PI聚酰胺缀合物的RUNX家族的簇调控
(1)RUNX1靶向基因的表达抑制
以mRNA水平，使用与烷基化剂苯丁酸氮芥缀合的PI聚酰胺(Chb-M'和Chb-50)，通过实时定量PCR(qRT-PCR)法，确认RUNX靶向基因的表达抑制。简而言之，将MV4-11细胞用5μM的Chb-M'或Chb-50处理6小时。从处理后的细胞中提取总RNA，然后经过qRT-PCR(参见上述“实时定量PCR(qRT-PCR)”)，对作为RUNX1的靶向基因的IL3、CSF2和CSF2RB的表达水平进行定量。作为对照，使用经DMSO处理的细胞。由各PI聚酰胺缀合物处理的细胞得到的值相对于用DMSO处理的细胞的值进行归一化(n=3)。
结果示于图2。Chb-M'和Chb-50有效地抑制了RUNX1靶向基因(IL3、CSF2RB和CSF2)的表达(图2)。
(2)BCL11A和TRIM24的表达抑制
以mRNA水平，除了1μM的Chb-M'和Chb-50之外以与上述(1)相同的方式，确认下述基因的表达抑制：作为p53的抑制因子而已知的BCL11A和TRIM24，两者均被报道为直接或间接地降解p53；以及p53的下游靶向基因p21、BAX、PUMA、和MDM2。结果示于图3。
进一步，以蛋白质水平，通过蛋白印迹法(参见上述“免疫印迹”)，确认BCL11A、TRIM24、p21、BAX、PUMA和MDM2、以及PARP和PARP的裂解形式、以及裂解半胱天冬蛋白酶-3的表达抑制。简而言之，将MV4-11细胞用1μM的Chb-M'或Chb-50处理24小时。将经处理的细胞溶解在蛋白质裂解缓冲液中。将全细胞提取物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，并且转移至聚偏二氟乙烯膜上。将膜用各抗体探测。对印迹进行检验并定量。作为对照，使用经DMSO处理的细胞。结果示于图4。
结果显示，通过用Chb-M'和Chb-50处理，下调了p53的抑制因子BCL11A和TRIM24的基因表达(图3)。尽管p53的mRNA表达量不变，但p21(细胞周期检查点基因)和PUMA(凋亡因子)的mRNA表达水平增加(图3)。以蛋白质水平，通过用Chb-M'和Chb-50处理，p53蛋白、和p53的下游蛋白(p21、BAX)的表达水平增加，并且p53抑制因子(BCL11A、TRIM24)的表达水平减少(图4)。这些结果表明，通过Chb-M'和Chb-50而增加的p53蛋白的表达水平并非基因的转录增强，而是由p53蛋白的增强的稳定性而导致的。进一步，裂解形式PARP和裂解半胱天冬蛋白酶-3的出现(图4)显示出p53的表达水平增强诱导的凋亡。
(3)通过RUNX家族调控而进行的基因表达谱的分析
以基因组水平，使用与烷基化剂苯丁酸氮芥缀合的PI聚酰胺(Chb-M'和Chb-50)，通过微阵列分析(参见上述“基因表达微阵列分析”)，确认基因表达谱。简而言之，将MV4-11细胞用1μM的Chb-M'或Chb-50处理6小时。将该细胞中前500个上调基因和前500个下调基因与敲减了RUNX基因家族的MV4-11细胞中的转录产物进行对比。其结果是，用Chb-M'或Chb-50处理的细胞中的基因表达谱与将RUNX家族的所有成员(RUNX1、RUNX2和RUNX3)的基因表达敲减了的细胞中的那些显著相关。
(4)癌细胞的生长抑制测定
测试通过不同浓度下的PI聚酰胺缀合物导致的表达功能性p53的一些AML细胞系(MV4-11、OCI-AML2、OCI-AML3和MOLM-13)的生长抑制。简而言之，将细胞设为1×105细胞/mL密度。向培养基添加不同浓度的PI聚酰胺缀合物(Chb-M'或Chb-50)，并且将细胞温育48小时(n=3)。将未添加PI聚酰胺缀合物时的细胞存活数用作对照(DMSO对照)。细胞存活率通过用Cell Count Reagent SF(nacalai tesque, Inc.)和Infinite (注册商标)200 PRO多模式读板仪(TECAN)，按照生产商的说明书，对存活细胞进行计数而评价。所得剂量-应答曲线示于图5。其结果是，Chb-M'和Chb-50对上述AML细胞以纳摩尔至低微摩尔水平高度有效。
(5)对各种癌细胞的抑制效果
研究了Chb-M'和Chb-50对多种起源的癌细胞的效果。具体而言，在表达功能性p53的下述癌细胞中，计算Chb-M'和Chb-50的50%抑制浓度(IC50)：AML细胞(MV4-11、OCI-AML2、OCI-AML3、MOLM-13)、ALL细胞(SU-Ph2、SU/SR、RS4-11)、淋巴瘤细胞(SU-DHL-5)、骨髄瘤细胞(KMS-12-BM)、肺癌细胞(A549、LU99A、NCI-H2228)、胃癌细胞(MKN45)、食管癌细胞(TE1)、乳腺癌细胞(HTB-27、DU4475、MCF7)、黑素瘤细胞(C32TG)、肾癌细胞(Caki-1)、和结肠癌细胞(HCT116、LOVO)。简而言之，将细胞培养为1×105细胞/mL密度。向培养基添加不同浓度的Chb-M'或Chb-50，并且将细胞温育48小时(n=3)。细胞存活率通过用Cell Count ReagentSF(nacalai tesque, Inc.)和Infinite (注册商标)200 PRO多模式读板仪(TECAN)，按照生产商的说明书，对存活细胞进行计数而评价。抑制50%增殖的剂量(IC50)通过中效法进行分析(Chou, T. C. & Talalay, P. Quantitative analysis of dose-effectrelationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors.Adv Enzyme Regul 22, 27-55 (1984))。另外，使用具有p53突变型或不具有p53的各种癌细胞(以下总称为“p53突变癌细胞”)实施相同测试。作为p53突变癌细胞，使用AML细胞(MV4-11NR、HL60、ME1、KG1a、THP1、Kasumi-1、NB4、K562)、ALL细胞(KOCL-45)、淋巴瘤细胞(Raji、Dauji)、肺癌细胞(ABC-1)、胃癌细胞(MKN7)、黑素瘤细胞(Mewo)、乳腺癌细胞(HCC1937、MDA-MB-231)、和食管癌细胞(TE5、TE11)。
结果示于图6(Chb-M')和图7(Chb-50)。如图6和图7明确所示，这些PI聚酰胺缀合物对包括急性骨髄性白血病(AML)、急性淋巴性白血病(ALL)、淋巴瘤、骨髄瘤、肺癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、黑素瘤、肾癌、和结肠癌在内的多种起源的癌细胞出乎意料地有效。特别地，在表达野生型p53的许多癌细胞和部分p53突变型细胞中，Chb-M'或Chb-50给药以5μM或更低的IC50值抑制了细胞生长。Chb-M'一般而言比Chb-50更强效，其理由可能在于，Chb-M'靶向RUNX的主要结合序列，而Chb-50靶向少数结合序列。
(5)与p53诱导剂联用的效果
这些PI聚酰胺缀合物被发现与表达功能性p53的癌细胞相比，在所测试的许多p53突变癌细胞中，具有减少的效能(图6和图7)。我们检验了缀合物与p53诱导剂联用的效果。具体而言，将MV4-11NR、HL60、KG1a、THP1、和Kasumi-1细胞在不同浓度的单独的Chb-M'或单独的p53诱导剂PRIMA-1的存在下、或者不同浓度的Chb-M'和5μM的PRIMA-1的组合的存在下，培养48小时(n=3)；并且计算IC50值。KG1a和HL60细胞不具有p53(p53null细胞系)。MV4-11NR、Kasumi-1和THP-1具有突变的p53(p53mut(+)细胞系)。各细胞中得到的IC50值示于表3。
[表3]
细胞 P53的状态 PRIMA-1单剂给药的IC50 (μM) Chb-M'单剂给药的IC50 (μM) Chb-M'与PRIMA-1(5μM)联用的IC50 (μM)
KG1a p53null >100 >100 >100
HL60 p53null 5.74 11.4 11.7
Kasumi-1 p53mut(+) 7.03 >100 0.359
THP-1 p53mut(+) 6.00 >100 0.5
MV4-11NR p53mut(+) 5.50 >100 0.00103
KG1a和HL60中，通过PRIMA-1的联用，Chb-M'的IC50值未发生变化，并且没有发现到联用的效果。Kasumi-1、THP-1和MV4-11NR中，通过PRIMA-1的联用，Chb-M'的所需量急剧减少。
接着，为了对Chb-M'和PRIMA-1的联用效果进行定量，使用COMPUSYN软件计算Chou-Talalay的联合指数CI定理(Combination index)(参见Chou, T. C. Theoreticalbasis, experimental design, and computerized simulation of synergism andantagonism in drug combination studies. Pharmacol Rev 58, 621-681, doi:10.1124/pr.58.3.10 (2006))。CI值＜1被认为是统计学显著的，其意味着协同效果。CI值相对于抑制细胞率Fa(Fraction affected，抑制效应)的描点示于图8。此外，Fa为0.5时的各细胞的CI值示于表4。
[表4]
细胞 P53的状态 CI (Fa = 0.5)
KG1a p53null 2.01
HL60 p53null 1.10
Kasumi-1 p53mut(+) 0.156
THP-1 p53mut(+) 0.249
MV4-11NR p53mut(+) 0.380
如上述结果明确示出那样，联合使用p53诱导剂PRIMA-1和Chb-M'与p53诱导剂或Chb-M'单剂给药的情况相比，示出对癌细胞增殖的更强的抑制效果，并且示出对细胞增殖的协同抑制效果。另外，使用p53诱导剂MIRA-1实施相同实验，并且得到了相同的结果。尽管本发明的PI聚酰胺缀合物可能在p53突变细胞(具有突变p53或不具有p53的癌细胞)中效能显著减弱，但与p53诱导剂联用能够抑制这样的p53突变细胞。这些结果暗示，Chb-M'发挥抗肿瘤效果的机理与p53诱导剂不同。
(6)体内抗肿瘤效果
1.PI聚酰胺缀合物的安全性测试
首先，为了检查PI聚酰胺缀合物的体内药理学的安全性，在小鼠中实施Chb-M'的急性毒理学测试。以不同浓度对NOD/Shi-scid,IL-2RγKO(NOG)小鼠注射Chb-M'。测量全血细胞计数、血液生物化学和体重(n=5)。结果示于图9。10mg/kg体重的Chb-M'注射导致血小板计数的轻微减少(图9(a))。该剂量比得到PI聚酰胺缀合物的药物学效果所需的量大30倍以上，确保了该分子在体内是高度可耐受的。
2.异种移植小鼠模型的制作
为了研究Chb-M'和Chb-50的体内抗肿瘤效果，使用NOG小鼠，制作人癌细胞系的异种移植小鼠模型。对于白血病小鼠模型，静脉内注射2.5×106细胞/只的MV4-11或SU/SR细胞。每周收集外周血(PB)，并且通过使用抗-人CD45抗体(BD Biosciences)检查嵌合现象。在第7天，开始各处理。对于制作肺癌小鼠模型，经由眼球后静脉注射1×106细胞/只的A549细胞。该肺癌细胞为了细胞转运而用由pLenti-荧光素酶载体(addgene)生产的表达荧光素酶的慢病毒进行转导。以150mg/kg体重腹膜内注射D-荧光素(Wako Pure ChemicalIndustries, Ltd.)，并且通过IVIS Spectrum In Vivo Imaging System(PerkinElmer)每周评价肿瘤体积的量。对于制作胃癌异种移植小鼠模型，在右背侧皮下注射1×106细胞/只的MKN45细胞。该胃癌细胞用荧光素酶标记，并且通过IVIS监测肿瘤生长。
3.AML小鼠模型中的抗肿瘤效果
对上述2中制作的异种移植AML小鼠模型，在移植后第7天每周2次静脉内注射320μg/kg体重的Chb-M'或Chb-50，以检验其效能(n=7)。作为对照，将小鼠用溶剂(二甲基亚砜：DMSO)(320μg/kg体重，每周2次静脉内注射)、苯丁酸氮芥(320μg/kg体重，每周2次静脉内注射)、Chb-S(320μg/kg体重，每周2次静脉内注射)、和阿糖胞苷(Ara-C)(Wako PureChemical Industries, Ltd.)(100mg/kg体重的腹腔内注射，连续5天(第7天至第11天))处理。在第14天，从AML小鼠中移出骨髄、肝脏、和脾脏组织，并且经受苏木精和伊红染色(以下也称为“H&E染色”)和用抗-人CD45抗体的免疫组织化学染色(以下也称为“hCD45染色”)，并且拍摄显微镜图像。H&E染色对造血组织进行染色。hCD45染色将人的造血细胞染色为棕色，并且对小鼠组织不染色。
通过各处理而进行的小鼠的存活试验的结果示于图10。如由图10可明确，用Chb-M'或Chb-50处理强效地延长(越2倍或更多)了该fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)突变阳性预后不良AML模型中的总生存期。
对于来自移植了MV4-11细胞的小鼠的骨髄组织的H&E染色，DMSO给药、阿糖胞苷给药或Chb-S给药导致几乎没有变化，并且组织被均匀的白血病细胞填充(放大4倍和20倍)。给药Chb-M'时，该均匀性丧失，并且图像变得接近正常骨髄图像(WT)(图11-1和图11-2)。对于hCD45染色，来自用DMSO、阿糖胞苷或Chb-S处理的小鼠的骨髄组织被白血病细胞填充(由于是人细胞，其在hCD45染色中被染色为棕色)(图11-1和图11-2)。相反，给药Chb-M'时，该棕色大部分消失，并且未染色的细胞(小鼠的骨髄细胞)占全部组织的大部分(图11-1和图11-2)。因此，发现通过Chb-M'给药，来自人的AML细胞消失。
对于来自移植了MV4-11细胞的小鼠的肝脏组织的hCD45染色，给药DMSO、阿糖胞苷、Chb-S或Chb-M'时，如来自无移植小鼠的组织(WT)那样，组织均未被染色为棕色。因此，发现AML细胞难以侵入肝脏。脾脏组织中，观察到相同结果。
MV4-11细胞示出对现有可用的抗癌剂阿糖胞苷的耐性。本发明的PI聚酰胺缀合物即使对这样的耐受现有抗癌剂的癌症也是体内有效的。
4.ALL小鼠模型中的抗肿瘤效果
对上述2中制作的异种移植AML小鼠模型，每周2次静脉内注射320μg/kg体重的Chb-M'，以检验其效能(n=5)。作为对照，用DMSO(320μg/kg体重，每周2次静脉内注射)和伊马替尼处理小鼠。伊马替尼处理通过从第7天起每天给药2次100mg/kg体重的伊马替尼甲磺酸盐(imatinib mesylate)(Focus Biomolecules)直至受体小鼠因该疾病死亡为止而实施。以与上述3相同的方式，从ALL小鼠中移出骨髄、肝脏、和脾脏组织，并且经受H&E染色和hCD45染色，并且拍摄显微镜图像。通过各处理而进行的小鼠的存活试验的结果示于图12。来自接受各处理的ALL小鼠的各组织的显微镜图像示于图13(骨髄)、图14(肝脏)和图15(脾脏)。
如由图12可明确地，即使在用费城染色体阳性(Ph+)细胞(SU/SR细胞)制作的异种移植ALL小鼠中，用Chb-M'处理也强效地(约1.8倍)延长总生存期。
对于来自异种移植ALL小鼠的骨髄组织的H&E染色，给药DMSO或伊马替尼导致几乎没有变化，并且组织被均匀的白血病细胞填充(放大4倍和20倍)。给药Chb-M'时，该均匀性丧失，并且图像接近正常骨髄图像(图13)。对于hCD45染色，来自用DMSO或伊马替尼处理的小鼠的组织被白血病细胞填充(由于是人的细胞，因此在hCD45染色中被染色为棕色)。但是，给药Chb-M'时，该棕色大部分消失，未染色的细胞(小鼠的骨髄细胞)占全部组织的大部分(图13)。即，发现通过Chb-M'给药，来自人的PhALL细胞几乎消失。
对于来自异种移植ALL小鼠的肝脏组织的hCD45染色，在DMSO给药组中，组织被染色为棕色(图14)。这表明，移植的人白血病细胞侵入肝脏。由于来自用伊马替尼给药处理的小鼠的组织也通过hCD45染色而被染色为棕色，因此发现通过伊马替尼给药，未抑制所移植的人phALL细胞对肝脏的侵入。另一方面，对于来自用Chb-M'给药处理的小鼠的组织的hCD45染色，棕色的PhALL细胞减少。因此，发现通过Chb-M'给药，癌细胞对肝脏的侵入减少(图14)。当然，对于来自未移植人癌细胞的小鼠(WT)的组织，未观察到被染色为棕色的组织。脾脏组织中，观察到相同结果(图15)。
SU/SR细胞具有T315I突变，其递送对当前可用的酪氨酸激酶抑制剂(例如伊马替尼)的耐性。本发明的PI聚酰胺缀合物即使对这样的耐受现有抗癌剂的癌症也是体内有效的。
5.肺癌小鼠模型中的抗肿瘤效果
对上述2中制作的异种移植肺癌小鼠模型，在移植后第7天开始用Chb-M'(320μg/kg体重，每周2次静脉内注射)、DMSO(320μg/kg体重，每周2次静脉内注射)或吉非替尼(gefitinib)(100mg/kg体重。每周5次口服给药)处理(n=5)。从移植后第7天起，每周腹腔内注射荧光素，通过IVIS拍摄而检查移植肺癌细胞的植活。此外，移植后第14天，从肺癌小鼠中移出肺组织，并且经受H&E染色和用抗-人Ki-67抗体的免疫组织化学染色，并且拍摄显微镜图像。结果示于图16~19。
如由图16可明确地，即使在用吉非替尼耐性肺腺癌细胞系(A549细胞)制作的异种移植肺癌小鼠中，用Chb-M'处理也强效地(约2倍)延长了总生存期。
另外，如由接受各处理的肺癌小鼠的IVIS图像可明确的，在人肺癌细胞移植后第7天(各药物给药前)，确认移植癌细胞在肺中的植活(图17，上图)。对于人肺癌细胞移植后第14天(各药物给药2次后)的小鼠，在DMSO给药组和吉非替尼给药组中，肺癌细胞在肺中致密增殖，并且荧光素酶的亮度增加(图17，中图)。另一方面，对于移植后第14天的Chb-M'给药小鼠，荧光素酶的亮度与移植后第7天相比反而减弱(图17，中图)。对于移植后第21天(药物给药总计4次)的小鼠，在DMSO给药组和吉非替尼给药组中，肺癌细胞进一步增殖，荧光素酶的亮度增加(即，肿瘤在肺中的总体积增加)(图17，下图)。另一方面，对于Chb-M'给药小鼠，荧光素酶的亮度进一步减弱(图17，下图)。此外，移植后第21天的IVIS图像中的生物发光信号强度的定量显示，与DMSO或吉非替尼给药处理的小鼠相比，Chb-M'处理小鼠中的强度远更低(图18)。
对于来自人肺癌移植小鼠的肺组织的H&E染色，在DMSO给药组和吉非替尼给药组中，肺泡被肺癌细胞致密填充，并且肺泡几乎不含空气(肺癌致密填满)，以使得肺泡中无法进行换气(图19，上两行)。Chb-M'给药组中，致密填满的肺癌细胞反而消失，并且肺泡充气(类似于未移植的正常肺泡像(WT)的图像)(图19，上两行)。
A549是耐受当前临床可用的针对上皮增殖因子受体(EGFR)的标准酪氨酸激酶抑制剂、例如吉非替尼和艾洛替尼(erlotinib)的人肺癌细胞系。事实上，吉非替尼对该肺癌模型没有示出效果(图16~图19)。与此相对地，Chb-M'在体内抑制了肺癌细胞的生长，并且最终与DMSO或吉非替尼给药组相比，延长了总生存期(图16)。因此，示出Chb-M'具有强抗肿瘤效果，并且在吉非替尼耐性肺癌中发挥效果。
6.胃癌小鼠模型中的抗肿瘤效果
对上述2中制作的异种移植胃癌小鼠模型，在移植后第7天开始用Chb-M'(320μg/kg体重，每周2次静脉内注射)或等量的DMSO处理(n=8)。移植后第7天至第35天，每周2次腹腔内注射荧光素，并且通过IVIS拍摄监测肿瘤生长。此外，移植后第35天，从胃癌小鼠中移出肿瘤移植物，基于高度、宽度和深度维度而确定胃癌体积。结果示于图20~22。
如由图20可明确的，Chb-M'给药组中，肿瘤生长被抑制，并且肿瘤尺寸与刚移植后相比几乎没有变化。这也由移植后第35天从小鼠中移出的肿瘤移植物的尺寸而确认(图22)。此外，根据IVIS图像，在移植后第7天(药物给药前)，确认了移植的癌细胞的植活(图21，上图)。移植后第21天(药物总计4次给药后)，DMSO给药组中胃癌生长，而Chb-M'给药组中胃癌尺寸减小(图21，中图)。移植后第35天(药物总计8次给药后)，DMSO给药组中进一步胃癌生长，而Chb-M'给药组中胃癌尽管略微生长，但与DMSO给药组相比生长远更小(图21，下图)。
MKN45细胞是耐受Her2抑制剂(其适应症包括Her2阳性胃癌的药物)的人胃癌细胞系。本发明的PI聚酰胺缀合物即使对这样的耐受现有抗癌剂的癌症也是体内有效的。
实施例3：作为反映总RUNX量的新型万能癌标志物的CBFβ
为了靶向整个RUNX家族成员以治疗癌症，检查癌组织和其对应的正常组织中的RUNX1、RUNX2、RUNX3和CBFβ的表达差异。基于先前报告的阵列数据集(Reference databasefor gene Expression Analysis; RefExA)(Ge, X.等人., Interpreting expressionprofiles of cancers by genome-wide survey of breadth of expression in normaltissues. Genomics 86, 127-141, doi:10.1016/j.ygeno.2005.04.008 (2005))，CBFβ的表达与其对应的正常组织相比，在癌组织中始终更高，同时各RUNX表达在癌症与其对应的正常组织之间多变。然而，令人感兴趣的是，通过上述“实时定量PCR(qRT-PCR)”方法，使用用于检测RUNX1-3的共同区域的引物而对AML细胞(MV4-11、MOLM-13、OCI-AML2、OCI-AML3、MV4-11NR、HL60、THP-1、KG1a、Kasumi-1)中的总RUNX表达(RUNX1+RUNX2+RUNX3)进行定量时，其与CBFβ的表达正相关(图23)。该现象也以蛋白质水平通过上述“免疫印迹”法而观察到(图24)。因此，显示出CBFβ表达可能是用于作为本发明的PI聚酰胺缀合物的靶向的全部RUNX家族成员的表达的替代标志物。CBFβ实际上是各种癌组织中mRNA水平上调最多的基因之一，表明了CBFβ作为宽泛种类癌症的肿瘤标志物的特性。
接着，研究了在各种起源的癌细胞系和其对应的正常组织中的CBFβ的蛋白质表达。使用AML细胞(MV4-11、MOLM-13、OCI-AML2、OCI-AML3、MV4-11NR、HL60、THP-1、KG1a、Kasumi-1)、ALL细胞(SU-Ph2、SU/SR、RS4；11、KOCL-45)、肺癌细胞(PC-3、Lu99a、A549)、乳腺癌细胞(DU4475、MCF-7、HTB-27、MDA-MB-231、HCC1937)、肾癌细胞(A498、786O、Caki-1)和黑素瘤细胞(C32TG、Mewo)。CBFβ的免疫印迹表明，CBFβ的表达即使以蛋白质水平，与其对应的正常组织相比，在癌细胞中也始终更高。进一步，发现在患有AML、多发性骨髓瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、和黑素瘤的患者中，具有高水平CBFβ表达的患者的总体存活率低于具有低水平CBFβ表达的患者。因此，显示出CBFβ的表达可能是遍及包括AML、多发性骨髓瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、和黑素瘤在内的各种癌的新型预后标志物。
实施例4：对CML(慢性骨髄性白血病)和PhALL(费城染色体阳性急性B细胞性白血 病)的抑制效果
CML和PhALL是由BCR-ABL融合蛋白引起的白血病。检验了Chb-M'和Chb-50对CML和PhALL细胞的效果。作为CML细胞，使用BV173细胞系和MYL细胞系(由Department ofHematology and Respiratory Medicine, Saga Medical School提供)。BV173和MYL均是具有野生型p53和野生型p210BCR-ABL的细胞系。作为PhALL细胞，使用SU-Ph2细胞系和SU/SR细胞系。SU-Ph2是具有野生型p190BCR-ABL的细胞系。SU/SR是载有具有T351I点突变的突变型p190BCR-ABL的酪氨酸激酶抑制剂耐性细胞系。
(1)BCR-ABL融合蛋白的表达抑制
向BV173细胞、MYL细胞、SU-Ph2细胞和SU/SR细胞，给药3μM或1μM的Chb-M'。6小时后，从细胞中提取总RNA，然后经受qRT-PCR(参见上述“实时定量PCR(qRT-PCR)”)，对BCR-ABL基因的表达水平进行定量。作为对照，给药DMSO。MYL细胞以及SU-Ph2细胞和SU/SR细胞的结果示于图25-1和图25-2。图中，表达水平被示为相对于DMSO(对照)给药组中的p210BCR-ABL mRNA水平或p190BCR-ABL mRNA水平的值。
向BV173细胞、MYL细胞、SU-Ph2细胞和SU/SR细胞，给药3μM或1μM的Chb-M'。24小时后，提取蛋白质，然后经受使用ABL抗体的蛋白印迹法(参见上述“免疫印迹”)，以确认BCR-ABL融合蛋白的蛋白质水平的表达。作为对照，给药DMSO。MYL细胞以及SU-Ph2细胞和SU/SR细胞的结果示于图26-1和图26-2。
如由图25-2可明确，Chb-M'处理的SU-Ph2和SU/SR中，p190BCR-ABL的mRNA水平减少。如由图25-1可明确，Chb-M'处理的MYL中，p210BCR-ABL的mRNA水平减少。同样地，Chb-M'处理的BV173中，p210BCR-ABL的mRNA水平减少。因此，Chb-M'以转录水平抑制了BCR-ABL融合蛋白。此外，如由图26-2可明确的，与DMSO(对照)给药细胞相比，p190BCR-ABL融合蛋白在Chb-M'给药细胞中消失。如由图26-1可明确的，与DMSO(对照)给药细胞相比，p210BCR-ABL融合蛋白在Chb-M'给药细胞中消失。同样地，在BV173的Chb-M'给药组中，与DMSO(对照)给药细胞相比，p210BCR-ABL融合蛋白也消失。因此，Chb-M'以蛋白质水平抑制了BCR-ABL融合蛋白。
进一步，通过ChIP(染色质免疫沉淀)测定，确认RUNX1结合至BCR的启动子区域。因此，发现Chb-M'结合至在BCR的启动子区域中存在的RUNX共有序列，并且以转录水平抑制了BCR-ABL融合蛋白。
进一步，用Chb-M'处理的MYL细胞中，通过蛋白印迹法(参见上述“免疫印迹”)确认Bcl2和C-Myc的蛋白质水平的表达。Bcl2是BCR-ABL融合蛋白的最下游的凋亡抑制因子。已知C-Myc是癌基因c-Myc的表达产物，并且在CML中转录诱导C-Myc。结果示于图26-3。
此外，向MYL细胞给药1.5μM或3μM的Chb-M'。48小时后，通过PI-AnnexinV凋亡染色，分析凋亡的百分比。其结果是，早期凋亡比率依赖于Chb-M'的浓度地增大(图26-4)。
(2)细胞生长抑制试验
向培养基添加不同浓度的Chb-M'，并且将MYL细胞温育48小时。向培养基添加不同浓度的各种药物(Chb-50、Chb-M'或伊马替尼)，并且将SU-Ph2细胞和SU/SR细胞温育48小时。使用Cell Count Reagent SF(nacalai tesque, Inc.)和Infinite (注册商标)200 PRO多模式读板仪(TECAN)，确定48小时后的细胞存活率，并且计算IC50值(50%存活率)(使用SF试剂的MTS测定)。结果示于图27-1和图27-2。
如由图27-1和图27-2可明确的，本发明的PI聚酰胺缀合物示出对CML细胞和PhALL细胞的细胞增殖抑制效果。进一步，如由图27-2可明确的，Chb50和Chb-M'在SU/Ph2和SU/SR两者中，示出与伊马替尼(酪氨酸激酶抑制剂)相比更低的IC50值。特别地，由于SU/SR细胞系是伊马替尼耐性株，因此伊马替尼显示出14.76μM的高IC50值，而Chb-50和Chb-M'分别示出1.42μM和0.044μM的低值。因此，Chb-50和Chb-M'两者均显著抑制了酪氨酸激酶耐性株。
如上所述，本发明的RUNX抑制剂对于由BCR-ABL融合蛋白引起的白血病是有效的。
实施例5：对骨髄微环境的效果
骨髄微环境(niche)是对于白血病细胞归巢(Homing)而言的重要部位。骨髄微环境中，血管内皮微环境和成骨细胞微环境是两种重要的微环境。E-选择素(E-Selectin)是仅在骨髄的血管内皮微环境中表达的重要因子。
(1)E-选择素的表达抑制
用不同浓度(0μM、0.5μM、1μM、或5μM)的Chb-M'处理HUVEC(人脐带静脉内皮细胞系)(ATCC目录编号：ATCC CRL-1730)6小时。HUVEC是其增殖未被Chb-M'抑制的细胞系(IC50值：50μM或更高)。6小时后，从细胞中提取总RNA，然后经受qRT-PCR(参见上述“实时定量PCR(qRT-PCR)”)，对E-选择素基因的表达水平进行定量。作为对照，对P-选择素、Tie2、ICAM-1、VCAM-1和Jagged-1的表达水平进行定量。结果示于图28。图中，在用Chb-M' 0μM(即对照(DMSO))处理的细胞中基因的mRNA表达水平为1时，对基因的相对mRNA表达水平作图。E-选择素1和E-选择素2用两种用于RE-选择素的RT-PCR引物进行定量。
如由图28可明确的，通过Chb-M'，以mRNA水平大幅抑制了E-选择素、P-选择素、和VCAM-1。
(2)E-选择素的表达水平的体外变化
使用HUVEC，通过FACS(荧光活化细胞分选仪)来分析通过RUNX抑制剂和RUNX敲减而导致的E-选择素的表达水平的变化。向HUVEC给药1μM的Chb-M'。24小时后，使用不同抗体用于免疫染色，并且测量CD62E(E-选择素)在细胞表面的表达变化。作为对照，给药DMSO。将通过sh_RUNX1 #2敲减了RUNX1基因表达的HUVEC，使用不同抗体用于免疫染色，并且测量CD62E(E-选择素)在细胞表面的表达变化。作为对照，通过靶向荧光素酶的siRNA(sh_Luc.)敲减细胞。作为抗体，使用抗-人CD62E(E-选择素)抗体(eBioscience制造)、和抗-人CD62E(E-选择素)抗体的同型抗体(小鼠IgG1)(eBioscience制造)。
结果示于图29。图29的上图示出Chb-M'给药的结果，并且下图示出RUNX1敲减的结果。上图中，“DMSO”表示用抗-人CD62E(E-选择素)抗体对DMSO处理的细胞进行染色的结果，“Chb-M'”表示用抗-人CD62E(E-选择素)抗体对Chb-M'处理的细胞进行染色的结果，“同型DMSO”表示用抗-人CD62E(E-选择素)抗体的同型抗体(小鼠IgG1)染色的DMSO处理的细胞的阴性对照，并且“同型Chb-M'”表示用抗-人CD62E(E-选择素)抗体的同型抗体(小鼠IgG1)染色的Chb-M'处理的细胞的阴性对照。下图中，“sh.Luc E-选择素”表示用抗-人CD62E(E-选择素)抗体染色的对照Luc shRNAi细胞的阴性对照，“sh.Rx1#2 E-选择素”表示用抗-人CD62E(E-选择素)抗体染色的sh_RUNX1处理的细胞的结果，“sh.Luc同型”表示其中细胞用抗-人CD62E(E-选择素)抗体的同型抗体(小鼠IgG1)染色的阴性对照，并且“sh.Rx1#2_同型”表示其中细胞用抗-人CD62E(E-选择素)抗体的同型抗体(小鼠IgG1)染色的阴性对照。
如由图29可明确的，用Chb-M'处理和sh_RUNX1处理均导致与对照相比E-选择素的表达减少。另外，通过ChIP测定，确认E-选择素的SELE启动子中存在RUNX共有序列。因此，发现Chb-M'抑制RUNX1对作为E-选择素基因的SELE启动子的结合，并且这导致作为在血管微环境中存在的粘附因子的E-选择素的表达水平减少。
(3) E-选择素的表达水平的体内变化
在体内检验Chb-M'给药而导致的骨髄内皮细胞中E-选择素的表达水平的变化。向正常小鼠，经过2周给药6次DMSO(对照)或Chb-M'(每次给药320μg/kg)。最终给药24小时后(Chb-M'已从小鼠体内清除的状态下)，收集股骨和胫骨，从其中移出骨髄造血细胞，并且回收内皮细胞并经受FACS分析。对CD45阴性细胞(不具有骨髄造血细胞的骨髄细胞)进行门控(gate)，并且通过FACS分析CD31阳性细胞(血管内皮标志物阳性)Lin阴性CD45阴性CD31阳性E-选择素阳性细胞(E-选择素が阳性的骨髄血管内皮细胞)的比率。实验方案的示意性说明示于图30。结果示于图31。
如由图31可明确的，Chb-M'给药组中，内皮细胞中的E-选择素表达水平显著减少。即，Chb-M'在体内抑制了骨髄血管内皮细胞中的E-选择素表达。
(4)归巢测定
白血病干细胞迁移至特定的远离位点被称为“归巢效应”。本实验中，通过静脉注射移植白血病干细胞，然后测量向骨髄迁移并在微小环境中存活的白血病干细胞数。
使用逆转录病毒载体，用MLL-ENL白血病融合基因转染小鼠骨髄(B6)。将转染的细胞反复传代培养，以获得永生化的小鼠白血病细胞(用GFP标记的MLL-ENL白血病细胞)。向正常B6小鼠，经过2周给药6次DMSO(对照)或Chb-M'(每次给药320μg/kg)。最终给药24小时后(Chb-M'从体内完全清除的状态下：聚酰胺的半衰期为约5小时)，将小鼠经受放射线照射，并且从尾静脉注入1×107个MLL-ENL白血病细胞。24小时后，从右股骨和左股骨收集骨髄细胞和脾脏，并且通过FACS分析在骨髄和脾脏中存在的MLL-ENL细胞数。实验方案的示意性说明示于图32。结果示于图33。
如由图33可明确，Chb-M'处理组中，骨髄中的MLL-ENL细胞数小于对照组。即，已发现E-选择素减少时，白血病干细胞(MLL-ENL-GFP)难以在骨髄中存活。另一方面，Chb-M'处理组中，脾脏中白血病细胞数增加。因此，发现白血病细胞变得难以存在于骨髄中。
根据上述结果，已发现本发明的RUNX抑制剂不仅对白血病细胞有效，而且对白血病细胞粘附的微小环境(微环境)侧也是有效的。因此，暗示了本发明的RUNX抑制剂增强了抗癌剂的效果，并且对在骨髄微环境中清除微小残留病变是有效的。
实施例6：对Her2阳性胃癌的效果
Her2阳性胃癌中，通过作为RTK(Receptor Tyrosine Kinase，受体酪氨酸激酶)的Her2而增强PI3-AKT信号和MAPK-ERK信号，从而增加细胞增殖。Her2受细胞膜下的GRB2-SOS1衔接蛋白调控。该衔接蛋白增强并活化时，Her2被磷酸化且维持活化。
向MKN45胃癌细胞系(Her2抑制剂耐性细胞系)给药1μM的Chb-M'。48小时后，通过蛋白印迹法(参见上述“免疫印迹”)，评价Her2、p-ERK、ERK、p-AKT和AKT的蛋白质表达。作为对照，给药DMSO。结果示于图34。
此外，向MKN45胃癌细胞系给药0.1μM、1μM或10μM的Chb-M'。48小时后，通过蛋白印迹法(参见上述“免疫印迹”)，评价SOS1、p-Her2(磷酸化Her2)、和Her2的蛋白质表达。作为对照，给药DMSO。结果示于图35。
向MKN45胃癌细胞系给药1μM的Chb-M'。6小时后，使用qRT-PCR(参见上述“实时定量PCR(qRT-PCR)”)，通过RT-PCR法评价SOS1的mRNA水平。作为对照，给药DMSO。结果示于图36。图中，SOS1的mRNA表达水平被表示为相对于DMSO处理组中的值。
如由图34可明确的，尽管通过Chb-M'抑制了Her2蛋白表达，但ERK蛋白和AKT蛋白的总量没有改变。另一方面，ERK蛋白和AKT蛋白的磷酸化形式被Chb-M'抑制，并且p-ERK(磷酸化ERK)和p-AKT(磷酸化AKT)的信号减弱。此外，如由图35和图36可明确的，Chb-M'抑制了SOS1的表达和Her2的磷酸化。因此，已发现Chb-M'抑制RUNX1从而抑制Her2蛋白表达，并且也抑制SOS1衔接蛋白的表达从而抑制Her2的磷酸化。
实施例7：对EGFR野生型肺腺癌[EGFR抑制剂(吉非替尼)耐性肺癌细胞系]的效果
(1)对EGFR野生型p53野生型肺腺癌细胞系的效果
向培养基添加不同浓度的各种药物(Chb-M'、吉非替尼或苯丁酸氮芥)，将EGFR野生型p53野生型肺腺癌细胞系(A549和LU99A)温育48小时。使用Cell Count Reagent SF(nacalai tesque, Inc.)和Infinite (注册商标)200 PRO多模式读板仪(TECAN)，确定48小时后的细胞存活率，并且计算IC50值(50%存活率)(使用SF试剂的MTS测定)。结果示于图37。
如由图37可知，Chb-M'在A549细胞系和LU99A细胞系两者中显示出与EGFR抑制剂(吉非替尼)相比更低的IC50值。因此，本发明的RUNX抑制剂对于EGFR野生型的非小细胞肺癌是有效的。
(2)对EGFR野生型p53突变型肺腺癌细胞系的效果
向培养基添加不同浓度的各种药物(Chb-M'、吉非替尼、苯丁酸氮芥或Chb-S)，将EGFR野生型p53突变型肺腺癌细胞系(ABC-1和RERF-LC-MS)温育48小时。使用Cell CountReagent SF(nacalai tesque, Inc.)和Infinite (注册商标)200 PRO多模式读板仪(TECAN)，确定48小时后的细胞存活率，并且计算IC50值(50%存活率)(使用SF试剂的MTS测定)。结果示于图38。
如由图38可明确的，Chb-M'在ABC-1细胞系和RERF-LC-MS细胞系两者中显示出与EGFR抑制剂(吉非替尼)相比更低的IC50值。但是，与对p53野生型肺腺癌细胞系A549细胞和LU99A细胞的效果(图37)相比，抗肿瘤活性略微减弱。
(3)对EGFR信号的效果
向LU99A细胞和A549细胞，给药1μM的Chb-M'。24小时后，通过蛋白印迹法(参见上述“免疫印迹”)，评价Mig6的蛋白质表达。作为对照，给药DMSO。结果示于图39。
如由图39可明确的，在LU99A细胞和A549细胞两者中，通过Chb-M'增强了Mig6的表达水平。Mig6已知作为负向调节EGFR信号的因子。因此，本发明的RUNX抑制剂可能通过增强Mig6而抑制EGFR野生型肺腺癌。
(4)凋亡诱导效果
向A549细胞和LU99A细胞，给药1μM的Chb-M'。24小时后，通过蛋白印迹法(参见上述“免疫印迹”)，评价凋亡相关因子(p53、p21、PUMA和BAX)的表达水平。作为对照，给药DMSO。结果示于图40。图中，“C-M”表示Chb-M'给药组。
如由图40可明确的，通过Chb-M'增强了p53和p21，并且凋亡因子例如PUMA、BAX增强。因此，示出本发明的RUNX抑制剂在肺癌细胞中诱导凋亡。
实施例8：对人肥大细胞的效果
肥大细胞通过受体介导的活化而引起症状或疾病、例如过敏反应。此外，c-kit信号转导增强了来自受刺激的肥大细胞的化学介质释放。检验了RUNX抑制剂对人肥大细胞的效果。作为人肥大细胞，使用LAD2细胞系(表达野生型c-kit)和HMC-1.2细胞系(表达突变型c-kit)。HMC-1.2细胞系具有KIT D816V突变和V560G突变。野生型c-kit是SCF的受体，并且细胞增殖依赖于SCF。因此，对于LAD2细胞系，给药50ng/ml的SCF，并如下所述地实施实验。HMC-1.2细胞系在c-kit具有突变，并且细胞增殖不依赖于SCF。因此，对于HMC-1.2细胞系，不给药SCF，并如下所述地实施实验。作为RUNX抑制剂，使用Chb-M'。LAD2细胞系由Dr.Kirshenbaum AS和Dr. Metcalfe DD(Laboratory of Allergic Diseases, NIAID, NIH)提供。HMC-1.2细胞系由Dr. Nilsson G(Department of Genetics and Pathology,Uppsala University)建立，并由Dr. Metcalfe DD(Laboratory of Allergic Diseases,NIAID, NIH)提供。
(1)对KIT细胞表面表达的效果
向LAD2细胞系，给药10μM的Chb-M'。3小时和18小时后，将不同抗体用于在细胞表面表达的c-kit的免疫染色，并且通过FACS(荧光活化细胞分选仪)分析表达水平。向HMC-1.2细胞系，给药10μM的Chb-M'。18小时后，将不同抗体用于在细胞表面表达的c-kit的免疫染色，并且通过FACS分析表达水平。作为对照，替代Chb-M'而使用DMSO进行相同实验。作为抗体，使用抗-人CD117(c-kit)抗体(克隆104D2,BioLegend制造)、和小鼠IgG1,κ同型Ctrl(FC)抗体(克隆MOPC-21,BioLegend制造)。
结果示于图41。图中，“DMSO”表示用抗-人c-kit抗体染色的DMSO处理的细胞的结果。“Chb-M'”表示用抗-人c-kit抗体染色的Chb-M'处理的细胞的结果。“同型对照,DMSO”表示用抗-人c-kit抗体的同型抗体染色的DMSO处理的细胞中的阴性对照的结果。“同型对照,Chb-M'”表示用抗-c-kit抗体的同型抗体染色的Chb-M'处理的细胞中的阴性对照的结果。“MFI”表示平均荧光强度。
如由图41可明确的，用Chb-M'处理在18小时处理后导致在LAD2细胞系(野生型c-kit)和HMC-1.2细胞系(突变型c-kit)两者中，c-kit的表面表达水平减少。即，LAD2细胞系中，用DMSO处理18小时后的MFI为68.3，而用Chb-M'处理18小时后的MFI为48.8。HMC-1.2细胞系中，用DMSO处理18小时后的MFI为113，而用Chb-M'处理18小时后的MFI为100。基于这些实验，已发现Chb-M'在肥大细胞中抑制c-kit(野生型c-kit和突变型c-kit两者)的细胞表面表达。
(2)对KIT总量的效果
向LAD2细胞系和HMC-1.2细胞系，给药10μM的Chb-M'。培养细胞18小时后，从该细胞得到提取液，并且通过使用不同抗体的蛋白印迹分析(参见上述“免疫印迹”)，分析c-kit、磷酸化c-kit、AKT、磷酸化AKT、Mitf、和GAPDH的蛋白质表达水平。AKT是c-kit下游的重要信号蛋白。Mitf是c-kit的代表性的转录驱动因子。作为对照，给药DMSO。结果示于图42。图中，“KIT”表示c-kit，“pKIT”表示磷酸化c-kit，并且“pAKT”表示磷酸化AKT。应予说明，作为一次抗体，使用抗-c-Kit抗体(Ab81,Cell Signaling Technology制造)、抗-磷酸化c-Kit(Tyr719)抗体(Cell Signaling Technology制造)、抗-Akt抗体(Cell SignalingTechnology制造)、抗-磷酸化-Akt抗体(Ser473)(Cell Signaling Technology制造)、抗-Mitf抗体(Cosmo Bio制造)、抗-GAPDH抗体(0411,Santa Cruz Biotechnology, Inc.制造)。作为二次抗体，使用ECLTM抗-小鼠IgG辣根过氧化物酶连接的全抗体(GE Healthcare制造)、和ECLTM抗-兔IgG连接的全抗体(GE Healthcare制造)。
如由图42可明确的，LAD2细胞系中，通过Chb-M'抑制c-kit蛋白表达，并且还通过Chb-M'抑制了作为c-kit的活性形式的磷酸化c-kit蛋白。尽管AKT的总量未因Chb-M'而显著改变，但通过Chb-M'减少了磷酸化AKT的蛋白量。Mitf的蛋白表达水平未受到Chb-M'影响。
HMC-1.2细胞系中，通过Chb-M'，抑制了c-kit和磷酸化c-kit的表达水平。已报告，一般而言，突变型c-kit被运输至内溶酶体(endolysosomes)而非细胞膜，并激活Akt。对于HMC-1.2细胞系，从上述(1)所示的FACS的结果来看，据信细胞质内的c-kit主导地减少。实际上，如图42所示那样，由于用Chb-M'处理的HMC-1.2细胞系在c-kit的总量方面明显减少，因此已发现在HMC-1.2细胞系中，通过Chb-M'抑制了细胞内的c-kit。另外，对于pAKT，观察到蛋白质量方面的略微减少。
基于上述结果，已发现对于野生型c-kit，Chb-M'导致c-kit总量的显著减少，并且抑制了c-kit下游信号。另一方面，确认了对于突变型c-kit，Chb-M'与在细胞表面相比，显著抑制了细胞质内的c-kit蛋白质。基于这些实验，已发现Chb-M'导致在肥大细胞中c-kit(野生型c-kit和突变型c-kit两者)的总量减少。
进一步，通过ChIP测定，确认了RUNX1在肥大细胞(HMC-1.2细胞系)中结合至c-kit的内含子1。因此，已发现Chb-M'以转录水平抑制了对于肥大细胞中的细胞增殖而言必不可少的c-kit蛋白质。因此，Chb-M'可以调节肥大细胞中的过敏反应。另外，Chb-M'导致具有突变型c-kit的肥大细胞(HMC-1.2细胞系)中的c-kit表达减少，并且导致细胞增殖抑制。
由以上的结果，暗示了RUNX1调控c-kit表达，并且可以是人肥大细胞疾病中的新型治疗靶向。
实施例9：对结肠癌的效果
向培养基添加不同浓度的各种药物(Chb-M'、或苯丁酸氮芥)，并将p53突变型结肠癌细胞系HT29(由JCRB Cell Bank 购买)温育72小时。使用Cell Count Reagent SF(nacalai tesque, Inc.)和Infinite (注册商标)200 PRO多模式读板仪(TECAN)，按照生产商的说明书，确定72小时后的细胞存活率(图43)、和IC50值(50%存活率)(使用SF试剂的MTS测定)(表5)。如由图43可明确的，Chb-M'抑制HT29细胞的增殖。
[表5]
试剂 IC50 (μM)
苯丁酸氮芥 无法测量
Chb-M' 2.92
实施例10：对前列腺癌的效果
(1)细胞增殖抑制试验
向培养基添加不同浓度的各种药物(Chb-M'、Chb-S、苯丁酸氮芥或恩杂鲁胺(Entaluzamide))，并将前列腺癌细胞系PC-3(p53null/PTEN del/雄激素非依赖性)(由ATCC购买)、DU-145(雄激素非依赖性)(由JCRB CELL BANK购买)、和LNCaP(雄激素依赖性)(由ATCC购买)温育48小时。使用Cell Count Reagent SF(nacalai tesque, Inc.)和Infinite(注册商标)200 PRO多模式读板仪(TECAN)，确定48小时后的细胞存活率，并计算IC50值(50%存活率)(使用SF试剂的MTS测定)。结果示于图44和表6。
[表6]
试剂 PC-3细胞中的IC50 (μM) DU-145细胞中的IC50 (μM) LNCaP细胞中的IC50 (μM)
Chb-M' 0.62 1.82 0.68
Chb-S 25.11 107.87 107.87
苯丁酸氮芥 N/A 38.08 37.57
恩杂鲁胺 88.144 47.17 -
如由图44可明确的，Chb-M'显著抑制雄激素依赖性和非依赖性两者的前列腺癌细胞系的增殖。此外，Chb-M'与其他试剂相比，示出远更小的IC50值(PC-3中为0.62μM，DU-145中为1.82μM，或LNCaP中为0.68μM)。
(2)前列腺癌相关因子的表达抑制
向前列腺癌细胞系PC-3，给药5μM的Chb-M'。6小时后，通过qRT-PCR(参见上述“实时定量PCR(qRT-PCR)”)，评价作为对前列腺癌细胞增殖而言重要的基因的GATA2、E2F5、和AR(雄激素受体)的mRNA水平。作为对照，给药DMSO。结果示于图45。图中， GATA2、E2F5和AR的mRNA表达水平被表示为相对于DMSO处理组中的表达水平的值。如由图45可明确的，通过Chb-M'，以转录水平抑制了GATA2、E2F5和AR的表达。
(3)凋亡诱导效果
向PC-3细胞，给药3μM的Chb-M'。48小时和72小时后，通过PI-AnnexinV凋亡染色，分析凋亡的百分比。作为对照，给药DMSO。其结果是，凋亡的比率依赖于Chb-M'的浓度地增大(图46)。
实施例11：对脑瘤的效果
(1)细胞增殖试验
向培养基添加不同浓度的各种药物(Chb-M'、Chb-S或苯丁酸氮芥)，并将髓母细胞瘤细胞系DAOY(SHH,TP53突变型)温育48小时。使用Cell Count Reagent SF(nacalaitesque, Inc.)和Infinite(注册商标)200 PRO多模式读板仪(TECAN)，确定48小时后的细胞存活率，并计算IC50值(50%存活率)(使用SF试剂的MTS测定)。结果示于图47和表7。如由图47可明确的，Chb-M'显著抑制了髓母细胞瘤细胞系的增殖。此外，Chb-M'与其他试剂相比，示出远更小的IC50值(0.812μM)。
[表7]
试剂 IC50 (μM)
Chb-M' 0.812
Chb-S 39.33
苯丁酸氮芥 18.17
(2)髓母细胞瘤相关因子的表达抑制
向髓母细胞瘤细胞系DAOY，给药1μM的Chb-M'。6小时后，通过qRT-PCR(参见上述“实时定量PCR(qRT-PCR)”)，评价作为对于髓母细胞瘤而言重要的癌促进因子ROR1和ROR2的mRNA水平。作为对照，给药DMSO。结果示于图48。图中，ROR1和ROR2的mRNA表达水平被表示为相对于DMSO处理组中的表达水平的值。如由图48可明确的，通过Chb-M'，以转录水平抑制了ROR家族的表达。
向DAOY细胞，给药1μM的Chb-M'。24小时后，提取蛋白质，并且使用抗-ROR1抗体和抗-ROR2抗体，通过蛋白印迹法(参见上述“免疫印迹”)，确认ROR1和ROR2的蛋白质水平的表达。作为对照，给药DMSO。结果示于图49。如由图49可明确的，Chb-M'以蛋白质水平抑制了ROR2的表达。ROR1的表达极弱，以至于检测不到。
实施例12：对急性前骨髓细胞白血病(APL：acute promyelocytic leukemia)的效果
向培养基添加Chb-M'、或ATRA(全反式视黄酸：维生素A衍生物)，并将p53突变型APL细胞系 NB4(由DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)购买)或p53-null APL细胞系 UF1(由Department of Hematology and Oncology, KeioUniversity School of Medicine提供)温育48小时或72小时。使用Cell Count ReagentSF(nacalai tesque, Inc.)和Infinite(注册商标)200 PRO多模式读板仪(TECAN)，确定细胞存活率，并计算IC50值(50%存活率)(使用SF试剂的MTS测定)。结果示于图50-1和图50-2以及表8。应予说明，ATRA是用于APL的一般临床治疗的一线治疗药物。
[表8]
Figure 583510DEST_PATH_IMAGE019
如由图50-1和图50-2以及表8可明确的，Chb-M'显著抑制APL细胞系的增殖。Chb-M'在作为p53突变型细胞系的NB4中也显示出显著的细胞增殖抑制 (图50-1和表8)。尽管与NB4相比，ATRA对UF1略微更有效，但NB4和UF1两者均是ATRA耐性的(图50-2和表8)。Chb-M'在ATRA耐性APL细胞系中也对细胞增殖示出抑制效果(图50-1、表8)。
工业实用性
本发明的RUNX抑制剂能够抑制RUNX家族的所有成员的活性。包含本发明的RUNX抑制剂的抗肿瘤剂可以通过RUNX家族的簇调控而靶向包括白血病在内的各种类型的癌。本发明的抗肿瘤剂甚至对耐受其他分子靶向治疗药的肿瘤也发挥其效果。特别地，本发明的抗肿瘤剂甚至对当前临床可用的分子靶向治疗药无效的癌也发挥其效果。因此本发明的抗肿瘤剂被期待用作即使对所谓难治性癌症也有效的通用抗癌剂。此外，本发明的RUNX抑制剂可以被用作抗过敏剂。
序列表自由文本
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SEQ ID NO:32：CBFB基因扩增的反义引物。
序列表
<110> Kyoto University
<120> RUNX抑制剂
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<150> JP2016-150560
<151> 2016-7-29
<150> JP2016-234399
<151> 2016-12-01
<150> JP2017-072380
<151> 2017-3-31
<160> 37
<170> PatentIn 版本3.5
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<213> 北斗萤火虫 (Photinus pyralisd)
<400> 37
cgtacgcgga atacttcga 19

Claims (9)

1.RUNX抑制剂，其中，该抑制剂包含烷基化剂与吡咯-咪唑聚酰胺的缀合物，所述吡咯-咪唑聚酰胺结合至DNA上的RUNX结合序列而抑制RUNX家族成员对该结合序列的结合，并且
所述缀合物选自式I或式II所示的化合物：
[化学式1]
Figure DEST_PATH_IMAGE001
[化学式2]
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中，式I或式II中，
X1表示CH或N，X2表示CH或N，X3表示CH或N，X4表示CH或N，X5表示CH或N，X6表示CH或N，X7表示CH或N，X8表示CH或N，
Y表示酰胺键、磷酰二硫键、酯键、配位键、或醚键、或者表示含有形成选自这些键中的一种以上的官能团的部分，m表示0~5的整数；
R1表示H或烷基，R2表示H或烷基，R3表示H或烷基，R4表示H或烷基，R5表示H或烷基，R6表示H或烷基，R7表示H或烷基，R8表示H或烷基，
R9表示H或NHR11，R10表示H或NHR11，
R11表示H、生物素或荧光基团，
R表示烷基化剂。
2.根据权利要求1所述的RUNX抑制剂，其中，烷基化剂选自苯丁酸氮芥、倍癌霉素、seco-CBI(1-氯甲基-5-羟基-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚)、吡咯并苯并二氮杂䓬和氮芥。
3.根据权利要求2所述的RUNX抑制剂，其中，烷基化剂是苯丁酸氮芥。
4.根据权利要求3所述的RUNX抑制剂，其中，苯丁酸氮芥与吡咯-咪唑聚酰胺的缀合物选自下述式所示的化合物：
[化学式3]
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的RUNX抑制剂，其抑制RUNX家族的所有成员对RUNX结合序列的结合。
6.药物组合物，其是抗肿瘤剂，包含权利要求1~5中任一项所述的RUNX抑制剂。
7.药物组合物，其是抗过敏剂，包含权利要求1~5中任一项所述的RUNX抑制剂。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，其与另一种抗肿瘤剂组合使用。
9.根据权利要求6或8所述的药物组合物，其用于预防或治疗选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肺癌、食管癌、胃癌、结肠癌、肾细胞癌、神经母细胞瘤、皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌和脑瘤中的至少一种。
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