JPWO2017187696A1 - 神経細胞を培養する装置、神経細胞を培養する方法、培養された神経細胞、軸索束内のプロテインを解析及び同定する方法並びに神経細胞の使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)control PBS (Phosphate Buffered Saline) washing>>>culture medium
(2)H2O2 3hour treatment>>>PBS washing>>>culture medium
(3)H2O2 3hour treatment>>>PBS washing>>>culture medium containing Edaravone
処理を行ってから2日後に、マーカーであるTau 1 で免疫染色した後、評価を行った。なお、評価項目は、Directionality:軸索の方向性である。具体的には、図22内のオブジェクトの方向性を計測した。この場合、0度が流路(チャネル13)方向である。軸索は、束になっていて同じ方向に延びているので、チャネル13内で、例えば、図22(b)に示されるように、酸化ストレスを付与したときや、図22(c)に示されるように、酸化ストレスと、神経疾患の薬剤として用いられる抗酸化剤(Edaravone )とを同時に付与したときの形態変化を比較することができる。そして、図23に示されるような評価実験の結果は、酸化ストレスを付与すると、軸索方向に伸展する軸索が変性するので、流路方向(0度)への方向性が減少し複雑な形状に変化することを示している。形態変化の評価として、図23に示されるオブジェクトの配向性(Directionality)を調べると、負荷をかけていないnegative controlの軸索束の配向性が高く、次に、薬剤及びストレスを付与したとき、その次に、酸化ストレスだけを付与したとき、という順で、配向性の差を観ることができた。これにより、神経細胞が受けたストレスを、軸索の形態変化として、画像処理に基づいて評価することができることが分かる。
11 モジュール
12a 第1チャンバー
12b 第2チャンバー
13 チャネル
15 基板
16 上板
17 シール部材
18 培養液
21 カッター
22 ピペット
Claims (15)
- 軸索を有する神経細胞を培養する装置であって、
培養プレート(10)と、
該培養プレート(10)内に配置された複数のモジュール(11)であって、各モジュール(11)は、神経細胞の細胞体を受容可能な第1チャンバー(12a)を少なくとも1つ、第2チャンバー(12b)を少なくとも1つ、及び、細胞体から延びた軸索束を受容可能なチャネル(13)であって前記第1チャンバー(12a)と第2チャンバー(12b)とを接続するチャネル(13)を少なくとも1つ含むモジュール(11)と、
を備え、
前記第1チャンバー(12a)、第2チャンバー(12b)及びチャネル(13)の下端が閉止され、前記第1チャンバー(12a)及び第2チャンバー(12b)の上端が開放されている装置。 - 前記第1チャンバー(12a)、第2チャンバー(12b)及びチャネル(13)内に培養液(18)が入れられ、前記第2チャンバー(12b)の上端が少なくとも1つのシール部材(17)によって閉止される請求項1に記載の装置。
- 前記第2チャンバー(12b)は骨格筋を受容可能であり、これにより、細胞体から延びた軸索束が骨格筋に接合する請求項1に記載の装置。
- 前記チャネル(13)は、幅100〜150〔μm〕及び高さ100〜200〔μm〕である請求項1に記載の装置。
- 軸索を有する神経細胞を培養する方法であって、
第1チャンバー(12a)の少なくとも1つ、第2チャンバー(12b)の少なくとも1つ、及び、前記第1チャンバー(12a)と第2チャンバー(12b)とを接続するチャネル(13)の少なくとも1つに培養液を供給するステップであって、前記第1チャンバー(12a)、第2チャンバー(12b)及びチャネル(13)は培養プレート(10)内に配置されたモジュール(11)の少なくとも1つに含まれているステップと、
前記第1チャンバー(12a)内に神経細胞を播種するステップと、
前記神経細胞を培養し、これにより、軸索束が成長して各チャネル(13)内を延びるステップと、
を備える方法。 - 前記第2チャンバー(12b)の少なくとも1つに骨格筋が播種され、これにより、神経細胞から延びた軸索束が骨格筋に接合する請求項5に記載の方法。
- 培養液内に播種することによって培養された複数の神経細胞であって、
細胞体と、該細胞体から所定の方向に延びた少なくとも1つの軸索束とを備える神経細胞。 - 前記細胞体、軸索束及び軸索末端は、空間的に分離されている請求項7に記載の神経細胞。
- 前記神経細胞はスフェロイド状であり、前記軸索束は伸展可能である請求項7に記載の神経細胞。
- 前記軸索束は骨格筋に接合する請求項7に記載の神経細胞。
- 培養液内に播種することによって培養された複数の神経細胞であって、
細胞体と、該細胞体から所定の方向に延びた少なくとも1つの軸索束とを備え、該軸索束は細胞体を含んでいない神経細胞。 - 軸索束内のプロテインを解析及び同定する方法であって、
軸索束の少なくとも1つが成長して神経細胞の細胞体から伸展するように神経細胞を培養するステップと、
ウェスタンブロッティングによって、前記軸索束内では、前記細胞体の存在を示すマーカーがネガティブであることを確認するステップと、
を備える方法。 - 前記マーカーは、マップ2(Map2)及びヌクレオポリン(Nucleoporin)である請求項12に記載の方法。
- 軸索束内のプロテインを解析及び同定する方法であって、
軸索束の少なくとも1つが成長して神経細胞の細胞体から伸展するように神経細胞を培養するステップと、
前記軸索束をスライスするステップと、
前記軸索束内に存在するプロテインを解析及び同定するステップと、
を備える方法。 - 軸索束を含む神経細胞を使用する方法であって、
軸索束の少なくとも1つが成長して神経細胞の細胞体から伸展するように神経細胞を培養するステップと、
前記神経細胞に蛍光処理を施すステップと、
電気生理学的活動を観察するために前記細胞体にKClを付与するステップと、
を備える方法。
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