JP6430680B2 - 神経細胞を培養する装置、神経細胞を培養する方法、培養された神経細胞、軸索束内のプロテインを解析及び同定する方法並びに神経細胞の使用方法 - Google Patents
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Description
(1)control PBS (Phosphate Buffered Saline) washing>>>culture medium
(2)H2O2 3hour treatment>>>PBS washing>>>culture medium
(3)H2O2 3hour treatment>>>PBS washing>>>culture medium containing Edaravone
処理を行ってから2日後に、マーカーであるTau 1 で免疫染色した後、評価を行った。なお、評価項目は、Directionality:軸索の方向性である。具体的には、図22内のオブジェクトの方向性を計測した。この場合、0度が流路(チャネル13)方向である。軸索は、束になっていて同じ方向に延びているので、チャネル13内で、例えば、図22(b)に示されるように、酸化ストレスを付与したときや、図22(c)に示されるように、酸化ストレスと、神経疾患の薬剤として用いられる抗酸化剤(Edaravone )とを同時に付与したときの形態変化を比較することができる。そして、図23に示されるような評価実験の結果は、酸化ストレスを付与すると、軸索方向に伸展する軸索が変性するので、流路方向(0度)への方向性が減少し複雑な形状に変化することを示している。形態変化の評価として、図23に示されるオブジェクトの配向性(Directionality)を調べると、負荷をかけていないnegative controlの軸索束の配向性が高く、次に、薬剤及びストレスを付与したとき、その次に、酸化ストレスだけを付与したとき、という順で、配向性の差を観ることができた。これにより、神経細胞が受けたストレスを、軸索の形態変化として、画像処理に基づいて評価することができることが分かる。
11 モジュール
12a 第1チャンバー
12b 第2チャンバー
13 チャネル
15 基板
16 上板
17 シール部材
18 培養液
21 カッター
22 ピペット
Claims (17)
- 細胞体と軸索とを有する複数の神経細胞から成る神経細胞の密集体であって、1つのスフェロイドと、該スフェロイドから1方向に延びる1つの軸索束とを有する神経細胞の密集体を培養する装置であって、
培養プレート(10)と、
該培養プレート(10)内に配置された複数のモジュール(11)であって、各モジュール(11)は、神経細胞の細胞体を受容可能な第1チャンバー(12a)を1つ、第2チャンバー(12b)を1つ、及び、細胞体から延びた軸索束を受容可能なチャネル(13)であって前記第1チャンバー(12a)と第2チャンバー(12b)とを接続するチャネル(13)を1つ含むモジュール(11)と、
を備え、
前記第1チャンバー(12a)、第2チャンバー(12b)及びチャネル(13)の下端が閉止され、前記第1チャンバー(12a)及び第2チャンバー(12b)の上端が開放され、前記チャネル(13)は、幅100〜150〔μm〕及び高さ100〜200〔μm〕であり、長さ1〔mm〕以上である装置。 - 前記第2チャンバー(12b)は骨格筋を受容可能であり、これにより、細胞体から延びた軸索束が骨格筋に接合する請求項1に記載の装置。
- 細胞体と軸索とを有する複数の神経細胞から成る神経細胞の密集体であって、1つのスフェロイドと、該スフェロイドから1方向に延びる1つの軸索束とを有する神経細胞の密集体を培養する方法であって、
1つの第1チャンバー(12a)、1つの第2チャンバー(12b)、及び、前記第1チャンバー(12a)と第2チャンバー(12b)とを接続する長さ1〔mm〕以上、幅100〜150〔μm〕及び高さ100〜200〔μm〕の1つのチャネル(13)に培養液を供給するステップであって、前記第1チャンバー(12a)、第2チャンバー(12b)及びチャネル(13)は培養プレート(10)内に配置されたモジュール(11)の1つに含まれているステップと、
前記第1チャンバー(12a)内に1つのスフェロイドを播種するステップと、
前記神経細胞を培養し、これにより、前記1つのスフェロイドから1つの軸索束が成長して前記チャネル(13)内を延びるステップと、
を備える方法。 - 前記第2チャンバー(12b)に骨格筋が播種され、これにより、前記スフェロイドから延びた軸索束が骨格筋に接合する請求項3に記載の方法。
- 細胞体と軸索とを有する複数の神経細胞から成る神経細胞の密集体であって、1つのスフェロイドと、該スフェロイドから1方向に延びる1つの軸索束とを有する神経細胞の密集体における前記軸索束内の純度を確認する方法であって、
請求項3に記載の方法により、1つの軸索束が成長して1つのスフェロイドから伸展するように神経細胞を培養して、該神経細胞の密集体が、1つのスフェロイドと、該スフェロイドから1方向に延びる長さ1〔mm〕以上の1つの軸索束とを有する状態にするステップと、
前記軸索束を対象にプロテインを解析及び同定し、該プロテインの解析及び同定により、前記軸索束が、ウェスタンブロッティングによる細胞体の存在を示すマーカーがネガティブであることに相当する程度に細胞体が不存在な状態であることを確認するステップと、
を備える方法。 - 前記マーカーは、マップ2(Map2)及びヌクレオポリン(Nucleoporin)である請求項5に記載の方法。
- 細胞体と軸索とを有する複数の神経細胞から成る神経細胞の密集体であって、1つのスフェロイドと、該スフェロイドから1方向に延びる1つの軸索束とを有する神経細胞の密集体における前記軸索束内のプロテインを解析及び同定する方法であって、
請求項3に記載の方法により、1つの軸索束が成長して1つのスフェロイドから伸展するように神経細胞を培養するステップと、
前記軸索束をスライスするステップと、
前記軸索束内に存在するプロテインを解析及び同定するステップと、を備える方法。 - 細胞体と軸索とを有する複数の神経細胞から成る神経細胞の密集体であって、1つのスフェロイドと、該スフェロイドから1方向に延びる1つの軸索束とを有する神経細胞の密集体を使用する方法であって、
請求項3に記載の方法により、1つの軸索束が成長して1つのスフェロイドから伸展するように神経細胞を培養するステップと、
前記神経細胞に蛍光処理を施すステップと、
前記神経細胞を刺激するステップと、
を備える方法。 - 前記神経細胞に蛍光処理を施すステップが、前記神経細胞にカルシウム応答性蛍光色素を取り込ませるステップである請求項8に記載の方法。
- 前記神経細胞を刺激するステップが、電気生理学的活動を観察するために前記神経細胞にKCIを付与するステップである請求項8に記載の方法。
- 細胞体と軸索とを有する複数の神経細胞から成る神経細胞の密集体であって、1つのスフェロイドと、該スフェロイドから1方向に延びる1つの軸索束とを有する神経細胞の密集体における前記軸索束内のプロテインを解析及び同定する方法であって、
請求項3に記載の方法により、1つの軸索束が成長して1つのスフェロイドから伸展するように神経細胞を培養するステップと、
前記軸索束をスライスするステップと、
免疫染色法によって、前記軸索束内に存在するプロテインを解析及び同定するステップと、
を備える方法。 - ヒトiPS細胞由来の細胞体と該細胞体から延びた軸索とを有する複数の神経細胞から成る神経細胞の密集体であって、
該神経細胞の密集体は、1つのスフェロイドと、該スフェロイドから1方向に延びる長さ1〔mm〕以上の1つの軸索束とを有し、
前記スフェロイドは複数の細胞体の密集体であり、
前記軸索束は複数の軸索の束であって、前記軸索束内では、ウェスタンブロッティングによる細胞体の存在を示すマーカーがネガティブであることに相当する程度に細胞体が不存在な状態を示す、
神経細胞の密集体。 - 前記軸索束が4.5〔mm〕以上の長さを有する請求項12に記載の神経細胞の密集体。
- 前記スフェロイドがグリア細胞を含む請求項12又は13に記載の神経細胞の密集体。
- 前記神経細胞の密集体は単離されている請求項12〜14のいずれか1項に記載の神経細胞の密集体。
- 前記神経細胞の密集体は運動神経細胞である請求項12〜15のいずれか1項に記載の神経細胞の密集体。
- 前記軸索束は軸索末端において骨格筋細胞と接合する請求項16に記載の神経細胞の密集体。
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