JPWO2017061097A1 - 培養容器の表示用シール - Google Patents
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Abstract
Description
一方、患者の胚を培養するシャーレは、個別管理されるため、マジックでの記載やシールによるサンプルの識別が行われているが、これまで培養シャーレに貼付するシールが、受精卵の胚発生に悪影響を及ぼす可能性については考えられていなかった。
[1]基材層の片面に水溶性粘着剤層が形成されてなり、アウトガスの発生が低減又は抑制されていることを特徴とする、哺乳類受精卵又は細胞の培養に用いる培養容器表面に貼付するための表示用シール。
[2]哺乳類がヒトであることを特徴とする上記[1]に記載の表示用シール。
[3]アウトガスの成分の1つとして、2−プロパノールが含まれることを特徴とする上記[1]又は[2]に記載の表示用シール。
[4]アウトガスレスであることを特徴とする上記[1]〜[3]のいずれかに記載の表示用シール。
[5]採取された哺乳類受精卵、又は哺乳類細胞を、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の表示用シールを貼付した培養容器中で培養することを特徴とする受精卵又は細胞の培養方法。
[6]哺乳類がヒトであることを特徴とする上記[5]に記載の培養方法。
[7]上記[1]〜[4]のいずれかに記載の表示用シールを備えたことを特徴とする、哺乳類受精卵又は細胞の培養に用いるためのキット。
[8]哺乳類がヒトであることを特徴とする上記[7]に記載のキット。
胚発生における、表示用シールから放出されるアウトガスの影響を確認するために、以下の〔1〕〜〔3〕の手順の方法にしたがって検討を行った。
1−1 方法
〔1〕アウトガスレスの水溶性粘着シールとして、アウトガスが極めて少ない粘着テープ(厚さ:0.075mm、製品番号:H−41177−50、LINTEC社製)を、縦8mm、横28mmとなるように切断したものを用いた。また、アウトガスのシールとして、ASONE社製のシール(縦:8mm、横:28mm、厚さ:0.07mm、製品番号:72150)を用いた。これら2種類のシールを、培養ディッシュ(3002、falcon社製)の蓋上面の内側に7枚、及び側周面内側に6枚貼り、培養ディッシュ(1008、falcon社製)上に滴(ドロップ)状の培養液(4mg/mLBSA[Bovine serum albumin]を含有するM16培養液)(20μL/滴)をのせ、その上をパラフィンオイル(OVOIL、VitroLife社製)(3mL/ディッシュ)で覆った後、蓋を除いた培養ディッシュ(3002、falcon社製)の上に置いた(図1参照)。なお、コントロールとしてラベルシールを貼らない培養ディッシュを用いた実験を行った。
〔2〕滴状の培養液中にマウス受精卵を入れた後、インキュベーター(37℃、5%O2、5%CO2、90%N2)内で培養した。なお、マウス受精卵は、8週齢の雄BDF1と雌BDF1を用いて定法にしたがって体外受精を行い作製した。
〔3〕培養後2日目に、分割(卵割)した受精卵の数を算出し(表1、図2〜4の2日目参照)、培養後5日目に、胚盤胞に到達した受精卵の数を算出するとともに(表1、図2〜4の5日目参照)、Gardner分類により胚盤胞の発生ステージ(グレード1;初期胚盤胞[内腔が全体の1/2以下]、グレード2;胚盤胞[内腔が全体の1/2以上]、グレード3;完全胚盤胞、グレード4;拡張胚盤胞、グレード5;孵化中胚盤胞、及びグレード6;孵化後胚盤胞)を評価した(表2、図2〜4の5日目参照)。
まず、アウトガスの水溶性粘着シール(図5の「サンプル3」参照)をアウトガスレス処理したもの、すなわち、アウトガスレスの水溶性粘着シール(図5の「サンプル2」参照)におけるアウトガス量が検出感度以下であることを、GC−MSを用いた解析により確認した。
アウトガスのシールを貼った培養ディッシュを用いて受精卵を培養した場合、シールを貼らなかった培養ディッシュを用いた場合と比べ、分割する受精卵の割合は9%と少なく、また、胚盤胞に到達した受精卵は全くなかった(表1参照)。一方、アウトガスレスの水溶性粘着シールを貼った培養ディッシュを用いて受精卵を培養した場合、シールを貼らなかった培養ディッシュを用いた場合と同様に、受精卵のすべてが分割し、胚盤胞に到達した受精卵の割合は約90%と高く、そのほとんどが良好胚の目安とされているグレード3(完全胚盤胞)以上の胚盤胞であることが確認された(表1参照)。
以上の結果は、揮発性物質の発生が低減又は抑制された水溶性粘着シールは、受精卵の胚発生に悪影響を及ぼすことがないため、ヒト受精卵の培養に用いる培養容器表面に貼付するための表示用シールとして用いることができることを示している。
アウトガスのシールを培養ディッシュに貼付すると、シールから放出された揮発性物質が培養液中に溶解し、受精卵の胚発生に悪影響を及ぼすと考えられる。そこで、胚発生に悪影響を及ぼす揮発性物質を特定するために、以下の〔1〕〜〔3〕の手順の方法にしたがって検討を行った。
2−1 方法
〔1〕実施例1で用いた2種類のシール(アウトガスレスの水溶性粘着シール及びアウトガスのシール)を、培養ディッシュ(3002、falcon社製)の蓋上面の内側に7枚、及び側周面内側に6枚貼り、培養ディッシュ(1008、falcon社製)上に滴状の培養液(4mg/mLBSA[Bovine serum albumin]を含有するM16培養液)(20μL/滴)をのせ、その上をパラフィンオイル(OVOIL、VitroLife社製)(3mL/ディッシュ)で覆った後、蓋を除いた培養ディッシュ(3002、falcon社製)の上に置いた(図1参照)。なお、コントロールとしてラベルシールを貼らない培養ディッシュを用いた実験を行った。
〔2〕インキュベーター(37℃、5%O2、5%CO2、90%N2)内で5日間インキュベートした後、培養液サンプルをヘッドスペースバイアルに回収した。
〔3〕培養液サンプルを60℃で1時間加熱処理した後、測定装置(GCMS-TQ8030、島津社製)及びカラム(InertCap 1、GLサイエンス社製)を用いたGC−MSにより解析した。なお、コントロールとしてアウトガスのシール(ASONE社製)自体を加熱処理したもの(表3の「シールサンプル」参照)も、GC−MSにより解析した。
アウトガスレスのシールを用いてインキュベートした場合、エタノール以外の揮発性物質は検出されなかったのに対して(表3の「培養液サンプル アウトガスレス」参照)、アウトガスのシールを用いてインキュベートした場合、エタノールに加えて2−プロパノールが検出された(表3の「培養液サンプル アウトガス」参照)。この結果から、胚発生に悪影響を及ぼす揮発性物質の1つとして、2−プロパノールが同定された。
なお、エタノールは、シールを貼付しなかった培養液サンプルでも検出されたことから(表3の「培養液サンプル −」参照)、アウトガスレスのシールで検出されたエタノールは、シールから放出されたものではなく、殺菌・消毒に用いた空気中のエタノールが混入したものと考えられる。
アウトガスのシールを培養ディッシュに貼付すると、培養液中の2−プロパノールは検出感度以下であった。そこで、アウトガスのシール自体が、どの程度2−プロパノールを放出しているかについて、定量解析した。
3−1 方法
実施例1で用いた2種類のシール(アウトガスレスの水溶性粘着シール及びアウトガスのシール)を、60℃で1時間加熱処理した後、測定装置(GCMS-TQ8030、島津社製)及びカラム(InertCap 1、GLサイエンス社製)を用いたGC−MSにより定量解析した。
Claims (8)
- 基材層の片面に水溶性粘着剤層が形成されてなり、アウトガスの発生が低減又は抑制されていることを特徴とする、哺乳類受精卵又は細胞の培養に用いる培養容器表面に貼付するための表示用シール。
- 哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項1に記載の表示用シール。
- アウトガスの成分の1つとして、2−プロパノールが含まれることを特徴とする請求項1又は2に記載の表示用シール。
- アウトガスレスであることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の表示用シール。
- 採取された哺乳類受精卵、又は哺乳類細胞を、請求項1〜4のいずれかに記載の表示用シールを貼付した培養容器中で培養することを特徴とする受精卵又は細胞の培養方法。
- 哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項5に記載の培養方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の表示用シールを備えたことを特徴とする、哺乳類受精卵又は細胞の培養に用いるためのキット。
- 哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項7に記載のキット。
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