JPWO2016185518A1

JPWO2016185518A1 - 原子間力顕微鏡の情報取得方法

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Publication number: JPWO2016185518A1
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Inventors: 酒井　信明; 信明酒井
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Abstract

原子間力顕微鏡の情報取得方法は、カンチレバーの自由端に設けられた探針と試料の間に力学的な相互作用を生じさせながらカンチレバーと試料を相対的にラスター走査させるあいだ、探針と試料の間に第一の大きさを有する第一の相互作用を生じさせる第一の相互作用生成工程と、探針と試料の間に第一の相互作用が生じているときの試料の第一の情報を取得する第一の情報取得工程と、探針と試料の間に第二の大きさを有する第二の相互作用を生じさせる第二の相互作用生成工程と、探針と試料の間に第二の相互作用が生じているときの試料の第二の情報を取得する第二の情報取得工程とを有している。第一の相互作用の第一の大きさと第二の相互作用の第二の大きさは互いに異なっている。第一の相互作用生成工程と第一の情報取得工程と第二の相互作用生成工程と第二の情報取得工程は同一走査領域において行われる。

Description

本発明は、走査型プローブ顕微鏡、特に生物試料の観察に用いられる原子間力顕微鏡に関する。

走査型プローブ顕微鏡(ＳＰＭ)は機械的探針を機械的に走査して試料表面の情報を得る走査型顕微鏡であって、走査型トンネリング顕微鏡(ＳＴＭ)、原子間力顕微鏡(ＡＦＭ)、走査型磁気力顕微鏡(ＭＦＭ)、走査型電気容量顕微鏡(ＳＣａＭ)、走査型近接場光顕微鏡(ＳＮＯＭ)などの総称である。

走査型プローブ顕微鏡は、機械的探針と試料とを相対的にＸＹ方向にラスター走査し、試料の所望とする表面情報を機械的探針を介して得てディスプレイ上にマッピング表示することができる。なかでも原子間力顕微鏡（以下、ＡＦＭと呼ぶ）は、最も広く使用されている装置であり、機械的探針をその自由端に持つカンチレバー、カンチレバーの変位を検出する光学式変位センサ、カンチレバーと試料とを相対的に走査するスキャナを備えている。そして、機械的探針と試料の間に力学的な相互作用を生じさせ、その力学的な相互作用によって生じるカンチレバーの変形に基づいて試料の情報を得る。

近年、液体中の生きた生物試料の動く様子が観察可能な生体動画観察用ＡＦＭが注目を集めている。この生体動画観察用ＡＦＭにおいては液体中の生きた細胞の観察も可能である。最近では、細胞表面の情報と、細胞内部にある細胞小器官の情報、例えばアクチンフィラメントやミトコンドリアの情報をそれぞれ単独に取得した事例が「Yoshida A, Sakai N, Uekusa Y, Deguchi K, Gilmore JL, Kumeta M, Ito S, Takeyasu K. (2015) "Probing in vivo dynamics of mitochondria and cortical actin networks using high-speed atomic force/fluorescence microscopy", Genes Cells, 2015 Feb, 20(2):85-94」において発表されている。

上記事例に示した細胞表面の情報や細胞内部にある細胞小器官の情報を取得する場合、細胞表面と細胞内部の相互関係も重要な情報になる。しかしながら、従来の生体動画観察用ＡＦＭにおいては、細胞表面と細胞内部をそれぞれ単独で取得できる可能性は示唆されているとしても、それらの情報を関連づけて取得しようと試みはなされていない。

本発明は、カンチレバーの自由端に設けられた探針を試料と接触させ、それらの間に力学的な相互作用を生じさせながら、ＸＹ平面に沿ってカンチレバーと試料を相対的にラスター走査させて試料の情報を取得する原子間力顕微鏡の情報取得方法に向けられている。その方法は、前記探針と前記試料の間に第一の大きさを有する第一の相互作用を生じさせる第一の相互作用生成工程と、前記探針と前記試料の間に前記第一の相互作用が生じているときの前記試料の第一の情報を取得する第一の情報取得工程と、前記探針と前記試料の間に第二の大きさを有する第二の相互作用を生じさせる第二の相互作用生成工程と、前記探針と前記試料の間に前記第二の相互作用が生じているときの前記試料の第二の情報を取得する第二の情報取得工程とを有している。前記第一の相互作用の前記第一の大きさと前記第二の相互作用の前記第二の大きさは互いに異なっている。前記第一の相互作用生成工程と前記第一の情報取得工程と前記第二の相互作用生成工程と前記第二の情報取得工程は同一走査領域において行われる。

この原子間力顕微鏡の情報取得方法においては、例えば細胞の表面情報と内部情報の相互関係の情報を得ることが可能になる。

図１は、実施形態において共通に使用され得る原子間力顕微鏡の構成を示している。図２は、試料に対するカンチレバーの相対的なラスター走査の動きを示している。図３は、図２に示されたラスター走査を行うためのＸ走査信号とＹ走査信号を示している。図４は、第一実施形態による原子間力顕微鏡の情報取得方法のフローチャートである。図５は、第一実施形態の情報取得方法におけるＸ走査信号とＹ走査信号と試料情報表示器に表示される試料の第一の情報と試料の第二の情報を示している。図６は、試料である細胞を示している。図７は、図６の細胞の領域Ｆを、相互作用を小さくして観察した例を示している。図８は、図６の細胞の領域Ｆを、相互作用を大きくして観察した例を示している。図９は、第一実施形態の情報取得方法によって試料情報表示器に表示される観察画像の例を示している。図１０Ａは、試料に対するカンチレバーのラスター走査の１走査ラインの往路を強調して示している。図１０Ｂは、試料に対するカンチレバーのラスター走査の１走査ラインの復路を強調して示している。図１１Ａは、ラスター走査を行うためのＸ走査信号とＹ走査信号を示しており、図１０Ａに強調して示された往路に対応するＸ走査信号の部分を強調して示している。図１１Ｂは、ラスター走査を行うためのＸ走査信号とＹ走査信号を示しており、図１０Ｂに強調して示された復路に対応するＸ走査信号の部分を強調して示している。図１２は、第二実施形態による原子間力顕微鏡の情報取得方法のフローチャートである。図１３は、第二実施形態の情報取得方法におけるＸ走査信号とＹ走査信号と試料情報表示器に表示される試料の第一の情報と試料の第二の情報を示している。図１４は、第二実施形態の変形例による原子間力顕微鏡の情報取得方法のフローチャートである。図１５は、第二実施形態の変形例の情報取得方法におけるＸ走査信号とＹ走査信号と試料情報表示器に表示される試料の第一の情報と試料の第二の情報を示している。図１６は、第三実施形態による原子間力顕微鏡の情報取得方法のフローチャートである。図１７は、第三実施形態の情報取得方法におけるＸ走査信号とＹ走査信号と試料情報表示器に表示される試料の第一の情報と試料の第二の情報を示している。図１８は、第四実施形態による原子間力顕微鏡の情報取得方法のフローチャートである。図１９は、第四実施形態の情報取得方法によって試料情報表示器に表示される観察画像の例を示している。図２０は、第五実施形態による原子間力顕微鏡の情報取得方法のフローチャートである。図２１は、第六実施形態による原子間力顕微鏡の情報取得方法のフローチャートである。

［原子間力顕微鏡］
原子間力顕微鏡の情報取得方法の実施形態の説明に先立ち、実施形態において共通に使用され得る原子間力顕微鏡の構成について図１〜図３を用いて説明する。図１は、原子間力顕微鏡の構成を示している。

原子間力顕微鏡は、自由端に探針１０１をもつカンチレバー１０２を有している。カンチレバー１０２は、探針１０１が試料１０３と正対するように配置される。このカンチレバー１０２はホルダ１０４に保持される。

ホルダ１０４上には圧電素子１０５が設けられている。圧電素子１０５は、ホルダ１０４を介してカンチレバー１０２を振動させる加振器として動作する。この圧電素子１０５は、コントローラ１１０から出力される加振信号に基づいてカンチレバー１０２を振動させる。この加振信号は、カンチレバー１０２をその機械的共振周波数近傍で振動させるための交流成分を含んでいる。

カンチレバー１０２の上部には、カンチレバー１０２の変位を光学的に検出するための光てこセンサ１０６が配置されている。光てこセンサ１０６からは、カンチレバー１０２の振動状態信号が出力される。この振動状態信号は、コントローラ１１０に供給される。

試料１０３は、Ｚスキャナ１０７上に図示しない試料台を介して保持されており、Ｚスキャナ１０７はＸＹスキャナ１０８上に配置されている。ＸＹスキャナ１０８は、Ｘスキャナ１０８ａとＹスキャナ１０８ｂで構成されている。試料１０３は、図示しない液体セル中にある。この試料１０３は、例えば、液体中の生きた細胞である。

Ｚスキャナ１０７は、試料１０３を、カンチレバー１０２に対してＺ方向に沿って走査させるものである。Ｚスキャナ１０７は、コントローラ１１０により制御され、コントローラ１１０から出力されるＺ走査信号に基づいてＺ方向に沿って伸縮し、それによって試料１０３を、カンチレバー１０２に対してＺ方向に沿って走査させる。このＺ走査信号は、カンチレバー１０２の振動状態信号の例えば振幅値を一定に保つようＺスキャナ１０７を制御するための信号であり、このＺ走査信号によって、カンチレバー１０２と試料１０３のＺ方向に沿った相対距離が制御される。すなわちコントローラ１１０によって、探針１０１と試料１０３の間の力学的な相互作用の大きさを制御し得る。

ＸＹスキャナ１０８は、試料１０３を、カンチレバー１０２に対してＸＹ平面に沿ってラスター走査させるものである。ＸＹスキャナ１０８を構成するＸスキャナ１０８ａとＹスキャナ１０８ｂは、コントローラ１１０により制御され、コントローラ１１０から出力されるＸ走査信号とＹ走査信号に基づいて、それぞれＸ方向とＹ方向に沿って変位し、それによって試料１０３を、カンチレバー１０２に対してＸＹ平面に沿ってラスター走査させる。

図２は、試料１０３に対するカンチレバー１０２の相対的なラスター走査の動きを示している。このラスター走査の動きは従来の一般的なものである。図２において、ラスター走査の走査線方向（走査速度の速い方向）をＸ方向とする。

図３は、図２に示されたラスター走査を行うためのＸ走査信号とＹ走査信号を示している。

コントローラ１１０は、Ｘ走査信号とＹ走査信号とＺ走査信号に基づいて、試料の情報をマッピングするための画像データを生成し取得し、試料情報表示器１１１に供給する。

試料情報表示器１１１は、例えばモニターであり、コントローラ１１０で取得された画像データ、すなわち試料情報を表示する。

コントローラ１１０には、入力部１１２が接続されている。入力部１１２は、例えば、後述する各実施形態の情報取得方法をコントローラ１１０に実行させるプログラムを、原子間力顕微鏡を制御するコントローラ１１０にインストールしたり、観察領域を指定したり、観察開始や観察終了などの指令をコントローラ１１０に出したりするためのものである。

［第一実施形態］
次に、第一実施形態による原子間力顕微鏡の情報取得方法について図４と図５を用いて説明する。図４は、第一実施形態による原子間力顕微鏡の情報取得方法のフローチャートである。また図５は、第一実施形態の情報取得方法におけるＸ走査信号とＹ走査信号と試料情報表示器１１１に表示される試料１０３の第一の情報と試料１０３の第二の情報を示している。

本実施形態の情報取得方法は、１回のラスター走査の１走査ライン毎に試料１０３の第一の情報と試料１０３の第二の情報を交互に取得する手法である。

ステップＳ１０１において、観察（試料の情報取得）を開始する。コントローラ１１０から加振信号が出力され、加振器として動作する圧電素子１０５に供給される。圧電素子１０５は、加振信号に基づいてカンチレバー１０２をその機械的共振周波数近傍で振動させる。カンチレバー１０２の上部に配置された光てこセンサ１０６は、カンチレバー１０２の振動状態を検出し、振動状態信号をコントローラ１１０に供給する。コントローラ１１０は、振動状態信号に基づいてＺ走査信号を生成し、Ｚスキャナ１０７を伸縮動作させて試料１０３とカンチレバー１０２のＺ方向に沿った相対距離を制御する。

ステップＳ１０２において、コントローラ１１０は、Ｘ走査信号とＹ走査信号を出力する。ＸＹスキャナ１０８は、Ｘ走査信号とＹ走査信号を受けて、試料１０３のカンチレバー１０２に対するＸＹ平面に沿ったラスター走査を開始する。

ステップＳ１０３において、コントローラ１１０は、今のラスター走査の走査ライン（Ｘ走査信号による走査ライン）が奇数番目であるか偶数番目であるかを判断する。ここでは、１走査ラインは、Ｘ方向に関する一往復に対応していると想定されている。

ステップＳ１０３の判断の結果、走査ラインが奇数番目である場合、例えば１番目である場合、コントローラ１１０は、ステップＳ１０４において、カンチレバー１０２と試料１０３のＺ方向に沿った相対距離を調節して探針１０１と試料１０３の間の力学的な相互作用を調節し、第一の大きさを有する第一の相互作用を探針１０１と試料１０３の間に生じさせる。例えば、コントローラ１１０は、カンチレバー１０２と試料１０３のＺ方向に沿った相対距離を大きくして探針１０１と試料１０３の間の力学的な相互作用を小さくし、第一の大きさを有する第一の相互作用を探針１０１と試料１０３の間に生じさせる。

ステップＳ１０５において、コントローラ１１０は、Ｘ走査信号とＹ走査信号とＺ走査信号に基づいて、試料１０３の第一の情報をマッピングするための１走査ライン分の画像データ、すなわち１走査ライン分の試料１０３の第一の情報を生成し、取得する。試料１０３の第一の情報は、探針１０１と試料１０３の間に小さい相互作用が生じているときの試料の情報であり、例えば、試料の表面の情報である。

ステップＳ１０６において、試料情報表示器１１１は、コントローラ１１０で取得された１走査ライン分の画像データ、すなわち１走査ライン分の試料１０３の第一の情報を、図５に示される領域Ａに１走査ライン分表示する。走査ラインが奇数番目である場合、すなわちＸ走査信号が図５に示される区間Ａにあるときは、試料情報表示器１１１は、試料１０３の第一の情報を、図５に示される領域Ａに表示する。

ステップＳ１０３の判断の結果、走査ラインが偶数番目である場合、例えば２番目である場合、コントローラ１１０は、ステップＳ１０７において、カンチレバー１０２と試料１０３のＺ方向に沿った相対距離を小さくして探針１０１と試料１０３の間の力学的な相互作用を大きくし、第二の大きさを有する第二の相互作用を探針１０１と試料１０３の間に生じさせる。ここで、第二の相互作用の第二の大きさは、第一の相互作用の第一の大きさよりも大きい。

ステップＳ１０８において、コントローラ１１０は、Ｘ走査信号とＹ走査信号とＺ走査信号に基づいて、試料１０３の第二の情報をマッピングするための１走査ライン分の画像データ、すなわち１走査ライン分の試料１０３の第二の情報を生成し、取得する。試料１０３の第二の情報は、探針１０１と試料１０３の間に大きい相互作用が生じているときの試料情報であり、例えば、試料の内部の情報である。

ステップＳ１０９において、試料情報表示器１１１は、コントローラ１１０で取得された１走査ライン分の画像データ、すなわち１走査ライン分の試料１０３の第二の情報を、図５に示される領域Ｂに１走査ライン分表示する。走査ラインが偶数番目である場合、すなわちＸ走査信号が図５に示される区間Ｂにあるときは、試料情報表示器１１１は、試料１０３の第二の情報を、図５に示される領域Ｂに表示する。

ステップＳ１０６またはステップＳ１０９の後、ステップＳ１１０において、コントローラ１１０は、ラスター走査の１回分が終了したかどうかを判断する。ステップＳ１１０の判断の結果、ラスター走査の1回分が終了していない場合、ステップＳ１０３に戻り、ラスター走査の１回分が終了するまで、ステップＳ１０３〜ステップＳ１１０を繰り返す。その結果、図５の領域Ａに表示される試料１０３の第一の情報と図５の領域Ｂに表示される試料１０３の第二の情報は、時間的等間隔で交互に更新表示される。

ラスター走査の１回分が終了した時点で、図５に示される領域Ａと領域Ｂに対する、相互作用が小さいときの試料１０３の第一の情報と相互作用が大きいときの試料１０３の第二の情報の全走査ライン分の表示が完了する。

コントローラ１１０は、ステップＳ１１１において、観察を終了するか、言い換えれば、次のラスター走査を行うか、すなわちもう一度観察を行うか（もう一度試料の情報取得を行うか）を判断する。

ステップＳ１１１の判断の結果、もう一度観察を行う場合は、ステップＳ１０２に戻る。

ステップＳ１１１の判断の結果、観察を終了する場合は、ステップＳ１１２において、観察を終了する。

本実施形態の情報取得方法は、探針１０１と試料１０３の間の力学的な相互作用の大きさが大小の２種類の試料の情報を、１走査ライン毎に、言い換えれば、１走査ラインの走査に相当する時間的等間隔で交互に取得する。これは、２種類の試料の情報をほぼ同時に取得するとみなせる。従って、それらの相互関係の情報を得ることが可能になる。

具体例を以下に示す。試料１０３が、図６に示される細胞であるとする。そして図６の領域ＦをＡＦＭ観察するとする。

図７は、図６の細胞の領域Ｆを、相互作用を小さくして観察した例を示している。相互作用が小さい場合は、細胞の細胞膜表面情報を得ることができるため、細胞種によっては図７のように凹凸のほとんどない、滑らかな細胞表面形状が得られる。この情報は、試料情報表示器１１１の領域Ａに表示される。

図８は、図６の細胞の領域Ｆを、相互作用を大きくして観察した例を示している。相互作用が大きい場合は、細胞の細胞内部（細胞小器官）の情報を得ることができる。図８は、例えば細胞骨格（アクチンフィラメント）が画像化されたものである。この情報は、試料情報表示器１１１の領域Ｂに表示される。

図９は、本実施形態の情報取得方法によって試料情報表示器に表示される観察画像の例を示しており、試料情報表示器１１１の領域Ａと領域Ｂに、それぞれ、相互作用が小さいときの試料１０３の第一の情報と相互作用が大きいときの試料１０３の第二の情報の全ライン分の表示が完了した状態を示している。

このように、本実施形態の情報取得方法によれば、細胞の表面情報と内部情報をほぼ同時に取得でき、その結果、それらの相互関係の情報を得ることが可能になる。

［第二実施形態］
第二実施形態による原子間力顕微鏡の情報取得方法の説明に先立ち、ラスター走査の走査ラインの往路と復路について図１０Ａと図１０Ｂと図１１Ａと図１１Ｂを用いて説明する。

図１０Ａと図１０Ｂは、試料に対するカンチレバーのラスター走査の動きを示しており、それぞれ、ラスター走査の１走査ラインの往路と復路を強調して示している。また、図１１Ａと図１１Ｂは、ラスター走査を行うためのＸ走査信号とＹ走査信号を示しており、それぞれ、図１０Ａと図１０Ｂに強調して示された往路と復路に対応するＸ走査信号の部分を強調して示している。

ラスター走査における走査の往路は、図１０Ａに示されるように＋Ｘ方向であり、またそれに対応するＸ走査信号は、図１１Ａに示されるように右上がり部分となる。

またラスター走査における走査の復路は、図１０Ｂに示されるように−Ｘ方向であり、またそれに対応するＸ走査信号は、図１１Ｂに示されるように右下がり部分となる。

次に、第二実施形態による原子間力顕微鏡の情報取得方法について図１２と図１３を用いて説明する。図１２は、第二実施形態による原子間力顕微鏡の情報取得方法のフローチャートである。また図１３は、第二実施形態の情報取得方法におけるＸ走査信号とＹ走査信号と試料情報表示器に表示される試料１０３の第一の情報と試料１０３の第二の情報を示している。

第一実施形態と第二実施形態を比較すると、第一実施形態では、Ｘ方向の走査の一往復を単位として試料１０３の第一の情報と試料１０３の第二の情報を交互に取得するのに対して、第二実施形態では、Ｘ方向の走査の一往復の半分すなわち往路または復路を単位として試料１０３の第一の情報と試料１０３の第二の情報を交互に取得する取得する。

ステップＳ２０１において、観察（試料の情報取得）を開始する。ステップＳ２０１の詳細は、第一実施形態のステップＳ１０１と同様であり、その詳細は省略する。

ステップＳ２０２において、コントローラ１１０は、Ｘ走査信号とＹ走査信号を出力する。ＸＹスキャナ１０８は、Ｘ走査信号とＹ走査信号を受けて、試料１０３のカンチレバー１０２に対するＸＹ平面に沿ったラスター走査を開始する。

ステップＳ２０３において、コントローラ１１０は、今のラスター走査の走査ライン（Ｘ走査信号による走査ライン）が往路であるか復路であるかを判断する。ここでは、１走査ラインは、Ｘ方向に関する往路または復路の一方に対応していると想定されている。

ステップＳ２０３の判断の結果、今の走査ラインが往路である場合、コントローラ１１０は、ステップＳ２０４において、カンチレバー１０２と試料１０３のＺ方向に沿った相対距離を調節して探針１０１と試料１０３の間の力学的な相互作用を調節し、第一の大きさを有する第一の相互作用を探針１０１と試料１０３の間に生じさせる。例えば、コントローラ１１０は、カンチレバー１０２と試料１０３のＺ方向に沿った相対距離を大きくして探針１０１と試料１０３の間の力学的な相互作用を小さくし、第一の大きさを有する第一の相互作用を探針１０１と試料１０３の間に生じさせる。

ステップＳ２０５において、コントローラ１１０は、Ｘ走査信号とＹ走査信号とＺ走査信号に基づいて、試料１０３の第一の情報をマッピングするための１往路分の画像データ、すなわち１往路分の試料１０３の第一の情報を生成し、取得する。試料１０３の第一の情報は、探針１０１と試料１０３の間に小さい相互作用が生じているときの試料の情報であり、例えば、試料の表面の情報である。

ステップＳ２０６において、試料情報表示器１１１は、コントローラ１１０で取得された１往路分の画像データ、すなわち１往路分の試料１０３の第一の情報を、図１３に示される領域Ａに１往路分表示する。走査ラインが往路である場合、すなわちＸ走査信号が図１３に示される区間Ａにあるときは、試料情報表示器１１１は、試料１０３の第一の情報を、図１３に示される領域Ａに表示する。

ステップＳ２０３の判断の結果、今の走査ラインが復路である場合、コントローラ１１０は、ステップＳ２０７において、カンチレバー１０２と試料１０３のＺ方向に沿った相対距離を小さくして探針１０１と試料１０３の間の力学的な相互作用を大きくし、第二の大きさを有する第二の相互作用を探針１０１と試料１０３の間に生じさせる。ここで、第二の相互作用の第二の大きさは、第一の相互作用の第一の大きさよりも大きい。

ステップＳ２０８において、コントローラ１１０は、Ｘ走査信号とＹ走査信号とＺ走査信号に基づいて、試料１０３の第二の情報をマッピングするための１復路分の画像データ、すなわち１復路分の試料１０３の第二の情報を生成し、取得する。試料１０３の第二の情報は、探針１０１と試料１０３の間に大きい相互作用が生じているときの試料情報であり、例えば、試料の内部の情報である。

ステップＳ２０９において、試料情報表示器１１１は、コントローラ１１０で取得された１復路分の画像データ、すなわち１復路分の試料１０３の第二の情報を、図１３に示される領域Ｂに１復路分表示する。走査ラインが復路である場合、すなわちＸ走査信号が図１３に示される区間Ｂにあるときは、試料情報表示器１１１は、試料１０３の第二の情報を、図１３に示される領域Ｂに表示する。

ステップＳ２０６またはステップＳ２０９の後、ステップＳ２１０において、コントローラ１１０は、ラスター走査の１回分が終了したかどうかを判断する。ステップＳ２１０の判断の結果、ラスター走査の1回分が終了していない場合、ステップＳ２０３に戻り、ステップＳ２０３〜ステップＳ２１０をラスター走査が１回分終了するまで繰り返す。

ラスター走査の１回分が終了した時点で、図１３に示される領域Ａと領域Ｂに対する、相互作用が小さいときの試料１０３の第一の情報と相互作用が大きいときの試料１０３の第二の情報の全走査ライン分の表示が完了する。

コントローラ１１０は、ステップＳ２１１において、観察を終了するか、言い換えれば、もう一度観察を行うかを判断する。

ステップＳ２１１の判断の結果、もう一度観察を行う場合は、ステップＳ２０２に戻る。

ステップＳ２１１の判断の結果、観察を終了する場合は、ステップＳ２１２において、観察を終了する。

本実施形態の情報取得方法は、小さい相互作用が生じているときの試料１０３の第一の情報と大きい相互作用が生じているときの試料１０３の第二の情報を、それぞれ、ラスター走査の往路と復路において、言い換えれば時間的等間隔で交互に取得する。これは、２種類の試料の情報をほぼ同時に取得するとみなせる。従って、それらの相互関係の情報を得ることが可能になる。

本実施形態においても、細胞の表面情報と内部情報をほぼ同時に取得でき、その結果、それらの相互関係の情報を得ることが可能になる。

〔変形例〕
次に、第二実施形態の変形例による原子間力顕微鏡の情報取得方法について図１４と図１５を用いて説明する。図１４は、第二実施形態の変形例による原子間力顕微鏡の情報取得方法のフローチャートである。また図１５は、第二実施形態の変形例の情報取得方法におけるＸ走査信号とＹ走査信号と試料情報表示器に表示される試料１０３の第一の情報と試料１０３の第二の情報を示している。図１４において、図１２と同一の参照符号で示されたステップは同様のステップを示しており、続く説明ではその詳細は省略する。

本変形例の情報取得方法では、ラスター走査の往路と復路において試料の情報を交互に取得する代わりに、ラスター走査の往路においてのみ試料の情報を交互に取得する。すなわち、ラスター走査の奇数番目の往路と偶数番目の往路において試料の情報を交互に取得する。

本変形例の情報取得方法は、図１２に示されたフローチャートのステップＳ２０３が、図１４に示されるように、ステップＳ２０３ＡとＳ２０３Ｂに置き換えられたものとなっている。

ステップＳ２０１において、観察（試料の情報取得）を開始する。

ステップＳ２０３Ａにおいて、コントローラ１１０は、今のラスター走査の走査ライン（Ｘ走査信号による走査ライン）が往路であるか復路であるかを判断する。ここでは、１走査ラインは、Ｘ方向に関する往路または復路の一方に対応していると想定されている。

ステップＳ２０３Ａの判断の結果、今の走査ラインが復路である場合、再びステップＳ２０３Ａに戻る。

ステップＳ２０３Ａの判断の結果、今の走査ラインが往路である場合、ステップＳ２０３Ｂにおいて、コントローラ１１０は、今の往路が奇数番目であるか偶数番目であるかを判断する。

ステップＳ２０３Ｂの判断の結果、今の走査ラインが奇数番目である場合、コントローラ１１０は、ステップＳ２０４において、カンチレバー１０２と試料１０３のＺ方向に沿った相対距離を大きくして探針１０１と試料１０３の間の力学的な相互作用を小さくし、第一の大きさを有する第一の相互作用を探針１０１と試料１０３の間に生じさせる。

ステップＳ２０６において、試料情報表示器１１１は、コントローラ１１０で取得された１往路分の画像データ、すなわち１往路分の試料１０３の第一の情報を、図１５に示される領域Ａに１往路分表示する。走査ラインが奇数番目の往路である場合、すなわちＸ走査信号が図１５に示される区間Ａにあるときは、試料情報表示器１１１は、試料１０３の第一の情報を、図１５に示される領域Ａに表示する。

ステップＳ２０３Ｂの判断の結果、今の走査ラインが偶数番目の往路である場合、コントローラ１１０は、ステップＳ２０７において、カンチレバー１０２と試料１０３のＺ方向に沿った相対距離を小さくして探針１０１と試料１０３の間の力学的な相互作用を大きくし、第二の大きさを有する第二の相互作用を探針１０１と試料１０３の間に生じさせる。ここで、第二の相互作用の第二の大きさは、第一の相互作用の第一の大きさよりも大きい。

ステップＳ２０８において、コントローラ１１０は、Ｘ走査信号とＹ走査信号とＺ走査信号に基づいて、試料１０３の第二の情報をマッピングするための１往路分の画像データ、すなわち１往路分の試料１０３の第二の情報を生成し、取得する。試料１０３の第二の情報は、探針１０１と試料１０３の間に大きい相互作用が生じているときの試料情報であり、例えば、試料の内部の情報である。

ステップＳ２０９において、試料情報表示器１１１は、コントローラ１１０で取得された１往路分の画像データ、すなわち１往路分の試料１０３の第二の情報を、図１５に示される領域Ｂに１往路分表示する。走査ラインが偶数番目の往路である場合、すなわちＸ走査信号が図１５に示される区間Ｂにあるときは、試料情報表示器１１１は、試料１０３の第二の情報を、図１５に示される領域Ｂに表示する。

ステップＳ２０６またはステップＳ２０９の後、ステップＳ２１０において、コントローラ１１０は、ラスター走査の１回分が終了したかどうかを判断する。ステップＳ２１０の判断の結果、ラスター走査の1回分が終了していない場合、ステップＳ２０３Ａに戻り、ステップＳ２０３ＡとステップＳ２０３ＢとステップＳ２０４〜ステップＳ２１０をラスター走査が１回分終了するまで繰り返す。

ラスター走査の１回分が終了した時点で、図１５に示される領域Ａと領域Ｂに対する、相互作用が小さいときの試料１０３の第一の情報と相互作用が大きいときの試料１０３の第二の情報の全走査ライン分の表示が完了する。

本実施形態の変形例の情報取得方法は、小さい相互作用が生じているときの試料１０３の第一の情報と大きい相互作用が生じているときの試料１０３の第二の情報をラスター走査の往路においてのみ交互に取得する。これは、２種類の試料の情報をほぼ同時に取得するとみなせる。従って、それらの相互関係の情報を得ることが可能になる。

ここでは、ラスター走査の往路においてのみ試料の情報を交互に取得する例をあげたが、ラスター走査の復路においてのみ試料の情報を交互に取得するように変更しても同様の効果が得られる。

［第三実施形態］
第三実施形態による原子間力顕微鏡の情報取得方法について図１６と図１７を用いて説明する。図１６は、第三実施形態による原子間力顕微鏡の情報取得方法のフローチャートである。また図１７は、第三実施形態の情報取得方法におけるＸ走査信号とＹ走査信号と試料情報表示器に表示される試料１０３の第一の情報と試料１０３の第二の情報を示している。

本実施形態の情報取得方法は、観察領域に対して交互に少なくとも１回ずつラスター走査を行い、すなわち第一のラスター走査と第二のラスター走査を交互に行い、第一のラスター走査である１回目のラスター走査の最中に試料１０３の第一の情報を取得し、第二のラスター走査である２回目のラスター走査の最中に試料１０３の第二の情報を取得する手法である。

ステップＳ３０１において、観察（試料の情報取得）を開始する。ステップＳ３０１の詳細は、第一実施形態のステップＳ１０１と同様であり、その詳細は省略する。

ステップＳ３０２において、コントローラ１１０は、Ｘ走査信号とＹ走査信号を出力する。ＸＹスキャナ１０８は、Ｘ走査信号とＹ走査信号を受けて、試料１０３のカンチレバー１０２に対するＸＹ平面に沿ったラスター走査を開始する。

ステップＳ３０３において、コントローラ１１０は、今のラスター走査が１回目のラスター走査であるかどうかを判断する。

ステップＳ３０３の判断の結果、今のラスター走査が１回目のラスター走査である場合、コントローラ１１０は、ステップＳ３０４において、カンチレバー１０２と試料１０３のＺ方向に沿った相対距離を大きくして探針１０１と試料１０３の間の力学的な相互作用を小さくし、第一の大きさを有する第一の相互作用を探針１０１と試料１０３の間に生じさせる。

ステップＳ３０５において、コントローラ１１０は、Ｘ走査信号とＹ走査信号とＺ走査信号に基づいて、試料１０３の第一の情報をマッピングするための画像データを生成し、取得する。試料１０３の第一の情報は、探針１０１と試料１０３の間に小さい相互作用が生じているときの試料の情報であり、例えば、試料の表面の情報である。ここで、第一のラスター走査は、ステップＳ３０４、ステップＳ３０５を含んでいる。

ステップＳ３０６において、試料情報表示器１１１は、コントローラ１１０で取得されたラスター走査１回分の画像データすなわち試料１０３の第一の情報を、図１７に示される領域Ａに表示する。Ｙ走査信号が図１７に示される区間Ａにあるときは、試料情報表示器１１１は、試料１０３の第一の情報を、図１７に示される領域Ａに表示する。

ステップＳ３０３の判断の結果、今のラスター走査が１回目のラスター走査でない場合、コントローラ１１０は、ステップＳ３０７において、カンチレバー１０２と試料１０３のＺ方向に沿った相対距離を小さくして探針１０１と試料１０３の間の力学的な相互作用を大きくし、第二の大きさを有する第二の相互作用を探針１０１と試料１０３の間に生じさせる。ここで、第二の相互作用の第二の大きさは、第一の相互作用の第一の大きさよりも大きい。

ステップＳ３０８において、コントローラ１１０は、Ｘ走査信号とＹ走査信号とＺ走査信号に基づいて、試料１０３の第二の情報をマッピングするための画像データを生成し、取得する。試料１０３の第二の情報は、探針１０１と試料１０３の間に大きい相互作用が生じているときの試料情報であり、例えば、試料の内部の情報である。ここで、第二のラスター走査は、ステップＳ３０７、ステップＳ３０８を含んでいる。

ステップＳ３０９において、試料情報表示器１１１は、コントローラ１１０で取得されたラスター走査１回分の画像データすなわち試料１０３の第二の情報を、図１７に示される領域Ｂに表示する。Ｘ走査信号が図１７に示される区間Ｂにあるときは、試料情報表示器１１１は、試料１０３の第二の情報を、図１７に示される領域Ｂに表示する。

ステップＳ３０６またはステップＳ３０９の後、ステップＳ３１０において、コントローラ１１０は、２回目のラスター走査が終了したか判断する。

ステップＳ３１０の判断の結果、２回目のラスター走査が終了していない場合、ステップＳ３０２に戻り、２回目のラスター走査が終了するまで、ステップＳ３０２〜ステップＳ３１０を繰り返す。

２回目のラスター走査が終了した時点で、図１７に示される領域Ａと領域Ｂに対する、相互作用が小さいときの試料１０３の第一の情報と相互作用が大きいときの試料１０３の第二の情報の表示が完了する。

ステップＳ３１０の判断の結果、２回目のラスター走査が終了した場合、コントローラ１１０は、ステップＳ３１１において、観察を終了するか、言い換えれば、もう一度観察を行うかを判断する。

ステップＳ３１１の判断の結果、もう一度観察を行う場合は、ステップＳ３０２に戻る。

ステップＳ３１１の判断の結果、観察を終了する場合は、ステップＳ３１２において、観察を終了する。

本実施形態の情報取得方法は、第一のラスター走査と第二のラスター走査を、交互に少なくとも１回ずつ行う。それによって、小さい相互作用が生じているときの試料１０３の第一の情報と大きい相互作用が生じているときの試料１０３の第二の情報を、交互に、ラスター走査１回分に相当する時間的等間隔で、少なくとも１回ずつ取得し得る。これは、走査速度が十分に速い場合、２種類の試料の情報をほぼ同時に取得しているとみなせる。従って、それらの相互関係の情報を得ることが可能になる。

そして本実施形態においても、細胞の表面情報と内部情報をほぼ同時に取得でき、その結果、それらの相互関係の情報を得ることが可能になる。

［第四実施形態］
本実施形態の情報取得方法について図１８と図１９を用いて説明する。図１８は、第四実施形態の情報取得方法のフローチャートである。また図１９は、第四実施形態の情報取得方法によって試料情報表示器に表示される観察画像の例を示している。

本実施形態の情報取得方法は、第一実施形態の情報取得方法に似ている。図４と図１８を比較して分かるように、本実施形態の情報取得方法は、第一実施形態の情報取得方法の諸ステップに加えて、ステップＳ１１０とステップＳ１１１の間に、試料１０３の第一の情報と試料１０３の第二の情報を演算して表示するステップＳ４０１を有している。ステップＳ４０１において、コントローラ１１０は、領域Ａと領域Ｂにそれぞれ表示された相互作用が小さいときの試料１０３の第一の情報と相互作用が大きいときの試料１０３の第二の情報を演算して試料１０３の第三の情報を取得する。また、試料情報表示器１１１は、コントローラ１１０で取得された試料１０３の第三の情報を、図１９に示される領域Ｃに表示する。試料１０３の第三の情報を取得する演算は、例えば合成すなわち加算であってよいが、これに限らず、減算や除算など、得たい情報によって使い分けられることが望ましい。

図１９は、試料情報表示器１１１の領域Ａの試料１０３の第一の情報と領域Ｂの試料１０３の第二の情報に加えて、試料１０３の第一の情報と第二の情報が合成された試料１０３の第三の情報が領域Ｃに表示された様子を示している。

このように、本実施形態においては、細胞の表面情報と内部情報をほぼ同時に取得でき、さらにそれらを合成することにより表面と内部の位置関係も明確にできる。これにより、表面と内部の相互関係の情報をより詳しく得ることが可能になる。

［第五実施形態］
第五実施形態の情報取得方法について図２０を用いて説明する。図２０は、第五実施形態の情報取得方法のフローチャートである。本実施形態の情報取得方法は、第二実施形態の情報取得方法に似ている。図１２と図２０を比較して分かるように、本実施形態の情報取得方法は、第二実施形態の情報取得方法の諸ステップに加えて、ステップＳ２１０とステップＳ２１１の間に、試料１０３の第一の情報と試料１０３の第二の情報を演算して表示するステップＳ５０１を有している。ステップＳ５０１において、コントローラ１１０は、領域Ａと領域Ｂにそれぞれ表示された相互作用が小さいときの試料１０３の第一の情報と相互作用が大きいときの試料１０３の第二の情報を演算して試料１０３の第三の情報を取得する。また、試料情報表示器１１１は、コントローラ１１０で取得された試料１０３の第三の情報を表示する。試料１０３の第三の情報を取得する演算は、例えば合成すなわち加算であってよいが、これに限らず、減算や除算など、得たい情報によって使い分けられることが望ましい。

［第六実施形態］
第六実施形態の情報取得方法について図２１を用いて説明する。図２１は、第六実施形態の情報取得方法のフローチャートである。本実施形態の情報取得方法は、第三実施形態の情報取得方法に似ている。図１６と図２１を比較して分かるように、本実施形態の情報取得方法は、第三実施形態の情報取得方法の諸ステップに加えて、ステップＳ３１０とステップＳ３１１の間に、試料１０３の第一の情報と試料１０３の第二の情報を演算して表示するステップＳ６０１を有している。ステップＳ６０１において、コントローラ１１０は、Ａの領域とＢの領域にそれぞれ表示した相互作用が小さい試料１０３の第一の情報と相互作用が大きい試料１０３の第二の情報を演算して第三の試料情報を取得する。また、試料情報表示器１１１は、コントローラ１１０で取得された試料１０３の第三の情報を表示する。試料１０３の第三の情報を取得する演算は、例えば合成すなわち加算であってよいが、これに限らず、減算や除算など、得たい情報によって使い分けられることが望ましい。

Claims

カンチレバーの自由端に設けられた探針を試料と接触させ、それらの間に力学的な相互作用を生じさせながら、ＸＹ平面に沿って前記カンチレバーと前記試料を相対的にラスター走査させて前記試料の情報を取得する原子間力顕微鏡の情報取得方法であって、
前記探針と前記試料の間に第一の大きさを有する第一の相互作用を生じさせる第一の相互作用生成工程と、
前記探針と前記試料の間に前記第一の相互作用が生じているときの前記試料の第一の情報を取得する第一の情報取得工程と、
前記探針と前記試料の間に、前記第一の大きさと異なる第二の大きさを有する第二の相互作用を生じさせる第二の相互作用生成工程と、
前記探針と前記試料の間に前記第二の相互作用が生じているときの前記試料の第二の情報を取得する第二の情報取得工程と、を有し、
前記第一の相互作用生成工程および前記第一の情報取得工程と、前記第二の相互作用生成工程および前記第二の情報取得工程は同一走査領域において行われる、原子間力顕微鏡の情報取得方法。
前記第一の相互作用生成工程および前記第一の情報取得工程と、前記第二の相互作用生成工程および前記第二の情報取得工程は、前記ラスター走査の走査ライン毎に交互に繰り返される、請求項１記載の原子間力顕微鏡の情報取得方法。
前記ラスター走査の走査ラインは、走査の往路と復路の少なくとも一方である、請求項２記載の原子間力顕微鏡の情報取得方法。
前記第一の相互作用生成工程と前記第一の情報取得工程とを含む第一のラスター走査工程と、
前記第二の相互作用生成工程と前記第二の情報取得工程とを含む第二のラスター走査工程と、を備え、
前記第一のラスター走査工程と前記第二のラスター走査工程は、交互に少なくとも１回ずつ行われる、請求項１記載の原子間力顕微鏡の情報取得方法。
前記試料の第一の情報と前記試料の第二の情報を、時間的等間隔で交互にそれぞれ更新表示する第一の情報表示工程と第二の情報表示工程を有している、請求項１〜４のいずれかひとつに記載の原子間力顕微鏡の情報取得方法。
前記第二の相互作用の前記第二の大きさは前記第一の相互作用の前記第一の大きさよりも大きく、
前記試料は、細胞であり、
前記試料の第一の情報は、前記細胞の表面の情報であり、
前記試料の第二の情報は、前記細胞の内部の情報である、請求項１〜５のいずれかひとつに記載の原子間力顕微鏡の情報取得方法。
前記試料の第一の情報と前記試料の第二の情報を演算することにより前記試料の第三の情報を生成する情報生成工程をさらに有している、請求項１〜６のいずれかひとつに記載の原子間力顕微鏡の情報取得方法。
前記演算は合成演算である、請求項７に記載の原子間力顕微鏡の情報取得方法。
前記試料の第三の情報を表示する第三の情報表示工程をさらに有している、請求項７または８に記載の原子間力顕微鏡の情報取得方法。
請求項１〜９のいずれかひとつに記載の原子間力顕微鏡の情報取得方法を原子間力顕微鏡に実行させるプログラム。
請求項１０に記載のプログラムがコントローラにインストールされた原子間力顕微鏡。