JPWO2016153058A1 - 接合菌の測定方法及び接合菌測定用の試薬キット - Google Patents
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Abstract
Description
[1]
酸処理した試料を測定対象として接合菌を測定する、接合菌の測定方法。
[2]
酸処理が、酸性成分と試料を共存させる処理である、前記[1]に記載の接合菌の測定方法。
[3]
酸性成分が、オキソ酸、有機酸、無機酸からなる群より選択される1又は2以上の酸である、前記[2]に記載の接合菌の測定方法。
[4]
オキソ酸が、カルボン酸、スルホン酸、硫酸、リン酸、硝酸、ハロゲンオキソ酸からなる群より選択される1又は2以上の酸である、前記[3]に記載の接合菌の測定方法。
[5]
有機酸が、カルボン酸及び/又はスルホン酸である、前記[3]に記載の接合菌の測定方法。
[6]
カルボン酸が、酢酸、ギ酸、クエン酸、シュウ酸からなる群より選択される1又は2以上の酸である、前記[4]又は[5]に記載の接合菌の測定方法。
[7]
無機酸が、ハロゲン化水素、硫酸、リン酸、硝酸、ハロゲンオキソ酸からなる群より選択される1又は2以上の酸である、前記[3]に記載の接合菌の測定方法。
[8]
ハロゲン化水素が、塩酸である、前記[7]に記載の接合菌の測定方法。
[9]
ハロゲンオキソ酸が、次亜ハロゲン酸及び/又は過ハロゲン酸である、前記[4]又は[7]に記載の接合菌の測定方法。
[10]
次亜ハロゲン酸が、次亜塩素酸、次亜臭素酸、次亜ヨウ素酸からなる群より選択される1又は2以上の酸である、前記[9]に記載の接合菌の測定方法。
[11]
過ハロゲン酸が、過塩素酸、過臭素酸、過ヨウ素酸からなる群より選択される1又は2以上の酸である、前記[9]に記載の接合菌の測定方法。
[12]
接合菌の測定が、接合菌成分の検出試薬を用いた接合菌の測定である、前記[1]〜[11]のいずれかに記載の接合菌の測定方法。
[13]
接合菌成分の検出試薬が、キトサンに結合する抗体である、前記[12]に記載の接合菌の測定方法。
[14]
接合菌の測定が、免疫測定法による接合菌の測定である、前記[1]〜[13]のいずれかに記載の接合菌の測定方法。
[15]
免疫測定法が、キトサンに結合する抗体を用いた免疫測定法である、前記[14]に記載の接合菌の測定方法。
[16]
免疫測定法が、酵素免疫測定法、イムノクロマト法、イムノブロット法、凝集法、比濁法、又は比ろう法である、前記[14]又は[15]に記載の接合菌の測定方法。
[17]
凝集法が、ラテックス凝集法である、前記[16]に記載の接合菌の測定方法。
[18]
試料が、動物に由来する試料である、前記[1]〜[17]のいずれかに記載の接合菌の測定方法。
[19]
動物に由来する試料が、血液由来試料、気管支肺胞洗浄液(BALF)、生検検体、喀痰、脳脊髄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔吸引液、又は腹水である、前記[18]に記載の接合菌の測定方法。
[20]
血液由来試料が、血清又は血漿である、前記[19]に記載の接合菌の測定方法。
[21]
接合菌の測定方法が、接合菌症の検知方法である、前記[1]〜[20]のいずれかに記載の接合菌の測定方法。
[22]
接合菌症が、ムーコル症又はエントモフトラ症である、前記[21]に記載の接合菌の測定方法。
[23]
酸性成分を含有する、接合菌測定用試料の調製剤。
[24]
調製剤が、前記[1]〜[22]のいずれかに記載の接合菌の測定方法を行う試料の酸処理に用いられる調製剤である、前記[23]に記載の調製剤。
[25]
接合菌の測定を行う試料の酸処理に使用するための酸性成分。
[26]
酸性成分が、前記[1]〜[22]のいずれかに記載の接合菌の測定方法を行う試料の酸処理に用いられる酸性成分である、前記[25]に記載の酸性成分。
[27]
酸処理することにより、試料を接合菌測定用試料にする、接合菌測定用試料の調製方法。
[28]
酸処理が、試料を前記[1]〜[22]のいずれかに記載の接合菌の測定方法を行うための試料とするための処理である、前記[27]に記載の調製方法。
[29]
酸処理が、酸性成分と試料を共存させる処理である、前記[27]又は[28]に記載の調製方法。
[30]
酸性成分と試料を共存させる処理が、前記[23]又は[24]に記載の調製剤と試料を共存させる処理である、前記[29]に記載の調製方法。
[31]
酸性成分を含有する試薬及び/又は接合菌成分の検出試薬を構成品として含む、接合菌の測定を行うための試薬キット。
[32]
酸性成分を含有する試薬及び/又は接合菌成分の検出試薬を構成品として含む、前記[1]〜[22]のいずれかに記載の接合菌の測定方法を行うための試薬キット。
[33]
酸性成分を含有する試薬が、前記[23]又は[24]に記載の調製剤である、前記[31]又は[32]に記載の試薬キット。
[34]
接合菌成分の検出試薬が、キトサンに結合する抗体である、前記[31]〜[33]のいずれかに記載の試薬キット。
[35]
試薬キットが、接合菌症の診断キットである、前記[31]〜[34]のいずれかに記載の試薬キット。
[36]
試薬キットが、ムーコル症又はエントモフトラ症の診断キットである、前記[31]〜[34]のいずれかに記載の試薬キット。
本発明により、酸処理した試料を測定対象として接合菌を測定することを特徴とする、接合菌の測定方法(以下「本発明の測定方法」という。)が提供される。本発明の測定方法は、例えば、接合菌の検知方法、接合菌の検出方法、接合菌の定量方法、接合菌症の検知方法、接合菌症の検出方法、又は接合菌症の定量化方法として用いることができる。また、本発明の測定方法は、例えば、酸処理した試料(検体)を測定対象として接合菌の測定(検体検査)を行い、動物が接合菌症に罹患しているか否かを診断するためのデータを取得することを特徴とする、接合菌症を診断するためのデータ取得方法として用いることもできる。
上記の通り、本発明において接合菌の測定が行われる試料は酸処理が施されている。当該酸処理は、試料に酸性成分を共存させて行うことが実用上簡便である。ここに酸性成分を含有することを特徴とする、接合菌測定用試料の調製剤(以下「本発明の試料調製剤」という。)が提供される。当該酸性成分を含む剤は、接合菌の測定を行う試料の酸処理剤として使用することができる。本発明の試料調製剤と当該酸処理剤は、どちらも酸性成分を剤に含有させる工程を含む任意の方法により製造することができる。また、本発明の試料調製剤と当該酸性成分は、どちらも本発明の測定方法を行う試料の酸処理に好適に用いることができる。
上記の通り、酸処理を行うことにより試料を接合菌測定用試料とすることができる。ここに酸処理することにより試料を接合菌測定用試料にすることを特徴とする、接合菌測定用試料の調製方法(以下「本発明の試料調製方法」という。)が提供される。本発明の試料調製方法は、本発明の測定方法を行う試料の酸処理に好適に用いることができる。本発明の試料調製方法において、酸処理は酸性成分と試料を共存させる処理であることが好適である。酸性成分と試料を共存させる処理は、本発明の試料調製剤と試料を共存させる処理であることが好適である。
本発明において接合菌の測定は、酸性成分を含有する試薬と接合菌成分の検出試薬のうち少なくとも一方を構成品として含む試薬キット(以下「本発明の試薬キット」という。)を用いて行うことが実用上簡便である。本発明の試薬キットは、本発明の測定方法を行うために好適に用いることができる。酸性成分を含有する試薬は、本発明の試料調製剤であることが好適である。接合菌成分の検出試薬は、キトサンに結合する抗体であることが好適である。本発明の試薬キットは、前記構成品以外に、さらに他の構成品を含んでいてもよい。当該他の構成品は、接合菌の測定の態様に応じて適宜選択できる。本発明の試薬キットは、例えば、ムーコル症やエントモフトラ症等の接合菌症の診断キットとしても用いることができる。
本発明において酸処理は、接合菌の測定を行う試料の前処理として行われる。当該酸処理は、試料を酸性にする処理であり、試料を酸性下に供することで行うことができる。当該酸処理は、試料に酸性成分を共存させて行われることが実用上簡便である。酸処理した試料は、酸性成分と共存させる処理が行われた試料であってよい。
本発明において酸性成分は、有機酸であってもよく、無機酸であってもよい。有機酸はカルボン酸であることが好適である。カルボン酸は酢酸、ギ酸、又はクエン酸であることが好適である。また、無機酸はハロゲン化水素、硫酸、又はリン酸であることが好適である。ハロゲン化水素は塩化水素(塩酸)であることが好適である。このような酸性成分は、1種のみを用いてもよく、2種又はそれ以上を組み合わせて用いてもよい。
本発明において接合菌の測定は、例えば、接合菌成分の検出試薬を用いて行うことができる。接合菌成分の検出試薬は、キトサンに結合する抗体であることが好適である。また、本発明において接合菌の測定は、例えば、免疫測定法により行うことができる。免疫測定法は、キトサンに結合する抗体を用いた免疫測定法であることが好適である。免疫測定法としては、酵素免疫測定(Enzyme ImmunoAssay、EIA)法、イムノクロマト法、イムノブロット法、凝集法、比濁法、又は比ろう法が例示される。凝集法としては、ラテックス凝集法が例示される。酵素免疫測定法は、ELISA(Enzyme−Linked ImmunoSorbent Assay)法であってよい。
本発明において接合菌の測定を行う試料は、接合菌を含有し得る物質である限り特に制限されないが、ヒトを含む動物に由来する試料(検体)であることが好適であり、本発明は検体検査において好適に用いられる。動物に由来する試料としては、動物の体から得られる試料や動物の体と接触させた液体を回収して得られる試料が例示される。動物の体と接触させる液体は、生体に適合可能な液体である限り特に制限されない。そのような液体としては、生理食塩水が挙げられる。動物の体と接触し、回収された液体は、そのまま接合菌の測定を行う試料として酸処理に供することができる。動物の体から得られる試料は、血液由来試料であることが好適である。血液由来試料は、血清又は血漿であることが特に好適である。動物の体と接触させた液体を回収して得られる試料は、気管支肺胞洗浄液(BALF)であることが好適である。また、ここにいう動物は、接合菌症に罹患した動物又は接合菌症に罹患した可能性のある動物であることが好適である。接合菌症としては、ムーコル症やエントモフトラ症が例示される。
GlcN:グルコサミン
GlcNAc:N−アセチル−D−グルコサミン
CTS:キトサン
CTS6:キトサンヘキサマー
GCTS:グリコールキトサン
CTN:キチン
EGCTN:エチレングリコールキチン
CTSpAb:抗キトサンポリクローナル抗体
CTSmAb:抗キトサンモノクローナル抗体
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
本発明において接合菌の測定が行われる試料は、上述した通りに酸処理が施されて調製される。本発明において酸処理は、試料を酸性下に供する処理(酸性の状態にする処理)である限り、その手段は特に制限されない。そのような手段としては、陽イオン交換体、活性炭(酸性炭)、又は酸性成分と試料を共存させる方法が例示される。酸処理は、酸性成分と試料を共存させる処理であることが簡便かつ安価であり好適である。共存とは、対象物同士が接触し得る状態にあることを意味する。例えば、酸性成分と試料の共存は、試料に対して酸性成分を添加することにより行うことも可能であり、酸性成分に対して試料を添加することにより行うことも可能である。酸処理は液体中において行われることが好適である。また、酸処理が行われる液体は、水又は水溶液であることが好適である。
酸性成分は、水と共存した時に酸性を示す物質である限り特に制限されない。酸性成分は、水と共存した時に水素イオンを遊離する化合物であってよく、イオン化した時に水素イオンを遊離する化合物であってよい。すなわち、酸性成分はアレニウス酸であってよい。酸性成分としては、オキソ酸、有機酸、無機酸等が例示される。オキソ酸としては、カルボン酸、スルホン酸、硫酸、リン酸、硝酸、ハロゲンオキソ酸等が例示される。有機酸としては、カルボン酸、スルホン酸等が例示される。カルボン酸としては、酢酸、ギ酸、クエン酸、シュウ酸等が例示される。無機酸としては、ハロゲン化水素、硫酸、リン酸、硝酸、ハロゲンオキソ酸等が例示される。ハロゲン化水素としては、塩化水素(塩酸)等が例示される。ハロゲンオキソ酸としては、次亜ハロゲン酸、過ハロゲン酸等が例示される。次亜ハロゲン酸としては、次亜塩素酸、次亜臭素酸、次亜ヨウ素酸等が例示される。過ハロゲン酸としては、過塩素酸、過臭素酸、過ヨウ素酸等が例示される。酸性成分が有機酸である場合は、酸性成分はカルボン酸であることが好ましく、酢酸、ギ酸、又はクエン酸であることが特に好ましい。また、酸性成分が無機酸である場合は、酸性成分はハロゲン化水素、硫酸、又はリン酸であることが好ましく、ハロゲン化水素であることがより好ましい。ハロゲン化水素は塩化水素(塩酸)であることが特に好ましい。
試料は、接合菌を含有し得る物質である限り特に制限されない。試料としては、動物に由来する試料が挙げられる。動物としては、具体的には、ヒトをはじめ、ムーコル症やエントモフトラ症等の接合菌症の罹患の対象となり得るその他の動物、例えば、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ等の哺乳動物、トリ等が挙げられる。接合菌症は、ペット由来の感染や、ペット自体の接合菌症の罹患も問題になっており、ヒト以外の動物も試料の由来として重要である。動物に由来する試料は、動物の体から得られる試料であってもよいし、動物の体と接触させた液体を回収して得られる試料であってもよい。
本発明において酸処理は、試料を酸性にする処理であり、試料を酸性下に供することで行うことができる。試料の酸処理が行われる時(以下「酸処理時」という。)のpHは6以下の酸性である限り特に制限されず、任意のpHを選択することができる。酸処理時のpHは、例えば、試料の種類や接合菌の測定の態様に応じて適宜設定することができる。下限を含んだ当該pHは、例えば、pH0以上、pH0.5以上、pH1以上、pH2以上、pH3以上、pH3.5以上等であってよい。また上限を含んだ当該pHは、例えば、pH6以下、pH5.5以下、pH5以下、pH4.5以下等であってよい。さらに具体的には、pH0〜6、pH0.5〜5.5、pH0〜5、pH0.5〜5、pH1〜5、pH2〜5、pH3〜5、pH3.5〜4.5等が例示される。
本発明の試料調製剤は、上記に例示される酸性成分を含有する剤であり、試料を酸処理するために用いられる剤である。本発明の試料調製剤は、液剤であってもよいし、粉末剤、顆粒剤、錠剤等の用時溶解用の固形剤であってもよい。本発明の試料調製剤は、酸性成分そのものであってもよく、酸性成分を水等の溶媒に希釈又は溶解したものであってもよい。また、本発明の試料調製剤は、製剤上の理由等により、酸性成分や溶媒以外の他の成分を含有するものであってもよい。当該他の成分は、試薬・診断薬学的に許容される成分である限り特に制限されず、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、各種添加剤等が例示される。各種添加剤としては、安定化剤、保存剤、防腐剤、乳化剤、界面活性剤、湿潤剤、懸濁化剤、分散剤、浸透圧調整剤、等張化剤、緩衝剤、pH調整剤、抗酸化剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤等が例示される。
本発明の試料調製方法は、酸処理することにより試料(接合菌の測定を行う試料)を接合菌測定用試料(接合菌の測定が行われる試料)にするための方法である。本発明の試料調製方法は、酸処理する工程以外に、当該工程の前後、又は、同時において、さらに他の工程を含んでいてもよい。本発明の試料調製方法は、例えば、酸処理を終了する工程、固形状の試料を溶解する工程、液状の試料を希釈又は濃縮する工程等を含んでいてもよい。また、本発明の試料調製方法は、例えば、調製された試料が接合菌の測定に適した温度となるように、当該試料を加温又は冷却する工程を含んでいてもよい。さらに、本発明の試料調製方法は、例えば、調製された試料が接合菌の測定に適したpHとなるように、当該試料のpHを調整する工程を含んでいてもよい。
2−1: 測定手法
本発明の測定方法は、上述の通りに接合菌を測定する方法である。本発明において測定の対象となる接合菌は、具体的には、酸処理された接合菌であり、一態様においては、接合菌に由来する成分である。本発明において測定の対象となる接合菌は、菌体そのものであってもよく、断片化された菌体であってもよく、菌体の一部又は一成分であってもよい。また、本発明において測定の対象となる接合菌は、生菌体であってもよく、不活化された菌体等の死菌体であってもよい。接合菌の測定は、例えば、接合菌成分の検出試薬(接合菌が有する成分を検出するための試薬)を用いて行うことができる。
本発明において用いられる抗体は、抗体を作製するために用いられる公知の方法により作製することができ、その方法は特に制限されない。当該抗体を作製する方法としては、動物を抗原で免疫する方法が典型例として挙げられる。抗原は、接合菌そのものであってもよく、断片化された接合菌であってもよく、接合菌の一成分であってもよく、免疫原性を高めるためにこれらを他の物質と融合させた複合体であってもよい。当該複合体の形成に用いられる他の物質としては、タンパク質が挙げられ、具体的には、ウシ血清アルブミン(BSA)が挙げられる。また、抗原は、抗原性補強剤(アジュバント)と共存させた状態で動物の免疫に用いられてもよい。
本発明において測定の対象となり得る接合菌の種類は特に限定されない。接合菌は、接合菌門(Zygomycota)に属する真菌として定義される。当該真菌としては、接合菌綱(Zygomycetes)、トリコミケス綱(Trichomycetes)に属する真菌が挙げられる。接合菌綱に属する真菌としては、ディマルガリス目(Dimargaritales)、アツギケカビ目(Endogonales)、ハエカビ目(Entomophthorales)、グロムス目(Glomales)、キックセラ目(Kickxellales)、ケカビ目(Mucorales)、トリモチカビ目(Zoopagales)に属する真菌が挙げられる。トリコミケス綱に属する真菌としては、アメビディウム目(Amoebidiales)、アセラリア目(Asellariales)、エクリナ目(Eccrinales)、ハルペラ目(Harpellales)に属する真菌が挙げられる。
本発明の測定方法は、上述した試料の酸処理をする工程や接合菌成分の検出試薬と接合菌を接触させて接合菌を検知する工程(以下「接合菌の検知工程」という。)以外に、必要に応じて他の工程を含んでいてもよい。当該他の工程としては、酸処理を終了させるために酸処理をした試料を中性又は塩基性にする工程(中和工程)が挙げられる。酸処理を終了させる工程は、例えば、接合菌成分の検出試薬が酸性条件下での使用に適さない試薬である場合に好適に行われる。例えば、接合菌成分の検出試薬が抗体等のタンパク質である場合は、酸性条件下での使用がタンパク質の変性や接合菌成分との結合阻害等を引き起こす可能性があるため、接合菌の検知工程の前に中和工程が好適に行われてよい。
本発明の試薬キットは、酸性成分を含有する試薬と接合菌成分の検出試薬のうち少なくとも一方を構成品として含む、接合菌測定用の試薬キットである。本発明の試薬キットは、一態様として、接合菌症の診断キット、ムーコル症の診断キット、又はエントモフトラ症の診断キットであってもよい。
(1)免疫抗原の調製(キトサン−ウシ血清アルブミン複合体の調製)
動物を免疫する抗原には、キトサンヘキサマー(CTS6)にウシ血清アルブミン(BSA)を共有結合した複合体(以下「CTS6−BSA」という。)を用いた。CTS6−BSAの調製手順を以下に示す。
抗キトサンポリクローナル抗体(CTSpAb)は、CTS6−BSAを用いてニワトリを免疫して調製した。CTSpAbの調製手順を以下に示す。
(1)結合法による測定
結合法により、CTSpAbのCTSに対する結合特異性を確認した。プレートに固相化する抗原には、キトサン(CTS、生化学工業社製、脱アセチル化度:80%以上)、グリコールキトサン(GCTS、MP Biomedicals社製、脱アセチル化度:76.2%)、又はエチレングリコールキチン(EGCTN、生化学工業社製)を用いた。
競合法により、CTSpAbのCTSに対する結合特異性を確認した。競合物質としてはCTS、GCTS、又はEGCTNを用いた。
3〜6量体のCTSオリゴ糖(生化学工業社製)を競合物質とした競合ELISA法により、CTSpAbによる測定が可能なCTSの分子サイズを確認した。
抗キトサンモノクローナル抗体(CTSmAb)の作製は、文献(WO2011/049082)に記載された方法を参照して行った。CTSmAbの調製手順を以下に示す。
ファージ抗体ライブラリーの作製は、文献(nakamura et al., J Vet Med Sci. 2004 Jul; 66(7): 807-14.)に記載された方法を参照して行った。
CTSに結合するファージ抗体のスクリーニングは、CTSを固相化したプレートを用いたパニングにより行った。
抗キトサンモノクローナルIgY抗体の調製は、文献(Shimamoto et al., Biologicals. 2005 Sep; 33(3): 169-74.)に記載された手法を参照して行った。
ELISA法に用いる検出抗体には西洋わさびペルオキシダーゼ(Horseradish Peroxidase、HRP)で標識したCTSmAb(HRP標識CTSmAb)を用いた。HRP標識CTSmAbはPeroxidase Labeling Kit−NH2(同仁化学社製)を用いて調製した。HRP標識CTSmAbの調製手順を以下に示す。
本願実施例の一部においては、培養により調製した菌体(以下「培養菌体」という。)を含有する試料を測定対象として接合菌の測定を行った。本願の実施例において、「菌体」の語は、真菌(Fungi)と真正細菌(Bacteria)を含む微生物の総称として使用される。培養菌体の調製に使用した菌体を表4に示す。
本願の実施例の一部においては、作業上の安全確保の理由により、高圧蒸気滅菌により不活化した培養菌体(以下「不活化菌体」という。)を使用した。不活化菌体の調製手順を以下に示す。
以下の手順に従い、CTS含有ヒト血清、及びCTS含有ウサギ血清を調製した。
本願実施例の一部においては、真菌症等の感染症に罹患したヒトの血清を試料として接合菌の測定を行った。当該試料は帝京大学医真菌研究センター(Teikyo University Institute of Medical Mycology, TIMM)から入手した。
ヒト血清0.025mLに10%BA/PBS−Tを0.225mL添加して調製した。
ヒト血清0.022mLに終濃度で1%(175mM)となるように2%(v/v)酢酸を0.022mL添加して30秒間撹拌した後、10%BA/PBS−Tを0.176mL添加して調製した。この時、ヒト血清に酢酸を添加した時のpHは4.1であり、10%BA/PBS−Tを添加した後のpHは4.9であった。
以下の手順に従い、菌体を含有する試料(酸処理なし、酸処理あり)、菌体を含有しない試料(ブランク試料)、及び標準曲線の作成に用いるCTS標準液を調製した。
不活化菌体試料25μLとヒト血清225μLを混合して調製した試料に対して2M Tris−HCl(pH8.0)を250μL混合した。
不活化菌体試料25μLとヒト血清225μLを混合して調製した試料に対して5%(v/v)酢酸を62.5μL混合し、室温に1分間静置して酸処理を行った。その後、2M Tris−HCl(pH8.0)を187.5μL混合して中和し、酸処理を終了した。
不活化菌体試料に代えて蒸留水を用い、上記(b)と同じ操作を行った。
CTSに1%(v/v)酢酸を添加して200ng/mLとなるように調製した溶液に対して等量の1%(v/v)酢酸を混合する操作を繰り返し、200〜25ng/mLのCTS希釈液を調製した。これらのCTS希釈液25μLにウサギ血清225μLを混合して20〜2.5ng/mLのCTSを含有する標準試料を調製した。この試料を2M Tris−HCl(pH8.0)250μLと混合し、以後の試験に用いた。
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、菌体を含有しない試料、及び標準曲線の作成に用いるCTS標準液を調製した。
不活化菌体試料12.5μLとヒト血清112.5μLを混合して調製した試料に対して5%(v/v)酢酸を31.3μL混合し、室温に1分間静置して酸処理を行った。その後、0.8M Tris−HCl(pH8.0)を93.7μL混合して中和し、酸処理を終了した。
不活化菌体試料に代えて蒸留水を用い、上記(a)と同じ操作を行った。
CTSに1%(v/v)酢酸を添加して100ng/mLとなるように調製した溶液に対して等量の1%(v/v)酢酸を混合する操作を繰り返し、25〜1.56ng/mLのCTS希釈液を調製した。これらのCTS希釈液12.5μLにウサギ血清112.5μLを混合して2.5〜0.156ng/mLのCTSを含有する標準試料を調製した。この試料を0.8M Tris−HCl(pH8.0)250μLと混合し、以後の試験に用いた。
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、及び菌体を含有しない試料を調製した。
不活化菌体試料2.5μLとヒト血清22.5μLを混合して調製した試料に対して2%(v/v)の酸(硫酸、塩酸、ギ酸、又はリン酸)又は2%(w/v)の酸(クエン酸)を25μL混合し、室温に1分間静置して酸処理を行った。その後、0.4M Tris−HCl(pH8.0)を200μL混合して中和し、酸処理を終了した。
不活化菌体試料に代えて蒸留水を用い、上記(a)と同じ操作を行った。
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、及び菌体を含有しない試料を調製した。
不活化菌体試料5μLとヒト血清45μLを混合して調製した試料に対して2%(v/v)酢酸を50μL混合し、室温に所定時間(10分間、1時間、又は2時間)静置して酸処理を行った。その後、0.4M Tris−HCl(pH8.0)を200μL混合して中和し、酸処理を終了した。
不活化菌体試料に代えて蒸留水を用い、上記(a)と同じ操作を行った。
実施例3に記載した手順に従い調製した。
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、及び菌体を含有しない試料を調製した。
不活化菌体試料5μLとヒト血清45μLを混合して調製した試料に対して2%(v/v)酢酸を50μL混合し、所定の温度(室温(25℃)、37℃、50℃、又は70℃)に10分間静置して、試料自体を各設定温度にして酸処理を行った。その後、0.4M Tris−HCl(pH8.0)を400μL混合して中和し、酸処理を終了した。
不活化菌体試料に代えて蒸留水を用い、上記(a)と同じ操作を行った。
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、及び標準曲線の作成に用いるCTS標準液を調製した。
1mm四方の培養菌体試料(Cunninghamella bertholletiae)にヒト血清0.5mLと蒸留水0.5mLを添加して30秒間撹拌した後、遠心後の上清から0.9mLを除去した。次に、ヒト血清0.45mLと蒸留水0.45mLを添加して30秒間撹拌した後、遠心後の上清から0.9mLを除去する操作を2回繰り返した。続いて、ヒト血清0.45mLと酢酸(2%、1%、0.4%、又は0.1%)0.45mLを添加して30秒間撹拌した後、室温に5分間静置して酸処理を行った。その後、遠心後の上清0.1mLに0.4M Tris−HCl(pH8.0)を0.4mL混合して中和し、酸処理を終了した。
酢酸に代えて蒸留水を用い、上記(a)と同じ操作を行った。
CTSに1%(v/v)酢酸を添加して1000ng/mLとなるように調製した溶液に対して等量の1%(v/v)酢酸を混合する操作を繰り返し、1000〜15.625ng/mLのCTS希釈液を調製した。これらのCTS希釈液0.1mLにヒト血清0.9mLを混合して100〜1.5625ng/mLのCTSを含有する標準試料を調製した。この試料を0.4M Tris−HCl(pH8.0)0.4mLと混合し、以後の試験に用いた。
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、及び標準曲線の作成に用いるCTS標準液を調製した。
1mm四方の培養菌体試料(Rhizopus oryzae)にヒト血清0.5mLと蒸留水0.5mLを添加して30秒間撹拌した後、遠心後の上清から0.9mLを除去した。次に、ヒト血清0.45mLと蒸留水0.45mLを添加して30秒間撹拌した後、遠心後の上清から0.9mLを除去する操作を2回繰り返した。続いて、ヒト血清0.45mLと塩酸(0.5N、0.1N、又は0.05N)0.45mLを添加して30秒間撹拌した後、室温に5分間静置して酸処理を行った。その後、遠心後の上清0.1mLに0.4M Tris−HCl(pH8.0)を0.4mL混合して中和し、酸処理を終了した。
塩酸に代えて蒸留水を用い、上記(a)と同じ操作を行った。
実施例7に記載した手順に従い調製した。
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、及び標準曲線の作成に用いるCTS標準液を調製した。
1mm四方の培養菌体試料(Cunninghamella bertholletiae、及びBasidiobolus ranarum)にヒト血清0.5mLと蒸留水0.5mLを添加して30秒間撹拌した後、遠心後の上清から0.9mLを除去した。次に、ヒト血清0.45mLと蒸留水0.45mLを添加して30秒間撹拌した後、遠心後の上清から0.9mLを除去する操作を2回繰り返した。続いて、ヒト血清0.45mLと2%(v/v)酢酸0.45mLを添加して30秒間撹拌した後、室温に5分間静置して酸処理を行った。その後、遠心後の上清0.1mLに0.4M Tris−HCl(pH8.0)を0.4mL混合して中和し、酸処理を終了した。
実施例7に記載した手順に従い調製した。
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、及び標準曲線の作成に用いるCTS標準液を調製した。
1mm四方の培養菌体試料(Cunninghamella bertholletiae)にヒト血清0.5mLと蒸留水0.5mLを添加して30秒間撹拌した後、遠心後の上清から0.9mLを除去した。次に、ヒト血清0.45mLと蒸留水0.45mLを添加して30秒間撹拌した後、遠心後の上清から0.9mLを除去する操作を2回繰り返した。続いて、ヒト血清0.45mLと酢酸(100%(v/v)酢酸0.01mL、25%(v/v)酢酸0.04mL、10%(v/v)酢酸0.1mL、又は2%(v/v)酢酸0.45mL)を添加して30秒間撹拌した後、室温に5分間静置して酸処理を行った。全量1mLとなるように蒸留水を混合した後、遠心後の上清0.1mLに0.4M Tris−HCl(pH8.0)を0.4mL混合して中和し、酸処理を終了した。
実施例7に記載した手順に従い調製した。
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、及び菌体を含有しない試料を調製した。
不活化菌体試料(Mucor racemosus)8μLとヒト血清72μLを混合して調製した試料に対して5%(v/v)酢酸を20μL混合し、室温に5分間静置して酸処理を行った。その後、0.8M Tris−HCl(pH8.0)を60μL混合して中和し、酸処理を終了した。
酢酸に代えて蒸留水を用い、上記(a)と同じ操作を行った。
以下の手順に従い、菌体を含有する試料、及び標準曲線の作成に用いるCTS標準液を調製した。
1mm四方の培養菌体試料(Rhizopus oryzae、又はCunninghamella bertholletiae)に血漿等(ヒト血漿(コスモバイオ社製)、ウマ血清(コスモバイオ社製)、ウシ血清(日本バイオテスト研究所社製)、ウサギ血清(コージンバイオ社製)、又は生理食塩水(大塚製薬社製))0.5mLと蒸留水0.5mLを添加して30秒間撹拌した後、遠心後の上清から0.9mLを除去した。次に、血漿等0.45mLと蒸留水0.45mLを添加して30秒間撹拌した後、遠心後の上清から0.9mLを除去する操作を2回繰り返した。続いて、血漿等0.45mLと2%(v/v)酢酸0.45mLを添加して30秒間撹拌した後、室温に5分間静置して酸処理を行った。その後、遠心後の上清0.1mLに0.4M Tris−HCl(pH8.0)を0.4mL混合して中和し、酸処理を終了した。
実施例7に記載した手順に従い調製した。
Claims (15)
- 酸処理した試料を測定対象として接合菌を測定する、接合菌の測定方法。
- 酸処理が、酸性成分と試料を共存させる処理である、請求項1に記載の接合菌の測定方法。
- 接合菌の測定が、接合菌成分の検出試薬を用いた接合菌の測定である、請求項1又は2に記載の接合菌の測定方法。
- 接合菌の測定が、免疫測定法による接合菌の測定である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の接合菌の測定方法。
- 免疫測定法が、キトサンに結合する抗体を用いた免疫測定法である、請求項4に記載の接合菌の測定方法。
- 試料が、動物に由来する試料である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の接合菌の測定方法。
- 動物に由来する試料が、血液由来試料又は気管支肺胞洗浄液(BALF)である、請求項6に記載の接合菌の測定方法。
- 血液由来試料が、血清又は血漿である、請求項7に記載の接合菌の測定方法。
- 接合菌の測定方法が、接合菌症の検知方法である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の接合菌の測定方法。
- 接合菌症が、ムーコル症又はエントモフトラ症である、請求項9に記載の接合菌の測定方法。
- 酸性成分を含有する、接合菌測定用試料の調製剤。
- 酸処理することにより、試料を接合菌測定用試料にする、接合菌測定用試料の調製方法。
- 酸性成分を含有する試薬及び/又は接合菌成分の検出試薬を構成品として含む、接合菌の測定を行うための試薬キット。
- 試薬キットが、接合菌症の診断キットである、請求項13に記載の試薬キット。
- 試薬キットが、ムーコル症又はエントモフトラ症の診断キットである、請求項13に記載の試薬キット。
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