JPWO2016132802A1 - ｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒ選択的蛍光プローブ - Google Patents

ｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒ選択的蛍光プローブ Download PDF

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Abstract

【解決課題】十分な水溶性を示し、かつ生体内でｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒを検出する新たな蛍光プローブを提供すること。【解決手段】以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。

Description

本発明は、ｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒを選択的に検出できる新規蛍光プローブに関する。
生体内において産生される活性イオウ分子はその反応性の高さからタンパク質やシグナル分子を修飾し、様々な生理機能に関与することが報告されており、近年注目されている。ここで、活性イオウ分子とは、硫化水素（Ｈ２Ｓ）や０価の硫黄原子（Ｓ０、ｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒ）を初めとした反応性の高い硫黄原子を持った分子のことを意味する。
１９９０年頃からＨ２Ｓが活性イオウ分子として注目を集め、研究が行われてきた。（非特許文献１及び２）さらに近年、Ｈ２Ｓに加えて、０価の硫黄原子（Ｓ０、ｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒ）がより反応性の高い硫黄原子として注目を集めている（非特許文献３）。生体内で活性イオウ分子を産生する酵素はｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ β−ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＣＢＳ）、ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ γ−ｌｙａｓｅ（ＣＳＥ）、３−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｙｒｕｖａｔｅ ｓｕｌｆｕｒｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（３ＭＳＴ）などが報告されている（図１参照）。生体内でＨ２Ｓとｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒのどちらがどの程度重要なのか、そしてこれら酵素が生体内でＨ２Ｓとｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒをそれぞれどの程度産生するのかは未だ議論の渦中である。そのため、生体内で活性イオウ分子を選択的かつ感度良く検出する技術などの研究用ツールの開発は本研究分野の進展に極めて重要である。
２０１４年に、ｃｙｓｔｉｎｅを基質としたとき、ＣＳＥからｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒを含むｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｅｒｓｕｌｆｉｄｅが産生されることが明らかになり、実際に生体内でｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒが存在することが示された。（非特許文献４）そのため、近年、細胞内のｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒを検出する技術に注目が集まっている。
Ｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒの検出方法として、吸光法、モノブロモビマン法、蛍光プローブの３つがあげられる。
吸光法
吸光法は、ｃｙａｎｉｄｅとｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒから産生されるチオシアネートをＦｅ３＋で定量する方法であり、以下のスキームによりｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒが検出される。吸光法は感度の低さが問題となる。
スキーム１；シアニドを用いたsulfane sulfurの検出スキーム
Figure 2016132802
モノブロモビマン法
モノブロモビマンによる検出法は、親電子性の蛍光試薬であるモノブロモビマンと活性イオウ分子との反応産物をＬＣ−ＭＳにより解析する手法である(スキーム２)。この手法は、どのような活性イオウ分子がどの程度存在するかを同時に感度良く定量できる利点があるものの、吸光法と同様にホモジナイズなどの侵襲的な操作が必要であるため、リアルタイム測定には不向きである。
スキーム２：モノブロモビマンを用いたsulfane sulfurの検出スキーム
Figure 2016132802
蛍光プローブ
蛍光プローブを用いた蛍光イメージング法は、細胞を生きたままの状態で感度良く簡便に時空間分解能高く測定することができる点で優れており、汎用されている方法である。これまでＳｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒ選択的な蛍光プローブについて以下の２種類の報告があり、いずれもＭｉｎｇらのグループが報告している（図２参照）。（非特許文献５及び６）
（１）ＳＳＰ
Ｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒの求電子反応でｐｅｒｓｕｌｆｉｄｅが生成し、近傍のエステル構造に求核攻撃することで蛍光団が放出される。
（２）ＤＳＰ
Ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｓｕｌｆｉｄｅ（Ｈ−Ｓ−Ｓｎ−Ｓ−Ｈ）の求核反応を利用したプローブである。求核置換反応によりｐｅｒｓｕｌｆｉｄｅが生成し、近傍のエステル構造に求核攻撃することで蛍光団が放出される。ＤＳＰは硫黄原子の末端が修飾された分子（Ｒ−Ｓ−Ｓｎ−Ｓ−Ｒ、Ｒ−Ｓ−Ｓｎ−Ｈ）には応答せず、硫黄原子の末端が修飾されていないｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｓｕｌｆｉｄｅに選択的に応答する蛍光プローブである。
Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．, １９９６, １６, １０６６−１０７１ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．, １９９７, ２３７, ５２７−５３１． Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．, ２０１１, ４１３, １−７． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ, ２０１４, １１１, ７６０６−７６１１． Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．, ２０１３, ４, ２８９２−２８９６． Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．, ２０１４，１３６, ７２５７−７２６０．
上記の従来技術の蛍光プローブは培養細胞でのｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒのイメージングに成功しているが、フルオレセインのキサンテン環状のフェノール性水酸基を両側修飾しており、その分子構造から水溶性が非常に悪いため、大量の界面活性剤を添加した条件下で実験を行っている。また蛍光団が放出される不可逆型の蛍光プローブであり、生細胞への応用には改善の余地は多いと考えられる。
本発明は、十分な水溶性を示し、かつ生体内でｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒを検出する新たな蛍光プローブを提供することを目的とするものである。
 課題を解決する手段
本発明者等は、キサンテン骨格を母核とする蛍光色素に、これにＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ（蛍光共鳴エネルギー移動））を起こすことができるドナーとしての色素分子を結合し、更に、ｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒと反応後はキサンテン系色素に由来する蛍光を発しない構造を有する新規蛍光色素を設計する目的で鋭意検討したところ、キサンテン骨格に結合したベンゼン環に特定の置換基を導入することにより、上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、
［１］以下の一般式（Ｉ）：
Figure 2016132802
（式中、
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ２は、ＳＨ又はＳ−Ｓ−Ｒ（Ｒは、炭素数１〜６のアルキル基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し
Ｒ７及びＲ８は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ７及びＲ８は存在せず、
Ｘがリン原子の場合は、−Ｒ７及び−Ｒ８の一方は、＝Ｏであってもよい；
Ｒ９及びＲ１０は、
（ｉ）それぞれ独立に、ＮＨ２、モノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基から選択され、又は
（ｉｉ）それぞれ独立に、ヒドロキシル基又はアルコキシ基から選択され；
Ｘは、酸素原子、珪素原子、錫原子、ゲルマニウム原子又はリン原子を示し；
Ｙは、Ｌとの結合基ａを示し；
Ｌは、リンカーを示し；
Ｚは、Ｌとの結合基ｂを示し；
Ｄは、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、クマリン、クマリン誘導体、ローダミン又はローダミン誘導体を示し；
ｍは、０〜３の整数であり、ｎは、１〜４の整数であり、ｍ＋ｎ＝４である。）
で表される化合物又はその塩。
［２］以下の一般式（Ｉａ）：
Figure 2016132802
（式中、
Ｒ１〜Ｒ８、Ｘ、Ｙ、Ｌ、Ｚ、Ｄ、ｍ及びｎは、一般式（Ｉ）で定義した通りであり；
Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ１１又はＲ１２は、Ｒ３又はＲ５と一緒になって、Ｒ１１又はＲ１２が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい：
Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
Ｒ１３又はＲ１４は、Ｒ４又はＲ６と一緒になって、Ｒ１３又はＲ１４が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。）
で表される、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］以下の一般式（Ｉｂ）：
Figure 2016132802
（式中、
Ｒ１〜Ｒ８、Ｘ、Ｙ、Ｌ、Ｚ、Ｄ、ｍ及びｎは、一般式（Ｉ）で定義した通りであり；
Ｒ１５は、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示す。）
で表される、［１］に記載の化合物又はその塩。
［４］前記リンカーは、シクロアルキル基又はアリール基から選択される、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［５］結合基ａは、カルボニル基、アルキルカルボニル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アミド基、アルキルアミド基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基又はアルキニル基から選択される、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［６］結合基ｂは、カルボニル基、アルキルカルボニル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アミド基、アルキルアミド基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基又はアルキニル基から選択される、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［７］［１］〜［６］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
［８］細胞内のｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒを検出する方法であって、
（ａ）［１］〜［６］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び
（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内で発する蛍光を測定する工程
を含む方法。
を、提供するものである。
本発明により、十分な水溶性を示し、かつ生体内でｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒを検出する蛍光プローブを提供することが可能である。
特に、本発明により、ｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒとの反応前は、ＦＲＥＴ効果によりドナーの色素分子からは蛍光が発せられないのに対して、反応後は、ドナーの色素分子由来の強い蛍光が発せられることから、優れたＯＦＦ／ＯＮ型の蛍光プローブを提供することが可能である。
また、本発明の蛍光プローブは、ｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒとの反応前は、ドナーの色素分子からは蛍光が発せられないのに対して、反応後は、ドナーの色素分子由来の強い蛍光が発せられることから、アクセプターとなるキサンテン骨格を母核とする蛍光色素の蛍光が減少することと組み合わせて、レシオ測定にも用いることができる。
酵素により反応性イオウ種の生成とその選択的検出の概略図 従来技術の蛍光イメージング法の概略図 化合物８（ＳＳｉｐ−１）にＮａ２Ｓ４を添加した後の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルの測定結果 ５０μＭのＮａ２Ｓ４添加後における、５ｍＭのＧＳＨ存在下での０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー中における１μＭ ＳＳｉｐ−１の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルの測定結果 ＳＳｉｐ−１のＨ２Ｓとの選択性を調べた結果 ＳＳｉｐ−１による生細胞（Ａ５４９細胞）のイメージングの結果 化合物ａ１にＮａ２Ｓ４を添加した前後の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルの測定結果 化合物ａ２にＮａ２Ｓ４を添加した前後の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルの測定結果 化合物２５にＮａ２Ｓ４を添加した前後の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルの測定結果 ２５０μＭのＮａ２Ｓ４を添加したＳＳｉｐ−１を用いたＡ５４９生細胞の共焦点顕微鏡像 ＳＳｉｐ−１の生細胞中での可逆性の観察結果（共焦点顕微鏡像） ＳＳｉｐ−１の生細胞中での可逆性の観察結果（蛍光強度の変化） ２５０μＭのＮａ２Ｓ４を繰り返し添加した後のＳＳｉｐ−１でインキュベートしたＡ５４９生細胞の比（ＦＬ／ＲＢ）の変化及びはそのレシオ像 ＳＳｉｐ−１とＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ又はＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒとの共染色の結果 ２５０μＭのＮａ２Ｓ４を添加した化合物ａ４を用いたＡ５４９生細胞の共焦点顕微鏡像
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１〜６個、好ましくは炭素数１〜４個、更に好ましくは炭素数１〜３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。
本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
本発明の１つの実施態様は、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
Figure 2016132802
一般式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示す。
Ｒ１がベンゼン環上に存在する一価の置換基を示す場合には、ベンゼン環上に同一又は異なる置換基が１ないし２個程度存在していることが好ましい。Ｒ１が１個又は２個以上の一価の置換基を示す場合には、該置換基はベンゼン環上の任意の位置に置換することができる。好ましくは、Ｒ１の全てが水素原子であるか、Ｒ１の１つが一価の置換基であり、それ以外のＲ１は水素原子である。
Ｒ１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜６個のアルキル基、炭素数１〜６個のアルケニル基、炭素数１〜６個のアルキニル基、炭素数１〜６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲ１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。更に、Ｒ１が示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４−カルボキシブトキシ基又は４−アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。
一つの好ましい側面において、Ｒ１が炭素数１〜６個のアルキル基などの一価の置換基であり、該置換基はベンゼン環上の３位から６位に存在する。
Ｒ２は、ＳＨ又はＳ−Ｓ−Ｒ（Ｒは、炭素数１〜６、好ましくは１〜２のアルキル基を示す）。
理論に拘束されることを意図するものではないが、一般式（Ｉ）の化合物においては、ＤとしてＦＲＥＴを起こすことができるドナーの色素分子が導入されていることから、ｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒ添加前は、ドナー色素に由来する蛍光は発せられないが、ｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒを添加すると、ｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒとＲ２のＳＨ又はＳ−Ｓ−Ｒが反応して閉環構造を形成することにより、ＦＲＥＴが起こらないため、Ｄに由来する蛍光強度が上昇することで、ＯＦＦ／ＯＮ型のプローブを提供することができる。従って、一般式（Ｉ）の化合物において、Ｒ２の位置にＳＨ又はＳ−Ｓ−Ｒが導入されていることが重要である。
一般式（Ｉ）において、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。Ｒ３又はＲ４がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ３又はＲ４が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ３及びＲ４がともに水素原子である場合、又はＲ３及びＲ４がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
一般式（Ｉ）において、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示すが、Ｒ３及びＲ４について説明したものと同様である。Ｒ５及びＲ６が共に水素原子であるか、共に塩素原子であるか、又は共にフッ素原子であることが好ましい。
一般式（Ｉ）において、Ｒ７及びＲ８は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示すが、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、炭素数１〜３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒ７及びＲ８がともにメチル基であることがより好ましい。Ｒ７及びＲ８が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ７又はＲ８が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ７又はＲ８がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
また、後述するＸが酸素原子の場合は、Ｒ７及びＲ８は存在しない。
また、Ｘがリン原子の場合は、−Ｒ７及び−Ｒ８の一方は、＝Ｏであってもよい。Ｘがリン原子の場合の好ましい側面においては、−Ｒ５及び−Ｒ６の一方は、＝Ｏであり、他方は、炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示す。
Ｒ９及びＲ１０としては、（ｉ）それぞれ独立に、ＮＨ２、モノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基から選択される態様、又は、（ｉｉ）それぞれ独立に、ヒドロキシル基又はアルコキシ基から選択される態様がある。
モノアルキルアミノ基及びジアルキルアミノ基は、炭素数１〜６の置換又は無置換のアルキル基を有することが好ましい。置換基としては、メチル基、エチル基、エチルカルボキシ基などが挙げられる。
アルコキシ基は、炭素数１〜６のアルコキシ基が好ましく、メトキシ基、エトキシ基がより好ましい。
上記（ｉ）の態様において、Ｒ９、Ｒ１０の少なくとも１つが、モノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基である場合、モノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基は、Ｒ４〜Ｒ６のいずれかと一緒になって、モノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基の窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。
一般式（Ｉ）において、Ｘは、酸素原子、珪素原子、錫原子、ゲルマニウム原子又はリン原子を示す。本発明の好ましい態様においては、Ｘは酸素原子である。
Ｙは、ベンゼン環とＬとを連結させる結合基ａを示す。結合基ａとしては、カルボニル基、アルキルカルボニル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アミド基、アルキルアミド基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基などが挙げられ、特にカルボニル基、アミド基、アルキルアミド基が好ましい。
Ｌは、リンカーを示す。リンカーとしては、キサンテン骨格を母核とする蛍光色素と、ＦＲＥＴを起こすことができるドナーとしての色素分子が近づくことを妨げる構造的に堅い構造から選択される。
また、リンカーとして、シクロアルキル基、アリール基が好ましい。
シクロアルキル基としてはトランスーシクロヘキシル基が好ましい。アリール基としては、フェニル基が好ましい。
Ｚは、ＬとＤとを連結させる結合基ｂを示す。結合基ｂとしては、カルボニル基、アルキルカルボニル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アミド基、アルキルアミド基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基などが挙げられ、特にカルボニル基、アミド基、アルキルアミド基が好ましい。
Ｄは、母核であるキサンテン系色素に対してＦＲＥＴ現象を引き起こすドナー色素を表す。このような色素としては、好ましくは、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、クマリン、クマリン誘導体、ローダミン、ローダミン誘導体が挙げられる。
フルオレセイン誘導体としては、置換基を有するフルオレセイン、キサンテン骨格の水酸基がアセチル化されたフルオレセイン誘導体（当該誘導体はその他の置換基を有していてもよい）、キサンテン骨格に結合したフェニル基上のＣＯＯＨがキサンテン骨格と閉環構造を形成したフルオレセイン誘導体（当該誘導体はその他の置換基を有していてもよい）等が挙げられる。置換基としては、カルボキシル基を有するアルキルアミン、カルボキシエステル基（例えば、−ＣＯＯＣＨ２ＯＣＯＣＨ３）を有するアルキルアミン、クロロ基、フルオロ基、メチル基等が好ましい。置換基の導入位置としては特に限定されないが、キサンテン環２位、４位、５位、７位が好ましい。
クマリン誘導体としては、置換基を有するクマリンであり、置換基としては、ヒドロキシ基、塩素原子、アセトキシ基、アセトキシ基を有するアルコキシ基、トリフルオロメチル基等が好ましい。置換基の導入位置としては、クマリン３位、４位、６位が好ましい。
ローダミン誘導体としては、置換基を有するローダミン、キサンテン骨格のアミノ基がアルキル化されたローダミン誘導体（当該誘導体はその他の置換基を有していてもよい）、キサンテン骨格に結合したフェニル基上のＣＯＯＨがキサンテン骨格と閉環構造を形成したローダミン誘導体（当該誘導体はその他の置換基を有していてもよい）等が挙げられる。置換基としては、クロロ基、フルオロ基等が好ましい。
フルオレセイン、及びフルオレセイン誘導体の非限定的な例としては、以下が挙げられる。
Figure 2016132802
クマリン、及びクマリン誘導体の非限定的な例としては以下が挙げられる。
Figure 2016132802
フルオレセイン又はフルオレセイン誘導体を連結基ｂを介してリンカーにつなげる場合、連結基ｂはフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体のキサンテン骨格に結合したフェニル基上の４位又は５位に導入するのが好ましい。
クマリン又はクマリン誘導体を連結基ｂを介してリンカーにつなげる場合、連結基ｂはクマリン又はクマリン誘導体の３位又は４位に導入するのが好ましい。
クマリン誘導体をリンカーにつなげる場合の非限定的例を以下に示す。
Figure 2016132802
一般式（Ｉ）において、ｍは、０〜３の整数であり、ｎは、１〜４の整数であり、ｍ＋ｎ＝４である。
本発明の好ましい態様において、ｍが３であり、ｎは１である。
本発明の１つの側面は、以下の一般式（Ｉａ）で表される化合物又はその塩である。
Figure 2016132802
一般式（Ｉａ）において、Ｒ１〜Ｒ８、Ｘ、Ｙ、Ｌ、Ｚ、Ｄ、ｍ及びｎは、一般式（Ｉ）で定義した通りである。
一般式（Ｉａ）において、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示す。
Ｒ１１又はＲ１２は、Ｒ３又はＲ５と一緒になって、Ｒ１１又はＲ１２が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。
好ましくは、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、エチル基である。
一般式（Ｉａ）において、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示す。
Ｒ１３又はＲ１４は、Ｒ４又はＲ６と一緒になって、Ｒ１３又はＲ１４が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。

好ましくは、Ｒ１３及びＲ１４は、どれぞれ独立に、水素原子、メチル基、エチル基である。
本発明の１つの側面は、以下の一般式（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩である。
Figure 2016132802
一般式（Ｉｂ）において、Ｒ１〜Ｒ８、Ｘ、Ｙ、Ｌ、Ｚ、Ｄ、ｍ及びｎは、一般式（Ｉ）で定義した通りである。
一般式（Ｉｂ）において、Ｒ１５は、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示す。
好ましくは、Ｒ１５は、水素原子、メチル基、エチル基である。
一般式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）に含まれる化合物の非限定的例を以下に示す。
Figure 2016132802
Figure 2016132802
Figure 2016132802
式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（Ｉｂ）で表される本発明の化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質も本発明の範囲内である。
本発明の式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（Ｉｂ）で表される化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。
本発明の化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、一般式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（Ｉｂ）で表される本発明の化合物を製造することができる。
本発明の式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（Ｉｂ）で表される本発明の化合物は、細胞内のｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒを検出する蛍光プローブとして有用である。
即ち、本発明のもう１つの態様は、式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む蛍光プローブである。
また、本発明のもう１つの態様は、細胞内のｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒを検出する方法であって、（ａ）式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内で発する蛍光を測定する工程を含む方法、である。
式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（Ｉｂ）で表される本発明の化合物又はその塩は、ｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒのない環境において実質的に無蛍光であるか、弱い蛍光のみを有するが、ｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒのある環境においてドノー色素に由来する強い蛍光を発する特徴を有する。従って、式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（Ｉｂ）で表される本発明の化合物又はその塩は、細胞内でのｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒを生理条件下で検出するための優れたＯＦＦ／ＯＮ型の蛍光プローブを提供できる点で極めて有用である。
本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の蛍光プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに上記式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（Ｉｂ）で表される化合物又はそれらの塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。本発明の蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［合成実施例１］
本発明の化合物８（ＳＳｉｐ−１）の合成
以下のスキーム１により、本発明の化合物８を合成するのに用いる合成中間体を合成した。
スキーム１(合成中間体を合成する工程まで)
Figure 2016132802
（１）化合物１の合成
フラスコに４−ブロモ安息香酸（５．０６ｇ、２５．３ｍｍｏｌ）を入れ、クロロスルホン酸（１２ｍＬ）をゆっくりと滴下した。１４０°Ｃで６時間加熱還流した。室温まで冷却後、反応溶液を氷水へゆっくりと滴下した。そのときに目的物の沈殿を生じた。ブフナー漏斗で沈殿をろ取、漏斗上でＨ２Ｏにて洗浄し、４−ブロモ−３−クロロスルホニル安息香酸（化合物１、６．１７ｇ、２０．７ｍｍｏｌ、収率８２％）を得た。
1H NMR (400 MHz, Acetone-d6): δ 8.23 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 8.33 (dd, 1H, J = 8.3, 2.0 Hz), 8.74 (d, 1H, J = 2.0 Hz). 13C NMR (100 MHz, Acetone-d6): δ 125.8, 132.1, 132.2, 137.8, 138.4, 143.8, 165.0.
HRMS (ESI-): Calcd. for [M-H]- 298.8604, Found 298.8589 (-1.5 mmu)
（２）化合物２の合成
４−ブロモ−３−クロロスルホニル安息香酸（化合物１、６．１７ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）を酢酸（６０ｍＬ）に溶解させ、そこへ１０Ｎ ＨＣｌ ａｑ．（２５ｍＬ）に溶解させた塩化スズ（ＩＩ）（２７．８ｇｍ、１２３．６ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン下で８０°Ｃで２時間撹拌した。室温まで冷却後、生じた目的物の沈殿をブフナー漏斗でろ取、漏斗上でＨ２Ｏにて洗浄し４−ブロモ−３−メルカプト安息香酸（化合物２、４．０３ｇ、１７．０ｍｍｏｌ、収率８４％）を得た。
1H NMR (400 MHz, Acetone-d6): δ 5.04 (1H, s), 7.66 (dd, 1H, J = 8.3, 2.0 Hz), 7.72 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 8.14 (d, 1H, J = 2.0 Hz). 13C NMR (100 MHz, Acetone-d6): δ 126.7, 128.2, 131.4, 131.5, 134.0, 136.7, 166.5.
HRMS (ESI-): Calcd. for [M-H]- 232.9095, Found 232.9139 (-4.4 mmu).
（３）化合物３の合成
４−ブロモ−３−メルカプト安息香酸（化合物２、５００ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（３６０ｍｇ、４．３ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）に溶解させ、アルゴン下で０°Ｃで冷却した。そこへ、三フッ化ホウ素−エチルエーテル錯体（３１２ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後に残渣に水を加え、この混合物を酢酸エチルで抽出し、食塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥して溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）で一部の副生成物を除いた。
粗精製した化合物をｔｅｒｔ−ブチルアルコール（１５ｍＬ）に溶解させ、４−ジメチルアミノピリジン（３８ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）とｄｉ−ｔｅｒｔ−ブチルジ炭酸塩（２３９ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン下で４０°Ｃで１２時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後に残渣に水を加え、この混合物を酢酸エチルで抽出し、食塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥して溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン／ｎ−ヘキサン）でｔｅｒｔ−ブチル ４−ブロモ−３−（テトラヒドロピラン−２−イルチオ）ベンゾエート（化合物３、３３８ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ、収率４２％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.59 (s, 9H), 1.64-1.77 (m, 3H), 1.87-1.98 (m, 2H), 2.05-2.13 (m, 1H), 3.63-3.71 (m, 1H), 4.13-4.20 (m, 1H), 5.35-5.38 (m, 1H), 7.56 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.62 (dd, 1H, J = 1.8, 8.4 Hz), 8.19 (d, 1H, J = 1.5 Hz). 13C NMR (75 MHz,CDCl3): δ 21.5, 25.2, 28.0, 31.0, 64.6, 81.3, 83.6, 127.5, 128.0, 130.2, 131.6, 132.4, 137.6, 164.6.
（４）化合物４の合成
乾燥させアルゴン置換したフラスコにｔｅｒｔ−ブチル ４−ブロモ−３−（テトラヒドロピラン−２−イルチオ）ベンゾエート（化合物３、６００ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ）と脱水テトラヒドロフラン（１５ｍＬ）を加えた。−７８°Ｃに冷却後、１Ｍ ｓｅｃ−ブチルリチウム（１．０ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）を加え、２０分間攪拌した。そのままの温度で３，６−ビス（ジエチルアミノ）キサントン（１００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン（５ｍＬ）に溶解してゆっくりと加え、室温に戻して１時間攪拌した。２Ｎ ＨＣｌ ａｑ．で反応を停止させた。この混合物をジクロロメタンで抽出して食塩水で洗浄し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた後に溶媒を減圧留去した後、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝２５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、２−Ｓ−ＴＨＰ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−テトラエチルローダミン（化合物４、１９０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、ｑｕａｎｔ．）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.32 (t, 12H, J = 6.8 Hz), 1.43-1.62 (m, 4H), 1.65 (s, 1H), 1.82-1.85 (m, 2H), 3.47-3.52 (m, 1H), 3.68-3.72 (m, 8H), 3.86-3.89 (m, 1H), 5.27-5.29 (m, 1H), 7.00 (d, 2H, J = 2.4 Hz), 7.06-7.09 (m, 2H), 7.15 (dd, 1H, J = 2.2, 9.5 Hz), 7.42 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 8.05 (dd, 1H, J = 1.7, 8.1 Hz), 8.48 (d, 1H, J = 1.5 Hz). 13C NMR (75 MHz,CD3OD): δ 12.8, 22.4, 26.4, 28.4, 32.4, 46.9, 65.6, 83.2, 86.4, 97.4, 114.4, 115.7, 128.5, 131.0, 132.5, 132.9, 135.3, 137.7, 138.4, 156.7, 157.4, 159.4, 166.1. HRMS (ESI+): Calcd. for [M]+ 615.3257, Found 615.3223 (-3.4 mmu).
（５）化合物５の合成
化合物４（２０ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）にＴＦＡ（３ｍＬ）とトリエチルシラン（２０μＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後に、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝２５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で一部の副生成物を除いた。
粗精製した化合物を脱水ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解させ、そこへ、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（６ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）と三フッ化ホウ素−エチルエーテル錯体（１０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を加え、室温で６時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後に、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝２５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、２−Ｓ−ＴＨＰ−４−カルボキシテトラエチルローダミン（化合物５、３．３ｍｇ、０．００５９ｍｍｏｌ、収率１８％）を得た。
1H NMR(300 MHz, CD3OD): δ 1.32 (t, 12H, J = 7.0 Hz), 1.49-1.58 (m, 5H), 1.86-1.99 (m, 1H), 3.45-3.53 (m, 1H), 3.70 (q, 8H, J = 6.8 Hz), 3.84-3.88 (m, 1H), 5.33 (t, 1H, J = 4.4 Hz), 7.01 (d, 2H, J = 3.0 Hz), 7.08 (d, 2H, J = 10.2 Hz), 7.17 (dd, 1H, J = 3.6, 9.6 Hz), 7.44 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 8.12 (dd, 1H, J = 1.5, 8.1 Hz), 8.53 (d, 1H, J = 1.5 Hz). 13C NMR (100 MHz,CD3OD): δ 12.8, 22.2, 26.4, 32.5, 46.9, 65.3, 86.5, 97.5, 114.6, 115.7, 128.9, 131.1, 132.8, 133.4, 134.4, 137.7, 138.8, 156.7, 157.4, 159.4, 168.4. HRMS (ESI+): Calcd. For [M+H]+ 559.2631, Found 559.2593 (-3.8 mmu).
（６）化合物６の合成
５−カルボキシ フルオレセイン（３６ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）とＮ−Ｂｏｃ−ｔｒａｎｓ−１，４−シクロヘキサンジアミン（３６ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６５ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）と１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（６０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、室温で１４時間撹拌させた。２Ｎ ＨＣｌａｑ．で反応を停止させた。この混合物をジクロロメタンで抽出して食塩水で洗浄し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた後に溶媒を減圧留去した後、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝２５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で一部の副生成物を除いた。
粗精製した化合物にＴＦＡ（４ｍＬ）とトリエチルシラン（１００μＬ）を加え、室温で４時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後に、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝２５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、５−アミノシクロヘキシルアミド−フルオレセイン（化合物６、１２．４ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ、収率２７％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.51-1.63 (m, 4H), 2.13-2.18 (m, 4H), 3.10-3.19 (m, 1H), 3.89-3.96 (m, 1H), 6.59 (dd, 2H, J = 2.4, 8.8 Hz), 6.66 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 6.75 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.33 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 8.20 (dd, 1H, J = 1.5, 8.3 Hz), 8.45 (d, 1H, J = 1.5 Hz). 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ 29.2, 29.7, 47.5, 48.6, 102.2, 109.0, 112.6, 123.3, 124.1, 126.4, 129.0, 134.7, 136.3, 151.8, 154.6, 157.9, 159.6, 163.9, 168.1. HRMS (ESI+): Calcd. for [M+H]+ 473.1713, Found 473.1699 (-1.4 mmu).
次に以下のスキーム２により、本発明の化合物８を合成した。
スキーム２（中間体からプローブの合成）
Figure 2016132802
（７）化合物７の合成
化合物５（１０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１６．１ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）と１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１３．５ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解させ、アルゴン下で室温で１２時間撹拌させた。０．１Ｎ ＨＣｌａｑ．で反応を停止させた。この混合物をジクロロメタンで抽出して食塩水で洗浄し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた後に溶媒を減圧留去した後、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝２５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で一部の副生成物を除いた。
粗精製した化合物と化合物６（１４ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、アルゴン下で３０°Ｃで６時間撹拌した。０．１Ｎ ＨＣｌａｑ．で反応を停止させた。この混合物をジクロロメタンで抽出して食塩水で洗浄し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた後に溶媒を減圧留去した後、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、Ｓ−ｐｙｒａｎ ＳＳｉｐ−１（化合物７、４．０ｍｇ、０．００３９ｍｍｏｌ、収率２２％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.31 (t, 12H, J = 6.4 Hz), 1.45-1.58 (m, 5H), 1.65-1.69 (m, 4H), 1.83-1.84 (m, 1H), 2.16- 2.18 (m, 4H), 3.42-3.43(m, 1H), 3.69 (q, 8H, J =4.0 Hz), 3.76-3.78 (m, 1H), 4.00-4.07 (m, 2H), 5.32-5.34 (m, 1H), 6.52-6.54 (m, 2H), 6.62 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.71 (d, 2H, J = 2.4 Hz), 6.98 (d, 2H, J = 2.0 Hz), 7.03-7.06 (m, 2H), 7.14-7.16 (m, 2H), 7.30-7.40 (m, 2H), 7.94 (dd, 1H, J = 8.1, 1.7 Hz), 8.23 (dd, 1H, J = 7.8, 1.5 Hz). 13C NMR(100 MHz,CD3OD); δ 12.8, 22.1, 26.4, 32.3, 32.5, 46.9, 50.1, 50.2, 65.2, 86.7, 97.4, 103.7, 111.1, 113.8, 114.8, 115.7, 125.1, 125.8, 126.9, 128.7, 130.2, 131.1, 132.6, 132.9, 135.5, 137.4, 137.8, 138.2, 138.4, 154.2, 156.9, 157.3, 157.4, 159.4, 159.5, 167.9, 168.3, 170.5. HRMS (ESI+): Calcd. for [M]+ : 1013.4159, Found 1013.4137 (-2.2 mmu).
（８）化合物８の合成
Ｓ−ｐｙｒａｎ ＳＳｉｐ−１（化合物７、４．０ｍｇ、０．００３９ｍｍｏｌ）にＴＦＡ（２ｍＬ）とトリエチルシラン（２０μＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後に、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、ＳＳｉｐ−１（１．８ｍｇ、０．００１９ｍｍｏｌ、収率５０％）を得た。
1H NMR(400 MHz, CD3OD): δ 1.33 (t, 12H, J = 7.1 Hz), 1.64-1.68 (m, 4H), 2.13-2.19 (m, 4H), 3.71 (q, 8H, J =7.0 Hz), 4.00-4.06 (m, 2H), 6.96-7.05 (m, 4H), 7.10 (dd, 2H, J = 2.4, 9.6 Hz), 7.17-7.30 (m, 6H), 7.42 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 7.53 (d, 2H, J = 7.8 Hz), 7.86 (dd, 1H, J = 1.7, 8.1 Hz), 8.11 (d, 1H, J = 1.5 Hz), 8.31 (dd, 1H, J = 1.5, 7.8 Hz), 8.73 (m, 1H). HRMS (ESI+): Calcd. for [M]+ 929.3584, Found 929.3554 (-3.0 mmu). ；
精製後のＨＰＬＣクロマトグラム（２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水から８０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（流速＝１．０ｍＬ／ｍｉｎ）のリニアグラディエント，Ａｂｓ．３００ｎｍ）では１７分に単一ピークを認めた。
［実施例１］
上記で合成した化合物８にＮａ２Ｓ４を添加し、吸収スペクトル（ＵＶ−１６５０ＰＣ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ）および蛍光スペクトル（Ｆ−４５００、ＨＩＴＡＣＨＩ）を測定した。
図３の左図は、５０μＭのＮａ２Ｓ４（共溶媒として０．１％ＤＭＳＯ及び１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ含有）添加後における、３００μＭのＧＳＨ存在下での０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中における１μＭ ＳＳｉｐ−１の吸収スペクトルの測定結果を、図３の右図は同じ条件での蛍光スペクトルの測定結果示す。励起波長は４７０ｎｍである。
ＳＳｉｐ−１は５０μＭのＮａ２Ｓ４添加後、ローダミン側の吸光減少とフルオレセイン由来の蛍光上昇が見られ、ｏｆｆ／ｏｎ型の蛍光プローブとなった。細胞内のｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒを含む分子であるｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｐｅｒｓｕｌｆｉｄｅ（ＧＳＳＨ）の濃度は１０−１００μＭと報告されており、ＳＳｉｐ−１は５０μＭのＮａ２Ｓ４添加で約１０倍の蛍光強度上昇が起こることから、細胞内のｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒを十分に探知できるプローブといえる。
ＳＳｉｐ−１の可逆性（５ｍＭ ＧＳＨ下でのｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙ）
細胞内のＧＳＨ濃度である、５ｍＭ ＧＳＨ存在下においてｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒに応答するかを調べた（図４）。
図４の左図は、５０μＭのＮａ２Ｓ４（共溶媒として０．１％ＤＭＳＯ及び１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ含有）添加後における、５ｍＭのＧＳＨ存在下での０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中における１μＭ ＳＳｉｐ−１の吸収スペクトルの測定結果を、図４の右図は同じ条件での蛍光スペクトルの測定結果示す。励起波長は４７０ｎｍである。
その結果、５ｍＭのＧＳＨ存在下において、Ｎａ２Ｓ４添加後、一度蛍光が上昇した後、経時的に蛍光強度が減少した。そこへ再びＮａ２Ｓ４を添加すると再び蛍光強度が上昇し、可逆性を示した。
Ｈ ２ Ｓとの選択性
ＳＳｉｐ−１のＨ２Ｓとの選択性を調べた結果を図５に示す。図５の左図は、５０μＭのＮａＨＳ（共溶媒として０．１％ＤＭＳＯ及び１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ含有）添加後における、３００μＭのＧＳＨ存在下での０．１Ｍナトリウムリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中における０．１μＭ ＳＳｉｐ−１の吸収スペクトルの測定結果を、図３の右図は同じ条件での蛍光スペクトルの測定結果示す。励起波長は４７０ｎｍである。
図５から分かるように、Ｈ２Ｓドナーである５０μＭ ＮａＨＳを添加しても、蛍光強度の上昇はほとんど見られず、選択性を示した。
生細胞イメージング
Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＳＳｉｐ−１はｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒに対し優れた応答を示したため、ＳＳｉｐ−１の細胞イメージングを行った。ＳＳｉｐ−１はフルオレセイン構造を持つため、細胞膜透過性を有していない可能性が考えられた。そこで、フルオレセインを細胞膜透過型にする際に用いられるジアセテート（ＤＡ）体をＳＳｉｐ−１に適用し、以下のスキームによりＳＳｉｐ−１ ＤＡの合成を行った。
スキーム３
Figure 2016132802
化合物９（ＳＳｉｐ−１ ＤＡ）の合成
Ｓ−ｐｙｒａｎ ＳＳｉｐ−１（化合物７、１０ｍｇ、０．００９９ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル（５ｍＬ）に溶解させ、無水酢酸（１ｍＬ）とピリジン（８０ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン下で４０°Ｃで６時間撹拌させた。溶媒を減圧留去した後に、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、一部の副生成物を除いた。
粗精製した化合物にＴＦＡ（１ｍＬ）とトリエチルシラン（１０μＬ）に溶解させ、室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後に、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、ＳＳｉｐ−１ ＤＡ（１．８ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ、収率１８％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.32 (t, 12H, J = 6.8 Hz), 1.60-1.63 (m, 4H), 2.13- 2.15 (m, 4H), 2.30 (s, 6H), 3.71 (q, 8H, J =6.7 Hz), 3.94-4.02 (m, 2H), 6.85-6.94 (m, 4H), 7.01 (d, 2H, J = 2.4 Hz), 7.10 (dd, 2H, J = 2.2, 9.5 Hz), 7.17-7.18 (m, 2H), 7.20-7.21 (m, 2H), 7.34-7.42 (m, 2H), 7.85 (dd, 1H, J = 7.8, 2.0 Hz), 8.09 (m, 1H), 8.22-8.24 (m, 1H), 8.47-8.48 (m, 1H). HRMS (ESI+): Calcd. for [M]+ 1013.3795, Found 1013.3764 (-3.1 mmu).
精製後のＨＰＬＣクロマトグラム（８０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水から２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（流速＝１．０ｍＬ／ｍｉｎ）のリニアグラディエント、Ａｂｓ．５５０ｎｍ）では８分に単一ピークを認めた。
ＳＳｉｐ−１ ＤＡをＡ５４９細胞に導入し、顕微鏡下で５００μＭのＮａ２Ｓ４を細胞外へ添加した。Ａ５４９細胞は、１０μＭ ＳＳｉｐ−１ ＤＡ（０．０００３％のｐｕｒｕｌｏｎｉｃ及び共溶媒として１％ＤＭＳＯを含有）で３時間インキュベートした。励起波長は４８８ｎｍであり、発光波長は５００−５７０ｎｍ及び５９０−６５０ｎｍであった。
その結果、蛍光強度が上昇し、ＳＳｉｐ−１は生細胞内でｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒを検出できた（図６）。なお、プローブの導入の際に、界面活性剤であるｐｕｒｕｌｏｎｉｃを使用し、プローブの凝集を防いだ。また、フルオレセイン由来の蛍光波長の領域（５００−５７０ｎｍ）とローダミン由来の蛍光波長の領域（５９０−６５０ｎｍ）の２つの波長の蛍光強度を算出すると、フルオレセイン由来の蛍光波長領域の強度は増加し、ローダミン由来の蛍光波長領域の強度はわずかに減少した。そのため、本測定下ではＳＳｉｐ−１は細胞イメージングにおいて、フルオレセインからの蛍光強度の変化にするイメージングだけでなく、レシオ測定も可能であると考えられた。
［合成実施例２］
本発明の化合物ａ１（６−フルオレセインーＳＳｉｐ−１）の合成
以下のスキーム４により、本発明の化合物ａ１を合成した。
スキーム４
Figure 2016132802
（１）化合物９の合成
６−カルボキシフルオレセイン（２００ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）とＮ−Ｂｏｃ−ｔｒａｎｓ−１，４−シクロヘキサンジアミン（２８５ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６８６ｍｇ、５．３２ｍｍｏｌ）とＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェート（ＨＡＴＵ）（４０３ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、室温で３時間撹拌した。１Ｎ ＨＣｌａｑ．で反応を停止させた。この混合物をジクロロメタンで抽出して、有機層をｂｒｉｎｅで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。その後、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で一部の副生成物および試薬残渣を除いた。
粗精製した化合物にＴＦＡ（４ｍＬ）とトリエチルシラン（１００μＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後に、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝２５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、６−アミノシクロヘキシルアミド−フルオレセイン（化合物９、９８．３ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、収率３９％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 1.45-1.52 (4H, m), 2.00-2.07 (4H, m), 3.07 (1H, br m), 3.82 (1H, br m), 6.62 (2H, dd, J = 8.8, 2.2 Hz), 6.71 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.78 (2H, d, J = 2.2 Hz), 7.64 (1H, d, J = 1.5 Hz), 8.11 (1H, d, J = 8.1 Hz), 8.15(1H, dd, J = 8.1, 1.5 Hz)
13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ 29.14, 29.61, 47.59, 48.60, 102.26, 109.13, 112.77, 122.16, 124.78, 128.25, 129.23, 129.58, 140.65, 151.82, 152.56, 157.32, 159.65, 163.76, 168.00
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 473.1713, found, 473.1680 (-3.3 mmu)
（２）化合物ａ１の合成
化合物５（２０．０ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３７．０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）と１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（３１．０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解させ、室温で１１時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で粗精製した。
粗精製した化合物と化合物９（１４ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、室温で３０時間撹拌した。０．１Ｎ ＨＣｌａｑ．で反応を停止させた。この混合物をジクロロメタンで抽出して有機層をｂｒｉｎｅで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣にトリフルオロ酢酸（１ｍＬ）、トリエチルシラン（１０μＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後に、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、化合物ａ１（４．３ｍｇ、４．６２μｍｏｌ、３工程での収率６１％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.30 (12H, t, J = 7.1 Hz), 1.50-1.52 (4H, m), 2.02-2.03 (4H, m), 3.68 (8H, q, J = 7.3 Hz), 3.88 (2H, br), 6.53-6.56 (4H, m), 6.60-6.62 (2H, m), 6.69-6.70 (2H, m), 6.88 (2H, d, J = 9.2 Hz), 6.93-6.97 (4H, m), 7.43 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.63 (1H, br), 7.99 (1H, dd, J = 8.1, 1.7 Hz), 8.06 (1H, d, J = 7.8 Hz), 8.12-8.14 (1H, m), 8.22 (1H, d, J = 1.5 Hz)
HRMS (ESI+): calcd for [M]2+, 1857.7045, found, 1857.7021 (-2.4 mmu)
The HPLC chromatogram after purification was as follows. The solution was done with a liner gradient from 20% CH3CN/0.1% TFA aq. (0 min) to 80% CH3CN/0.1% TFA aq. (15 min) (flow rate = 1.0 mL/min).
Figure 2016132802
［合成実施例３］
本発明の化合物ａ２（５−アミド−ＳＳｉｐ−１）の合成
以下のスキーム５により、本発明の化合物ａ２を合成した。
スキーム５
Figure 2016132802
（１）化合物１２の合成
四硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ４、４．３７ｇ、２５．１ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦに溶解し、２−ブロモ−１−フルオロ−４−ニトロベンゼン（５．０ｇ、２２．８ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１．５時間撹拌した。反応溶液を０°Ｃに冷やし、２Ｎ ＨＣｌａｑ．を加えて反応を停止させた。この混合物にジクロロメタンを加えた後、桐山漏斗でろ過して不溶物を取り除いた。ろ液をジクロロメタンで抽出して、有機層を水、ｂｒｉｎｅで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後にＤＭＦ以外の溶媒を減圧留去した。 残渣を桐山漏斗でろ過し、ＤＭＦに溶解しない固体を取り除いた。ろ液を減圧留去し、残渣をジクロロメタンで洗浄し、粗精製の化合物１１を得た。化合物１１をＴＨＦ（６０ｍＬ）、エタノール（２０ｍＬ）の混合溶媒に溶解させ、０°Ｃに冷却し、水素化ホウ素ナトリウム（４８９ｍｇ、１２．９ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間撹拌した。反応溶液を０°Ｃに冷却し、２Ｎ ＨＣｌａｑ．を加えて反応を停止させた。有機溶媒を減圧留去した後、析出した固体を桐山漏斗でろ取し、水で洗浄し、２−ブロモ−４−ニトロベンゼンチオール（化合物１２、４．８ｇ、２０．５ｍｍｏｌ、２工程での収率９０％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 4.37 (1H, s), 7.49 (1H, d, J = 8.8 Hz), 8.04 (1H, dd, J = 8.4, 2.6 Hz), 8.42 (1H, d, J = 2.2 Hz)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 121.16, 122.57, 127.99, 128.71, 144.51
HRMS (ESI-): calcd for [M-H]-, 231.9068, found, 231.9064 (-0.4 mmu)
（２）化合物１３の合成
化合物１２（１．３６ｇ、５．８１ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解し、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（４．８８ｇ、５８．１ｍｍｏｌ）を加えて、アルゴン下で０°Ｃに冷却した。そこへ、トリフッ化ボロン−エチルエーテル錯体（８２６ｍｇ、５．８１ｍｍｏｌ）を加え、３５°Ｃで１２時間撹拌した。反応溶液を室温に戻した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止した。この混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層をｂｒｉｎｅで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）で精製し、２−（（２−ブロモ−４−ニトロフェニル）チオ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン（化合物１３、１．２８ｇ、４．０３ｍｍｏｌ、収率６９％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.67-1.82 (3H, m), 1.92-1.97 (2H, m), 2.14-2.18 (1H, m), 3.66-3.73 (1H, m), 4.09-4.13 (1H, m), 5.53 (1H, m), 7.70 (1H, d, J = 8.8 Hz), 8.11 (1H, dd, J = 8.8, 2.9 Hz), 8.37 (1H, d, J = 2.9 Hz)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ20.84, 25.27, 30.96, 63.90, 82.98, 121.32, 122.51, 127.14, 127.26, 127.46, 145.09, 148.10
（３）化合物１４の合成
アルゴン下で化合物１３（１．２８ｇ、４．０３ｍｍｏｌ）をエタノール（４０ｍＬ）に溶解し、ｐａｌｌａｄｉｕｍ１０％ ｏｎ ｃａｒｂｏｎ（１２８ｍｇ）を加えた。そこへ、エタノール（１０ｍＬ）に溶解したヒドラジン水和物（Ｈ２Ｏ中５０％、６４４ｍｇ、２０．１ｍｍｏｌ）を滴下し、８０°Ｃで８時間撹拌した。反応溶液を室温まで冷却した後、セライトろ過し、パラジウムを取り除いた。ろ液を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ−ヘキサン／ジクロロメタン）で精製し、３−ブロモ−４−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）チオ）アニリン（化合物１４、０．９０ｇ、３．１３ｍｍｏｌ、収率７８％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.57-1.67 (3H, m), 1.83-1.88 (2H, m), 2.01-2.04 (1H, m), 3.52-3.59 (1H, m), 3.75 (2H, s), 4.14-4.22 (1H, m), 5.13 (1H, m), 6.56 (1H, dd, J = 8.4, 2.6 Hz), 6.93 (1H, d, J = 2.9 Hz), 7.40 (1H, d, J = 8.1 Hz)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 21.27, 25.55, 31.23, 64.23, 85.62, 114.65, 119.04, 122.91, 128.77, 135.65, 147.17
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 288.0058, found, 288.0049 (-0.9 mmu)
（４）化合物１５の合成
化合物１４（０．８０ｍｇ、２．７８ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル（１５ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．５９ｇ、２７．８ｍｍｏｌ）、臭化アリル（１．６８ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）を加えて、アルゴン下８０°Ｃで６時間撹拌した。反応溶液を室温まで冷却した後、水を加え、この混合物をジクロロメタンで抽出し、有機層を１Ｎ ＨＣｌａｑ．およびｂｒｉｎｅで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ−ヘキサン／ジクロロメタン）で精製し、Ｎ，Ｎ−ジアリル−３−ブロモ−４−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）チオ）アニリン（化合物１５、０．６９ｇ、１．８７ｍｍｏｌ、収率６８％）を得た。
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 1.57-1.63 (3H, m), 1.69-1.85 (2H, m), 1.94-1.99 (1H, m), 3.46-3.53 (1H, m), 3.97-3.98 (4H, m), 4.07-4.14 (1H, m), 5.11-5.17 (4H, m), 5.20 (1H, m), 5.81-5.93 (2H, m), 6.67 (1H, dd, J = 8.8, 2.9 Hz), 6.93 (1H, d, J = 2.9 Hz), 7.40 (1H, d, J = 8.8 Hz)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 21.27, 25.59, 31.25, 52.61, 64.19, 85.82, 111.87, 116.22, 116.40, 120.02, 129.55, 132.90, 135.80, 149.22
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 368.0684, found, 368.0683 (-0.1 mmu)
（５）化合物１６の合成
乾燥させアルゴン置換したフラスコに化合物１５（２２９ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を加え、脱水テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に溶解させた。−７８°Ｃに冷却後、１Ｍｓｅｃ−ブチルリチウム（６２０μＬ、０．６２ｍｍｏｌ）を加え、２０分間攪拌した。そのままの温度で３，６−ビス（ジエチルアミノ）キサントン（３０ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン（５ｍＬ）に溶解してゆっくりと加え、室温に戻した後、７０°Ｃで１時間攪拌した。室温まで冷却した後、２Ｎ ＨＣｌａｑ．で反応を停止させた。この混合物をジクロロメタンで抽出して、有機層をｂｒｉｎｅで洗浄しＮａ２ＳＯ４で乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール）で精製し、５−Ｎ−ジアリル−２−Ｓ−ＴＨＰ−テトラエチルローダミン（化合物１６、５０ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ、収率９２％）を得た。
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 1.33 (12H, t, J = 7.0 Hz), 1.39-1.54 (5H, m), 1.65-1.69 (1H, m), 3.14-3.21 (1H, m), 3.60-3.67 (1H, m), 3.77 (8H, q, J = 7.1 Hz), 4.04 (4H, d, J = 5.1 Hz), 4.83 (1H, m), 5.15-5.19 (4H, m), 5.83-5.91 (2H, m), 6.71 (1H, d, J = 2.9 Hz), 6.94-6.96 (2H, m), 6.99 (2H, dd, J = 8.8, 2.9 Hz), 7.14-7.20 (2H, m), 7.28 (1H, d, J = 9.5 Hz), 7.30 (1H, d, J = 9.5 Hz), 7.64 (1H, d, J = 8.8 Hz)
13C NMR (75 MHz, acetone-d6): δ 12.77, 21.91, 26.08, 32.28, 46.51, 53.41, 64.46, 87.77, 96.70, 96.81, 114.04, 114.64, 114.72, 114.85, 115.04, 115.11, 116.60, 119.25, 132.96, 133.47, 134.31, 137.54, 137.55, 137.85, 149.05, 156.57, 156.69, 158.70, 158.89, 159.25
HRMS (ESI+): calcd for [M]+, 610.3467, found, 610.3449 (-1.8 mmu)
（６）化合物１７の合成
アルゴン置換したフラスコに１，３−ジメチルバルビツール酸（７４ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１１ｍｇ、９．５μｍｏｌ）を加え、脱水ジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解させた化合物１６（５８ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）を加えて、３５°Ｃで１２時間攪拌した。室温まで冷却した後、反応溶液を飽和炭酸ナトリウム水溶液、ｂｒｉｎｅで洗浄しＮａ２ＳＯ４で乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン／メタノール）で精製し、５−アミノ−２−Ｓ−ＴＨＰ−テトラエチルローダミン（化合物１７、２５ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ、収率５０％）を得た。
1H NMR (300 MHz, acetone-d6): δ 1.33 (12H, t, J = 7.0 Hz), 1.45-1.62 (6H, m), 3.15-3.19 (1H, m), 3.59-3.66 (1H, m), 3.77 (8H, q, J = 7.1 Hz), 4.76 (1H, m), 5.61 (2H, s), 6.73 (1H, d, J = 2.2 Hz), 6.96 (3H, m), 6.99 (3H, m), 7.18 (1H, dd, J = 9.5, 2.2 Hz), 7.20 (1H, dd, J = 9.5, 2.2 Hz), 7.30 (1H, d, J = 9.5 Hz), 7.33 (1H, d, J = 9.5 Hz), 7.52 (1H, d, J = 8.1 Hz)
13C NMR (75 MHz, acetone-d6): δ 12.80, 22.02, 26.08, 32.31, 46.50, 64.60, 87.92, 96.72, 96.82, 114.60, 114.67, 114.88, 115.06, 115.54, 117.13, 118.61, 132.98, 133.49, 137.97, 138.14, 150.35, 156.55, 156.67, 158.66, 158.84, 159.38
HRMS (ESI+): calcd for [M]+, 530.2841, found, 530.2830 (-1.0 mmu)
（７）化合物１８の合成
化合物１７（１０ｍｇ、１９μｍｏｌ）、Ｎ−Ｆｍｏｃ−ｔｒａｎｓ−１，４−シクロヘキサンジアミン（２１ｍｇ、５７μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２５ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）（２２ｍｇ、５７μｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解させ、４０°Ｃで１６時間攪拌した。反応溶液を室温まで冷却した後、１Ｎ ＨＣｌａｑ．で反応を停止させた。この混合物をジクロロメタンで抽出し、有機層をｂｒｉｎｅで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。粗精製物をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（０．５０ｍＬ）を加えて室温で１時間撹拌した。１Ｎ ＨＣｌａｑ．で反応を停止させた。この混合物をジクロロメタンで抽出し、有機層をｂｒｉｎｅで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（２０分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、５−アミノシクロヘキシルアミド−２−Ｓ−ＴＨＰ−テトラエチルローダミン（化合物１８、６．０ｍｇ、１１μｍｏｌ、２工程での収率５６％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 1.31 (12H, t, J = 7.0 Hz), 1.48-1.59 (9H, m), 1.76-1.79 (1H, m), 1.94-1.98 (4H, m), 2.34-2.38 (1H, m), 2.72-2.76 (1H, m), 3.55 (1H, m), 3.63 (1H, m), 3.69 (8H, q, J = 7.1 Hz), 5.08-5.09 (1H, m), 6.98-6.99 (2H, m), 7.06-7.08 (2H, m), 7.21 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.24 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.69-7.71 (2H, m), 7.82 (1H, d, J = 8.1 Hz).
HRMS (ESI+): calcd for [M]+, 571.3107, found, 571.3117 (+1.0 mmu)
The HPLC chromatogram after purification was as follows. The solution was done with a liner gradient from 20% CH3CN/0.1% TFA aq. (0 min) to 80% CH3CN/0.1% TFA aq. (15 min) (flow rate = 1.0 mL/min).
Figure 2016132802
（８）化合物ａ２の合成
５−カルボキシフルオレセイン（５０．０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロシキスクシンイミド（７６．０ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）と１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（７７．０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、室温で１１時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）によって、粗精製した化合物１０を得た。化合物１８（３．０ｍｇ、４．６μｍｏｌ）と化合物１０（６．５ｍｇ、１４μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５．９ｍｇ、４６μｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、室温で９時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、残渣にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）０．５０ｍＬ、トリエチルシラン（１０μＬ）を加え、室温で１．５時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後に、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、化合物ａ２（２．１ｍｇ、２．２μｍｏｌ、２工程での収率４９％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.30 (12H, t, J = 6.8 Hz), 1.50-1.56 (2H, m), 1.71-1.74 (2H, m), 2.03-2.04 (2H, m), 2.15-2.16 (2H, m), 2.45 (1H, br m), 3.68 (8H, q, J = 7.0 Hz), 3.94 (1H, br m), 6.53 (2H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz), 6.58 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.69 (2H, d, J = 2.4 Hz), 6.88 (2H, dd, J = 9.3, 2.0 Hz), 6.93 (2H, d, J = 9.7 Hz), 6.98 (1H, d, J = 2.0 Hz), 7.29 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.66 (1H, d, J = 2.0 Hz), 7.72 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.83 (1H, dd, J = 8.8, 2.4 Hz), 8.19 (1H, dd, J = 8.1, 1.2 Hz), 8.41 (1H, d, J = 1.5 Hz)
HRMS (ESI+): calcd for [M]2+, 1857.7045, found, 1857.6998 (-4.7 mmu)
The HPLC chromatogram after purification was as follows. The solution was done with a liner gradient from 20% CH3CN/0.1% TFA aq. (0 min) to 80% CH3CN/0.1% TFA aq. (15 min) (flow rate = 1.0 mL/min).
Figure 2016132802
［合成実施例４］
本発明の化合物ａ３（Ｓ−メチルジスルファニル−ＳＳｉｐ−１ ＤＡ）の合成
以下のスキーム６により、本発明の化合物ａ３を合成した。
スキーム６
Figure 2016132802
（１）化合物１９の合成
化合物４（１２．９ｍｇ、２０．９μｍｏｌ）にトリフルオロ酢酸（０．５０ｍＬ）、トリエチルシラン（１０μＬ）を加え、室温で５時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後に、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で粗精製した。メチルメタンチオスルフェート（７．９ｍｇ、６３μｍｏｌ）をメタノール（３ｍＬ）に溶解し、そこに粗精製した化合物をメタノール（２ｍＬ）に溶解したものを少しずつ加え、室温で１５分撹拌した。溶媒を減圧留去した後に、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、２−メチルジスルファニル−４−カルボキシテトラエチルローダミン（化合物１９、４．８ｍｇ、９．２１μｍｏｌ、収率４４％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 1.32 (12H, t, J = 7.0 Hz), 2.38 (3H, s), 3.70 (8H, q, J = 7.1 Hz), 7.01 (2H, d, J = 2.2 Hz), 7.09 (2H, dd, J = 9.5, 2.2 Hz), 7.15 (2H, d, J = 9.5 Hz), 7.48 (1H, d, J = 8.1 Hz), 8.16 (1H, dd, J = 8.1, 1.5 Hz), 8.71 (1H, d, J = 1.5 Hz)
13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ12.80, 23.30, 46.98, 97.61, 114.43, 115.94, 129.40, 130.13, 131.61, 132.42, 134.84, 136.95, 138.71, 155.12, 157.51, 159.38, 168.33
HRMS (ESI+): calcd for [M]+ , 521.1933, found, 521.1895 (-3.8 mmu)
（２）化合物２１の合成
化合物１９（４．８ｍｇ、９．２１μｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（９．５ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）と１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（８．０ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解させ、室温で１２時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、残渣からＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）によって、粗精製した化合物２０を得た。
粗精製した化合物２０と化合物６（１３．１ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１２ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、室温で１０時間撹拌した。その後、０．１Ｎ ＨＣｌａｑ．で反応を停止させた。この混合物をジクロロメタンで抽出して、有機層をｂｒｉｎｅで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、Ｓ−メチルジスルファニル−ＳＳｉｐ−１（化合物２１、４．３ｍｇ、４．６２μｍｏｌ、２工程での収率６１％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.32 (12H, t, J = 6.8 Hz), 1.70-1.72 (4H, m), 2.18-2.20 (4H, m), 2.37 (3H, s), 3.69 (8H, q, J = 7.0 Hz), 4.06-4.08 (2H, br), 6.62 (2H, dd, J = 8.8, 2.0 Hz), 6.72 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.79 (2H, d, J = 2.0 Hz), 6.99 (2H, d, J = 2.0 Hz), 7.05 (2H, dd, J = 9.8, 2.4 Hz), 7.14 (2H, d, J = 9.8 Hz), 7.33 (1H, d, J = 7.8 Hz), 7.98 (1H, dd, J = 7.8, 1.5 Hz), 8.24 (1H, dd, J = 7.8, 1.5 Hz), 8.52-8.53 (2H, m)
HRMS (ESI+): calcd for [M]+ , 975.3461, found, 975.3444 (-1.7 mmu)
The HPLC chromatogram after purification was as follows. The solution was done with a liner gradient from 20% CH3CN/0.1% TFA aq. (0 min) to 80% CH3CN/0.1% TFA aq. (15 min) (flow rate = 1.0 mL/min).
Figure 2016132802
（３）化合物ａ３の合成
化合物２１（１．８ｍｇ、１．８５μｍｏｌ）を脱水アセトニトリル（５ｍＬ）に溶解させ、無水酢酸（１５μＬ）とピリジン（２９ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後に、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、化合物ａ３（１．８ｍｇ、１７０μｍｏｌ、収率９２％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 1.32 (12H, t, J = 7.0 Hz), 1.63-1.67 (4H, m), 2.15-2.17 (4H, m), 2.30 (6H, s), 2.38 (3H, s), 3.71 (8H, q, J = 6.8 Hz), 4.03 (2H, br), 6.91-6.93 (4H, m), 7.01 (2H, d, J = 2.2 Hz), 7.09 (2H, dd, J = 9.5, 2.2 Hz), 7.16 (2H, d, J = 9.5 Hz), 7.21 (2H, d, J = 2.2 Hz), 7.38 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.46 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.97 (1H, dd, J = 8.1, 1.5 Hz), 8.24 (1H, dd, J = 8.1, 1.5 Hz), 8.49 (1H, d, J = 1.5 Hz), 8.53 (1H, d, J = 1.5 Hz)
HRMS (ESI+): calcd for [M]+ , 1059.3673, found, 1059.3629 (-4.4 mmu)
The HPLC chromatogram after purification was as follows. The solution was done with a liner gradient from 20% CH3CN/0.1% TFA aq. (0 min) to 80% CH3CN/0.1% TFA aq. (15 min) (flow rate = 1.0 mL/min).
Figure 2016132802
［合成実施例５］
本発明の化合物ａ４（２―ｔｈｉｏ―テトラエチルローダミン−ローダミングリーン）の合成
以下のスキーム７により、本発明の化合物ａ４を合成した。
スキーム７
Figure 2016132802
（１）化合物２２の合成
４−ブロモイソフタル酸（２．４５ｇ、１０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解させ、４−ジメチルアミノピリジン（４８８ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）とｄｉ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（８．７２ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン下で８０℃で８時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後に残渣にｂｒｉｎｅを加え、この混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、ｂｒｉｎｅで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ジクロロメタン／ｎ−ヘキサン）で精製し、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ブロモイソフタル酸（化合物２２、２．０１ｇ、５．６３ｍｍｏｌ、収率５６％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.59 (9H, s), 1.61 (9H, s), 7.66 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.85 (1H, dd, J = 8.1, 2.2 Hz), 8.24 (1H, d, J = 2.2 Hz)
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 27.86, 28.09, 81.90, 83.01, 125.64, 131.12, 131.55, 132.19, 134.05, 134.43, 164.30, 165.07
（２）化合物２３の合成
乾燥させアルゴン置換したフラスコに化合物２２（２５７ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を加え、脱水ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解させた。−７８°Ｃに冷却後、１Ｍｓｅｃ−ブチルリチウム（５４０μＬ、０．５４ｍｍｏｌ）を加え、２分間攪拌した。そのままの温度で３，６−ビス（ジフェニルメチレンアミノ）キサントン（２０ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）を脱水テトラヒドロフラン（５ｍＬ）に溶解してゆっくりと加え、室温に戻して１時間攪拌した。２Ｎ ＨＣｌａｑ．で反応を停止させた。この混合物をジクロロメタンで抽出して有機層をｂｒｉｎｅで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣にトリフルオロ酢酸（５．０ｍＬ）、トリエチルシラン（１００μＬ）を加え、室温で５時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、ＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から５６％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、２，４−ジカルボキシローダミングリーン（化合物２３、８．５ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ、２工程での収率６３％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 6.80-6.81 (4H, m), 7.04 (2H, d, J = 9.5 Hz), 7.53 (1H, d, J = 8.1 Hz), 8.43 (1H, dd, J = 8.1, 1.5 Hz), 8.91 (1H, d, J = 1.5 Hz)
HRMS (ESI+): calcd for [M]+ , 375.0981, found, 375.0958 (-2.3 mmu)
The HPLC chromatogram after purification was as follows. The solution was done with a liner gradient from 20% CH3CN/0.1% TFA aq. (0 min) to 80% CH3CN/0.1% TFA aq. (15 min) (flow rate = 1.0 mL/min).
Figure 2016132802
（３）化合物２４の合成
化合物２３（１０ｍｇ、２７μｍｏｌ）とＮ−Ｂｏｃ−ｔｒａｎｓ−１，４−シクロヘキサンジアミン（１７ｍｇ、８０μｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３５ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）と１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）（２８ｍｇ、５４μｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、室温で１０時間撹拌した。その後、１Ｎ ＨＣｌａｑ．で反応を停止させた。この混合物をジクロロメタンで抽出して有機層をｂｒｉｎｅで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣にＴＦＡ（２ｍＬ）加え、室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後に、残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から５６％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、２−カルボキシ−４−アミノシクロヘキシルアミド−ローダミングリーン（化合物２４、４．０ｍｇ、８．５μｍｏｌ、２工程での収率３１％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 1.57-1.61 (4H, m), 2.15-2.18 (4H, m), 3.11-3.15 (1H, m), 3.94-3.98 (1H, m), 6.79-6.81 (4H, m), 7.03 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.47 (1H, d, J = 8.1 Hz), 8.23 (1H, dd, J = 8.1, 1.5 Hz), 8.74 (1H, d, J = 1.5 Hz)
HRMS (ESI+): calcd for [M]+, 471.2032 , found, 471.2001 (-3.1 mmu)
The HPLC chromatogram after purification was as follows. The solution was done with a liner gradient from 20% CH3CN/0.1% TFA aq. (0 min) to 80% CH3CN/0.1% TFA aq. (15 min) (flow rate = 1.0 mL/min).
Figure 2016132802
（４）化合物ａ４の合成
化合物２０（２．２ｍｇ、３．５μｍｏｌ）と化合物２４（２．０ｍｇ、４．２μｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４．５ｍｇ、３５μｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶解させ、室温で３時間撹拌した。その後、０．１Ｎ ＨＣｌａｑ．で反応を停止させた。この混合物をジクロロメタンで抽出して有機層をｂｒｉｎｅで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣ（溶離液、２０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（１５分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、化合物ａ４（３．２ｍｇ、３．２９μｍｏｌ、収率９４％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 1.32 (12H, t, J = 7.0 Hz), 1.66-1.69 (4H, m), 2.16-2.18 (4H, m), 2.39 (3H, s), 3.71 (8H, q, J = 7.1 Hz), 4.05 (2H, br s), 6.80-6.82 (4H, m), 7.03-7.10 (6H, m), 7.16 (2H, d, J = 9.5 Hz), 7.47 (1H, d, J = 7.3 Hz), 7.51 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.98 (1H, dd, J = 7.3, 1.5 Hz), 8.25 (1H, dd, J = 8.1, 2.2 Hz), 8.54 (1H, d, J = 1.5 Hz), 8.76 (1H, d, J = 2.2 Hz)
HRMS (ESI+): calcd for [M]2+, 974.3859, found, 974.3873 (+1.4 mmu)
The HPLC chromatogram after purification was as follows. The solution was done with a liner gradient from 20% CH3CN/0.1% TFA aq. (0 min) to 80% CH3CN/0.1% TFA aq. (15 min) (flow rate = 1.0 mL/min).
Figure 2016132802
［実施例２］
合成した化合物ａ１、化合物ａ２、及び化合物ａ４の脱保護の化合物２５にＮａ２Ｓ４を添加し、吸収および蛍光スペクトルを測定した。
図７の左図は、５０μＭのＮａ２Ｓ４（共溶媒として０．１％ＤＭＳＯ及び１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ含有）添加前後における、１ｍＭのＧＳＨ存在下での０．１ＭＮａＰｉバッファー（ｐＨ７．４）中における１μＭの化合物ａ１の吸収スペクトルの測定結果を、図７の右図は同じ条件での蛍光スペクトルの測定結果を示す。励起波長は４７０ｎｍである。
図８の左図は、５０μＭのＮａ２Ｓ４（共溶媒として０．１％ＤＭＳＯ及び１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ含有）添加前後における、２．５ｍＭのＧＳＨ存在下での０．１Ｍ ＮａＰｉバッファー（ｐＨ７．４）中における１μＭの化合物ａ２の吸収スペクトルの測定結果を、図８の右図は同じ条件での蛍光スペクトルの測定結果を示す。励起波長は４７０ｎｍである。
図９の真中の図は、５０μＭのＮａ２Ｓ４（共溶媒として０．１％ＤＭＳＯ及び１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ含有）添加前後における、１ｍＭのＧＳＨ存在下での０．１Ｍ ＮａＰｉバッファー（ｐＨ７．４）中における１μＭの化合物２５の吸収スペクトルの測定結果を、図９の右図は同じ条件での蛍光スペクトルの測定結果を示す。励起波長は４７０ｎｍである。
化合物ａ１、化合物ａ２及び化合物ａ４の脱保護の化合物２５は、Ｎａ２Ｓ４添加後、ＳＳｉｐ−１と同程度のローダミンに由来する吸光度の減少と、フルオレセインに由来する蛍光の上昇がみられた。
［実施例３］
化合物ａ３の生細胞イメージング
化合物ａ３を生細胞イメージングへと応用した。化合物ａ３はＳＳｉｐ−１ ＤＡの安定性を向上させるため、チオール基をジスルフィドで保護したものであり、細胞内の還元環境下で脱保護される。
図１０は、２５０μＭのＮａ２Ｓ４を添加したＳＳｉｐ−１を用いたＡ５４９生細胞の共焦点顕微鏡像である。Ａ５４９細胞は、１０μＭ ＳＳｉｐ−１ ＤＡ（０．０３％のｐｕｒｕｌｏｎｉｃ及び共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含有）で３時間インキュベートした。励起波長は４８８ｎｍである。（レーザー強度２０％）／５００−５４０ｎｍ（ＰＭＴ１０００）及び５９０−６５０ｎｍ（ＨｙＤ１００）
Ｎａ２Ｓ４添加後にフルオレセイン由来の蛍光強度の上昇を示した。ローダミン由来の蛍光波長領域でも蛍光強度が上昇しているが、フルオレセイン由来の蛍光が漏れ出しているためであると考えられる。ローダミンの励起波長および蛍光波長（５６１ｎｍ／５９０−６５０ｎｍ）で蛍光イメージング画像を取得すると、蛍光強度は減少していた。
ＳＳｉｐ−１の生細胞中での可逆性を観察した。
図１１は、２５０μＭのＮａ２Ｓ４を添加したＳＳｉｐ−１を用いたＡ５４９生細胞の共焦点顕微鏡像であり、Ｎａ２Ｓ４を添加した後、ｗａｓｈｏｕｔし、その後、再度Ｎａ２Ｓ４を添加しｗａｓｈｏｕｔした場合の共焦点顕微鏡像を示す。Ａ５４９細胞のインキュベーションの条件及び測定の条件は図１０で示した測定と同じである。
また、図１２は、２５０μＭのＮａ２Ｓ４を繰り返し添加した後のＳＳｉｐ−１でインキュベートしたＡ５４９生細胞の蛍光強度の変化を示す。
図１１及び１２から、Ｎａ２Ｓ４添加後１分以内に蛍光が上昇し、ｗａｓｈｏｕｔ後は２０分程度で蛍光は減少したことが示される。
また、ＳＳｉｐ−１の蛍光はフルオレセイン由来の蛍光上昇と同時に、ローダミン由来の蛍光の減少を観察できることから、レシオイメージングも可能である。図１３の上図は、２５０μＭのＮａ２Ｓ４を繰り返し添加した後のＳＳｉｐ−１でインキュベートしたＡ５４９生細胞の比（ＦＬ／ＲＢ）の変化、及び、上図はそのレシオ像を示す。
化合物ａ３について細胞での局在を調べた。図１４は、ＳＳｉｐ−１とＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ又はＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒとの共染色の結果を示す。細胞を、ＤＭＥＭ（０．０３％プルロニック及び共溶媒として０．１％のＤＭＳＯを含有）中で１０μＭの化合物ａ３と５０ｎＭのＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ ｒｅｄ又は２００ｎＭのＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ ｒｅｄで１時間インキュベートした。Ｅｘ／Ｅｍ＝４８８ｎｍ（レーザー強度２０％）／５００−５４０ｎｍ（ＰＭＴ１０００）及び６５０ｎｍ／６７０−７００ｎｍ（ＰＭＴ６００）
ＳＳｉｐ−１はＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒおよびＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒとｍｅｒｇｅしなかったが、２つの共染色条件でＳＳｉｐ−１の分布が異なっていた。ＳＳｉｐ−１のみをロードしたときの局在と比較すると、ＳＳｉｐ−１はミトコンドリアに局在しているといえる。また、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒによる追い出しによって、ＳＳｉｐ−１を細胞質にとどまらせることも可能であり、細胞質のｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒのイメージングも可能であると考えられる。
［実施例４］
化合物ａ４の生細胞イメージング
化合物ａ４を生細胞イメージングへと応用した。化合物ａ４はＳＳｉｐ−１のフルオレセイン部位をローダミングリーンに変えたものであり、光退色耐性が向上すると考えられる。
図１５は、２５０μＭのＮａ２Ｓ４を添加した化合物ａ４を用いたＡ５４９生細胞の共焦点顕微鏡像である。Ａ５４９細胞は、１０μＭの化合物ａ４（０．０３％のｐｕｒｕｌｏｎｉｃ及び共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含有）で１時間インキュベートした。励起波長は４８８ｎｍである。（レーザー強度２０％）／５００−５４０ｎｍ（ＰＭＴ１０００）及び５９０−６５０ｎｍ（ＨｙＤ１００）
化合物ａ４は、Ｎａ２Ｓ４添加後にローダミングリーン由来の蛍光強度の上昇およびローダミンＢ由来の蛍光強度の減少を示した。

Claims (8)

  1. 以下の一般式（Ｉ）：
    Figure 2016132802
    （式中、
    Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
    Ｒ２は、ＳＨ又はＳ−Ｓ−Ｒ（Ｒは、炭素数１〜６のアルキル基を示し；
    Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
    Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し
    Ｒ７及びＲ８は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１〜６個のアルキル基又はアリール基を示し、
    ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ７及びＲ８は存在せず、
    Ｘがリン原子の場合は、−Ｒ７及び−Ｒ８の一方は、＝Ｏであってもよい；
    Ｒ９及びＲ１０は、
    （ｉ）それぞれ独立に、ＮＨ２、モノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基から選択され、又は
    （ｉｉ）それぞれ独立に、ヒドロキシル基又はアルコキシ基から選択され；
    Ｘは、酸素原子、珪素原子、錫原子、ゲルマニウム原子又はリン原子を示し；
    Ｙは、Ｌとの結合基ａを示し；
    Ｌは、リンカーを示し；
    Ｚは、Ｌとの結合基ｂを示し；
    Ｄは、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、クマリン、クマリン誘導体、ローダミン又はローダミン誘導体を示し；
    ｍは、０〜３の整数であり、ｎは、１〜４の整数であり、ｍ＋ｎ＝４である。）
    で表される化合物又はその塩。
  2. 以下の一般式（Ｉａ）：
    Figure 2016132802
    （式中、
    Ｒ１〜Ｒ８、Ｘ、Ｙ、Ｌ、Ｚ、Ｄ、ｍ及びｎは、一般式（Ｉ）で定義した通りであり；
    Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
    Ｒ１１又はＲ１２は、Ｒ３又はＲ５と一緒になって、Ｒ１１又はＲ１２が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい：
    Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示し、
    Ｒ１３又はＲ１４は、Ｒ４又はＲ６と一緒になって、Ｒ１３又はＲ１４が結合している窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１〜３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル、炭素数２〜６個のアルケニル、又は炭素数２〜６個のアルキニル、炭素数６〜１０個のアラルキル基、炭素数６〜１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。）
    で表される、請求項１に記載の化合物又はその塩。
  3. 以下の一般式（Ｉｂ）：
    Figure 2016132802
    （式中、
    Ｒ１〜Ｒ８、Ｘ、Ｙ、Ｌ、Ｚ、Ｄ、ｍ及びｎは、一般式（Ｉ）で定義した通りであり；
    Ｒ１５は、水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を示す。）
    で表される、請求項１に記載の化合物又はその塩。
  4. 前記リンカーは、シクロアルキル基又はアリール基から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
  5. 結合基ａは、カルボニル基、アルキルカルボニル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アミド基、アルキルアミド基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基又はアルキニル基から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
  6. 結合基ｂは、カルボニル基、アルキルカルボニル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アミド基、アルキルアミド基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基又はアルキニル基から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
  7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
  8. 細胞内のｓｕｌｆａｎｅ ｓｕｌｆｕｒを検出する方法であって、
    （ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び
    （ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内で発する蛍光を測定する工程
    を含む方法。
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