WO2018043579A1 - ホスファローダミン化合物若しくはその塩、並びにそれを用いた蛍光色素 - Google Patents

ホスファローダミン化合物若しくはその塩、並びにそれを用いた蛍光色素 Download PDF

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WO2018043579A1
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phospharhodamine
salt
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山口　茂弘
正泰 多喜
良勝 佐藤
愛子 中
マレク グジャゴッシュ ガージボウスキー
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国立大学法人名古屋大学
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    • C07F9/6568—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms having phosphorus atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/65685—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms having phosphorus atoms as the only ring hetero atoms the ring phosphorus atom being part of a phosphine oxide or thioxide
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    • C09B11/10—Amino derivatives of triarylmethanes
    • C09B11/12—Amino derivatives of triarylmethanes without any OH group bound to an aryl nucleus
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to a phospharhodamine compound or a salt thereof, and a fluorescent dye using the same.
  • ICG indocyanine green
  • Near-infrared fluorescent dyes are currently poor in light stability and have limited applications, but the development of compounds that exhibit strong fluorescence in the near infrared has been extremely difficult in terms of non-invasive imaging in the deep part of the body. This is an important research topic. Also, in the imaging of plants, a compound having fluorescence in a long wavelength region exceeding the wavelength region of autofluorescence of chloroplasts is extremely useful.
  • Such near-infrared fluorescent dyes are disclosed in, for example, Patent Document 1 and Non-Patent Document 1.
  • the near-infrared fluorescent dye shown in Patent Document 1 is a phospharhodamine compound having a P (O ⁇ ) ⁇ O structure on a phosphorus atom at the 9-position of the xanthene skeleton.
  • the near-infrared fluorescent dye shown in Non-Patent Document 1 is a phospharhodamine compound having a P (CH 3 ) ⁇ O structure on the phosphorus atom at the 9-position of the xanthene skeleton.
  • Such conventional near-infrared fluorescent dyes have a fluorescence maximum wavelength of only about 710 nm.
  • Patent Document 1 as a compound in which the conjugated system of the phospharhodamine skeleton is further expanded to form aromatic rings on the left and right,
  • the fluorescence maximum wavelength of the compound represented by is 732 nm.
  • the present invention has been made to solve the above-described problems, and further increases the wavelength of the fluorescent maximum wavelength compared with conventional near-infrared fluorescent dyes without extending the conjugated system of the phospharhodamine skeleton.
  • the object is to provide compounds that can be made.
  • the present inventors have found that a compound having a structure in which an aryl group is bonded to a phosphorus atom of a phospharhodamine skeleton has a fluorescence maximum wavelength more than that of a conventional near-infrared fluorescent dye. It has been found that the wavelength can be further increased. When the ⁇ conjugation of the phospharhodamine skeleton is expanded, it is possible to further increase the fluorescence maximum wavelength.
  • the present invention has been completed by further research based on such knowledge. That is, the present invention includes the following configurations.
  • R 1 to R 4 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group, or a substituted or unsubstituted (hetero) aryl group.
  • R 5 represents a substituted or unsubstituted aryl group.
  • R 6 and R 7 represent a hydrogen atom.
  • R 1 and R 6 and / or R 3 and R 7 may be bonded to each other to form a substituted or unsubstituted alkylene group.
  • R 8 represents a substituted or unsubstituted aryl group.
  • X represents a counter ion.
  • Item 2 The phospharhodamine compound or a salt thereof according to Item 1, wherein R 6 and R 7 are both hydrogen atoms.
  • R 6 represents the general formula (2):
  • R 9 and R 10 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group, or a substituted or unsubstituted alkoxy group.
  • R 11 represents a hydrogen atom or a reactive group.
  • Item 4. The phospharhodamine compound or a salt thereof according to Item 3, wherein each of R 9 and R 10 is a substituted or unsubstituted alkyl group, or a substituted or unsubstituted alkoxy group.
  • Item 5 The phospharhodamine compound or a salt thereof according to Item 3 or 4, wherein R 11 is an amine-reactive group or a thiol-reactive group.
  • the amine-reactive group or thiol-reactive group has the general formulas (3A) to (3E):
  • R 12 represents a hydrogen atom or a sulfo group.
  • R 13 represents a substituted or unsubstituted alkyl group. The bond indicated by the solid line and the broken line is a single bond or a double bond.
  • Item 6 A phospharhodamine compound or a salt thereof according to Item 5, which is a group having a structure represented by:
  • Item 7 A fluorescent dye comprising the phospharhodamine compound or a salt thereof according to any one of Items 1 to 6.
  • Item 8 A protein labeling agent using the phospharhodamine compound or a salt thereof according to Item 5 or 6.
  • Item 9. A protein labeling kit comprising the protein labeling agent according to Item 8.
  • Item 10 A protein labeling method comprising a step of reacting the protein labeling agent according to Item 8 with a protein.
  • the fluorescence maximum wavelength is further increased as compared with conventional near-infrared fluorescent dyes without extending the phospharhodamine skeleton.
  • the wavelength can be increased.
  • the phospharhodamine compound of the present invention can maintain the absorption intensity and the fluorescence intensity over a long period of time at various pH depending on the type of group represented by R 8 , the stability can be particularly improved.
  • the phospharhodamine compound of the present invention can also function as a protein labeling agent that labels a protein. In this case, it is possible to maintain fluorescence over a longer period of time compared to commercially available protein labeling agents.
  • PR1 (Example 1), PR2 (Example 2), PR4 (Example 4) and PR6 (Example 8). It is the absorption spectrum and fluorescence spectrum in various pH of PR1 (Example 1), PR2 (Example 2), and PR4 (Example 4). It is a graph which shows stability of the absorption intensity with progress of time of PR1 (Example 1), PR2 (Example 2), and PR4 (Example 4) in various pH. It is a graph which shows stability of absorption intensity with progress of time of PR1 (Example 1), PR2 (Example 2), PR3 (Example 3), and PR4 (Example 4) in pH10.
  • PR4-NHS In PR4-NHS (Example 6), it is a graph which shows the relationship between DOL and absolute quantum yield (PHI). Goat anti-mouse conjugated with PR4-NHS (Example 6; DOL3.5, 27 ⁇ g), PR5-NHS (Example 7; DOL3.1, 20 ⁇ g), Cy5.5 (Comparative Example 1; DOL2.3, 30 ⁇ g) It is a maintenance factor with the passage of time of absorption intensity and fluorescence intensity of antibody IgG, and an absorption spectrum and a fluorescence spectrum.
  • (hetero) aryl group means an aryl group or a heteroaryl group.
  • “containing” is a concept including any of “comprise”, “consisting essentially”, and “consisting of”. is there. In this specification, when the numerical range is indicated by “A to B”, it means A or more and B or less.
  • Phospharhodamine compound or salt thereof has the general formula (1):
  • R 1 to R 4 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group, or a substituted or unsubstituted (hetero) aryl group.
  • R 5 represents a substituted or unsubstituted aryl group.
  • R 6 and R 7 represent a hydrogen atom.
  • R 1 and R 6 and / or R 3 and R 7 may be bonded to each other to form a substituted or unsubstituted alkylene group.
  • R 8 represents a substituted or unsubstituted aryl group.
  • X represents a counter ion.
  • the phospharhodamine compound represented by the general formula (1) or a salt thereof is a novel compound not described in any literature.
  • X represents a counter ion (anion).
  • the counter ion (anion) include halogen ion (fluorine ion, chlorine ion, bromine ion, iodine ion, etc.), cyan ion, acetate ion, trifluoroacetate ion, and the like.
  • alkyl group represented by R 1 to R 4 either a linear alkyl group or a branched alkyl group can be employed.
  • a straight chain alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferable, and specifically, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an n-butyl group, and n-pentyl. Group, n-hexyl group and the like.
  • branched alkyl group a branched alkyl group having 3 to 6 carbon atoms (particularly 3 to 5 carbon atoms) is preferable.
  • an isopropyl group, an isobutyl group, a tert-butyl group, a sec-butyl group, a neopentyl group examples thereof include an isohexyl group and a 3-methylpentyl group.
  • the alkyl group represented by R 1 to R 4 may have a substituent.
  • the substituent that the alkyl group may have is not particularly limited, and is a hydroxyl group, a halogen atom (a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, etc.), an aryl group described later, a heteroaryl group described later, And the like.
  • the number of substituents is not particularly limited, and is preferably 1 to 6, more preferably 1 to 3.
  • any of a monocyclic aryl group, a condensed ring aryl group, and a polycyclic aryl group can be employed.
  • the aryl group represented by R 1 to R 4 may have a substituent.
  • substituents include, but are not limited to, a hydroxyl group, a halogen atom (fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, etc.), the alkyl group, the aryl group, a heteroaryl group described later, and a reactive group described later. Etc.
  • the number of substituents is not particularly limited, and is preferably 1 to 6, more preferably 1 to 3.
  • any of a monocyclic heteroaryl group and a polycyclic heteroaryl group can be employed, for example, a pyrrolidyl group, a pyrrolyl group, a tetrahydrothienyl group.
  • the heteroaryl group represented by R 1 to R 4 may have a substituent.
  • substituents include, but are not particularly limited to, a hydroxyl group, a halogen atom (fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, etc.), the above alkyl group, the above aryl group, the above heteroaryl group, a reactive group described later, and the like. Is mentioned.
  • the number of substituents is not particularly limited, and is preferably 1 to 6, more preferably 1 to 3.
  • R 1 to R 4 a substituted or unsubstituted monocyclic alkyl group and a substituted or unsubstituted (hetero) aryl group are preferable, and a substituted or unsubstituted alkyl group is more preferable.
  • the aryl group represented by R 5 can employ the above-described one.
  • the kind and number of substituents are the same.
  • the fluorescence maximum wavelength can be lengthened, and since it is excellent in cell membrane permeability, non-invasive imaging of the deep part of the living body is easy, and fluorescence is caused in a region where autofluorescence of the chloroplast is reduced. Therefore, it is easy to image plants.
  • R 6 and R 7 are hydrogen atoms.
  • R 1 and R 6 and / or R 3 and R 7 may be bonded to each other to form a substituted or unsubstituted alkylene group.
  • alkylene group include alkylene groups having 1 to 6 carbon atoms (particularly 2 to 4 carbon atoms), such as a methylene group, an ethylene group, a trimethylene group, and a tetramethylene group.
  • the alkylene group may have a substituent.
  • the substituent is not particularly limited, and examples thereof include a hydroxyl group, a halogen atom (a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, etc.), the above aryl group, the above heteroaryl group, and a reactive group described later.
  • the number of substituents is not particularly limited, and is preferably 1 to 6, more preferably 1 to 3. From the viewpoint of further improving water solubility and further suppressing nonspecific adsorption during imaging, R 1 and R 6 , and R 3 and R 7 are both bonded to each other to form a substituted or unsubstituted alkylene group.
  • R 6 and R 7 are preferably hydrogen atoms, and R 1 and R 6 and / or R 3 and R 7 are bonded to each other from the viewpoint of making the fluorescence maximum wavelength longer. It is preferable to constitute a substituted or unsubstituted alkylene group.
  • the aryl group represented by R 8 can employ the above-described one.
  • the kind and number of substituents are the same.
  • the fluorescence maximum wavelength can be made longer, the absorption intensity and fluorescence intensity can be maintained over a longer period of time at various pHs, and from the viewpoint of superior light resistance.
  • R 9 and R 10 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group, or a substituted or unsubstituted alkoxy group.
  • R 11 represents a hydrogen atom or a reactive group.
  • the group represented by these is preferable.
  • the alkoxy group represented by R 9 and R 10 is preferably an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms (particularly 1 to 4), such as a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, Examples include isopropyloxy group, n-butyloxy group, isobutyloxy group, tert-butyloxy group, n-pentyloxy group, neopentyloxy group, n-hexyloxy group and the like.
  • the alkoxy group represented by R 9 and R 10 may have a substituent.
  • the substituent is not particularly limited and includes, for example, a halogen atom (fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom, etc.), the above alkyl group, the above aryl group, the above heteroaryl group, a reactive group described later, and the like. It is done.
  • the number of substituents is not particularly limited, and is preferably 1 to 6, more preferably 1 to 3.
  • R 9 and R 10 are both from the viewpoint that the fluorescence maximum wavelength can be made longer, and that the absorption intensity and fluorescence intensity can be maintained for a longer time at various pHs.
  • a substituted or unsubstituted alkyl group or a substituted or unsubstituted alkoxy group is preferred.
  • R 9 and R 10 are substituted or non-reduced from the viewpoint that the fluorescence maximum wavelength can be made longer and the absorption intensity and fluorescence intensity can be maintained for a longer time at various pHs.
  • a substituted alkyl group or a substituted or unsubstituted alkoxy group is preferred, and a substituted or unsubstituted alkoxy group is more preferred.
  • each of R 9 and R 10 is a substituted or unsubstituted alkyl group, or a substituted or unsubstituted alkoxy group
  • the fluorescence intensity can be maintained.
  • at least one of R 9 and R 10 is a hydrogen atom, it has an excellent effect as compared with the fact that the absorption intensity and the fluorescence intensity are easily reduced with the passage of time under alkaline conditions.
  • the reactive group represented by R 11 is not particularly limited as long as it is a reactive group.
  • R 11 is a carboxy group, a hydroxyl group, an amino group, isocyanate group; a halogenated alkyl group such as chloromethyl group Isochiashian phosphazene rhodamine compound or a salt thereof is a group or the like, by reacting with the reactive group, R 11 Can be easily used as a group for labeling a protein (amine reactive group, thiol reactive group, etc.).
  • a group of compounds in which R 11 is a group for labeling a protein is also within the category of the phospharhodamine compound of the present invention or a salt thereof.
  • the amine-reactive group is a group that is reactive with a substituted or unsubstituted amino group possessed by a compound to be labeled, and reacts with a substituted or unsubstituted amino group possessed by a protein (particularly an antibody), thereby producing the present invention.
  • the phospharhodamine compound or a salt thereof can function as a protein labeling agent (particularly an antibody labeling agent).
  • the thiol-reactive group is a group that is reactive with a substituted or unsubstituted thiol group possessed by a compound to be labeled, and reacts with a substituted or unsubstituted thiol group possessed by a protein (particularly an antibody),
  • the phospharhodamine compound or a salt thereof of the present invention can function as a protein labeling agent (particularly an antibody labeling agent). In this case, it is possible to label (fluorescent) a target protein (particularly an antibody) for a long time.
  • both R 9 and R 10 are substituted or unsubstituted alkoxy groups
  • the protein (especially antibodies) of interest is labeled (fluoresced) particularly over a long period of time while being excellent in water solubility. Is possible.
  • amine-reactive group or thiol-reactive group examples include general formulas (3A) to (3E):
  • R 12 represents a hydrogen atom or a sulfo group.
  • R 13 represents a substituted or unsubstituted alkyl group.
  • the bond indicated by the solid line and the broken line is a single bond or a double bond.
  • Examples of the amine-reactive group or thiol-reactive group satisfying such conditions include a group represented by —O—, —COO—, —CONR 18 — (R 18 represents a hydrogen atom or the above alkyl group) (particularly A group having an amine-reactive terminus or a thiol-reactive terminus via a linking group such as —COO—) is preferred.
  • R 18 represents a hydrogen atom or the above alkyl group
  • the phospharhodamine compound of the present invention can easily function as a protein labeling agent (particularly an antibody labeling agent).
  • an amine reactive group or thiol reactive group specifically,
  • n an integer of 1 to 6.
  • n is preferably an integer of 1 to 6, more preferably an integer of 1 to 4.
  • n is the same as defined above. ] Is preferred.
  • phospharhodamine compound of the present invention satisfying such conditions include, for example,
  • Ph represents a phenyl group. The same applies hereinafter.
  • a phospharhodamine compound represented by the above or a salt thereof is preferable.
  • the phospharhodamine compound of the present invention can also exist in a salt state.
  • salts include base addition salts such as metal salts such as sodium salts, potassium salts, calcium salts, and magnesium salts; ammonium salts; organic amine salts such as triethylamine salts, and the like.
  • examples thereof include mineral acid salts such as hydrochloride, sulfate and nitrate; organic acid salts such as p-toluenesulfonate, methanesulfonate, maleate and oxalate.
  • a salt with an amino acid such as glycine may be formed.
  • the phospharhodamine compound of the present invention may exist as a hydrate or solvate, and any of these substances is included in the scope of the present invention.
  • Such a phospharhodamine compound or a salt thereof of the present invention can have an absorption maximum wavelength of 680 to 730 nm, particularly 690 to 720 nm, and a fluorescence maximum wavelength of 720 to 750 nm, particularly 730 to 740 nm. . That is, it is possible to make the fluorescence maximum wavelength longer than that of the conventional fluorescent dye without expanding the conjugated system of the rhodamine skeleton. In addition, the absorption intensity and fluorescence intensity can be maintained over a longer period of time under various pH conditions as compared with conventional fluorescent dyes.
  • the phospharhodamine compound or a salt thereof of the present invention is excellent in cell membrane permeability because R 5 in the general formula (1) is a substituted or unsubstituted aryl group, non-invasive imaging in the deep part of a living body.
  • R 5 in the general formula (1) is a substituted or unsubstituted aryl group
  • non-invasive imaging in the deep part of a living body by selecting R 8 , proteins (particularly antibodies) in a living body can be suitably labeled (fluorescent).
  • the phospharhodamine compound or a salt thereof of the present invention has a longer fluorescence maximum wavelength as described above, it can be made to fluoresce in a region where the autofluorescence of the chloroplast is further reduced. Therefore, it is easy to image plants.
  • phospharhodamine compound or salt thereof is not particularly limited.
  • the phospharhodamine compound (1) in which R 6 and R 7 are hydrogen atoms includes the following: Reaction formula 1:
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 8 and X are the same as defined above.
  • X 1 and X 2 are the same or different and each represents a halogen atom.
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 9 , R 10 , R 11 and X are the same as defined above.
  • X 1 and X 2 are the same or different and each represents a halogen atom.
  • R 11 can also function as a protein labeling agent.
  • the halogen atom represented by X 1 and X 2 can employ any of a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom and an iodine atom, but from the viewpoint of easy progress of the cyclization reaction, A chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom and the like are preferable, and a bromine atom is more preferable.
  • the compound (3) in the above reaction formulas 1 and 2 can be a known or commercially available compound, or can be synthesized. In the case of synthesizing, it can be synthesized according to the previously reported.
  • the organolithium compound is not particularly limited, and known compounds can be used.
  • alkyl lithium such as n-hexyl lithium
  • cycloalkyl lithium such as cyclohexyl lithium
  • aryl lithium such as phenyl lithium
  • alkyllithium is preferable and sec-butyllithium is more preferable from the viewpoint of yield and ease of synthesis.
  • These organolithium compounds can be used alone or in combination of two or more.
  • the organic phosphorus compound is not particularly limited as long as the compound (4) can be obtained in this step, and a known compound can be used. However, since a substituted or unsubstituted aryl group is introduced as R 5 , it is preferable to use a dihalogenated aryl phosphine, and examples thereof include dichlorophenylphosphine and dibromophenylphosphine. These organophosphorus compounds can be used alone or in combination of two or more.
  • the amount of the organolithium compound, organophosphorus compound and hydrogen peroxide used is not particularly limited. From the viewpoint of yield, ease of synthesis, etc., the organolithium compound is used in an amount of 1.0 to 1 mol per 1 mol of the compound (3). It is preferable to use 10.0 mol (especially 1.5 to 5.0 mol) and 0.2 to 3.0 mol (especially 0.5 to 2.0 mol) of the organophosphorus compound.
  • the hydrogen peroxide it is preferable to use an excessive amount of aqueous hydrogen peroxide as an aqueous solution.
  • the organic solvent that can be used in this step a known one can be adopted, and in this step, for example, cyclic ether compounds such as tetrahydrofuran and dioxane are preferable.
  • the reaction conditions are preferably such that the reaction proceeds sufficiently.
  • the reaction atmosphere is preferably an inert gas atmosphere (nitrogen gas atmosphere, argon gas atmosphere, etc.), and the reaction temperature is ⁇ 100 to 100 ° C., particularly ⁇ 50 -50 ° C is preferred, and the reaction time is preferably 5 minutes to 12 hours, particularly 10 minutes to 6 hours.
  • purification can be performed according to a conventional method if necessary. Moreover, the following process can also be performed without performing a refinement
  • an oxidation reaction can be caused in the presence of a basic catalyst and a phase transfer catalyst with respect to the compound (4) in the above reaction formulas 1 and 2 in an organic solvent.
  • the basic catalyst is not particularly limited, and examples thereof include alkali metal alkoxides such as sodium methoxide, sodium ethoxide and potassium tert-butoxide; alkali metals such as lithium hydroxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide and cesium hydroxide.
  • alkali metals such as lithium hydroxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide and cesium hydroxide.
  • hydroxides include alkali metal carbonates such as lithium carbonate, sodium carbonate, potassium carbonate, and cesium carbonate. From the viewpoints of yield and ease of synthesis, alkali metal hydroxides and alkali metal carbonates are preferred. Sodium hydroxide and potassium carbonate are more preferable. In particular, it is preferable to cause the second oxidation reaction using sodium hydroxide to the remaining raw material after the first oxidation reaction using potassium carbonate.
  • the phase transfer catalyst is not particularly limited, and examples thereof include tetramethylammonium chloride, tetramethylammonium bromide, tetramethylammonium iodide, tetramethylammonium hydroxide, tetraethylammonium chloride, tetraethylammonium bromide, tetraethylammonium hydroxide, tetrapropyl.
  • Quaternary ammonium salts such as ammonium bromide, tetrabutylammonium chloride, tetrabutylammonium bromide (TBAB), tetrabutylammonium iodide, tetrabutylammonium hydroxide; methyltributylphosphonium iodide, tetrabutylphosphonium chloride, tetrabutylphosphonium bromide, etc.
  • TBAB tetrabutylammonium bromide
  • tetrabutylammonium iodide tetrabutylammonium hydroxide
  • methyltributylphosphonium iodide tetrabutylphosphonium chloride
  • tetrabutylphosphonium bromide etc.
  • Quaternary phosphonium salts of dibenzo 18 crown 6, benzo 15 crown 5, 18 Un 6, include diaza 18 crown 6, 21 crown ether crown 7 such like, yields, in view of easiness of synthesis, preferably quaternary ammonium salts, tetrabutylammonium bromide (TBAB) is more preferable.
  • TBAB tetrabutylammonium bromide
  • the amount of the basic catalyst and phase transfer catalyst used is not particularly limited. From the viewpoint of yield, ease of synthesis, etc., the basic catalyst is used in an amount of 0.5 to 10.0 mol (especially with respect to 1 mol of the compound (4)). 1.0 to 5.0 mol) and 0.01 to 0.10 mol (especially 0.02 to 0.05 mol) of a phase transfer catalyst is preferably used. When the oxidation reaction is performed a plurality of times, it is preferable to use the above amount for each oxidation reaction.
  • an oxidizing agent can be used or no oxidizing agent can be used.
  • an oxidizing agent there is no particular limitation, and permanganate (such as potassium permanganate) can be used.
  • the amount of the oxidizing agent used is not particularly limited, and from the viewpoint of yield and the like, it is preferable to use 1 to 10 mol (particularly 2 to 5 mol) with respect to 1 mol of compound (4).
  • the oxidation reaction can be efficiently advanced by setting the reaction atmosphere to an atmosphere containing oxygen (oxygen atmosphere, air atmosphere, etc.).
  • the organic solvent that can be used in this step known ones can be employed.
  • cyclic ether compounds such as tetrahydrofuran and dioxane; dimethyl sulfoxide (DMSO) and the like are preferable.
  • the same solvent as the said cyclization process can also be used.
  • the reaction conditions are preferably such that the reaction proceeds sufficiently.
  • the reaction atmosphere is preferably an oxygen-containing atmosphere (oxygen atmosphere, air atmosphere, etc.), and the reaction temperature is ⁇ 50 to 150 ° C., particularly 0 to 100 ° C.
  • the reaction time is preferably 5 minutes to 72 hours, particularly preferably 10 minutes to 48 hours.
  • purification can be performed according to a conventional method if necessary. Moreover, the following process can also be performed without performing a refinement
  • nucleophilic addition reaction (compound (5) ⁇ compound (1))
  • the nucleophilic addition reaction is carried out by reacting the compound (5) in the above reaction formula 1 with the desired halogenated aromatic compound in the presence of an organic lithium compound and an oxidizing agent in an organic solvent. Can cause.
  • the same reaction can proceed by using a desired Grignard reagent instead of the organolithium compound and the desired halogenated aromatic compound.
  • the Grignard reagent can be synthesized in advance, or can be synthesized in the system by a conventional method using the halogenated aromatic compound.
  • the halogenated aromatic compound that can be used in this case is, for example, the general formula (6) R 8 -X 3 (6) [Wherein R 8 is the same as defined above. X 3 represents a halogen atom. ] And the group R 8 can be introduced into the compound (5).
  • halogen atom represented by X 3 those described above can be adopted. The same applies to preferred embodiments.
  • halogenated aromatic compounds that satisfy these conditions include:
  • R 19 represents a hydrogen atom or a protecting group for a carboxy group.
  • the protecting group for the carboxy group represented by R 19 is not particularly limited, and is a lower alkyl group (an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms such as a methyl group, an ethyl group, an isopropyl group, or a tert-butyl group), an alkoxycarbonyl group. (Methoxycarbonyl group, tert-butoxycarbonyl group, etc.), aralkyl group (benzyl group, p-methoxybenzyl group, p-nitrobenzyl group etc.) which may be substituted, alkoxyalkyl group (methoxymethyl group etc.), etc. Can be mentioned.
  • the organolithium compound is not particularly limited, and known compounds can be used.
  • alkyl lithium such as n-hexyl lithium
  • cycloalkyl lithium such as cyclohexyl lithium
  • aryl lithium such as phenyl lithium
  • alkyllithium is preferable and sec-butyllithium is more preferable from the viewpoint of yield and ease of synthesis.
  • These organolithium compounds can be used alone or in combination of two or more.
  • the amount of the organolithium compound and the halogenated aromatic compound used is not particularly limited, and from the viewpoint of yield and the like, 1 to 10 mol (especially 2 to 5) of the organolithium compound is used per 1 mol of the compound (5). Mol), and 1 to 10 mol (particularly 2 to 5 mol) of the halogenated aromatic compound is preferably used.
  • the oxidizing agent is preferably used in an excess amount as an aqueous solution.
  • the organic solvent that can be used in this step known ones can be adopted, and in this step, for example, cyclic ether compounds such as tetrahydrofuran and dioxane are preferable.
  • the same solvent as the said cyclization process can also be used.
  • the reaction conditions may be such that the reaction proceeds sufficiently.
  • the reaction atmosphere is preferably an inert gas atmosphere (nitrogen gas atmosphere, argon gas atmosphere, etc.), and the reaction temperature is -50 to 100 ° C., In particular, 0 to 50 ° C. is preferable, and the reaction time is preferably 5 minutes to 10 hours, particularly preferably 10 minutes to 5 hours.
  • the phospharhodamine compound of the present invention can be obtained by purifying according to a conventional method as necessary.
  • nucleophilic addition reaction is carried out by reacting the compound (5) in the above reaction formula 1 with the desired halogenated aromatic compound in the presence of an organic lithium compound and an oxidizing agent in an organic solvent.
  • the compound (1A) can be obtained by further causing an oxidation reaction using an oxidizing agent.
  • the reaction hardly proceeds when the desired Grignard reagent is used instead of the organolithium compound and the desired halogenated aromatic compound.
  • halogenated aromatic compound that can be used at this time is, for example, the general formula (7):
  • R 9 and R 10 are the same as defined above.
  • R 14 , R 15 , R 16 and R 17 are the same or different and each represents a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted alkyl group.
  • X 4 represents a halogen atom.
  • the compound represented by these is preferable.
  • alkyl group represented by R 14 , R 15 , R 16 and R 17 those described above can be adopted. The same applies to the type and number of substituents and preferred specific examples.
  • halogen atom represented by X 4 those described above can be adopted. The same applies to preferred embodiments.
  • halogenated aromatic compounds that satisfy these conditions include:
  • organic lithium compound the same as the above (2-3) can be used. The same applies to preferred embodiments.
  • the oxidizing agent is not particularly limited, and hydrogen chloride (hydrochloric acid) or the like can be used for both the nucleophilic addition reaction and the oxidation reaction.
  • the amount of the organolithium compound and the halogenated aromatic compound used is not particularly limited, and from the viewpoint of yield and the like, 1 to 10 mol (especially 2 to 5) of the organolithium compound is used per 1 mol of the compound (5). Mol), and 1 to 10 mol (particularly 2 to 5 mol) of the halogenated aromatic compound is preferably used.
  • the oxidizing agent is preferably used in an excessive amount as an aqueous solution for both the nucleophilic addition reaction and the oxidation reaction.
  • the organic solvent that can be used in this step known ones can be adopted, and in this step, for example, cyclic ether compounds such as tetrahydrofuran and dioxane are preferable.
  • the same solvent as the said cyclization process can also be used.
  • the reaction conditions may be such that the reaction proceeds sufficiently.
  • the reaction atmosphere is preferably an inert gas atmosphere (nitrogen gas atmosphere, argon gas atmosphere, etc.), and the reaction temperature is -50 to 100 ° C., In particular, 0 to 50 ° C. is preferable, and the reaction time is preferably 5 minutes to 10 hours, particularly preferably 10 minutes to 5 hours.
  • purification can be performed according to a conventional method if necessary. Moreover, the following process can also be performed without performing a refinement
  • the phospharhodamine compound represented by the general formula (1) can be obtained, and can be used through ordinary isolation and purification steps as necessary.
  • the fluorescent dye of the present invention comprises the phospharhodamine compound of the present invention or a salt thereof.
  • the absorption maximum wavelength can be 680 to 730 nm, particularly 690 to 720 nm
  • the fluorescence maximum wavelength can be 720 to 750 nm, particularly 730 to 740 nm.
  • the fluorescent dye of the present invention has a longer fluorescence maximum wavelength, so that it can be made to fluoresce in a region where the autofluorescence of the chloroplast is further reduced. Easy to image.
  • the fluorescent dye of the present invention can maintain the absorption intensity and the fluorescent intensity over a longer time under various pH conditions as compared with the conventional fluorescent dye.
  • the fluorescence maximum wavelength is increased. The wavelength can be increased, and the absorption intensity and fluorescence intensity can be maintained for a longer time at various pHs.
  • R 5 in the general formula (1) is a substituted or unsubstituted aryl group, it is not anionized unlike the case of having a P (O ⁇ ) ⁇ O structure on the phosphorus atom.
  • a cell membrane is a biological membrane that separates the inside and outside of a cell, and has a function of allowing low molecules such as ions to permeate through a specific channel or receiving a signal from outside the cell via a receptor. It is known that the main component constituting this cell membrane is a phospholipid, and has a structure having a high anionic property.
  • the fluorescent dye of the present invention is a fluorescent dye that easily penetrates the cell membrane without being anionized. . For this reason, the fluorescent dye of the present invention is easy to perform non-invasive imaging of the deep part of the living body.
  • the phospharhodamine compound of the present invention or a salt thereof when the group represented by R 8 is an amine-reactive group or a thiol-reactive group, a substituted or unsubstituted amino group possessed by a protein (particularly an antibody), It can be reacted with a thiol group or the like. Therefore, the phospharhodamine compound of the present invention or a salt thereof can be used as a protein labeling agent (particularly an antibody labeling agent) for labeling (fluorescence) a protein (particularly an antibody).
  • the phospharhodamine compound or its salt of this invention has lengthened the fluorescence maximum wavelength more as mentioned above, it can reduce the damage to a biological body significantly. Moreover, when the phospharhodion compound of the present invention or a salt thereof is used, the target protein (particularly an antibody) can be fluorescent for a longer time than before.
  • the target protein includes, for example, avidin, streptavidin, annexin V, anti-IgG antibody , Anti-IgM antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody, anti-CD20 antibody, anti-CD25 antibody, anti-CD43 antibody, anti-CD44 antibody, anti-CD68 antibody, anti-IFN- ⁇ antibody, anti-TNF- ⁇ antibody, anti-Ly-6G antibody , Anti-Ku70 antibody, anti-IL-4 antibody, anti-IL-17 antibody, anti-IL-31 antibody, anti-Notch1 antibody, anti-Notch3 antibody, anti-FOXBP3 antibody, anti-Ki-67 antibody, anti-HLA-A2 antibody, anti- ⁇ - Tubulin antibody, anti-cathepsin-D antibody, anti-angiotensin antibody, anti-COX1 antibody, anti-GLUT1 antibody,
  • a protein labeling agent (particularly an antibody labeling agent) contains the phospharhodamine compound of the present invention or a salt thereof, but is preferably dissolved in an organic solvent to form a solution.
  • the concentration of the phospharhodamine compound of the present invention is preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 8 to 1 ⁇ 10 ⁇ 4 mol / L, and more preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 7 to 1 ⁇ 10 ⁇ 5 mol / L.
  • the organic solvent that can be used is not particularly limited and is polar. Either a solvent or a nonpolar solvent can be used.
  • polar solvents examples include ether compounds (tetrahydrofuran, anisole, 1,4-dioxane, cyclopentyl methyl ether, etc.), alcohols (methanol, ethanol, allyl alcohol, etc.), ester compounds (ethyl acetate, etc.), ketones (acetone, etc.) , Halogenated hydrocarbons (dichloromethane, chloroform), dimethyl sulfoxide, amide solvents (N, N-dimethylformamide, dimethylacetamide, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, N-methylpyrrolidone, etc.) .
  • nonpolar solvent examples include aliphatic organic solvents such as pentane, hexane, cyclohexane and heptane; aromatic solvents such as benzene, toluene, xylene and mesitylene.
  • the protein labeling agent (especially antibody labeling agent) of the present invention has a maximum absorption wavelength of 680 to 730 nm, particularly 690 to 720 nm, and a fluorescence maximum wavelength of 720 to 750 nm, particularly 730 to 740 nm.
  • the pH is preferably about 4 to 11 and more preferably about 4.5 to 8.0 from the viewpoint of introducing into a cell while achieving a sufficiently high fluorescence quantum yield even under conditions.
  • a buffer Hepes buffer, Tris buffer, Tricine-sodium hydroxide buffer, phosphate buffer, phosphate buffered physiological saline
  • Water etc.
  • the protein labeling kit of the present invention contains the protein labeling agent of the present invention (particularly an antibody labeling agent). In addition, if necessary, it can contain a buffer, a medium, an instruction manual, etc. used when labeling a protein (particularly an antibody). Using the protein labeling kit of the present invention, proteins (particularly antibodies) can be easily labeled.
  • As the buffer, the medium and the like that can be used, known ones that have been conventionally used can be adopted.
  • the protein labeling method of the present invention it is possible to easily label a protein (particularly an antibody) by reacting the protein labeling agent of the present invention with a protein (particularly an antibody).
  • This reaction can be performed by bringing the protein labeling agent (particularly antibody labeling agent) of the present invention into contact with a protein (particularly an antibody).
  • the contact method is not particularly limited, and examples thereof include a method of adding a solution containing the protein labeling agent (particularly antibody labeling agent) of the present invention to a solution containing a protein (particularly an antibody).
  • the method of transferring protein (especially antibody) to the buffer or culture medium containing the protein labeling agent (especially antibody labeling agent) of this invention is also mentioned.
  • the amount of the protein (particularly antibody) and the protein labeling agent (particularly antibody labeling agent) of the present invention in each solution is not particularly limited, and can be according to conventional methods.
  • 1 H NMR spectrum and 13 C ⁇ 1 H ⁇ NMR spectrum are shown in JEOL AL-400 spectrometer ( 1 H: 400 MHz, 13 C: 100 MHz), JEOL JNM-ECS400 ( 1 H: 400 MHz, 13 C: 100 MHz) ), Or JEOL A-600 spectrometer ( 1 H: 600 MHz, 13 C: 150 MHz), and measured in CDCl 3 or CD 3 OD as a solvent.
  • the chemical shift of the 1 H NMR spectrum was expressed in ⁇ ppm using the residual proton of the solvent as an internal standard (CHCl 3 ⁇ 7.26, CD 3 OD ⁇ 5.30).
  • Preparative recycling HPLC was performed using YMC LC-Forte / R equipped with a reverse phase column (YMC-Actus Triart C18). Unless otherwise limited, all reactions were conducted under a nitrogen atmosphere. Unless otherwise limited, commercially available solvents and reagents were used without further purification.
  • Anhydrous tetrahydrofuran (THF) and CH 2 Cl 2 were purchased from Kanto Chemical Co., Inc. and purified by Glass Contour Solvent Systems.
  • Bis (2-bromo-4-diethylaminophenyl) methane (compound 1) and 4-bromo-3,5-dimethylbenzaldehyde were synthesized according to the reports (Chem. Commun. 2012, 48, 8781-8783, Chem. Sci. 2012, 3, 1938-1944).
  • Et represents an ethyl group.
  • s-BuLi represents sec-butyllithium.
  • Ph represents a phenyl group.
  • TBAB represents tetrabutylammonium bromide.
  • DMSO stands for dimethyl sulfoxide.
  • THF represents tetrahydrofuran. The same applies hereinafter.
  • aqueous hydrogen peroxide 5 mL was added.
  • the resulting mixture was stirred at 0 ° C. for 1 h, and saturated aqueous Na 2 SO 3 (35 mL) was added to quench the reaction.
  • the mixture was extracted four times with chloroform, washed with water and saturated brine, and dried over anhydrous Na 2 SO 4 .
  • the solvent was evaporated and the oily residue was dissolved in 50 mL dimethyl sulfoxide (DMSO) and K 2 CO 3 powder (4.56 g, 33 mmol) and tetrabutylammonium bromide (TBAB; 89 mg, 0.275 mmol) were added.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • K 2 CO 3 powder 4.56 g, 33 mmol
  • TBAB tetrabutylammonium bromide
  • Compound 3 was obtained from 4-bromo-3,5-dimethylbenzaldehyde by a modified method of the oxazoline synthesis method (Synthesis, 2006, 2996-3002) reported by Glorius et al.
  • the obtained green crystalline powder (89 mg) was a co-crystal of compound PR1 and CHCl 3 in a molar ratio of 1: 2, and the solvent could not be removed by drying under vacuum.
  • the solid was dissolved in methanol (ca. 3 mL), the solvent was evaporated to dryness and the residue was dried under vacuum to give compound PR1 as a dark green solid (69 mg, 0.124 mmol, 49%).
  • the desiccant was filtered and the solvent was removed under reduced pressure.
  • the product was purified by silica gel column chromatography (DCM / methanol 9/1) and recrystallized by slowly adding diethyl ether to the DCM solution of the product. In order to remove the crystalline solvent (DCM, diethyl ether and water), the resulting brown powder was dissolved in methanol and the solvent was evaporated to dryness. The residue was dried under vacuum to give compound PR2 as a dark green solid (57 mg, 0.10 mmol, 20%).
  • Comparative Example 1 A commercially available fluorescent dye, Cy5.5 (GE Healthcare), was used as the fluorescent dye of Comparative Example 1.
  • the mixture was concentrated on a rotary evaporator to a volume of about 10 mL.
  • the mixture was then diluted with water and extracted four times with dichloromethane (DCM), washed with brine and dried over anhydrous Na 2 SO 4 .
  • DCM dichloromethane
  • the product was purified by silica gel column chromatography (silica, DCM / acetone 90/10 to 80/20). The solvent was evaporated under vacuum to give xanthone compound 6 as a bright yellow solid (249 mg, 0.601 mmol, 27%).
  • Test Example 1 The absorption spectrum and fluorescence spectrum of photophysical characteristics PR1 (Example 1), PR2 (Example 2), PR4 (Example 4) and PR6 (Example 8) were measured. Specifically, the absorption spectrum was measured with a Shimadzu UV-3150 spectrometer at a resolution of 0.2 nm using a sample solution prepared by dissolving 10 ⁇ 6 M of each compound in a PBS buffer aqueous solution (pH 7.4). The fluorescence spectrum was measured with a Hitachi F-4500 spectrometer with a resolution of 1 nm using a sample solution in which each compound was dissolved in a PBS buffer aqueous solution (pH 7.4) at 10 ⁇ 6 M.
  • the absolute fluorescence quantum yield was measured by Hamamatsu photonics PMA-11. The results are shown in FIG. In FIG. 1, a broken line is an absorption spectrum and a solid line is a fluorescence spectrum. As a result, PR1, PR2 and PR4 had similar photophysical properties. In addition, as in PR6, by extending the ⁇ conjugation of the phospharhodamine skeleton, it was possible to increase the absorption maximum wavelength and the fluorescence maximum wavelength by about 70 to 90 nm. In addition, all these compounds are water soluble. Therefore, a measurement sample could be produced without adding DMSO as a cosolvent.
  • Test Example 2 Evaluation of pH dependency of fluorescence
  • PR1 (Example 1)
  • PR2 (Example 2)
  • PR4 (Example 4)
  • aqueous buffer solutions having various pHs.
  • pH 3 to 6 use citric acid / Na 2 HPO 4 buffer aqueous solution
  • pH 7 to 8 use Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 buffer aqueous solution
  • pH 9 to 11 Na 2 CO. 3 / NaHCO 3 buffer aqueous solution was used.
  • the absorption spectrum and fluorescence spectrum were measured in the same manner as in Test Example 1.
  • FIG. 2 shows the absorption spectrum and fluorescence spectrum of each compound at various pHs.
  • the solid line indicates the result at pH 4.17
  • the broken line indicates the result at pH 7.43
  • the alternate long and short dash line indicates the result at pH 10.30.
  • FIG. 3 and Table 2 show the stability of absorption intensity over time of PR1 (Example 1), PR2 (Example 2), and PR4 (Example 4) at various pHs.
  • the stability is indicated by the absorption intensity maintenance rate (A / A 0 ; the ratio between the absorption intensity after the elapse of a predetermined time and the initial absorption intensity).
  • the solid line indicates the result at pH 4.17
  • the broken line indicates the result at pH 7.43
  • the alternate long and short dash line indicates the result at pH 10.30.
  • Table 2 with respect to PR1 (Example 1) and PR2 (Example 2), from the results of FIG.
  • FIG. 4 shows the stability of absorption intensity over time of PR1 (Example 1), PR2 (Example 2), PR3 (Example 3), and PR4 (Example 4) at pH 10.
  • the stability is indicated by the absorption intensity maintenance rate (A / A0; the ratio of the absorption intensity after the lapse of a predetermined time and the initial absorption intensity).
  • the solid line indicates the result of PR1 of Example 1
  • the broken line indicates the result of PR2 of Example 2
  • the two-dot chain line indicates the result of PR3 of Example 3
  • the alternate long and short dash line indicates the result of PR4 of Example 4.
  • Test example 3 Conjugation of phospharhodamine NHS ester and antibody 1 mg of goat anti-mouse antibody IgG (TCI, 1 mg / vial, preservative: 0.07% NaN 3 ) in about 0.5 mL of PBS buffer solution (pH 7.4) The antibody solution was dissolved and further diluted with a PBS buffer solution (pH 7.4) to make a total volume of 1.0 mL.
  • PR4-NHS (Example 6; 0.010 to 0.100 mg, 8 to 40 equivalents) or PR5-NHS (Example 7; 0.010 to 0.100 mg, 8 to 40 equivalents) was dissolved in water (30 ⁇ L) in a 1 mL vial. And diluted with the above antibody solution (500 ⁇ L). Next, 27 ⁇ L of carbonate buffer solution (pH 9.0, 0.2 M sodium bicarbonate solution adjusted to pH 9.0 with 1 M NaOH) is added to raise the pH to 8.0 to 8.5, the vial is sealed, and the resulting solution is Mixed at work (shaking gently). The vial was covered with aluminum platinum and left at room temperature for 1 hour. During this time, I gently shake several times.
  • carbonate buffer solution pH 9.0, 0.2 M sodium bicarbonate solution adjusted to pH 9.0 with 1 M NaOH
  • the resulting mixture is then stabilized with 30 mL of Sephadex G-25 column (approximately 4 g Sephadex gel, PBS buffer solution (pH 7.4) before use) using PBS buffer solution (pH 7.4) as the eluent. Filtered).
  • the first colored fraction (very light green) was collected to obtain about 3-4 mL of conjugation solution and measured with a UV-Vis spectrometer and a PL quantum yield spectrometer.
  • the degree of labeling (DOL) is determined by “Determination of Degree” in the ThermoFisher Scientific Alexa Fluor® 488 Microscale Protein Labeling Kit manual (https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp30006.pdf). According to the calculation method described in “Labeling of Labeling (DOL)”, calculation was performed using A 280 and A 710 instead of A 280 and A 494 .
  • Test Example 4 Fluorescence imaging The fading of an antibody conjugated with a fluorescent dye was evaluated as follows. As a sample for measurement, PR4-NHS (Example 6; DOL3.5, 27 ⁇ g), PR5-NHS (Example 7; DOL3.1, 20 ⁇ g), Cy5.5 (Comparative Example 1; DOL2.3, 30 ⁇ g) The goat anti-mouse antibody IgG conjugated with was used. Using a 300W xenon lamp, without using a filter, the absorption intensity was measured in the wavelength range of 385 to 750 nm, and the initial absorption intensity was adjusted to about 0.1. With respect to the absorption intensity and fluorescence intensity of each compound, FIG.
  • Example 8 shows the results of evaluating the temporal transition of the fluorescence intensity in the state where the cells are stained.
  • the solid line is (Example 6; DOL3.5, 27 ⁇ g)
  • the broken line is PR5-NHS (Example 7; DOL3.1, 20 ⁇ g)
  • the alternate long and short dash line is Cy5.5 (Comparative Example 1; DOL2.3, 30 ⁇ g).
  • Test Example 5 Plant imaging Fluorescent imaging of the primordial body of Physcomitrella patens was performed using oligoarginine (octamer) labeled with PR5-NHS.
  • Oligoarginine and PR5-NHS were joined as follows. Peptide stretching reaction of oligoarginine (octamer) linked with 8 arginines was performed by a general Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) solid phase synthesis method using 2-chlorotrityl polystyrene as a support resin. It was.
  • Fmoc-Arg (Pbf) -OH N- ⁇ - (9-fluorenylmethoxycarbonyl) -N- ⁇ - (2,2,4 , 6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl) -L-arginine
  • HCTU O- (6-chloro-1H-benzotriazol-1-yl) -N, N, N 'as a condensing agent N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate.
  • the terminal amino group is fluorescently labeled by applying 2 equivalents of PR5-NHS in DMF solution to oligoarginine (octamer) at room temperature for 1 hour, followed by excess trifluoroion for cleavage and deprotection from the resin.
  • the reaction was carried out in the presence of acetic acid.
  • the crude product is purified using reverse-phase HPLC (stationary phase: Phenomenex Jupiter C18; mobile phase: a mixture of acetonitrile and water containing 0.1% TFA (trifluoroacetic acid)) and the resulting fractions are lyophilized.
  • reverse-phase HPLC stationary phase: Phenomenex Jupiter C18; mobile phase: a mixture of acetonitrile and water containing 0.1% TFA (trifluoroacetic acid)
  • Fluorescence imaging was performed with a general-purpose mercury lamp using a fluorescence microscope IX-71 (Olympus). Fluorescent filter is excitation filter, dichroic filter, barrier filter in order of FF01-710 / 13, FF740-dio1, FF01-785 / 62 (Semrock) for PR5-NHS, and G365 for chlorophyll in chloroplasts , FT396, LP420 (Olympus) were used.

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Abstract

一般式（1）：［式中、R1～R4は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、又は置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。R5は置換若しくは非置換アリール基を示す。R6及びR7は水素原子を示す。R1とR6、及び／又はR3とR7は、互いに結合して置換若しくは非置換アルキレン基を構成してもよい。R8は置換若しくは非置換アリール基を示す。Xは対イオンを示す。］ で表されるホスファローダミン化合物又はその塩は、ホスファローダミン骨格の共役系を拡張せずとも、従来の近赤外蛍光色素よりも蛍光極大波長をさらに長波長化することができる。

Description

ホスファローダミン化合物若しくはその塩、並びにそれを用いた蛍光色素
　本発明は、ホスファローダミン化合物若しくはその塩、並びにそれを用いた蛍光色素に関する。
　高い光安定性を有する近赤外蛍光色素の開発は、生命科学研究のみならず、医療分野においても大変興味を持たれている。実際、近赤外蛍光色素の代表格であるインドシアニングリーン（ICG）を用いた外科手術は、近年比較的増えてきており、今後も増え続けることが期待される。しかしながら、ICGは光安定性に乏しく、用途も限定的である。
　近赤外蛍光色素は、現在はこのように光安定性に乏しく、用途も限定的であるが、近赤外に強い蛍光を示す化合物の開発は、生体深部の非浸襲イメージングの観点から非常に重要な研究課題である。また、植物類のイメージングにおいても、葉緑体の自家蛍光の波長領域を超える長波長領域に蛍光を有する化合物は極めて有用である。
　このような近赤外蛍光色素としては、例えば、特許文献１及び非特許文献１に開示されている。特許文献１で示されている近赤外蛍光色素は、キサンテン骨格の9位の位置に有するリン原子上にP(O-)=O構造を有するホスファローダミン化合物である。また、非特許文献１で示されている近赤外蛍光色素は、キサンテン骨格の9位の位置に有するリン原子上にP(CH3)=O構造を有するホスファローダミン化合物である。このような従来の近赤外蛍光色素は、蛍光極大波長は710nm程度に過ぎなかった。この場合、生体深部透過性の観点からは十分とは言えず、また、葉緑体の自家蛍光も無視できない範囲である。この蛍光極大波長を数十nm長波長化すれば、生体深部透過性をより高めることができるのみならず、葉緑体の自家蛍光の影響を完全に無視できる領域であるため非常に重要である。
　上記した特許文献１には、ホスファローダミン骨格の共役系をさらに拡張して左右に芳香環を形成した化合物として、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
で表される化合物の蛍光極大波長が732nmであることが記載されている。しかしながら、合成の煩雑さ、水溶性、イメージング時の非特異吸着の起こりやすさ等の観点からは、ホスファローダミン骨格自体を改変することで蛍光極大波長を長波長化できる手法が望まれている。
米国特許第８５０６６５５号明細書
Chem. Eur. J., 2015, 21, 16754.
　本発明は、上記のような課題を解決するためになされたものであり、ホスファローダミン骨格の共役系を拡張せずとも、従来の近赤外蛍光色素よりも蛍光極大波長をさらに長波長化することができる化合物を提供することを目的とする。
　上記目的を鑑み、鋭意検討した結果、本発明者らは、ホスファローダミン骨格が有するリン原子上にアリール基を結合した構造を有する化合物が、従来の近赤外蛍光色素よりも蛍光極大波長をさらに長波長化することができることを見出した。ホスファローダミン骨格のπ共役を拡張した場合は、蛍光極大波長をさらに長波長化させることが可能である。本発明は、このような知見に基づきさらに研究を重ね、完成させたものである。すなわち、本発明は以下の構成を包含する。
　項１．一般式（1）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
［式中、R1～R4は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、又は置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。R5は置換若しくは非置換アリール基を示す。R6及びR7は水素原子を示す。R1とR6、及び／又はR3とR7は、互いに結合して置換若しくは非置換アルキレン基を構成してもよい。R8は置換若しくは非置換アリール基を示す。Xは対イオンを示す。］
で表されるホスファローダミン化合物又はその塩。
　項２．前記R6及びR7がいずれも水素原子である、項１に記載のホスファローダミン化合物又はその塩。
　項３．前記R6が、一般式（2）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
［式中、R9及びR10は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、又は置換若しくは非置換アルコキシ基を示す。R11は水素原子又は反応性基を示す。］
で表される、項１又は２に記載のホスファローダミン化合物又はその塩。
　項４．前記R9及びR10がいずれも置換若しくは非置換アルキル基、又は置換若しくは非置換アルコキシ基である、項３に記載のホスファローダミン化合物又はその塩。
　項５．前記R11が、アミン反応性基又はチオール反応性基である、項３又は４に記載のホスファローダミン化合物又はその塩。
　項６．前記アミン反応性基又はチオール反応性基が、一般式（3A）～（3E）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
［式中、R12は水素原子又はスルホ基を示す。R13は置換若しくは非置換アルキル基を示す。実線と破線で示される結合は、単結合又は二重結合である。］
で表される構造を末端に有する基である、項５に記載のホスファローダミン化合物又はその塩。
　項７．項１～６のいずれかに記載のホスファローダミン化合物又はその塩からなる蛍光色素。
　項８．項５又は６に記載のホスファローダミン化合物又はその塩を用いたタンパク質標識剤。
　項９．項８に記載のタンパク質標識剤を含有する、タンパク質標識化キット。
　項１０．項８に記載のタンパク質標識剤と、タンパク質とを反応させる工程
を備える、タンパク質標識化方法。
　本発明のホスファローダミン化合物は、リン原子上にアリール基を結合した構造を有しているため、ホスファローダミン骨格を拡張せずとも、従来の近赤外蛍光色素よりも蛍光極大波長をさらに長波長化することができる。さらに、ホスファローダミン骨格のπ共役を拡張することにより、蛍光極大波長をさらに長波長化することも可能である。
　本発明のホスファローダミン化合物は、R8で示される基の種類によっては、様々なpHにおいて長時間にわたって吸収強度及び蛍光強度を維持することができるため、安定性を特に向上させることもできる。
　さらに、本発明のホスファローダミン化合物は、R8で示される基をアミン反応性基又はチオール反応性基とする場合には、タンパク質を標識するタンパク質標識剤として機能することもできる。この場合、市販されているタンパク質標識剤と比較しても、より長時間にわたって蛍光を維持することが可能である。
PR1（実施例1）、PR2（実施例2）、PR4（実施例4）及びPR6（実施例8）の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルである。 PR1（実施例1）、PR2（実施例2）及びPR4（実施例4）の様々なpHにおける吸収スペクトル及び蛍光スペクトルである。 様々なpHにおけるPR1（実施例1）、PR2（実施例2）及びPR4（実施例4）の時間の経過に伴う吸収強度の安定性を示すグラフである。 pH10におけるPR1（実施例1）、PR2（実施例2）、PR3（実施例3）及びPR4（実施例4）の時間の経過に伴う吸収強度の安定性を示すグラフである。 PR4-NHS（実施例6）において、DOLと絶対量子収率Φとの関係を示すグラフである。 PR4-NHS（実施例6; DOL3.5, 27μg）、PR5-NHS（実施例7; DOL3.1, 20μg）、Cy5.5（比較例1; DOL2.3, 30μg）により接合したヤギ抗マウス抗体IgGの吸収強度及び蛍光強度の時間経過にともなう維持率と、吸収スペクトル及び蛍光スペクトルである。 PR4-NHS（実施例6）、PR5-NHS（実施例7）及びCy5.5（比較例1）で標識したヤギ抗マウス抗体IgGを用いて10分間共焦点蛍光イメージングを行った結果である。 PR4-NHS（実施例6）、PR5-NHS（実施例7）及びCy5.5（比較例1）で標識したヤギ抗マウス抗体IgGを用いて10分間共焦点蛍光イメージングを行った場合の照射領域の平均蛍光強度の結果を示すグラフである。 PR5-NHS（実施例7）で標識したオリゴアルギニンを用いてヒメツリガネゴケ原糸体細胞壁の蛍光イメージングを行った結果である。スケールバーは50μmを示す。
　本明細書において、「（ヘテロ）アリール基」は、アリール基又はヘテロアリール基を意味する。また、本明細書において、「含有」は、「含む（comprise）」、「実質的にのみからなる（consist essentially of）」、及び「のみからなる（consist of）」のいずれも包含する概念である。また、本明細書において、数値範囲を「A～B」で示す場合、A以上B以下を意味する。
　1．ホスファローダミン化合物又はその塩
　本発明のホスファローダミン化合物又はその塩は、一般式（1）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
［式中、R1～R4は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、又は置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。R5は置換若しくは非置換アリール基を示す。R6及びR7は水素原子を示す。R1とR6、及び／又はR3とR7は、互いに結合して置換若しくは非置換アルキレン基を構成してもよい。R8は置換若しくは非置換アリール基を示す。Xは対イオンを示す。］
で表される化合物又はその塩である。この一般式（1）で表されるホスファローダミン化合物又はその塩は、文献未記載の新規化合物である。
　上記一般式（1）において、Xは対イオン（アニオン）を示す。対イオン（アニオン）としては、例えば、ハロゲンイオン（フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン等）、シアンイオン、酢酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン等が挙げられる。
　上記一般式（1）において、R1～R4で示されるアルキル基としては、直鎖アルキル基及び分岐鎖アルキル基のいずれも採用できる。
　直鎖アルキル基としては、炭素数1～6（特に1～4）の直鎖アルキル基が好ましく、具体的には、メチル基、エチル基、n-プロピル基、n-ブチル基、n-ペンチル基、n-ヘキシル基等が挙げられる。
　分岐鎖アルキル基としては、炭素数3～6（特に3～5）の分岐鎖アルキル基が好ましく、具体的には、イソプロピル基、イソブチル基、tert-ブチル基、sec-ブチル基、ネオペンチル基、イソヘキシル基、3－メチルペンチル基等が挙げられる。
　R1～R4で示されるアルキル基は、置換基を有していてもよい。アルキル基が有していてもよい置換基としては、特に制限はなく、水酸基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、後述のアリール基、後述のヘテロアリール基、後述の反応性基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、特に制限されず、1～6個が好ましく、1～3個がより好ましい。
　上記一般式（1）において、R1～R4で示されるアリール基としては、単環アリール基、縮環アリール基及び多環アリール基のいずれも採用でき、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、フェナントレニル基、ビフェニル基、ターフェニル基、フルオレニル基、ピレニル基、トリフェニレニル基等のC6-18アリール基（特にC6-14アリール基）が挙げられる。
　R1～R4で示されるアリール基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、特に制限はなく、水酸基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、上記アルキル基、上記アリール基、後述のヘテロアリール基、後述の反応性基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、特に制限されず、1～6個が好ましく、1～3個がより好ましい。
　上記一般式（1）において、R1～R4で示されるヘテロアリール基としては、単環ヘテロアリール基及び多環ヘテロアリール基のいずれも採用でき、例えば、ピロリジル基、ピロリル基、テトラヒドロチエニル基、チエニル基、オキソラニル基、フラニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、ピペリジル基、ピリジル基、ピラジル基、インドリル基、イソインドリル基、ベンゾイミダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、キノキサリル基等が挙げられる。
　R1～R4で示されるヘテロアリール基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、特に制限はなく、水酸基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、上記アルキル基、上記アリール基、上記ヘテロアリール基、後述の反応性基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、特に制限されず、1～6個が好ましく、1～3個がより好ましい。
　なかでも、R1～R4としては、置換若しくは非置換単環アルキル基、並びに置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基が好ましく、置換若しくは非置換アルキル基がより好ましい。
　上記一般式（1）において、R5で示されるアリール基としては、上記したものを採用できる。置換基の種類及び数も同様である。これにより、蛍光極大波長を長波長化することができ、且つ、細胞膜透過性に優れるために生体深部の非浸襲イメージングがしやすいとともに、葉緑体の自家蛍光を低減した領域で蛍光させることが可能であることから植物類のイメージングもしやすい。
　上記一般式（1）において、R6及びR7は水素原子である。R1とR6、及び／又はR3とR7は、互いに結合して置換若しくは非置換アルキレン基を構成してもよい。このようなアルキレン基としては、炭素数1～6（特に炭素数2～4）のアルキレン基が挙げられ、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基等が挙げられる。アルキレン基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、特に制限はなく、水酸基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、上記アリール基、上記ヘテロアリール基、後述の反応性基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、特に制限されず、1～6個が好ましく、1～3個がより好ましい。なお、水溶性をより向上させ、イメージングの際の非特異吸着をより抑制する観点からは、R1とR6、及びR3とR7のいずれも、互いに結合して置換若しくは非置換アルキレン基を構成せず、R6及びR7が水素原子であることが好ましく、蛍光極大波長をより長波長化させる観点からは、R1とR6、及び／又はR3とR7は、互いに結合して置換若しくは非置換アルキレン基を構成することが好ましい。
　上記一般式（1）において、R8で示されるアリール基としては、上記したものを採用できる。置換基の種類及び数も同様である。なかでも、R8としては、蛍光極大波長をより長波長化することができ、様々なpHにおいてより長時間にわたって吸収強度及び蛍光強度を維持することができるとともに、耐光性にもより優れる観点から、一般式（2）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
［式中、R9及びR10は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、又は置換若しくは非置換アルコキシ基を示す。R11は水素原子又は反応性基を示す。］
で表される基が好ましい。
　一般式（2）において、R9及びR10で示されるアルキル基としては、上記したものを採用できる。置換基の種類及び数も同様である。
　一般式（2）において、R9及びR10で示されるアルコキシ基としては、炭素数1～6（特に1～4）のアルコキシ基が好ましく、例えば、メトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、イソプロピルオキシ基、n-ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、tert-ブチルオキシ基、n-ペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、n-ヘキシルオキシ基等が挙げられる。
　R9及びR10で示されるアルコキシ基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、特に制限はなく、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、上記アルキル基、上記アリール基、上記ヘテロアリール基、後述の反応性基等が挙げられる。置換基を有する場合の置換基の数は、特に制限されず、1～6個が好ましく、1～3個がより好ましい。
　なかでも、R9及びR10としては、蛍光極大波長をより長波長化することができ、且つ、様々なpHにおいてより長時間にわたって吸収強度及び蛍光強度を維持することができる観点から、いずれも置換若しくは非置換アルキル基、又は置換若しくは非置換アルコキシ基であることが好ましい。また、R9及びR10としては、蛍光極大波長をより長波長化することができ、且つ、様々なpHにおいてより長時間にわたって吸収強度及び蛍光強度を維持することができる観点から、置換若しくは非置換アルキル基、又は置換若しくは非置換アルコキシ基が好ましく、置換若しくは非置換アルコキシ基がより好ましい。特に、R9及びR10がいずれも置換若しくは非置換アルキル基、又は置換若しくは非置換アルコキシ基である場合には、酸性条件、中性条件、アルカリ性条件のいずれにおいても、より長時間にわたって吸収強度及び蛍光強度を維持することができる。R9及びR10の少なくとも1つが水素原子である場合には、アルカリ性条件においては吸収強度及び蛍光強度が時間の経過とともに低減しやすいことと比較して優れた効果を有する。
　一般式（2）において、R11で示される反応性基としては、反応性を有する基であれば特に制限されない。R11がカルボキシ基；水酸基；アミノ基；クロロメチル基等のハロゲン化アルキル基；イソシアン基；イソチアシアン基等であるホスファローダミン化合物又はその塩は、当該反応性基と反応させることにより、R11を容易に、タンパク質を標識するための基（アミン反応性基、チオール反応性基等）とすることが可能である。このR11がタンパク質を標識するための基（アミン反応性基、チオール反応性基等）である化合物群も、本発明のホスファローダミン化合物又はその塩の範疇である。
　上記アミン反応性基は、標識対象となる化合物が有する置換若しくは非置換アミノ基と反応性を有する基であり、タンパク質（特に抗体）が有する置換若しくは非置換アミノ基と反応することにより、本発明のホスファローダミン化合物又はその塩がタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）として機能することができる。
　また、上記チオール反応性基は、標識対象となる化合物が有する置換若しくは非置換チオール基と反応性を有する基であり、タンパク質（特に抗体）が有する置換若しくは非置換チオール基と反応することにより、本発明のホスファローダミン化合物又はその塩がタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）として機能することができる。この場合、長時間にわたって対象となるタンパク質（特に抗体）を標識する（蛍光させる）ことが可能である。特に、R9及びR10がいずれも置換若しくは非置換アルコキシ基である場合には、水溶性に優れつつも、特に、長時間にわたって対象となるタンパク質（特に抗体）を標識する（蛍光させる）ことが可能である。
　このようなアミン反応性基又はチオール反応性基としては、例えば、一般式（3A）～（3E）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
［式中、R12は水素原子又はスルホ基を示す。R13は置換若しくは非置換アルキル基を示す。実線と破線で示される結合は、単結合又は二重結合である。］
で表される構造を末端に有する基が好ましい。
　一般式（3C）において、R13で示されるアルキル基としては、上記したものを採用できる。置換基の種類及び数も同様である。
　このような条件を満たすアミン反応性基又はチオール反応性基としては、－O－、－COO－、－CONR18－（R18は水素原子又は上記アルキル基を示す）で表される基（特に－COO－）等の連結基を介してアミン反応性末端又はチオール反応性末端を有する基が好ましい。これにより、本発明のホスファローダミン化合物をタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）として機能しやすい。このようなアミン反応性基又はチオール反応性基としては、具体的には、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
［式中、nは1～6の整数を示す。］
等が挙げられる。
　上記式中、nは1～6の整数が好ましく、1～4の整数がより好ましい。
　なかでも、合成の容易さ、タンパク質（特に抗体）の標識しやすさ等の観点から、アミン反応性基としては
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
等が好ましく、チオール反応性基としては
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
［式中、nは前記に同じである。］
が好ましい。
　このような条件を満たす本発明のホスファローダミン化合物としては、例えば、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
［式中、Phはフェニル基を示す。以下同様である。］
等で表されるホスファローダミン化合物、又はその塩が好ましい。
　本発明のホスファローダミン化合物は、塩の状態で存在することもできる。このような塩としては、塩基付加塩として、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の金属塩；アンモニウム塩；トリエチルアミン塩等の有機アミン塩等を挙げることができ、酸付加塩として、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩等の鉱酸塩；p-トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩等の有機酸塩等を挙げることができる。これらのほか、グリシン等のアミノ酸との塩を形成する場合もある。
　また、本発明のホスファローダミン化合物は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。
　このような本発明のホスファローダミン化合物又はその塩は、吸収極大波長を680～730nm、特に690～720nmとすることができ、蛍光極大波長を720～750nm、特に730～740nmとすることができる。つまり、ローダミン骨格の共役系を拡張することなく、従来の蛍光色素よりも蛍光極大波長をより長波長化することが可能である。また、従来の蛍光色素と比較しても、様々なpH条件において、より長時間にわたって、吸収強度及び蛍光強度を維持することができる。また、本発明のホスファローダミン化合物又はその塩は、一般式（1）におけるR5が置換若しくは非置換アリール基であることにより、細胞膜透過性に優れているため、生体深部の非浸襲イメージングがしやすく、上記のとおり、R8を選択することにより、生体内のタンパク質（特に抗体）を好適に標識する（蛍光させる）ことができる。また、本発明のホスファローダミン化合物又はその塩は、上記のとおり、蛍光極大波長をより長波長化していることから、葉緑体の自家蛍光をより低減した領域で蛍光させることが可能であることから植物類のイメージングもしやすい。
　2．ホスファローダミン化合物又はその塩の製造方法
　本発明のホスファローダミン化合物又はその塩は、特に制限されず、例えば、R6及びR7が水素原子であるホスファローダミン化合物（1）は、以下の反応式1：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
［式中、R1、R2、R3、R4、R5、R8及びXは前記に同じである。X1及びX2は同一又は異なって、ハロゲン原子を示す。］
にしたがって合成することができる。
　R8が一般式（2）で表される基である場合は、以下の反応式2：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
  
［式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R9、R10、R11及びXは前記に同じである。X1及びX2は同一又は異なって、ハロゲン原子を示す。］
にしたがって合成することができる。この際、R11としてアミン反応性基又はチオール反応性基を導入すれば、タンパク質標識剤として機能することもできる。
　反応式1及び2において、X1及びX2で示されるハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子をいずれも採用できるが、環化反応の進行のしやすさの観点から、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が好ましく、臭素原子がより好ましい。
　（2－1）環化反応（化合物（3）→化合物（4））
　本工程では、例えば、有機溶媒中で、上記反応式1及び2における化合物（3）と、有機リチウム化合物とを反応させた後に、有機リン化合物を添加し、次いで、過酸化水素を添加することにより、所望の環化反応を進行させることができる。
　なお、上記反応式1及び2における化合物（3）は、公知又は市販の化合物を用いることもでき、合成することもできる。合成する場合は、既報にしたがって合成することができる。
　有機リチウム化合物としては、特に制限はなく、公知のものが採用でき、例えば、エチルリチウム、n-プロピルリチウム、イソプロピルリチウム、n-ブチルリチウム、sec-ブチルリチウム、tert-ブチルリチウム、n-ペンチルリチウム、n-ヘキシルリチウム等のアルキルリチウム；シクロヘキシルリチウム等のシクロアルキルリチウム；フェニルリチウム等のアリールリチウム等が挙げられる。これらのうち、本工程では、収率、合成の容易さの観点から、アルキルリチウムが好ましく、sec-ブチルリチウムがより好ましい。これら有機リチウム化合物は、単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。
　有機リン化合物としては、本工程で化合物（4）が得られれば特に制限はなく、公知のものが採用できる。ただし、R5として置換若しくは非置換アリール基を導入することから、ジハロゲン化アリールホスフィンを使用することが好ましく、例えば、ジクロロフェニルホスフィン、ジブロモフェニルホスフィン等が挙げられる。これら有機リン化合物は、単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。
　上記有機リチウム化合物、有機リン化合物及び過酸化水素の使用量は、特に制限はなく、収率、合成の容易さ等の観点から、化合物（3）1モルに対して、有機リチウム化合物を1.0～10.0モル（特に1.5～5.0モル）、有機リン化合物を0.2～3.0モル（特に0.5～2.0モル）使用することが好ましい。また、過酸化水素は、水溶液である過酸化水素水を過剰量用いることが好ましい。
　本工程において使用され得る有機溶媒としては、公知のものを採用することができ、本工程では、例えば、テトラヒドロフラン、ジオキサン等の環状エーテル化合物が好ましい。また、反応条件は、反応が十分に進行する程度が好ましく、例えば、反応雰囲気は不活性ガス雰囲気（窒素ガス雰囲気、アルゴンガス雰囲気等）が好ましく、反応温度は-100～100℃、特に-50～50℃が好ましく、反応時間は5分～12時間、特に10分～6時間が好ましい。
　反応終了後は、必要に応じて常法にしたがって精製処理をすることもできる。また、精製処理を施さずに次の工程を行うこともできる。
　（2－2）酸化反応（化合物（4）→化合物（5））
　本工程では、例えば、有機溶媒中で、上記反応式1及び2における化合物（4）に対して、塩基性触媒及び相間移動触媒の存在下に酸化反応を引き起こすことができる。
　塩基性触媒としては、特に制限はなく、例えば、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムtert-ブトキシド等のアルカリ金属アルコキシド；水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム等のアルカリ金属水酸化物；炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム等のアルカリ金属炭酸塩等が挙げられ、収率、合成の容易さ等の観点から、アルカリ金属水酸化物及びアルカリ金属炭酸塩が好ましく、水酸化ナトリウム及び炭酸カリウムがより好ましい。特に、炭酸カリウムを用いて1回目の酸化反応を起こした後に、残存する原料に対して、水酸化ナトリウムを用いて2回目の酸化反応を起こすことが好ましい。
　相間移動触媒としては、特に制限はなく、例えば、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラメチルアンモニウムブロミド、テトラメチルアンモニウムヨージド、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド、テトラエチルアンモニウムクロリド、テトラエチルアンモニウムブロミド、テトラエチルアンモニウムヒドロキシド、テトラプロピルアンモニウムブロミド、テトラブチルアンモニウムクロリド、テトラブチルアンモニウムブロミド（TBAB）、テトラブチルアンモニウムヨージド、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド等の4級アンモニウム塩；メチルトリブチルホスホニウムヨージド、テトラブチルホスホニウムクロリド、テトラブチルホスホニウムブロミド等の4級ホスホニウム塩；ジベンゾ18クラウン6、ベンゾ15クラウン5、18クラウン6、ジアザ18クラウン6、21クラウン7等のクラウンエーテル等が挙げられ、収率、合成の容易さ等の観点から、4級アンモニウム塩が好ましく、テトラブチルアンモニウムブロミド（TBAB）がより好ましい。
　上記塩基性触媒及び相間移動触媒の使用量は、特に制限はなく、収率、合成の容易さ等の観点から、化合物（4）1モルに対して、塩基性触媒を0.5～10.0モル（特に1.0～5.0モル）、相間移動触媒を0.01～0.10モル（特に0.02～0.05モル）使用することが好ましい。複数回酸化反応させる場合は、各酸化反応ごとに、上記使用量を使用することが好ましい。
　酸化反応は、酸化剤を使用することもできるし、酸化剤を使用しないこともできる。
　酸化剤を使用する場合、特に制限はなく、過マンガン酸塩（過マンガン酸カリウム等）等を使用することができる。この場合、上記酸化剤の使用量は、特に制限はなく、収率等の観点から、化合物（4）1モルに対して、1～10モル（特に2～5モル）使用することが好ましい。
　酸化剤を使用しない場合、反応雰囲気を酸素を含む雰囲気（酸素雰囲気、空気雰囲気等）とすることにより、効率的に酸化反応を進行させることができる。
　本工程において使用され得る有機溶媒としては、公知のものを採用することができ、本工程では、例えば、テトラヒドロフラン、ジオキサン等の環状エーテル化合物；ジメチルスルホキシド（DMSO）等が好ましい。なお、上記環化工程と同じ溶媒を使用することもできる。また、反応条件は、反応が十分に進行する程度が好ましく、例えば、反応雰囲気は酸素を含む雰囲気（酸素雰囲気、空気雰囲気等）が好ましく、反応温度は-50～150℃、特に0～100℃が好ましく、反応時間は5分～72時間、特に10分～48時間が好ましい。
　反応終了後は、必要に応じて常法にしたがって精製処理をすることもできる。また、精製処理を施さずに次の工程を行うこともできる。
　（2－3）求核付加反応（化合物（5）→化合物（1））
　本工程では、例えば、有機溶媒中で、有機リチウム化合物及び酸化剤の存在下に、上記反応式1における化合物（5）と所望のハロゲン化芳香族化合物とを反応させることで、求核付加反応を引き起こすことができる。なお、本工程では、有機リチウム化合物及び所望のハロゲン化芳香族化合物の代わりに、所望のグリニャール試薬を使用することによっても、同様の反応を進行することができる。グリニャール試薬は、あらかじめ合成することもでき、上記ハロゲン化芳香族化合物を用いて、常法により系中で合成することもできる。
　この際使用できるハロゲン化芳香族化合物は、例えば、一般式（6）：
R8－X3　　　（6）
［式中、R8は前記に同じである。X3はハロゲン原子を示す。］
で表される化合物であり、化合物（5）に基R8を導入することができる。
　X3で示されるハロゲン原子としては、上記したものを採用できる。好ましい具体例も同様である。
　このような条件を満たすハロゲン化芳香族化合物としては、例えば、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
［式中、R19は水素原子又はカルボキシ基の保護基を示す。］
等が挙げられる。
　R19で示されるカルボキシ基の保護基としては、特に制限はなく、低級アルキル基（メチル基、エチル基、イソプロピル基、tert-ブチル基等の炭素数1～6のアルキル基）、アルコキシカルボニル基（メトキシカルボニル基、tert-ブトキシカルボニル基等）、置換されていてもよいアラルキル基（ベンジル基、p-メトキシベンジル基、p-ニトロベンジル基等）、アルコキシアルキル基（メトキシメチル基等）等が挙げられる。
　有機リチウム化合物としては、特に制限はなく、公知のものが採用でき、例えば、エチルリチウム、n-プロピルリチウム、イソプロピルリチウム、n-ブチルリチウム、sec-ブチルリチウム、tert-ブチルリチウム、n-ペンチルリチウム、n-ヘキシルリチウム等のアルキルリチウム；シクロヘキシルリチウム等のシクロアルキルリチウム；フェニルリチウム等のアリールリチウム等が挙げられる。これらのうち、本工程では、収率、合成の容易さの観点から、アルキルリチウムが好ましく、sec-ブチルリチウムがより好ましい。これら有機リチウム化合物は、単独で用いることもでき、2種以上を組合せて用いることもできる。
　酸化剤としては、特に制限はなく、塩化水素（塩酸）等を使用することができる。
　上記有機リチウム化合物及びハロゲン化芳香族化合物の使用量は、特に制限はなく、収率等の観点から、化合物（5）1モルに対して、有機リチウム化合物を1～10モル（特に2～5モル）、ハロゲン化芳香族化合物を1～10モル（特に2～5モル）使用することが好ましい。また、酸化剤は水溶液として過剰量使用することが好ましい。
　本工程において使用され得る有機溶媒としては、公知のものを採用でき、本工程では、例えば、テトラヒドロフラン、ジオキサン等の環状エーテル化合物が好ましい。なお、上記環化工程と同じ溶媒を使用することもできる。また、反応条件は、反応が十分に進行する程度とすることができ、例えば、反応雰囲気は不活性ガス雰囲気（窒素ガス雰囲気、アルゴンガス雰囲気等）が好ましく、反応温度は-50～100℃、特に0～50℃が好ましく、反応時間は5分～10時間、特に10分～5時間が好ましい。
　反応終了後は、必要に応じて常法にしたがって精製処理をすることにより、本発明のホスファローダミン化合物を得ることができる。
　（2－4）求核付加反応及び酸化反応（化合物（5）→化合物（1A））
　本工程では、例えば、有機溶媒中で、有機リチウム化合物及び酸化剤の存在下に、上記反応式1における化合物（5）と所望のハロゲン化芳香族化合物とを反応させることで、求核付加反応を引き起こし、さらに、別途酸化剤を用いて酸化反応を起こすことで、化合物（1A）を得ることができる。なお、本工程では、上記（2－3）とは異なり、有機リチウム化合物及び所望のハロゲン化芳香族化合物の代わりに、所望のグリニャール試薬を使用した場合には、ほとんど反応が進行しない。
　この際使用できるハロゲン化芳香族化合物は、例えば、一般式（7）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
［式中、R9及びR10は前記に同じである。R14、R15、R16及びR17は同一又は異なって、水素原子又は置換若しくは非置換アルキル基を示す。X4はハロゲン原子を示す。］
で表される化合物が好ましい。
　R14、R15、R16及びR17で示されるアルキル基としては、上記したものを採用できる。置換基の種類及び数、好ましい具体例も同様である。
　X4で示されるハロゲン原子としては、上記したものを採用できる。好ましい具体例も同様である。
　このような条件を満たすハロゲン化芳香族化合物としては、例えば、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
等が挙げられる。
　なお、本工程で使用するハロゲン化芳香族化合物としては、上記工程（2－3）と同様に、一般式（6）で表される化合物、例えば、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
［式中、R19は前記に同じである。］
等が挙げられる。
　有機リチウム化合物としては、上記（2－3）と同様のものを使用することができる。好ましい具体例も同様である。
　酸化剤としては、特に制限はなく、求核付加反応及び酸化反応ともに、塩化水素（塩酸）等を使用することができる。
　上記有機リチウム化合物及びハロゲン化芳香族化合物の使用量は、特に制限はなく、収率等の観点から、化合物（5）1モルに対して、有機リチウム化合物を1～10モル（特に2～5モル）、ハロゲン化芳香族化合物を1～10モル（特に2～5モル）使用することが好ましい。また、酸化剤は求核付加反応及び酸化反応ともに、水溶液として過剰量使用することが好ましい。
　本工程において使用され得る有機溶媒としては、公知のものを採用でき、本工程では、例えば、テトラヒドロフラン、ジオキサン等の環状エーテル化合物が好ましい。なお、上記環化工程と同じ溶媒を使用することもできる。また、反応条件は、反応が十分に進行する程度とすることができ、例えば、反応雰囲気は不活性ガス雰囲気（窒素ガス雰囲気、アルゴンガス雰囲気等）が好ましく、反応温度は-50～100℃、特に0～50℃が好ましく、反応時間は5分～10時間、特に10分～5時間が好ましい。
　反応終了後は、必要に応じて常法にしたがって精製処理をすることもできる。また、精製処理を施さずに次の工程を行うこともできる。
　（2－5）縮合反応（化合物（1A）→化合物（1B））
　R11として反応性基を導入する場合、常法により、化合物（1A）のカルボキシ基を所望の反応性基に置換することができる。この際、例えば、カルボジイミド系縮合剤（N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩、ジイソプロピルカルボジイミド）、イミダゾール系縮合剤（カルボニルジイミダゾール、2-クロロ-1,3-ジメチルイミダゾリニウムクロリド）、トリアジン系縮合剤（4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド）、ホスホニウム系縮合剤（ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ-トリスジメチルアミノホスホニウム塩、ヘキサフルオロリン酸(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウム）、ウロニウム系縮合剤（{{[(1-シアノ-2-エトキシ-2-オキソエチリデン)アミノ]オキシ}-4-モルホリノメチレン}ジメチルアンモニウムヘキサフルオロリン酸塩、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩、N,N,N’,N’-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロボレート（TSTU））等の縮合剤を使用することができる。例えば、TSTUを使用した場合には、アミン反応性基としてスクシンイミド基を導入し、タンパク質標識剤（特に抗体標識剤）として機能することができる。
　この際の他の添加剤、反応条件等は常法により行うことができる。
　このようにして、一般式（1）で表されるホスファローダミン化合物を得ることができ、必要に応じて通常の単離及び精製工程を経て使用することもできる。
　なお、上記では、本発明のホスファローダミン化合物の一態様の合成方法の一例について記載したが、この製造方法に限定されることはなく、様々な合成方法で合成することができる。
　3．蛍光色素及びタンパク質標識剤
　本発明の蛍光色素は、上記の本発明のホスファローダミン化合物又はその塩からなる。
　本発明の蛍光色素は、ローダミンのキサンテン骨格の9位の位置にP(R5)=O構造を有しているため、ホスファローダミン骨格を拡張せずとも、従来の近赤外蛍光色素よりも蛍光極大波長をさらに長波長化することができる。具体的には、吸収極大波長を680～730nm、特に690～720nmとすることができ、蛍光極大波長を720～750nm、特に730～740nmとすることができる。また、このように、本発明の蛍光色素は、蛍光極大波長をより長波長化していることから、葉緑体の自家蛍光をより低減した領域で蛍光させることが可能であることから植物類のイメージングもしやすい。
　また、本発明の蛍光色素は、また、従来の蛍光色素と比較しても、様々なpH条件において、より長時間にわたって、吸収強度及び蛍光強度を維持することができる。特に、R8として、R9及びR10がいずれも置換若しくは非置換アルキル基、又は置換若しくは非置換アルコキシ基である一般式（2）で表される基を採用することにより、蛍光極大波長をより長波長化することができ、且つ、様々なpHにおいてより長時間にわたって吸収強度及び蛍光強度を維持することができる。
　本発明の蛍光色素は、一般式（1）におけるR5が置換若しくは非置換アリール基であるため、リン原子上にP(O-)=O構造を有する場合と異なり、アニオン化しない。一方、細胞膜は、細胞の内外を隔てる生体膜であり、特異的なチャンネルによってイオン等の低分子を透過させたり、受容体を介して細胞外からのシグナルを受け取ったりする機能等を有しており、この細胞膜を構成する主要成分はリン脂質であり、アニオン性が高い構造であることが知られている。R5がアニオン化しやすい構造である場合には、アニオン性の高い細胞膜を透過させることは困難であるため、本発明の蛍光色素は、アニオン化しないことにより、細胞膜を透過しやすい蛍光色素である。このため、本発明の蛍光色素は、生体深部の非浸襲イメージングがしやすい。
　さらに、本発明のホスファローダミン化合物又はその塩において、R8で示される基をアミン反応性基又はチオール反応性基とする場合には、タンパク質（特に抗体）が有する置換若しくは非置換アミノ基、チオール基等と反応させることができる。このため、本発明のホスファローダミン化合物又はその塩を、タンパク質（特に抗体）を標識する（蛍光させる）ためのタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）として用いることが可能である。この際、本発明のホスファローダミン化合物又はその塩は、上記のとおり、蛍光極大波長をより長波長化していることから、生体へのダメージを大幅に低減することができる。また、本発明のホスファローダミオン化合物又はその塩を用いた場合には、対象となるタンパク質（特に抗体）を従来よりも長時間にわたって蛍光させることが可能である。
　本発明のホスファローダミン化合物又はその塩をタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）として使用する場合、その対象となるタンパク質（特に抗体）としては、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、アネキシンV、抗IgG抗体、抗IgM抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD20抗体、抗CD25抗体、抗CD43抗体、抗CD44抗体、抗CD68抗体、抗IFN-γ抗体、抗TNF-α抗体、抗Ly-6G抗体、抗Ku70抗体、抗IL-4抗体、抗IL-17抗体、抗IL-31抗体、抗Notch1抗体、抗Notch3抗体、抗FOXBP3抗体、抗Ki-67抗体、抗HLA-A2抗体、抗α-チューブリン抗体、抗カテプシン-D抗体、抗アンジオテンシン抗体、抗COX1抗体、抗GLUT1抗体、抗AKT1/2/3抗体、抗Apg3抗体、抗βカテニン抗体、抗CDK5抗体、抗CEA抗体、抗HER2抗体、等が挙げられる。
　本発明のホスファローダミン化合物又はその塩のうち、R8で示される基をアミン反応性基又はチオール反応性基とした化合物をタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）に用いる場合は、本発明のタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）は、本発明のホスファローダミン化合物又はその塩を含有しているが、有機溶媒中に溶解させて溶液とすることが好ましい。具体的には、本発明のホスファローダミン化合物の濃度は1×10-8～1×10-4 mol/Lが好ましく、1×10-7～1×10-5 mol/Lがより好ましい。このように、本発明では、従来の蛍光色素と比較し、ホスファローダミン化合物の含有量を低く抑えることができる。
　本発明の蛍光色素（ホスファローダミン化合物又はその塩）を、本発明のタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）を含有する溶液とする場合、使用し得る有機溶媒としては、特に制限はなく、極性溶媒及び非極性溶媒のいずれも使用できる。
　極性溶媒としては、例えば、エーテル化合物（テトラヒドロフラン、アニソール、1,4-ジオキサン、シクロペンチルメチルエーテル等）、アルコール（メタノール、エタノール、アリルアルコール等）、エステル化合物（酢酸エチル等）、ケトン（アセトン等）、ハロゲン化炭化水素（ジクロロメタン、クロロホルム）、ジメチルスルホキシド、アミド系溶媒（N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン、N-メチルピロリドン等）等が挙げられる。
　非極性溶媒としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン等の脂肪族有機溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等の芳香族溶媒等が挙げられる。
　本発明のタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）は、上記のとおり、吸収極大波長を680～730nm、特に690～720nmとし、蛍光極大波長を720～750nm、特に730～740nmとしつつも、生理的条件下でもより十分に高い蛍光量子収率としつつ、細胞中に投入する観点から、pHは4～11程度が好ましく、4.5～8.0程度がより好ましい。本発明のタンパク質検出剤（特に抗体検出剤）のpHを調整するために、緩衝剤（ヘペス緩衝剤、トリス緩衝剤、トリシン－水酸化ナトリウム緩衝剤、リン酸系緩衝剤、リン酸緩衝生理食塩水等）等を使用してもよい。
　4．タンパク質標識キット及びタンパク質標識方法
　本発明のタンパク質標識キットは、本発明のタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）を含有する。その他、必要に応じて、タンパク質（特に抗体）の標識に用いる際に使用するバッファー、培地、使用説明書等を含有することもできる。本発明のタンパク質標識キットを用いれば、タンパク質（特に抗体）を容易に標識することが可能である。使用できるバッファー、培地等は、従来から使用されている公知のものを採用することができる。
　また、本発明のタンパク質標識方法によれば、本発明のタンパク質標識剤と、タンパク質（特に抗体）とを反応させることにより、タンパク質（特に抗体）を容易に標識することが可能である。
　この反応は、本発明のタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）と、タンパク質（特に抗体）とを接触させることにより行うことができる。接触方法は特に制限されず、例えば、タンパク質（特に抗体）を含有する溶液中に、本発明のタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）を含有する溶液を添加する方法が挙げられる。また、本発明のタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）を含むバッファー又は培地に、タンパク質（特に抗体）を移す方法も挙げられる。各溶液中のタンパク質（特に抗体）及び本発明のタンパク質標識剤（特に抗体標識剤）の分量は特に制限されず、常法にしたがうことができる。
　実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらのみに限定されるものではない。
　1H NMRスペクトル及び13C{1H} NMRスペクトルは、JEOL AL-400 spectrometer（1H: 400 MHz、13C: 100 MHz）、JEOL JNM-ECS400（1H: 400 MHz、13C: 100 MHz）、又はJEOL A-600 spectrometer（1H: 600 MHz、13C: 150 MHz）を用いて、溶媒としてCDCl3又はCD3OD中で測定した。1H NMRスペクトルの化学シフトは、内部標準（CHCl3 δ 7.26、CD3OD δ 5.30）として溶媒の残留プロトンを用いてδppmで表記した。13C NMRスペクトルの化学シフトは、内部標準（CDCl3 δ 77.16、CD3OD δ 49.0）として溶媒のシグナルを用いて報告した。マススペクトルは、Thermo Fisher Scientific Exactiveによるエレクトロスプレーイオン化（ESI）法により測定した。薄層クロマトグラフィー（TLC）は、シリカゲル60F254（Merck）を0.25 mmの厚さで塗布した板を用いて行った。カラムクロマトグラフィーは、中性シリカゲルPSQ100B（富士シリシア化学（株））又はシリカゲル60（関東化学（株））を用いて行った。分取リサイクルHPLCには、逆相カラム（YMC-Actus Triart C18）を備えたYMC LC-Forte/Rを用いて行った。特に制限のない限り、全ての反応は窒素雰囲気下で行った。特に制限のない限り、市販の溶媒及び試薬は、さらに精製することなく使用した。無水テトラヒドロフラン（THF）及びCH2Cl2は関東化学（株）から購入し、Glass Contour Solvent Systemsで精製した。ビス(2-ブロモ-4-ジエチルアミノフェニル)メタン（化合物1）及び4-ブロモ-3,5-ジメチルベンズアルデヒドは既報にしたがい合成した（Chem. Commun. 2012, 48, 8781-8783、Chem. Sci. 2012, 3, 1938-1944）。
　合成例1：3,7-ビス(ジエチルアミノ)-5-フェニル-10H-アクリドホスフィン-10-オン5-オキシド（化合物2）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
［式中、Etはエチル基を示す。s-BuLiはsec-ブチルリチウムを示す。Phはフェニル基を示す。TBABはテトラブチルアンモニウムブロミドを示す。DMSOはジメチルスルホキシドを示す。THFはテトラヒドロフランを示す。以下同様である。］
　無水テトラヒドロフラン（THF; 50mL）中のビス(2-ブロモ-4-ジエチルアミノフェニル)メタン（化合物1; 5.15g, 11.0mmol）の溶液に、sec-ブチルリチウム（シクロヘキサン中の0.99M溶液, 22.2mL, 22mmol）を-78℃で30分間かけて添加し、得られた混合物を-78℃で1.5時間撹拌した。次いで、P,P-ジクロロフェニルホスフィン（1.49mL, 11.0mmol）をゆっくりと30分以上かけて添加し、混合物を一晩で室温まで昇温した。次いで、混合物を0℃まで冷却し、35%過酸化水素水（5mL）を添加した。得られた混合物を0℃で1時間撹拌し、飽和Na2SO3水溶液（35mL）を添加して反応をクエンチした。混合物をクロロホルムで4回抽出し、水及び飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。溶媒を蒸発させ、油状の残渣を50mLのジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解させ、K2CO3粉末（4.56g, 33mmol）及びテトラブチルアンモニウムブロミド（TBAB; 89mg, 0.275mmol）を添加した。空気雰囲気下、室温で、得られた懸濁液を一晩激しく撹拌した。次いで、再度、K2CO3粉末（3.04g, 22mmol）及びTBAB（89mg, 0.275mmol）を添加し、懸濁液をさらに50℃で24時間撹拌した。混合物を水（150mL）で希釈し、冷ました。得られた黄色沈殿をろ過し、水で洗浄した。得られた固体をジクロロメタン（DCM）に溶解させ、層分離した。水層をDCMで5回抽出し、合わせた有機層を水で2回洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。溶媒を真空下に除去した後、残渣（5.35g）をトルエンから再結晶し、山吹色固体として化合物2を得た（2.18g, 44%）。再結晶により得られたろ液には、まだ化合物2と未酸化の前駆体2-Hが残存している。ろ液を真空下に濃縮し、残渣を60mLのTHFに溶解させた。NaOH粉末（720 mg）及びTBAB（97mg, 0.30mmol）をこの溶液に添加し、得られた懸濁液を、室温で空気雰囲気下に2時間激しく撹拌し、酸化を完了した。混合物を水で希釈し、DCMで4回抽出し、水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。溶媒を蒸発させた後に、生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（90/10 to 85/15 DCM/アセトン）により精製し、次いで、トルエン／ヘキサンから再結晶させ、化合物2を得た（836mg, 17%）。合計3.02 g（6.76mmol, 61%）の化合物2を山吹色結晶性固体として得た。
　　[数１]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.27 (dd, J = 9.2, 6.1 Hz, 2H), 7.67-7.48 (m, 2H), 7.44-7.27 (m, 3H), 7.09 (dd, J = 14.7, 3.1 Hz, 2H), 6.82 (dd, J = 8.9, 2.8 Hz, 2H), 3.61-3.25 (m, 8H), 1.14 (t, J = 7.3 Hz, 12H). 13C{1H} NMR (100 MHz, CDCl3) δ 180.2 (d, JCP = 7.7 Hz, C), 150.5 (d, JCP = 12.5 Hz, C), 135.3 (d, JCP = 105.5 Hz, C), 134.8 (d, JCP = 95.8 Hz, C), 131.5 (d, JCP = 10.5 Hz, CH), 131.4 (d, JCP =2.9 Hz, CH), 130.4 (d, JCP = 10.6 Hz, CH), 128.6 (d, JCP = 12.4 Hz, CH), 123.9 (d, JCP = 6.7 Hz, C), 114.3 (s, CH), 111.5 (d, JCP = 7.6 Hz, CH), 44.6 (s, CH2), 12.5 (s, CH3). HRMS (ESI) m/z calcd. for C27H31N2O2PNa ([M+Na]+): 469.2015; found: 469.2015.
　合成例2：2-(4-ブロモ-3,5-ジメチルフェニル)-4,4-ジメチル-2-オキサゾリン（化合物3）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　化合物3は、以下の通り、4-ブロモ-3,5-ジメチルベンズアルデヒドから、Gloriusらにより報告されたオキサゾリン合成法（Synthesis, 2006, 2996-3002）を修正した方法により得た。
　50 mLの無水DCM中の、4-ブロモ-3,5-ジメチルベンズアルデヒド（1.92g, 9.0mmol）、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール（0.86mL, 9.0mmol）、及び4Åモレキュラーシーブス（4.5g）の混合物を室温で16時間撹拌した。次いで、N-ブロモスクシンイミド（NBS; 1.60g, 9.0mmol）を添加し、混合物をさらに1.5時間撹拌した。ろ過により固体を除去し、DCMで洗浄した。有機ろ液を合わせ、NaHCO3水溶液及び水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。乾燥剤をろ過し、溶媒を減圧下に除去した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM）により精製し、真空下に乾燥し、黄色がかったオイルとして化合物3を得た（1.65g, 5.85mmol, 65%）。
　　[数２]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.64 (s, 2H), 4.10 (s, 2H), 2.43 (s, 6H), 1.37 (s, 6H). 13C{1H} NMR (100 MHz, CDCl3) δ 161.8, 138.7, 131.1, 127.8, 126.4, 79.3, 67.8, 28.5, 23.9. HRMS (ESI) m/z calcd. for C13H17BrNO ([M+H]+): 282.0488; found: 282.0487.
　合成例3：tert-ブチル4-ブロモ-3,5-ジメトキシベンゾエート（化合物4）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
［式中、tBuはtert-ブチル基を示す。］
　窒素雰囲気下、4-ブロモ-3,5-ジメトキシ安息香酸（5.22g, 20.0mmol）、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC; 5.36g, 26.0mmol）、及びN,N-ジメチル-4-アミノピリジン（DMAP; 244mg, 2.00mmol）を60mLのジクロロメタンに溶解させた。ここに、ジクロロメタン（20mL）中のtert-ブチルアルコール（3.85g, 52.0mmol）の溶液を添加し、得られた混合物を室温で3日間撹拌した。白色沈殿をろ過により除去し、ろ液を減圧下に濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/DCM 3/2 to 1/2）で精製し、白色固体として化合物4を得た（3.34g, 10.5mmol, 53%）。
　　[数３]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.20 (s, 2H), 3.95 (s, 6H), 1.61 (s, 9H). 13C{1H} NMR (125 MHz, CDCl3) δ 165.3, 157.0, 132.2, 106.3, 105.6, 81.9, 56.7, 28.3.
　実施例1：ホスファローダミン化合物PR1
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　無水テトラヒドロフラン（THF; 3mL）中の2-ブロモトルエン（90μL, 0.75mmol）の溶液に、sec-ブチルリチウム（シクロヘキサン中の0.99M溶液, 0.91mL, 0.90mmol）を、-78℃でゆっくりと添加し、得られた混合物を同じ温度で1時間撹拌した。ここに、テトラヒドロフラン（THF; 3mL）中の合成例1で得た化合物2（112mg, 0.251mmol）の溶液を20分以上かけて滴下し、混合物を1.5時間かけて室温まで昇温した。次いで、ここに20mLの1M塩酸を添加し、撹拌を30分間継続した。この間に、混合物の色彩が淡黄色から深緑色に変化した。混合物を飽和食塩水で希釈し、DCMで5回抽出した。有機層を合わせ、Na2SO4で乾燥した。乾燥剤をろ過し、溶媒を減圧下に除去した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/メタノール 95/5 to 85/15）で精製した。溶離液を減圧下に除去した後、生成物のクロロホルム溶液にジエチルエーテルを少しずつ添加して再結晶させた。1H NMR分析の結果から、得られた緑色結晶性粉末（89mg）は、化合物PR1とCHCl3のモル比1:2の共結晶であり、真空下の乾燥では溶媒は除去できなかった。固体をメタノール（約3mL）中に溶解させ、溶媒を蒸発させて乾燥させ、残渣を真空下に乾燥し、深緑色固体として化合物PR1を得た（69mg, 0.124mmol, 49%）。
　　[数４]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.80-7.40 (m, 10H), 7.28-7.18 (m, 1H), 7.18-7.08 (m, 2H), 6.97 (dd, J = 9.5, 2.8 Hz, 2H), 3.93-3.63 (m, 8H), 2.09 (2×s, 3H), 1.28 (2×t, J = 6.9 Hz, 12H). HRMS (ESI) m/z calcd. for C34H38N2OP (M+): 521.2716; found: 521.2707.
　実施例2：ホスファローダミン化合物PR2
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　2-ブロモ-1,3-ジメチルベンゼン（200μL, 1.50mmol）を、無水テトラヒドロフラン（THF; 5mL）中の削り状マグネシウム（38.3mg, 1.58mmol）の溶液に添加した。1,2-ジブロモエタン（15μL, 0.17mmol）を添加して金属－ハロゲン交換反応を起こし、得られた混合物を室温で16時間撹拌した（マグネシウム金属は完全に消費した）。得られたグリニャール試薬の溶液に、無水テトラヒドロフラン（THF; 10mL）中の合成例1で得た化合物2（223mg, 0.50mmol）の溶液を添加し、反応混合物を室温で2時間、還流（70℃）下に20時間撹拌した。混合物を室温まで冷却した後、20mLの2M塩酸を添加し、得られた乳濁液を1時間撹拌した。混合物をクロロホルム及び水で希釈し、層分離した。水層をクロロホルムで5回抽出し、合わせた有機層を2M塩酸及び水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。乾燥剤をろ過し、溶媒を減圧下に除去した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/メタノール 9/1）で精製し、生成物のDCM溶液にジエチルエーテルをゆっくりと添加して再結晶させた。結晶性溶媒（DCM, ジエチルエーテル及び水）を除去するため、得られた茶色粉末をメタノールに溶解させ、溶媒を蒸発させて乾燥させた。残渣を真空下に乾燥し、深緑色固体として化合物PR2を得た（57mg, 0.10mmol, 20%）。
　　[数５]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.86-7.61 (m, 5H), 7.56 (td, J = 7.6, 3.7 Hz, 2H), 7.41 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.28 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 7.13 (dd, J = 9.8, 6.1 Hz, 2H), 6.99 (dd, J = 9.8, 2.4 Hz, 2H), 3.77 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 2.04 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.30 (t, J = 7.0 Hz, 12H). 13C{1H} NMR (100 MHz, CD3OD) δ 165.3 (d, JCP = 6.8 Hz, C), 155.2 (d, JCP = 12.5 Hz, C), 140.6 (d, JCP = 8.6 Hz, CH), 139.3 (d, JCP = 94.9 Hz, C), 137.5 (s, C), 136.7 (s, C), 136.5 (s, C), 134.6 (d, JCP = 2.9 Hz, CH), 133.9 (d, JCP = 109.3 Hz, C), 131.3 (d, JCP = 11.5 Hz, CH), 130.7 (d, JCP = 12.4 Hz, CH), 130.7 (s, CH), 129.1 (s, CH), 129.0 (s, CH), 123.9 (d, JCP = 6.7 Hz, C), 121.1 (d, JCP = 7.6 Hz, CH), 117.4 (s, CH), 47.7 (s, CH2), 20.0 (s, CH3), 19.8 (s, CH3), 13.1 (s, CH3). HRMS (ESI) m/z calcd. for C35H40N2OP (M+): 535.2873; found: 535.2868.
　実施例3：ホスファローダミン化合物PR3
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　無水テトラヒドロフラン（THF; 5mL）中の2-ブロモ-1,3-ジメトキシベンゼン（326mg, 1.50mmol）の溶液に、sec-ブチルリチウム（シクロヘキサン中の0.99M溶液, 1.60mL, 1.58mmol）を、-78℃でゆっくりと添加し、得られた混合物を同じ温度で1時間撹拌した。ここに、無水テトラヒドロフラン（THF; 10mL）中の合成例1で得た化合物2（223mg, 0.50mmol）の溶液を30分以上かけて滴下し、混合物を2時間かけて室温まで昇温した。次いで、ここに20mLの1M塩酸を添加し、撹拌を30分間継続した。得られた深緑色の混合物を水で希釈し、DCMで4回抽出した。有機層を合わせ、2M塩酸で洗浄し、Na2SO4で乾燥した。乾燥剤をろ過し、溶媒を減圧下に除去した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/メタノール 9/1）で精製した。溶離液を減圧下に除去した後、生成物をDCMに溶解させ、2M塩酸で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、乾燥剤をろ過した。溶媒を蒸発させた後、生成物のDCM溶液にジエチルエーテルをゆっくりと添加して再結晶させた。共結晶性溶媒を除去するため、得られた茶色粉末を水中に溶解させ、液体N2中で凍結させ、フリーズドライした。深緑色粉末として化合物PR3を得た（90mg, 0.149mmol, 30%）。
　　[数６]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.82 (dd, J = 12.8, 7.9 Hz, 2H), 7.71-7.46 (m, 6H), 7.38-7.17 (m, 2H), 7.07-6.77 (m, 4H), 3.88-3.60 (m, 14H), 1.27 (t, J = 6.7 Hz, 12H). 13C{1H} NMR (100 MHz, CD3OD) δ 162.7 (d, JCP = 6.7 Hz, C), 159.2 (s, C), 158.8 (s, C), 155.1 (d, JCP = 12.5 Hz, C), 141.3 (d, JCP = 9.6 Hz, CH), 139.4 (d, JCP = 94.9 Hz, C), 134.3 (s, CH), 133.8 (d, JCP = 106.4 Hz, C), 133.3 (s, CH), 130.8 (d, JCP = 10.5 Hz, CH), 130.5 (d, JCP = 13.4 Hz, CH), 125.2 (d, JCP = 6.7 Hz, C), 119.9 (d, JCP = 7.7 Hz, CH), 116.7 (s, CH), 113.9 (s, C), 105.3 (s, CH), 105.2 (s, CH), 56.8 (s, CH3), 56.6 (s, CH3), 47.5 (s, CH2), 13.1 (s, CH3). HRMS (ESI) m/z calcd. for C35H40N2O3P (M+): 567.2771; found: 567.2766.
　実施例4：ホスファローダミン化合物PR4
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　無水テトラヒドロフラン（THF; 8mL）中の合成例2で得た化合物3（436mg, 1.55mmol）の溶液に、sec-ブチルリチウム（シクロヘキサン中の0.99M溶液, 1.59mL, 1.57mmol）を-78℃でゆっくりと添加し、得られた混合物を同じ温度で30分間撹拌した。ここに、無水テトラヒドロフラン（THF; 10mL）中の合成例1で得た化合物2（223mg, 0.50mmol）の溶液を20分以上かけて滴下し、混合物を2時間かけて室温まで昇温した。次いで、ここに20mLの2M塩酸を添加し、撹拌を30分間継続した。混合物を飽和食塩水で希釈し、DCMで5回抽出した。有機層を合わせ、飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。乾燥剤をろ過し、溶媒を減圧下に除去した。残渣を50mLの6M塩酸に溶解させ、80℃で6時間撹拌した。混合物を飽和食塩水で希釈し、DCMで抽出した。合わせた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。ろ過し、溶媒を減圧下に除去した後に、生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/メタノール/HCOOH 88/12/0.5 to 80/20/1）で単離した。生成物を含む留分を2M塩酸で2回洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。乾燥剤をろ過して除去し、溶媒を蒸発させた。生成物のDCM溶液にジエチルエーテルをゆっくりと添加して再結晶させた。生成物を真空下に乾燥させ、緑色粉末として化合物PR4を得た（47mg, 0.076mmol, 15%）。
　　[数７]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.95 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.78-7.61 (m, 5H), 7.56 (td, J = 7.5, 3.3 Hz, 2H), 7.09 (dd, J = 9.8, 6.1 Hz, 2H), 7.00 (dd, J = 9.8, 2.4 Hz, 2H), 3.77 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 2.11 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 1.30 (t, J = 7.3 Hz, 12H). 13C{1H} NMR (100 MHz, CD3OD) δ 169.1 (s, C), 163.6 (d, JCP = 6.7 Hz, C), 155.2 (d, JCP = 12.5 Hz, C), 141.1 (s, C), 140.2 (d, JCP = 9.5 Hz, CH), 139.3 (d, JCP = 94.8 Hz, C), 138.3 (s, C), 137.5 (s, C), 134.6 (s, CH), 133.8 (d, JCP = 109.2 Hz, C), 133.1 (s, C), 131.3 (d, JCP = 10.6 Hz, CH), 130.7 (d, JCP = 12.5 Hz, CH), 130.2 (s, CH), 130.1 (s, CH), 123.3 (d, JCP = 6.7 Hz, C), 121.4 (d, JCP = 7.7 Hz, CH), 117.6 (s, CH), 47.7 (s, CH2), 20.0 (s, CH3), 19.8 (s, CH3), 13.1 (s, CH3). 31P{1H} NMR (162 MHz, CD3OD) δ 11.6. HRMS (ESI) m/z calcd. for C36H40N2O3P (M+): 579.2771; found: 579.2770.
　実施例5：ホスファローダミン化合物PR5
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　無水テトラヒドロフラン（THF; 10mL）中の合成例3で得た化合物4（856mg, 2.70mmol）の溶液に、tert-ブチルリチウム（n-ペンタン中の1.64M溶液, 3.30mL, 5.41mmol）を-78℃でゆっくりと添加し、得られた混合物を同じ温度で1時間撹拌した。ここに、無水テトラヒドロフラン（THF; 20mL）中の合成例1で得た化合物2（402mg, 0.90mmol）の溶液を20分以上かけて滴下し、混合物を一晩かけて室温まで昇温した。次いで、ここに30mLの2M塩酸を添加し、撹拌を1時間継続した。混合物を飽和食塩水で希釈し、DCMで5回抽出した。有機層を合わせ、希釈塩酸で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。乾燥剤をろ過し、溶媒を減圧下に除去した。残渣を10mLのトリフルオロ酢酸に溶解させ、室温で2時間撹拌した。混合物を100mLの水に注ぎ、130mLの1M NaOH水溶液を添加して中和した。得られた溶液をDCMで5回抽出した。合わせた有機層を2M HClで2回洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。ろ過し、溶媒を減圧下に除去した後に、生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/メタノール/HCOOH 85/15/0.2）で単離した。溶離液を蒸発させ、生成物をDCMに溶解させ、2M HClで3回洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。乾燥剤をろ過して除去し、溶媒を蒸発させた。生成物のDCM溶液にジエチルエーテルをゆっくりと添加して再結晶させた。生成物を真空下に乾燥させ、茶色粉末として化合物PR5を得た（62mg, 0.096mmol, 11%）。
　　[数８]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.87-7.75 (m, 2H), 7.67-7.59 (m, 2H), 7.58-7.48 (m, 5H), 7.25 (dd, J = 9.5, 6.4 Hz, 2H), 6.94 (dd, J = 9.8, 2.4 Hz, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.73 (q, J = 7.1 Hz, 8H), 1.28 (t, J = 7.0 Hz, 12H). 13C{1H} NMR (100 MHz, CD3OD) δ 168.7 (s, C), 160.8 (d, JCP = 6.7 Hz, C), 159.2 (s, C), 158.8 (s, C), 155.1 (d, JCP = 13.5 Hz, C), 141.0 (d, JCP = 8.6 Hz, CH), 139.4 (d, JCP = 93.9 Hz, C), 136.0 (s, C), 134.3 (s, CH), 133.8 (d, JCP = 108.0 Hz, C), 130.8 (d, JCP = 10.5 Hz, CH), 130.6 (d, JCP = 13.4 Hz, CH), 124.7 (d, JCP = 6.7 Hz, C), 120.2 (d, JCP = 7.6 Hz, CH), 118.4 (s, C), 116.9 (s, CH), 106.5 (s, CH), 106.4 (s, CH), 57.0 (s, CH3), 56.8 (s, CH3), 47.6 (s, CH2), 13.1 (s, CH3). HRMS (ESI) m/z calcd. for C36H40N2O5P (M+): 611.2669; found: 611.2666.
　実施例6：ホスファローダミンNHSエステルPR4-NHS
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　無水ジメチルホルムアミド（DMF; 3mL）中の、実施例4で得た化合物PR4（24mg, 0.039mmol）及びN,N,N’,N’-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロボレート（TSTU; 23.5mg, 0.078mmol）の溶液に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（27μL, 0.156mmol）を添加し、室温で混合物を18時間撹拌した。反応混合物を5%クエン酸水溶液で希釈し、DCMで4回抽出した。合わせた有機層を飽和食塩水で2回洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。乾燥剤をろ過し、ろ液を減圧下に濃縮した。残存する生成物のDMF溶液に、2mLのDCMを添加し、次いで、ジエチルエーテルをゆっくりと添加して生成物を沈殿させた。ろ過により固体を集め、2mLの水に溶解させた。残存する溶液を液体窒素中で凍結してフリーズドライし、緑色粉末として化合物PR4-NHSを得た（24.5mg, 0.034mmol, 87%）。
　　　[数９]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.07 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.81-7.61 (m, 5H), 7.56 (td, J = 7.6, 3.3 Hz, 2H), 7.08 (br s, 2H), 7.00 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 3.78 (q, J = 5.5 Hz, 8H), 2.94 (s, 4H), 2.15 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 1.30 (t, J = 7.0 Hz, 12H). HRMS (ESI) m/z calcd. for C40H43N3O5P (M+): 676.2935; found: 676.2930.
　実施例7：ホスファローダミンNHSエステルPR5-NHS
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　無水ジメチルホルムアミド（DMF; 3mL）中の、実施例5で得た化合物PR5（35mg, 0.054mmol）及びN,N,N’,N’-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロボレート（TSTU; 32.5mg, 0.108mmol）の溶液に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（38μL, 0.218mmol）を添加し、室温で混合物を16時間撹拌した。反応混合物をDCMで希釈し、5%クエン酸水溶液で2回洗浄し、飽和食塩水で2回洗浄し、無水Na2SO4で乾燥した。乾燥剤をろ過し、ろ液を減圧下に濃縮した。生成物を水に溶解させ、得られた溶液を液体窒素中で凍結してフリーズドライし、緑色粉末として化合物PR5-NHSを得たことを確認した。
　比較例1
　市販の蛍光色素であるCy5.5（GE Healthcare）を比較例1の蛍光色素とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　合成例4（キサントン化合物6）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　窒素雰囲気下、無水テトラヒドロフラン（THF; 10mL）中の化合物5（960mg, 2.20mmol）の溶液に、sec-ブチルリチウム（シクロヘキサン及びn-ヘキサン中の1.00M溶液, 5.10mL, 5.10mmol）を-78℃でゆっくりと添加し、得られた混合物を-78℃で1.5時間撹拌した。次いで、P,P-ジクロロフェニルホスフィン（0.33mL, 2.4mmol）をゆっくりと30分以上かけて添加し、混合物を一晩で室温まで昇温した。次いで、混合物を0℃まで冷却し、35%過酸化水素水（1mL）を添加した。得られた混合物を0℃で1時間撹拌し、水及びジクロロメタンで希釈した。層を分離し、水層をジクロロメタンで4回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、残渣を30mLのテトラヒドロフラン（THF）に溶解させた。NaOH粉末（264mg, 6.60mmol）及びテトラブチルアンモニウムブロミド（TBAB; 35mg, 0.11mmol）を添加し、空気雰囲気下、室温で、得られた懸濁液を4時間激しく撹拌した。混合物をロータリーエバポレーターで約10mLの体積まで濃縮した。次いで、混合物を水で希釈し、ジクロロメタン（DCM）で4回抽出し、ブラインで洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。溶媒を蒸発させた後、生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカ, DCM/アセトン 90/10 to 80/20）により精製した。溶媒を真空下に蒸発させ、キサントン化合物6を山吹色固体として得た（249mg, 0.601mmol, 27%）。
　　[数１０]
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.09 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 7.65-7.60 (m, 2H), 7.42-7.36 (m, 1H), 7.36-7.30 (m, 2H), 6.79 (d, J = 14.0 Hz, 2H), 3.52 (t, J = 8.6 Hz, 4H), 3.12-3.01 (m, 4H), 2.86 (s, 6H).
　実施例8：ホスファローダミン化合物PR6
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　窒素雰囲気下、無水テトラヒドロフラン（THF; 5mL）中の2-ブロモ-1,3-ジメトキシベンゼン（217mg, 1.00mmol）の溶液に、sec-ブチルリチウム（シクロヘキサン中の1.00M溶液, 1.10mL, 1.10mmol）を、-78℃でゆっくりと添加し、得られた混合物を同じ温度で1.5時間撹拌した。ここに、テトラヒドロフラン（THF; 10mL）中の合成例4で得たキサントン化合物6（83mg, 0.20mmol）の溶液を30分以上かけて滴下した。室温まで昇温し、室温で混合物を一晩撹拌した。次いで、ここに15mLの1M塩酸を添加し、撹拌を1時間継続した。得られた混合物を水で希釈し、ジエチルエーテルで2回洗浄した。水層をジクロロメタン（DCM）で4回抽出した。ジクロロメタン（DCM）層を合わせ、ブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。乾燥剤をろ過し、溶媒を減圧下に除去した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/メタノール 85/15）で精製した。溶媒を除去し、ホスファローダミン化合物PR6を深緑色固体として得た（18mg, 0.032mmol, 16%）。
　　[数１１]
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.80-7.86 (m, 2H), 7.56-7.61 (m, 2H), 7.54-7.48 (m, 2H), 7.31 (d, J = 14.8 Hz, 2H), 6.85-6.92 (m, 4H), 3.95-3.84 (m, 4H), 3.76 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 3.21 (s, 6H), 3.06-2.96 (m, 4H). HRMS (ESI) m/z calcd. for C33H32N2O3P (M+): 535.2145; found: 535.2128.
　試験例1：光物理特性
　PR1（実施例1）、PR2（実施例2）、PR4（実施例4）及びPR6（実施例8）の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを測定した。具体的には、吸収スペクトルは、PBSバッファー水溶液（pH7.4）に各化合物を10-6M溶解させた試料溶液を用いて、Shimadzu UV-3150 spectrometerにより、解像度0.2nmで測定した。また、蛍光スペクトルは、解像度1nmのHitachi F-4500 spectrometerで、PBSバッファー水溶液（pH7.4）に各化合物を10-6M溶解させた試料溶液を用いて測定した。絶対蛍光量子収率は、Hamamatsu photonics PMA-11で測定した。結果を図１及び表１に示す。図１において、破線が吸収スペクトル、実線が蛍光スペクトルである。この結果、PR1、PR2及びPR4は、類似した光物理特性を有していた。また、PR6のように、ホスファローダミン骨格のπ共役を拡張することによって、吸収極大波長及び蛍光極大波長を70～90nm程度長波長化することが可能であった。さらに、これら全ての化合物は水溶性である。このため、DMSOを共溶媒として添加することなく、測定試料を作製することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
　試験例2：蛍光のpH依存性の評価
　PR1（実施例1）、PR2（実施例2）及びPR4（実施例4）の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを、様々なpHのバッファー水溶液中で測定した。pH3～6の調整にはクエン酸/Na2HPO4バッファー水溶液を用い、pH7～8の調整にはNa2HPO4/NaH2PO4バッファー水溶液を用い、pH9～11の調整にはNa2CO3/NaHCO3バッファー水溶液を用いた。その他、吸収スペクトル及び蛍光スペクトルの測定方法は試験例1と同様に行った。
　様々なpHにおける各化合物の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを図２に示す。図２において、実線はpH4.17、破線はpH7.43、一点鎖線はpH10.30の結果である。この結果、立体的に保護されたPR2（実施例2）及びPR4（実施例4）については、吸収強度及び蛍光強度に対するpHの影響は無視できた。一方、PR1（実施例1）については、OH-アニオンによる9位の炭素原子への求核攻撃により、塩基性下での吸収強度及び蛍光強度は低減し、無色アルコールを形成した。
　次に、様々なpHにおけるPR1（実施例1）、PR2（実施例2）及びPR4（実施例4）の時間の経過に伴う吸収強度の安定性を図３及び表２に示す。図３及び表２において、安定性は、吸収強度の維持率（A/A0; 所定時間経過後の吸収強度と、初期吸収強度との比）により示している。図２において、実線はpH4.17、破線はpH7.43、一点鎖線はpH10.30の結果である。表２では、PR1（実施例1）及びPR2（実施例2）について、図３の結果から、十分（無限大）に時間が経過した際の吸収強度の維持率を示している。図３及び表２の結果から、実施例1のPR1を使用した場合は、アルカリ性領域では時間経過とともに吸収強度が低下したのに対し、実施例2のPR2及び実施例4のPR4を使用した場合は、いずれのpHにおいても時間経過による吸収強度の低下は著しく小さかった。
　さらに、pH10におけるPR1（実施例1）、PR2（実施例2）、PR3（実施例3）及びPR4（実施例4）の時間の経過に伴う吸収強度の安定性を図４に示す。図４において、安定性は、吸収強度の維持率（A/A0; 所定時間経過後の吸収強度と、初期吸収強度との比）により示している。なお、図４において、実線は実施例1のPR1、破線は実施例2のPR2、二点鎖線は実施例3のPR3、一点鎖線は実施例4のPR4の結果を示す。
　この結果、立体的に保護されたPR2（実施例2）、PR3（実施例3）及びPR4（実施例4）については、時間の経過による吸収強度の減少を低減することができた。一方、PR1（実施例1）については、時間経過により吸収強度は低減した。
　試験例3：ホスファローダミンNHSエステルと抗体との接合
　1mgのヤギ抗マウス抗体IgG（TCI, 1mg/vial, 防腐剤: 0.07% NaN3）を約0.5mLのPBSバッファー溶液（pH7.4）に溶解させ、さらに、PBSバッファー溶液（pH7.4）で希釈して全量を1.0mLとし、抗体溶液を得た。
　1mLのバイアルに、PR4-NHS（実施例6; 0.010～0.100mg, 8～40当量）又はPR5-NHS（実施例7; 0.010～0.100mg, 8～40当量）を水（30μL）に溶解させ、上記抗体溶液（500μL）で希釈した。次いで、27μLのカーボネートバッファー溶液（pH9.0, 1M NaOHでpH9.0に調整した0.2M重曹溶液）を添加してpHを8.0～8.5に上昇させ、バイアルを密封し、得られた溶液を手作業で混合した（やさしくシェイクした）。バイアルをアルミニウムホイウムで覆い、室温で1時間放置した。この間、数回やさしくシェイクした。次いで、得られた混合物を、溶離液としてPBSバッファー溶液（pH7.4）を用いたSephadex G-25カラム（Sephadexゲル約4g, 使用前にPBSバッファー溶液（pH7.4）30 mLで安定化させた）でろ過した。最初に色づけられたフラクション（非常に淡い緑色）を集め、約3～4mLの接合溶液を得、UV-Vis分光計及びPL量子収率分光計で測定した。標識化度（DOL）はThermoFisher Scientific社のAlexa Fluor（登録商標）488 Microscale Protein Labeling Kitのマニュアル（https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp30006.pdf）の「Determination of Degree of Labeling (DOL)」に記載の計算方法に準拠して、A280及びA494の代わりに、A280及びA710を用いて計算した。
　結果を図５に示す。図５では、絶対量子収率Φを、DOLに対してプロットした。この結果、DOLが約3.5の場合が最も明るいことが理解できる。
　試験例4：蛍光イメージング
　蛍光色素を接合した抗体の退色を以下のように評価した。測定用試料としては、PR4-NHS（実施例6; DOL3.5, 27μg）、PR5-NHS（実施例7; DOL3.1, 20μg）、Cy5.5（比較例1; DOL2.3, 30μg）により接合したヤギ抗マウス抗体IgGを使用した。300Wキセノンランプを使用し、フィルターを使用せず、385～750 nmの波長域で吸収強度を測定し、初期吸収強度が約0.1となるように調整した。各化合物の吸収強度及び蛍光強度について、時間経過にともなう維持率と、吸収スペクトル及び蛍光スペクトルとを図６に示す。図６の上図において、実線はPR4-NHS（実施例6; DOL3.5）、破線はPR5-NHS（実施例7; DOL3.1, 20μg）、一点鎖線はCy5.5（比較例1; DOL2.3）を使用した結果である。さらに、PR4-NHS（実施例6）、PR5-NHS（実施例7）及びCy5.5（比較例1）で標識したヤギ抗マウス抗体IgGを用いて10分間共焦点蛍光イメージングを行った結果を図７に示し、照射領域の平均蛍光強度を図８に示す。図８は細胞を染色した状態での蛍光強度の時間推移を評価した結果である。図８において、実線は（実施例6; DOL3.5, 27μg）、破線はPR5-NHS（実施例7; DOL3.1, 20μg）、一点鎖線はCy5.5（比較例1; DOL2.3, 30μg）を用いた結果である。この結果、細胞を染色した状態においても、本発明のホスファローダミン化合物は、従来の蛍光色素であるCy5.5と比較して、長時間にわたって抗体を蛍光させることができた。
　試験例5：植物イメージング
　PR5-NHSで標識したオリゴアルギニン（8量体）を用いて、ヒメツリガネゴケ（学名：Physcomitrella patens)の原糸体の蛍光イメージングを行った。
　オリゴアルギニンとPR5-NHSの接合を以下のように実施した。担持樹脂として2-クロロトリチルポリスチレンを用いた一般的なFmoc（9-フルオレニルメトキシカルボニル）固相合成法により、8個のアルギニンが連結したオリゴアルギニン（8量体）のペプチド延伸反応を行った。なお、脱Fmoc化はピペリジンのDMF溶液を用い、保護アミノ酸にはFmoc-Arg(Pbf)-OH（N-α-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-N-ω-(2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル)-L-アルギニン）を用い、縮合剤としてHCTU（O-(6-クロロ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）を用いた。オリゴアルギニン（8量体）に対して2等量のPR5-NHSのDMF溶液を室温で1時間作用させることで末端アミノ基を蛍光標識し、引き続く樹脂からの切り出しと脱保護を過剰のトリフルオロ酢酸存在を作用させて実施した。粗生成物を逆相HPLC（固定相：Phenomenex Jupiter C18；移動相：0.1% TFA（トリフルオロ酢酸）を含むアセトニトリルと水の混合溶媒）を用いて精製し、得られたフラクションを凍結乾燥することでPR5-NHSで標識したオリゴアルギニン（8量体）を得た。
　蛍光イメージングには、蛍光顕微鏡IX-71（Olympus）を使用し汎用の水銀ランプで励起した。蛍光フィルターは励起フィルター、ダイクロイックフィルター、バリアフィルターの順に、PR5-NHS用にはFF01-710/13、FF740-dio1、FF01-785/62（Semrock）を用い、葉緑体内のクロロフィル用にはG365、FT396、LP420（Olympus）を用いた。
　結果を図９に示す。画像(a)において観察されるのがPR5-NHSのシグナルであり、画像(b)において粒状に観察されるのが葉緑体内のクロロフィルのシグナルであり、画像(c)は(a)及び(b)の重ね合わせ画像である。画像(a)においてクロロフィルのシグナルが検出されていないことから、本蛍光色素を用いることで、クロロフィルの存在下であっても蛍光色素由来のシグナルのみを特異的に検出できることが示された。

Claims (10)

  1. 一般式（1）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、R1～R4は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、又は置換若しくは非置換（ヘテロ）アリール基を示す。R5は置換若しくは非置換アリール基を示す。R6及びR7は水素原子を示す。R1とR6、及び／又はR3とR7は、互いに結合して置換若しくは非置換アルキレン基を構成してもよい。R8は置換若しくは非置換アリール基を示す。Xは対イオンを示す。］
    で表されるホスファローダミン化合物又はその塩。
  2. 前記R6及びR7がいずれも水素原子である、請求項１に記載のホスファローダミン化合物又はその塩。
  3. 前記R6が、一般式（2）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、R9及びR10は同一又は異なって、水素原子、置換若しくは非置換アルキル基、又は置換若しくは非置換アルコキシ基を示す。R11は水素原子又は反応性基を示す。］
    で表される、請求項１又は２に記載のホスファローダミン化合物又はその塩。
  4. 前記R9及びR10がいずれも置換若しくは非置換アルキル基、又は置換若しくは非置換アルコキシ基である、請求項３に記載のホスファローダミン化合物又はその塩。
  5. 前記R11が、アミン反応性基又はチオール反応性基である、請求項３又は４に記載のホスファローダミン化合物又はその塩。
  6. 前記アミン反応性基又はチオール反応性基が、一般式（3A）～（3E）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、R12は水素原子又はスルホ基を示す。R13は置換若しくは非置換アルキル基を示す。実線と破線で示される結合は、単結合又は二重結合である。］
    で表される構造を末端に有する基である、請求項５に記載のホスファローダミン化合物又はその塩。
  7. 請求項１～６のいずれかに記載のホスファローダミン化合物又はその塩からなる蛍光色素。
  8. 請求項５又は６に記載のホスファローダミン化合物又はその塩を用いたタンパク質標識剤。
  9. 請求項８に記載のタンパク質標識剤を含有する、タンパク質標識化キット。
  10. 請求項８に記載のタンパク質標識剤と、タンパク質とを反応させる工程
    を備える、タンパク質標識化方法。
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