JP6754970B2 - 超解像蛍光イメージング用プローブ - Google Patents
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Description
(1)以下の式(I)で表される化合物
〔式中、
Xは、酸素原子又はC(Ra)(Rb)又はSi(Ra)(Rb)を表し(ここで、Ra及びRbは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表す);
R1は、水素原子又は置換されていてもよいアリールを表し(ただし、R1がフェニル基の場合、当該フェニル基のベンゼン環における2位又は6位の位置に置換基を有しない);
R2及びR3は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、スルホ基、カルボキシル基、エステル基、アミド基及びアジド基よりなる群から独立に選択される1〜3個の同一又は異なる置換基を表し;
R4及びR5は、それぞれ独立に水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を表し、又は、N(R4)(R5)がアミド基もしくはカルバメート基を形成する(ここで、R4又はR5がアルキル基である場合、それぞれR2と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい);及び、
R6及びR7は、それぞれ独立に水素原子もしくは置換されていてもよいアルキル基を表し、又は、N(R6)(R7)がアミド基もしくはカルバメート基を形成する(ここで、R6又はR7がアルキル基である場合、それぞれR3と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい。)
又はその塩を含む超解像蛍光イメージング用プローブであって、
式(I)で表される化合物又はその塩が、−SH基を含有する求核性化合物との間で求核付加−解離平衡反応を行うことを特徴とする、
該超解像蛍光イメージング用プローブ;
(2)前記求核付加−解離平衡反応が、R1が結合する炭素原子において行われる、上記(1)に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ;
(3)前記求核付加−解離平衡反応における解離定数が、0.1μM〜10mMの範囲内であることを特徴とする、上記(1)又は(2)に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ;
(4)前記求核付加−解離平衡反応における求核付加反応速度定数が、中性条件の水系溶液中において、1〜1.0x106s−1であることを特徴とする、上記(1)〜(3)のいずれか1に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ;
(5)Xが、C(Ra)(Rb)又はSi(Ra)(Rb)である、上記(1)〜(4)のいずれか1に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ;
(6)Ra及びRbが、いずれもメチル基である、上記(5)に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ;
(7)R1は、水素原子又は置換されていてもよいフェニル基である(ただし、当該フェニル基のベンゼン環における2位又は6位の位置に置換基を有しない)、上記(1)〜(6)のいずれか1に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ;
(8)R4、R5、R6及びR7が、いずれも水素原子である、上記(1)〜(7)のいずれか1に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ;
(9)R4、R5、R6及びR7が、いずれもメチル基である、上記(1)〜(7)のいずれか1に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ;
(10)R4、R5、R6及びR7のうち少なくとも1つが、生体分子と共有結合又は非共有結合によって結合し得るラベル化置換基を含む、上記(1)〜(7)のいずれか1に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ;
(11)前記−SH基を含有する化合物が、システイン残基を有する化合物である、上記(1)〜(10)のいずれか1に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ;
(12)前記−SH基を含有する化合物が、グルタチオンである、上記(1)〜(10)のいずれか1に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ;及び
(13)式(I)で表される化合物が以下の群から選択される化合物である、上記(1)に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ
を提供するものである。
(14)上記(1)〜(13)のいずれか1に記載の超解像蛍光イメージング用プローブを用いる超解像蛍光イメージング方法であって、
生体分子にプローブ分子を結合させ、−SH基を含有する化合物の存在下でレーザー光を照射して前記プローブ分子からの蛍光発光を撮影した画像データを取得し、一定の時間間隔でこれを繰り返して得られた複数の前記画像データを解析したうえで重ね合わせることによって、前記生体分子の構造に対する超高解像のイメージ画像を得ることを含む、該方法
を提供するものである。
本明細書中において、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を意味する。
本発明の超解像蛍光イメージング用プローブは、一態様において、以下の一般式(I)で表される構造を有する化合物を含むものである。
を挙げることができる。ただし、これらに限定されるものではない。また、当該化合物は、任意の位置にラベル化置換基を有することができる。
本発明の超解像蛍光イメージング方法は、生体分子に上記で説明した式(I)のプローブ分子を接触させ、−SH基を含有する化合物の存在下で、これにレーザー光を照射して前記プローブ分子からの蛍光発光を撮影したCCDカメラ等によって画像データを取得し、一定の時間間隔でこれを繰り返して得られた複数の前記画像データを解析したうえで重ね合わせることによって、前記生体分子の構造に対する超高解像のイメージ画像を得ることを含むものである。観測対象となる生体分子としては、細胞膜(脂質)、タンパク質、DNA、RNA等が挙げられる。
以下に示すとおり、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物2、5、12、14、16、17、28、32、33、34、及び35をそれぞれ合成した。
以下のスキームに従って化合物2を合成した。なお、化合物1はKushida K et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (2012) 3908-3911に開示されており、これに基づいて合成を行なった。
以下のスキームに従って化合物4を合成した。なお、化合物3及び化合物4の合成については、Y. Koide et al., J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 5029-5031.に開示されており、これに基づいて合成を行なった。
化合物3(1.80 g, 4.37 mmol, 1 eq.)をTHF(100 ml)に溶かし、アルゴン雰囲気下、−78 °Cで15分間撹拌した。1.1 M sec-ブチルリチウム シクロヘキサン/n-ヘキサン溶液(9 ml, 9.9 mmol, 2.3 eq.)を15分間かけてゆっくり加えた。次いでジクロロジメチルシラン(700 μl, 5.75 mmol, 1.3 eq.)をTHF(5 ml)に希釈して加えて徐々に室温に戻し、2時間撹拌した。1 N 塩酸を加えて酸性にし、次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、THFを減圧除去した。得られた水層を酢酸エチルで抽出し、次いで有機相を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し(溶離液:ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 95/5 to 80/20)、目的化合物4 (852 mg, 63%)を薄黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.28 (s, 3H) , 2.96 (s, 12H), 3.98 (s, 2H), 6.76 (dd, J = 8.4, 2.8 Hz, 2H), 7.02 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 7.21 (d, J = 8.4 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ -2.6, 39.3, 41.3, 114.2, 117.7, 128.6, 135.3, 136.2, 148.8.
以下のスキームに従って化合物5を合成した。
化合物4(36.5 mg, 0.115 mmol, 1 eq.)をクロラニル(27 mg, 0.115 mmol, 1 eq.)を加えて室温にて10分撹拌し、濃青色の反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液:ジクロロメタン/メタノール = 100/0 to 80/20)にて分離し、青色のフラクションを回収して溶媒を減圧留去し、さらにHPLCで精製し(溶離液A(H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸)、溶離液B(アセトニトリル, 1 % H2O)(A/B = 90/10 to 10/90, 25 min)、目的化合物5 (53.6 mg, 96%)を青色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3CN): δ 0.50 (s, 6H), 3.30 (s, 12H), 6.89 (dd, J = 9.2, 2.7 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 2.7 Hz, 2H), 7.64 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.80 (s, 1H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 309.17815, Found, 309.17801 (-0.1 mmu).
以下のスキームに従って化合物6を合成した。
炭酸カリウム(7.46 g, 54.0 mmol, 2.0 eq.)をアセトニトリル(20 ml)に懸濁させ、3-ブロモ-N-メチルアニリン(4.96 g, 26.7 mmol, 1 eq.)及び臭化アリル(3.87 g, 31.3 mmol, 1.2 eq.)を加え、撹拌しながら90 °Cで終夜加熱還流した。反応混合物をセライトで濾過した後、濾物及びセライトを酢酸エチルで洗浄し、濾液及び洗浄液の混合液から溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し(溶離液:ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 100/0 to 98/2)、目的化合物6 (5.98 g, 99 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 2.95 (s, 3H), 3.91-3.93 (m, 2H), 5.15-5.21 (m, 2H), 5.79-5.89 (m, 1H), 6.63-6.65 (m, 1H), 6.82-6.86 (m, 2H), 7.06-7.10 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 38.1, 55.0, 110.9, 115.0, 116.4, 119.1, 123.5, 130.4, 133.1, 150.7; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 226.02259, Found, 226.02210 (-0.5 mmu).
以下のスキームに従って化合物7を合成した。
化合物6(4.60 g, 20.4 mmol, 1 eq.)及び3-ブロモ-N,N-ジメチルアニリン(5.00 g, 25.0 mmol, 1.2 eq.)を酢酸(10 ml)に溶かし、37 % ホルムアルデヒド水溶液(6.30 ml, 227 mmol, 11 eq.)を加え、80 °Cまで徐々に昇温させた後、3時間加熱した。反応混合液から酢酸を減圧除去し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機相を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し(溶離液:ノルマルヘキサン/ジクロロメタン = 80/20 to 70/30 to 60/40 to 50/50)、目的化合物7を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 2.92 (s, 3H), 2.93 (s, 6H), 3.88-3.90 (m, 2H), 4.02 (s, 2H), 5.15-5.20 (m, 2H), 5.83 (ddt, 1H, J = 14.8, 12.6, 4.9 Hz), 6.57-6.62 (m, 2H), 6.85 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 6.88 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 6.95 (d, 1H, J = 2.7 Hz), 6.96 (d, 1H, J = 2.6 Hz); 13C NMR (100 MHz, THF-d8): δ 38.2, 40.5, 40.6, 55.7, 112.6, 112.7, 116.3, 116.7, 116.8, 126.16, 126.17, 127.6, 127.7, 131.5, 131.6, 134.7, 150.1, 151.2; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 437.02225, Found, 437.02225 (±0.0 mmu).
以下のスキームに従って化合物8を合成した。
化合物7(900 mg, 2.05mmol, 1 eq.)をTHF(60 ml)に溶かし、アルゴン雰囲気下、−78 °Cで15分間撹拌した。1 M sec-ブチルリチウム シクロヘキサン/n-ヘキサン溶液(6.50 ml, 6.50 mmol, 3.2 eq.)を8分間かけてゆっくり加え、22分間撹拌した。次いでジクロロジメチルシラン(500 μl, 4.18 mmol, 2.0 eq.)のTHF(13 ml)溶液を加えて徐々に室温に戻し、3時間撹拌した。2 N 塩酸を加えて酸性にし、次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、THFを減圧除去した。得られた水層をジクロロメタンで抽出し、次いで有機相を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し(溶離液:ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 100/0 to 94/6)、目的化合物8 (382 mg, 55 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.44 (s, 6H), 2.927-2.93 (m, 9H), 3.90-3.91 (m, 2H), 3.95 (s, 2H), 5.12-5.20 (m, 2H), 5.85 (ddt, 1H, J = 17.2, 10.2, 5.2 Hz), 6.69-6.74 (m, 2H), 6.97 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 6.99 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 7.15-7.19 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ -2.7, 38.3, 39.2, 41.2, 55.9, 114.0, 114.2, 116.4, 117.4, 117.6, 128.56, 128.58, 134.3, 134.9, 135.3, 136.09, 136.13, 147.5, 148.8; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 337.20945, Found, 337.20957 (+0.1 mmu).
以下のスキームに従って化合物9を合成した。
化合物8 (382 mg, 1.13 mmol, 1 eq.)を脱酸素したジクロロメタン(14 ml)に溶かし、1,3-ジメチルバルビツール酸(1.48 g, 9.48 mmol, 8.4 eq.)及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(274 mg, 237 μmol, 0.2 eq.)を加え、室温にて終夜撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し(溶離液:ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 91/9 to 70/30)、目的化合物9 (289 mg, 86 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.44 (s, 6H), 2.85 (s, 3H), 2.93 (s, 6H), 3.94 (s, 2H), 6.58 (dd, 1H, J = 8.1, 2.6 Hz), 6.73 (dd, 1H, J = 8.4, 2.8 Hz), 6.85 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 6.99 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 7.14 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.18 (d, 1H, J = 8.4 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ -2.7, 31.2, 39.4, 41.3, 113.3, 114.3, 117.4, 117.7, 128.6, 128.7, 135.4, 135.7, 136.1, 136.4, 147.1, 148.8; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 297.17815, Found, 297.17853 (+0.4 mmu).
以下のスキームに従って化合物11を合成した。なお、化合物10の合成については、J. Le Notre et al., Adv. Synth. Catal. 349, 432 (2007).に開示されており、これに基づいて合成を行なった。
化合物9(102.8 mg, 0.347 mmol, 1 eq.)及び化合物10(756.9 mg, 2.94 mmol, 8.5 eq.)をアセトニトリル(4 ml)に溶かし、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(512 μl, 2.94 mmol, 8.5 eq.)及び少量のヨウ化カリウムを加え、80 °Cで5.5時間加熱還流した。水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機相を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し(溶離液:ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 86/14 to 65/35)、目的化合物11 (91.7 mg, 56 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.45 (s, 6H), 1.93 (quin, 2H, J = 7.2 Hz), 2.41 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 2.90 (s, 3H), 2.94 (s, 6H), 3.34 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 3.95 (s, 2H), 5.10 (s, 2H), 6.68 (dd, 1H, J = 8.4, 2.8 Hz), 6.74 (dd, 1H, J = 8.4, 2.8 Hz), 6.95 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 6.99 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 7.15 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.18 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.31-7.36 (m, 5H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ -2.7, 22.4, 31.8, 38.6, 39.2, 41.2, 52.4, 66.4, 113.8, 114.2, 117.2, 117.3, 117.7, 128.3, 128.4, 128.5, 128.65, 128.67, 134.8, 136.0, 136.1, 136.2, 147.3, 148.8, 173.2; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 473.26188, Found, 473.26185 (-0.0 mmu).
以下のスキームに従って化合物12を合成した。
化合物11(171 mg, 0.361 mmol, 1 eq.)をメタノールに溶かし、パラジウム炭素を加え、水素雰囲気下、室温で2日間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液から溶媒を減圧除去した。得られた残渣をジクロロメタンに溶かし、2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-p-ベンゾキノン(180.3 mg, 0.794 mmol, 2.2 eq.)を加え、室温で終夜撹拌した。水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機相を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をHPLCで精製し(溶離液A(H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸)、溶離液B(アセトニトリル, 1 % H2O)(A/B = 90/10 to 0/100 40 min))、目的化合物12 (110 mg, 61 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.54 (s, 6H), 1.95-2.02 (m, 2H), 2.45 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 3.34 (s, 3H), 3.37 (s, 6H), 3.73-3.77 (m, 2H), 6.98 (dd, 1H, J = 9.2, 2.7 Hz), 7.02 (dd, 1H, J = 9.1, 2.6 Hz), 7.33 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 7.51 (m, 1H), 7.71-7.73 (m, 2H, g), 7.87 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3CN): δ -1.3, 23.0, 31.1, 39.8, 41.4, 53.1, 115.06, 115.12, 122.3, 122.4, 128.25, 128.31, 144.0, 144.1, 148.42, 148.44, 155.68, 156.17, 160.6, 174.8; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 381.19928, Found, 381.19929 (+0.0 mmu).
以下のスキームに従って化合物14を合成した。なお、化合物13の合成については、Nat.Biotech.,2003, 21,86−89に開示されており、これに基づいて合成を行なった。
化合物12(9.40 mg, 0.0190 mmol, 1 eq.)を脱水N,N-ジメチルホルムアミドに溶かし、化合物13(7.5 mg, 0.0277 mmol, 1.5 eq.)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(9.1 mg, 0.0594 mmol, 3.1 eq.)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(6.6 mg. 0.0344 mmol, 1.8 eq.)、及びトリエチルアミン(10 μl, 0.0717 mmol, 3.8 eq.)を加え、アルゴン雰囲気下、室温で21時間撹拌した後、化合物13(2.3 mg, 0.00850 mmol, 0.45 eq.)を加え、さらに24時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をHPLCで精製し(溶離液A(H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸)、溶離液B(アセトニトリル, 1 % H2O)(A/B = 90/10 to 0/100 40 min))、目的化合物14 (7.5 mg, 53 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.52 (s, 6H), 1.99-2.06 (m, 2H), 2.38 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 3.33 (s, 3H), 3.37 (s, 6H), 3.70-3.74 (m, 2H), 4.41 (s, 2H), 5.63 (s, 2H), 6.96-7.00 (m, 2H), 7.31 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 7.35 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.41 (br s, 1H), 7.52 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.68-7.72 (m, 2H), 7.86 (s, 1H), 8.33 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ -1.4, 24.0, 33.1, 39.5, 41.0, 43.8, 53.4, 70.8, 108.2, 115.3, 122.3, 122.4, 128.86, 128.95, 128.98, 130.2, 135.4, 141.0, 143.5, 144.5, 144.6, 149.0, 149.1, 153.7, 156.2, 156.8, 158.3, 161.09, 161.11, 161.7, 174.6; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 633.31163, Found, 633.31169 (+0.1 mmu).
以下のスキームに従って化合物16を合成した。なお、化合物15の合成については、J.Am.Chem.Soc.2013,135,6184−6191に開示されており、これに基づいて合成を行なった。
化合物12(11.3 mg, 0.0228 mmol, 1 eq.)を脱水N,N-ジメチルホルムアミド(1.5 ml)に溶かし、化合物15(9.1 mg, 0.0407 mmol, 1.8 eq.)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(6.1 mg, 0.0451 mmol, 2.0 eq.)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(7.2 mg. 0.0375 mmol, 1.6 eq.)、及びトリエチルアミン(14.3 μl, 0.103 mmol, 4.5 eq.)を0 °Cで加え、アルゴン雰囲気下で徐々に室温に戻し、終夜撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をHPLCで精製し(溶離液A(H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸)、溶離液B(アセトニトリル, 1 % H2O)(A/B = 90/10 to 0/100 40 min))、目的化合物16 (9.21 mg, 58 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.55 (s, 6H), 1.32-1.44 (m, 4H), 1.55 (quin, 2H, J = 7.0 Hz), 1.72 (quin, 2H, J = 7.0 Hz), 1.98-2.05 (m, 2H), 2.33 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 3.34 (s, 3H), 3.38 (s, 6H), 3.44 (t, 2H, J = 6.6 Hz), 3.50-3.60 (m, 10H), 3.73 (t, 2H, J = 7.7 Hz), 6.98-7.03 (m, 2H), 7.33 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 7.41 (br s, 1H), 7.71-7.73 (m, 2H), 7.88 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ -1.4, 24.0, 26.5, 27.7, 30.5, 33.2, 33.7, 39.6, 40.4, 41.0, 45.7, 53.4, 70.5, 71.21, 71.24, 72.2, 115.26, 115.29, 122.3, 122.4, 128.97, 129.00, 144.57, 144.60, 149.0, 149.1, 156.2, 156.8, 161.1, 174.8; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 586.32262, Found, 586.32267 (+0.0 mmu).
以下のスキームに従って化合物17を合成した。
化合物12(7.0 mg, 0.0142 mmol, 1 eq.)を脱水N,N-ジメチルホルムアミド(5 ml)に溶かし、N-ヒドロキシコハク酸イミド(8.7 mg, 0.0756 mmol, 5.3 eq.)及び1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(6.1 mg. 0.0318 mmol, 2.2 eq.)を加え、アルゴン雰囲気下、室温で33時間撹拌した後、N-ヒドロキシコハク酸イミド(9.8 mg, 0.0852 mmol, 6.0 eq.)及び1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(11.1 mg. 0.0579 mmol, 4.1 eq.)を加え、さらに43時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をHPLCで精製し(溶離液A(H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸)、溶離液B(アセトニトリル, 1 % H2O)(A/B = 90/10 to 0/100 40 min))、目的化合物17 (1.7 mg, 20 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.53 (s, 6H), 2.10-2.17 (m, 2H), 2.82 (t, 2H, J = 6.6 Hz), 2.87 (s, 4H), 3.36 (s, 3H), 3.38 (s, 6H), 3.80-3.84 (m, 2H), 6.98-7.04 (m, 2H), 7.34 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 7.38 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.71-7.74 (m, 2H), 7.89 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ -1.5, 23.2, 26.5, 28.7, 39.5, 41.1, 52.6, 115.3, 115.4, 122.1, 122.4, 129.0, 129.1, 144.6, 144.8, 148.9, 149.4, 156.1, 156.9, 161.4, 170.2, 171.8; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 478.21566, Found, 478.21559 (-0.1 mmu).
以下のスキームに従って化合物19を合成した。
炭酸カリウム(11.96 g, 86.54 mmol, 2.5 eq.)をアセトニトリル(40 ml)に懸濁させ、3-ブロモアニリン(5.96 g, 34.65 mmol, 1 eq.)及び臭化アリル(21.89 g, 180.9 mmol, 5.2 eq.)を加え、撹拌しながら80 °Cで26時間加熱還流した。室温に戻した後、反応混合物をセライトで濾過し、濾物及びセライトを酢酸エチルで洗浄し、濾液及び洗浄液の混合液から溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し(溶離液:ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 100/0 to 89/11)、目的化合物19(5.68 g, 22.5 mmol, 65 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.93-3.95 (m, 4H), 5.20-5.25 (m, 4H), 5.83-5.93 (m, 2H), 6.64-6.67 (m, 1H), 6.84-6.89 (m, 2H), 7.06-7.10 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 52.7, 110.9, 115.0, 116.3, 119.1, 123.4, 130.3, 133.3, 149.9; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 252.03824, Found, 252.03819 (-0.1 mmu).
以下のスキームに従って化合物21を合成した。
アルゴンガスを封入したフラスコ内で化合物20(1.57 g, 6.22 mmol, 1 eq.)をトルエン(10 ml)に溶かし、N,N-ジメチルホルムアミド(700 μl, 9.04 mmol, 1.5 eq.)及び塩化ホスホリル(700 μl, 7.51 mmol, 1.2 eq.)を加え、80 °Cで3.5時間撹拌した。室温に戻した後、2N水酸化ナトリウム水溶液を加え、混合溶液からトルエンを減圧除去した。得られた水層をジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をメタノールに溶かし、0 °C下で水素化ホウ素ナトリウム(376.5 mg, 9.95 mmol, 1.6 eq.)を加え、10分間撹拌した。水を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し(溶離液:ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 83/17 to 62/38)、目的化合物21(740 mg, 2.62 mmol, 42 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.89-3.90 (m, 4H), 4.59 (s, 2H), 5.13-5.19 (m, 4H), 5.82 (ddt, 2H, J = 17.0, 10.5, 4.8 Hz), 6.60 (dd, 1H, J = 8.5, 2.6 Hz), 6.86 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 7.20 (d, 1H, J = 8.5 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 52.7, 64.8, 111.4, 115.9, 116.4, 124.3, 127.1, 130.3, 133.2, 149.3; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 304.03075, Found, 304.03081 (+0.1 mmu).
以下のスキームに従って化合物23を合成した。
炭酸カリウム(9.53 g, 68.97 mmol, 2.1 eq.)をアセトニトリル(30 ml)に懸濁させ、アニリン(3.07 g, 32.96 mmol, 1 eq.)及び臭化アリル(10.28 g, 85.01 mmol, 2.6 eq.)を加え、撹拌しながら80 °Cで5時間加熱還流した。臭化アリル(2.58 g, 21.29 mmol, 0.6 eq.)を追加した後、80 °Cでさらに13時間撹拌及び加熱還流した。室温に戻した後、反応混合物をセライトで濾過し、濾物及びセライトを酢酸エチルで洗浄し、濾液及び洗浄液の混合液から溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し(溶離液:ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 100/0 to 97/3)、目的化合物23(5.35 g, 30.9 mmol, 94 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.86-3.88 (m, 4H), 5.10-5.18 (m, 4H), 5.82 (ddt, 2H, J = 17.2, 10.3, 4.9 Hz), 6.64-6.68 (m, 3H), 7.14-7.19 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 52.8, 112.4, 116.0, 116.4, 129.1, 134.1, 148.7; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 174.12773, Found, 174.12867 (+0.9 mmu).
以下のスキームに従って化合物25を合成した。
化合物21(386.0 mg, 1.368 mmol, 1.1 eq.)及び化合物23(218.8 mg, 1.263 mmol, 1 eq.)を脱水ジクロロメタン(10 ml)に溶かし、0 °C下で三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体(500 μl, 4.051 mmol, 3.2 eq.)を少しずつ加え、10分間撹拌した後、室温に戻してさらに3時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し(溶離液:ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 100/0 to 88/12)、目的化合物25(395.2 mg, 0.903 mmol, 72 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.90-3.94 (m, 10H), 5.17-5.25 (m, 8H), 5.82-5.94 (m, 4H), 6.60 (dd, 1H, J = 8.6, 2.7 Hz), 6.67-6.70 (m, 2H), 6.93 (d, 1H, J = 2.7 Hz), 6.98 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.08 (d, 2H, J = 8.6 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 39.7, 52.9, 53.0, 111.9, 112.6, 116.06, 116.12, 116.3, 125.5, 128.4, 128.6, 129.6, 131.1, 133.7, 134.4, 147.2, 148.1; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 437.15869, Found, 437.15873 (+0.0 mmu).
以下のスキームに従って化合物26を合成した。
アルゴンを封入したフラスコ内で化合物25(208.5 mg, 0.477 mmol, 1 eq.)を脱水テトラヒドロフラン(15 ml)に溶かし、撹拌しながら-78 °Cに冷却した。1 M sec-ブチルリチウム シクロヘキサン/ノルマルヘキサン溶液(1.0 ml, 1.0 mmol, 2.1 eq.)を少しずつ加え、10分間撹拌した。次いで脱水アセトン(210 μl, 2.85 mmol, 6.0 eq.)を少しずつ加え、-78 °Cのまま15分間撹拌した後、室温に戻し、さらに5時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えた後、テトラヒドロフランを減圧除去した。得られた水相をジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し(溶離液:ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 89/11 to 68/32)、目的化合物26(125.8 mg, 0.302 mmol, 63 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.61 (s, 6H), 1.77 (s, 1H), 3.87-3.89 (m, 4H), 3.91-3.92 (m, 4H), 4.17 (s, 2H), 5.12-5.23 (m, 8H), 5.80-5.92 (m, 4H), 6.57 (dd, 1H, J = 8.5, 2.7 Hz), 6.62 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 6.83 (d, 1H, J = 2.7 Hz), 6.94-6.98 (m, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 31.9, 38.0, 53.0, 53.2, 74.3, 110.3, 111.4, 112.7, 116.1, 116.2, 126.5, 129.4, 130.9, 134.0, 134.5, 134.6, 146.6, 146.9, 147.0; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 417.29004, Found, 417.29000 (-0.0 mmu).
以下のスキームに従って化合物27を合成した。
0 °C下で化合物26(188.5 mg, 0.452 mmol, 1 eq.)に80 %硫酸を加え、30分間撹拌した後、室温に戻し、さらに30分間激しく撹拌した。水を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和水酸化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去し、目的化合物(177.2 mg, 0.445 mmol, 98 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.49 (s, 6H), 3.80 (s, 2H), 3.91-3.93 (m, 8H), 5.12-5.21 (m, 8H), 5.89 (ddt, 4H, J = 17.2, 10.3, 5.0 Hz), 6.57 (dd, 2H, J = 8.3, 2.6 Hz), 6.90 (d, 2H, J = 2.6 Hz), 7.02 (d, 2H, J = 8.3 Hz); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 29.4, 34.6, 40.6, 54.6, 110.7, 112.2, 116.3, 126.0, 129.1, 136.1, 146.7, 148.8; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 399.27948, Found, 399.27955 (+0.1 mmu).
以下のスキームに従って化合物28を合成した。
1,3-ジメチルバルビツール酸(60.55 mg, 0.388 mmol, 27 eq.)及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(7.8 mg, 0.00675 mmol, 0.47 eq.)を入れたフラスコにアルゴンを封入し、脱酸素したジクロロメタン(7 ml)に溶かした化合物27(5.7 mg, 0.0143 mmol, 1 eq.)を加え、室温で終夜撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をジクロロメタンに溶かし、p-クロラニル(20.0 mg, 0.0813 mmol, 5.7 eq.)を加え、室温で1時間撹拌した。水を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をHPLCで精製し(溶離液A(H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸)、溶離液B(アセトニトリル, 1 % H2O)(A/B = 90/10 to 0/100 40 min))、目的化合物28(2.1 mg, 0.00599 mmol, 42 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.63 (s, 6H), 6.77 (dd, 2H, J = 8.7, 2.0 Hz), 7.08 (dd, 2H, J = 2.0, 0.8 Hz), 7.63 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 8.06 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 33.5, 42.6, 114.1, 116.0, 122.1, 141.6, 156.2, 159.5, 161.4; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 237.13862, Found, 237.13854 (-0.1 mmu).
以下のスキームに従って化合物29を合成した。
1,3-ジメチルバルビツール酸(2.99 g, 19.14 mmol, 25 eq.)及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(181.0 mg, 0.157 mmol, 0.2 eq.)を入れたフラスコにアルゴンを封入し、脱酸素したジクロロメタン(15 ml)に溶かした化合物27(307.0 mg, 0.770 mmol, 1 eq.)を加え、室温で4時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をHPLCで精製し(溶離液A(H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸)、溶離液B(アセトニトリル, 1 % H2O)(A/B = 90/10 to 0/100 40 min))、目的化合物29(157.0 mg, 0.65 mmol, 86 %)を得た。
以下のスキームに従って化合物31を合成した。
4-ブロモ酪酸(2.57 g, 15.39 mmol, 1 eq.)をジクロロメタン(20 ml)に溶かし、硫酸マグネシウム(7.74 g, 64.30 mmol, 4.2 eq.)、tert-ブチルアルコール(5.70 g, 76.95 mmol, 5 eq.)、及び濃硫酸(0.25 ml)を加え、室温で2日間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し(溶離液:ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 50/50)、目的化合物31(1.17 g, 5.24 mmol, 47 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.27 (s, 9H), 1.91-1.98 (m, 2H), 2.22 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 3.27 (t, 2H, J = 6.5 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 27.9, 28.0, 32.8, 33.7, 80.5, 171.7.
以下のスキームに従って化合物32を合成した。
化合物29(31.0 mg, 0.130 mmol, 1 eq.)をアセトニトリル(2 ml)に溶かし、化合物31(22.3 mg, 0.100 mmol, 0.8 eq.)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン (113.3μl, 0.650 mmol, 5 eq.)、及び少量のヨウ化カリウムを加え、60 °Cで21時間撹拌した後、80 °Cでさらに7時間撹拌した。室温に戻した後、水を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をジクロロメタン(10 ml)に溶かし、トリフルオロ酢酸(2 ml)を加え、室温で2時間撹拌した後、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をジクロロメタン(5 ml)及びメタノール(2 ml)に溶かし、p-クロラニル(34.1 mg, 0.139 mmol, 1.1 eq.)を加え、室温で30分間撹拌した後、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をHPLCで精製し(溶離液A(H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸)、溶離液B(アセトニトリル, 1 % H2O)(A/B = 90/10 to 0/100 40 min))、目的化合物29(11.7 mg, 0.0268 mmol, 21 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.65 (s, 6H), 1.94-2.01 (m, 2H), 2.46 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 3.50 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 6.77 (dd, 1H, J = 2.0, 8.7 Hz), 6.84 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 7.09 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.15 (br s, 1H), 7.61-7.66 (m, 2H), 8.05 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 25.2, 31.7,33.6, 43.5, 114.1, 116.0, 122.2, 122.4, 141.4, 155.9, 159.6, 161.2, 176.6; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 323.17540, Found, 323.17538 (-0.0 mmu).
以下のスキームに従って化合物33を合成した。
化合物32(1.1 mg, 0.00252 mmol, 1 eq.)をN,N-ジメチルホルムアミド(2 ml)に溶かし、0 °C下で3-アジドプロピルアミン(0.74 μl, 0.00756 mmol, 3 eq.)、 N,N-ジイソプロピルアミン(8.8 μl, 0.0504 mmol, 20 eq.)、及び O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩(5.9 mg, 0.0155 mmol, 6.1 eq.)を加え、15分間撹拌した後、室温に戻してさらに13時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をHPLCで精製し(溶離液A(H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸)、溶離液B(アセトニトリル, 1 % H2O)(A/B = 90/10 to 0/100 40 min))、目的化合物33(1.0 mg, 0.00193 mmol, 77 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.66 (s, 6H), 1.76 (qui, 2H, J = 6.7 Hz), 1.99 (qui, 2H, J = 7.2 Hz), 2.35 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 3.27 (t, 2H, J = 6.7 Hz), 3.35 (t, 2H, J = 6.7 Hz), 3.48 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 6.77 (dd, 1H, J = 2.1, 8.7 Hz), 6.83 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.09-7.11 (m, 2H), 7.11 (brs, 1H), 7.62-7.67 (m, 2H), 8.06 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 25.9, 29.7, 33.6, 33.8, 37.8, 40.4, 43.7, 43.7, 50.1, 114.1, 116.0, 122.2, 122.4, 141.5, 155.9, 159.5, 161.3, 175.1; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 405.24028, Found, 405.23991 (-0.4 mmu).
以下のスキームに従って化合物34を合成した。
化合物32(1.15 mg, 0.00356 mmol, 1 eq.)及び化合物13(3.6 mg, 0.0133 mmol, 3.3 eq.)をN,N-ジメチルホルムアミド(1.5 ml)に溶かし、0 °C下で1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(4.5 mg, 0.0235 mmol, 6.6 eq.)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(2.0 mg, 0.0148 mmol, 4.2 eq.)、及びトリエチルアミン(4.96 μl, 0.0356, 10 eq.)を加え、10分間撹拌した後、室温に戻してさらに22時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をHPLCで精製し(溶離液A(H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸)、溶離液B(アセトニトリル, 1 % H2O)(A/B = 90/10 to 0/100 40 min))、目的化合物34(1.3 mg, 0.00189 mmol, 72 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.62 (s, 6H), 1.98-2.05 (m, 2H), 2.40 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 3.44-3.48 (m, 2H), 4.40 (s, 2H), 5.59 (s, 2H), 6.75-6.81 (m, 2H), 7.06-7.08 (m, 2H), 7.33 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.49 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.60-7.65 (m, 2H), 8.03 (s, 1H), 8.16 (s, 1H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 575.28775, Found, 575.28769 (-0.1 mmu).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.62 (s, 6H, f), 1.98-2.05 (m, 2H, l), 2.40 (t, 2H, J = 7.0 Hz, m), 3.44-3.48 (m, 2H, k), 4.39 (s, 2H, o), 5.59 (s, 2H, r), 6.74-6.79 (m, 2H, c, h), 7.06-7.08 (m, 2H, b, i), 7.32 (d, 2H, J = 8.0 Hz, q), 7.48 (d, 2H, J = 8.0 Hz, p), 7.59-7.64 (m, 2H, d, g), 8.00 (s, 1H, t), 8.02 (s, 1H, e),; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 575.28775, Found, 575.28769 (-0.1 mmu).
以下のスキームに従って化合物35を合成した。
化合物32(2.3 mg, 0.00711 mmol, 1 eq.)及び化合物15(5.3 mg, 0.0237 mmol, 3.3 eq.)をN,N-ジメチルホルムアミド(2 ml)に溶かし、0 °C下で1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(3.2 mg, 0.0167 mmol, 2.3 eq.)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(3.0 mg, 0.0222 mmol, 3.1 eq.)、及びトリエチルアミン(9.9 μl, 0.0711, 10 eq.)を加え、15分間撹拌した後、室温に戻してさらに2日間撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をHPLCで精製し(溶離液A(H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸)、溶離液B(アセトニトリル, 1 % H2O)(A/B = 90/10 to 0/100 40 min))、目的化合物35(1.2 mg, 0.00187 mmol, 36 % yield)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.29-1.43 (m, 4H), 1.563 (qui, 2H, J = 7.2 Hz), 1.66 (s, 6H), 1.69-1.77 (m, 2H), 2.00 (qui, 2H, J = 7.2 Hz), 2.36 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 3.37-3.61 (m, 14H), 6.77 (dd, 1H, J = 2.0, 8.8 Hz), 6.84 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.09-7.11 (m, 2H), 7.62-7.64 (m, 2H), 8.06 (s, 1H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 528.29875, Found, 528.29876 (+0.0 mmu).
本発明のプローブ化合物について、グルタチオン添加に伴う吸収スペクトル変化及び蛍光スペクトル変化を測定し、本発明のプローブ化合物とグルタチオンとの間の求核付加−解離平衡反応における解離定数を算出した。
レーザーフラッシュフォトリシスにより、種々のグルタチオン濃度における本発明のプローブ化合物の過渡吸収の経時変化を測定することによって、本発明のプローブ化合物とグルタチオンとの間の求核付加−解離平衡反応における求核付加反応速度定数k、求核付加反応速度時定数τを算出した。溶液条件は、1%DMSO水溶液、pH7.4(10mM NaPiバッファー)である。測定条件は295Kで、光源は10mJ/pulseのXeClエキシマーレーザー(308nm)である。化合物2、5、12、28、及び32について得られた結果をそれぞれ表2〜6に示す。
本発明のプローブ化合物について、蛍光量子収率を測定した。溶液条件は、プローブ化合物1μM、1%DMSO水溶液、pH7.4(200mM NaPiバッファー)である。化合物5、12、14、16、17、28、及び32について得られた結果を表7に示す。本発明のプローブ化合物は、SMLMによる超解像蛍光イメージングに適した高い蛍光量子収率を示すことが明らかとなった。
本発明のプローブ化合物でラベル化した抗体を用いて、細胞の超解像イメージングを行った。
化合物5の末端にスクシンイミジルエステルを導入したプローブ化合物である化合物17をDMSOに溶解し、1mM及び10mMのストック溶液を調製した。β−チューブリンの間接免疫染色のためのヤギ由来・抗マウス二次抗体(IgG、Sigma−Aldrich社)及びTom20の間接免疫染色のためのヤギ由来・抗ウサギ二次抗体(IgG、Jackson ImmunoResearch社)をそれぞれ、0.2Mのリン酸ナトリウムバッファー(pH8.5)中で化合物17と混和した(室温、30分間)。プローブ化合物でラベル化した抗体を、溶離液としてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH7.4、GIBCO社)を用いてPD MiniTrap TM G−25(GEヘルスケア社)によって精製した。抗体に対するプローブ化合物の標識度(DOL)として、プローブ化合物[mol]/抗体分子[mol]の比を算出した。ここで、プローブ化合物の濃度はプローブ化合物に由来する吸光度の測定値から算出し、抗体分子の濃度は、精製処理における抗体分子の損失はなかったものと仮定して、調製に使用した抗体分子の全量から算出した。超解像イメージング(SMLM)においては、標識度が2.1であるラベル化抗マウス抗体及び標識度が1.3であるラベル化抗ウサギ抗体を使用した。
抗体に対するプローブ化合物の標識度(DOL)として、プローブ化合物[mol]/抗体分子[mol]の比を算出した。ここで、プローブ化合物の濃度はプローブ化合物に由来する吸光度の測定値から算出し、抗体分子の濃度は、精製処理における抗体分子の損失はなかったものと仮定して、調製に使用した抗体分子の全量から算出した。超解像イメージング(SMLM)においては、標識度が1.4であるラベル化抗体を使用した。
アフリカミドリザルの腎臓に由来するベロ細胞を、フェノールレッド不含かつL−グルタミン含有のダルベッコ改変イーグル培地(高グルコース)(GIBCO社)にウシ胎仔血清(Invitrogen社)及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(和光純薬工業社)を添加した培地中で培養した(37℃、5%CO2)。イメージングを行う前日に、当該細胞をLab−Tek II 8ウェルチャンバーのカバーガラス(Thermo Fischer Scientific社)に播種した。以下に挙げる文献を参考に、固定と免疫染色を以下のとおり行った。
・M. Bates, G. T. Dempsey, K. H. Chen, X. Zhuang, Multicolor Super-Resolution Fluorescence Imaging via Multi-Parameter Fluorophore Detection. Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical chemistry 13, 99-107 (2012)
・B. Huang, S. A. Jones, B. Brandenburg, X. Zhuang, Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature methods 5, 1047-1052 (2008)
・C. Dellagiacoma et al., Targeted photoswitchable probe for nanoscopy of biological structures. Chembiochem 11, 1361-1363 (2010)
・D. R. Whelan, T. D. Bell, Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Scientific reports 5, 7924 (2015)
N−STORM装置(ニコン社)を用いて、室温でSMLMイメージングを行った。プローブ化合物である化合物17及び化合物33の励起は、それぞれ647nm(40〜500W/cm2)及び561nm(40〜500W/cm2)のレーザー光を用いた全反射照明または全反射照明に近い遮光照明により行った。画像データは、15ms/フレームまたは30ms/フレームで記録し、画像統合ソフトウェア(NIS−Elements Advanced Research、ニコン社)により解析することで超解像度画像を構築した。超解像度画像の表示にあたっては、150フォトン以上又は200フォトン以上が検出された輝点のみを表示した。
Claims (10)
- 以下の式(I)で表される化合物
Xは、C(Ra)(Rb)又はSi(Ra)(Rb)を表し(ここで、Ra及びRbは、いずれもメチル基である);
R1は、水素原子を表し;
R2及びR3は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、スルホ基、カルボキシル基、エステル基、アミド基及びアジド基よりなる群から独立に選択される1〜3個の同一又は異なる置換基を表し;
R4及びR5は、それぞれ独立に水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を表し、又は、N(R4)(R5)がアミド基もしくはカルバメート基を形成する(ここで、R4又はR5がアルキル基である場合、それぞれR2と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい);及び、
R6及びR7は、それぞれ独立に水素原子もしくは置換されていてもよいアルキル基を表し、又は、N(R6)(R7)がアミド基もしくはカルバメート基を形成する(ここで、R6又はR7がアルキル基である場合、それぞれR3と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい。)〕
又はその塩を含む超解像蛍光イメージング用プローブであって、
式(I)で表される化合物又はその塩が、−SH基を含有する求核性化合物との間で求核付加−解離平衡反応を行い、
前記求核付加−解離平衡反応における解離定数が、0.1μM〜100μMの範囲内であることを特徴とする、
該超解像蛍光イメージング用プローブ。 - 前記求核付加−解離平衡反応が、R1が結合する炭素原子において行われる、請求項1に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
- 前記求核付加−解離平衡反応における求核付加反応速度定数が、中性条件の水系溶液中において、1〜1.0x106s−1であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
- R4、R5、R6及びR7が、いずれも水素原子である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
- R4、R5、R6及びR7が、いずれもメチル基である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
- R4、R5、R6及びR7のうち少なくとも1つが、生体分子と共有結合又は非共有結合によって結合し得るラベル化置換基を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
- 前記−SH基を含有する化合物が、システイン残基を有する化合物である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
- 前記−SH基を含有する化合物が、グルタチオンである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
- 式(I)で表される化合物が以下の群から選択される化合物である、請求項1に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブを用いる超解像蛍光イメージング方法であって、
生体分子にプローブ分子を結合させ、−SH基を含有する化合物の存在下でレーザー光を照射して前記プローブ分子からの蛍光発光を撮影した画像データを取得し、一定の時間間隔でこれを繰り返して得られた複数の前記画像データを解析したうえで重ね合わせることによって、前記生体分子の構造に対する超高解像のイメージ画像を得ることを含む、該方法。
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