CN112500714A - 基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂及其制备方法和应用。本发明以磷原子取代的氨基罗丹明衍生物骨架作为溶酶体染料的基础，得到了基于磷原子罗丹明衍生物骨架的近红外发射波长的实时监测溶酶体介导的自噬过程的荧光染色试剂，该类试剂在快速靶向染色的同时，能够超高的光稳定性，有较高的生物相容性，不会对活细胞的生理活动产生干扰，能够实现活细胞内溶酶体介导的生理过程的实时追踪与成像。本发明的制备方法收率高、反应条件温和，制得的染色试剂斯托克斯位移大、靶向性高，对于长时动态监测活细胞内脂滴的自噬与代谢具有显著的优越性。

Description

基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及生物化学领域，尤其涉及溶酶体靶向染色技术领域，具体涉及一种基于 磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂及其制备方法和应用。
背景技术
溶酶体作为细胞内的“消化站”，可以降解各种内源和外源性的生物大分子，溶酶体 内酸性的微环境(pH 4.5-5.5)能够保证水解酶的活性，使得细胞内消化和降解的过程可 以顺利进行。在新陈代谢的过程中，溶酶体膜的通透性改变会刺激细胞产生诱导细胞内源性死亡的物质和活性氧簇，同时将水解酶释放到细胞质中，最终使细胞开始凋亡。此 外，溶酶体也是细胞内吞过程的“终点站”，与细胞死亡的三个通路：细胞凋亡(Apoptosis)、 II型细胞程序化死亡(Type II Programmed cell death)和细胞坏死(Necrosis)都有一定程度的关联。
脂滴是细胞内的一种一个复杂、活动旺盛、动态变化的多功能亚细胞器，其主要生理功能为贮存能量，当细胞需要能量时，用来供给能量。脂滴能够沿着细胞骨架运动， 并与其它细胞器相互作用，能在脂类代谢与存储、膜转运、蛋白降解以及信号传导过程 中起着重要的作用。另外，研究还表明，多种代谢性疾病，如肥胖、脂肪肝、心血管疾 病及糖尿病、中性脂贮存性疾病，往往都伴随着脂质贮存的异常。因此，关于脂滴的生 物学研究日益受到人们的重视。因此，开发具有超高的光稳定性，较好的生物相容性、 能够长时动态监测细胞内溶酶体介导的脂滴自噬的荧光染料，对于了解溶酶体介导的脂 滴自噬的细胞变化，以及脂类代谢的信号通路具有非常深远的意义。
现有的市售溶酶体染色染料通常为基于氟硼二吡咯结构的荧光染料，该类荧光染料 光稳定性较差，同时活细胞内的谷胱甘肽等还原性生物硫醇容易造成干扰，染料的斯托克斯位移太小，成像信噪比不高，导致成像所需浓度较高以及时间较长，从而限制了其 进一步应用。因此，开发一种光稳定性优异，能够长时动态监测细胞内溶酶体介导的脂 滴自噬的荧光染料具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂及其制备 方法和应用，其能够实时监测溶酶体介导的脂滴自噬过程，以解决现有溶酶体靶向染料 因成像浓度高，成像时间长而导致的操作过程复杂、耗时长、成像结果准确性低的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂，具有式(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所 示结构：
Figure BDA0002701270690000021
其中，R1为C1-C10烷基链或芳香基团。
在本发明较佳的实施例中，上述R1为丙基、苯基、萘基或吡啶基。
在本发明较佳的实施例中，上述染色试剂为：
Figure BDA0002701270690000022
制备上述具有式(Ⅰ)的基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂的方法，包括以下步骤：
(1.1)将间溴苯胺和1，4-二溴丁烷溶于第一有机溶剂中并加入第一弱碱加热搅拌， 反应得到中间体A1；
(1.2)在惰性气氛下将所述中间体A1加入至三氯氧磷和DMF的混合溶液中搅拌，然后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，得到中间体A2；
(1.3)将所述中间体A2和第一还原剂加入至第二有机溶剂中搅拌，然后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，得到中间体A3；
(1.4)将所述中间体A1和所述中间体A3加入至第三有机溶剂，加入三氟化硼乙醚搅拌，反应得到中间体A4；
(1.5)将所述中间体A4溶于第四有机溶剂并将溶液冷却至0℃以下，加入强碱，在搅拌下加入二氯苯基磷，升温至室温反应，然后加入过氧化氢，反应完全后将得到的反 应液用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，得到中间体A5；
(1.6)将所述中间体A5溶于第五有机溶剂中，在搅拌下加入四氯苯醌继续搅拌，反应得到中间体A6；
(1.7)将所述中间体A6溶于第六有机溶剂中，在搅拌下加入第二弱碱，再加入三氟甲磺酸酐，在搅拌下加入R1NH2，制得具有式(Ⅰ)的基于磷原子取代罗丹明衍生物 骨架的染色试剂；其中，R1NH2为C1-C10烷基胺或芳香胺。
在本发明较佳的实施例中，步骤(1.1.)中：搅拌时间为10-14h；所述第一有机溶剂为DMSO和DMF中的一种或两种组合，所述第一弱碱为碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾和磷 酸钠中的一种或多种组合；步骤(1.2)中：在0℃充分搅拌后升温至60-80℃并搅拌过夜； 步骤(1.3)中：在室温下搅拌6-10h；所述第一还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾和氢化铝 锂中的一种或多种组合，所述第二有机溶剂为甲醇、乙醇、二氧六环和四氢呋喃中的一 种或多种组合；步骤(1.4)中：在室温下搅拌5-7h；所述第三有机溶剂为二氯甲烷和三 氯甲烷中的一种或两种组合；步骤(1.5)中：将所述溶液进一步冷却至-70～-80℃，搅拌 时间为45-80min，在室温下反应10-14h；所述第四有机溶剂为四氢呋喃和乙醚中的一种 或两种组合，所述强碱为正丁基锂、仲丁基锂或叔丁基锂；步骤(1.6)中：加入四氯苯 醌之前，将体系温度冷却至0℃，然后加入四氯苯醌搅拌5-7h；所述第五有机溶剂为丙 酮和乙腈中的一种或两种组合；步骤(1.7)中：加入三氟甲磺酸酐之前，将体系温度冷 却至0℃，然后加入三氟甲磺酸酐搅拌45-80min，加入R1NH2后在室温下搅拌5-7h；所 述第六有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈和DMF中的一种或多种组合，所述第二弱 碱为吡啶、三乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或多种组合。
制备上述具有式(Ⅱ)的基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂的方法，其包括以下步骤：
(2.1)将6-溴吲哚溶于第七有机溶剂中在搅拌条件下加入碘甲烷和第一弱碱反应， 得到中间体B1；
(2.2)将所述中间体B1溶于第八有机溶剂中并在搅拌条件下加入第二还原剂，得到中间体B2；
(2.3)将所述中间体B2加入至三氯氧磷和DMF的混合溶液中搅拌，反应得到中间体B3；
(2.4)将所述中间体B3和第一还原剂加入至第二有机溶剂中搅拌，反应得到中间体B4；
(2.5)将所述中间体B2和所述中间体B4加入至第三有机溶剂，加入三氟化硼乙醚搅拌，反应得到中间体B5；
(2.6)将所述中间体B5溶于第四有机溶剂并将溶液冷却至0℃以下，加入强碱，在搅拌下加入二氯苯基磷，升温至室温反应，然后加入过氧化氢，反应完全后将得到的反 应液用二氯甲烷萃取，得到中间体B6；
(2.7)将所述中间体B6溶于第五有机溶剂中，在搅拌下加入四氯苯醌继续搅拌，反应得到中间体B7；
(2.8)将所述中间体B7溶于第六有机溶剂中，在搅拌下加入第二弱碱，再加入三氟甲磺酸酐，在搅拌下加入R1NH2，制得具有式(Ⅱ)的基于磷原子取代罗丹明衍生物 骨架的染色试剂；其中，R1NH2为C1-C10烷基胺或芳香胺。
在本发明较佳的实施例中，步骤(2.1.)中：所述第七有机溶剂为四氢呋喃、DMF、乙醚和乙腈中的一种或多种组合，所述第一弱碱为碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾和磷酸钠中 的一种或多种组合；步骤(2.2)中：所述第八有机溶剂为乙酸、丙酸和水中的一种或多 种组合，所述第二还原剂氰基硼氢化钠；步骤(2.4)中：所述第一还原剂为硼氢化钠、 硼氢化钾和氢化铝锂中的一种或多种组合，所述第二有机溶剂为甲醇、乙醇、二氧六环 和四氢呋喃中的一种或多种组合；步骤(2.5)中：所述第三有机溶剂为二氯甲烷和三氯 甲烷中的一种或两种组合；步骤(2.6)中：所述第四有机溶剂为四氢呋喃和乙醚中的一 种或两种组合，所述强碱为正丁基锂、仲丁基锂或叔丁基锂；步骤(2.7)中：所述第五 有机溶剂为丙酮和乙腈中的一种或两种组合；步骤(2.8)中：所述第六有机溶剂为二氯 甲烷、三氯甲烷、乙腈和DMF中的一种或多种组合，所述第二弱碱为吡啶、三乙胺和 4-二甲氨基吡啶中的一种或多种组合。
制备上述具有式(Ⅲ)的基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂的方法，其包括以下步骤：
(3.1)将将间溴苯胺、丙酮和碘单质溶于第九有机溶剂中，加入第一弱碱加热搅拌， 反应得到中间体C1；
(3.2)将所述中间体C1溶于第七有机溶剂，搅拌下，加入所述第一弱碱和碘甲烷，反应得到中间体C2；
(3.3)将所述中间体C2加入至三氯氧磷和DMF的混合溶液中搅拌，反应得到中间体C3；
(3.4)将所述中间体C3和第一还原剂加入至第二有机溶剂中搅拌，反应得到中间体C4；
(3.5)将所述中间体C2和所述中间体C4加入至第三有机溶剂，加入三氟化硼乙醚搅拌，反应得到中间体C5；
(3.6)将所述中间体C5溶于第四有机溶剂并将溶液冷却至0℃以下，加入强碱，在搅拌下加入二氯苯基磷，随后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷萃取，得到中 间体C6；
(3.7)将所述中间体C6溶于第五有机溶剂中，在搅拌下加入四氯苯醌继续搅拌，反应得到中间体C7；
(3.8)将所述中间体C7溶于第六有机溶剂中，在搅拌下加入第二弱碱，再加入三氟甲磺酸酐，在搅拌下加入R1NH2，制得具有式(Ⅲ)的基于磷原子取代罗丹明衍生物 骨架的染色试剂；其中，R1NH2为C1-C10烷基胺或芳香胺。
在本发明较佳的实施例中，步骤(3.1.)中：所述第九有机溶剂为四氢呋喃、乙腈和DMF中的一种或多种组合，所述第一弱碱为碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾和磷酸钠中的一种 或多种组合；步骤(3.2)中：所述第七有机溶剂为四氢呋喃、DMF、乙醚和乙腈中的一 种或多种组合；步骤(3.4)中：所述第一还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾和氢化铝锂中的 一种或多种组合，所述第二有机溶剂为甲醇、乙醇、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多 种组合；步骤(3.5)中：所述第三有机溶剂为二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或两种组合； 步骤(3.6)中：所述第四有机溶剂为四氢呋喃和乙醚中的一种或两种组合，所述强碱为 正丁基锂、仲丁基锂或叔丁基锂；步骤(3.7)中：所述第五有机溶剂为丙酮和乙腈中的 一种或两种组合；步骤(3.8)中：所述第六有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈和DMF 中的一种或多种组合，所述第二弱碱为吡啶、三乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或多种 组合。
基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂在溶酶体介导的脂滴自噬成像中的应 用。
本发明具有以下有益效果：
本发明将以磷原子取代的罗丹明衍生物为基础骨架，通过进行不同形式的芳香胺的 修饰，扩大了染料的共轭平面，进一步使得染料的发射波长红移，由红光红移至近红外发射，基于此设计并合成了大斯托克斯位移近红外的基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂，其能够实时监测溶酶体介导的脂滴自噬过程，可用于体外培养细胞、组织 细胞的溶酶体介导的脂滴自噬过程的动态监测。
本发明制得的染色试剂具有较大的斯托克斯位移(＞150nm)可以有效避免背景光的干扰。本发明的染色试剂对于溶酶体染色具有光稳定性优异、生物相容性好，靶向性 能优异的特性，能够有效降低背景荧光的干扰，提升了细胞成像结果的准确性，并且使 长时监测生物过程的成为可能。
附图说明
图1(a)为本发明实施例1的合成路线图。图1(b)为本发明实施例2的合成路线 图。图1(c)为本发明实施例3的合成路线图。
图2(a)为实施例1的染色试剂的氢谱。图2(b)为实施例1的染色试剂的碳谱。 图2(c)为实施例1的染色试剂的高分辨质谱。
图3(a)为实施例2的染色试剂的氢谱。图3(b)为实施例2的染色试剂的碳谱。 图3(c)为实施例2的染色试剂的高分辨质谱。
图4(a)为实施例3的染色试剂的氢谱。图4(b)为实施例3的染色试剂的碳谱。 图4(c)为实施例3的染色试剂的高分辨质谱。
图5为实施例1的染色试剂在PBS溶液中的紫外吸收光谱。
图6为实施例2的染色试剂在PBS溶液中的紫外吸收光谱。
图7为实施例3的染色试剂在PBS溶液中的紫外吸收光谱。
图8为实施例1的染色试剂在PBS溶液中的荧光发射光谱。
图9为实施例2的染色试剂在PBS溶液中的荧光发射光谱。
图10为实施例3的染色试剂在PBS溶液中的荧光发射光谱。
图11为实施例1、2、3的染色试剂MTS细胞毒性实验。
图12为实施例1、2、3在HepG2细胞中的溶酶体染色激光共聚焦实验。
图13为实施例3染色试剂在HepG2细胞中的溶酶体染色动态追踪激光共聚焦实验。
图14为实施例3的染色试剂在U2OS细胞中的溶酶体动态监测脂滴自噬的激光共聚焦实验。
图15为实施例3的染色试剂在HepG2细胞中的长时间追踪溶酶体染色的激光共聚焦实验。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非 用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例中，间溴苯胺、丁基锂、三氯氧磷、各类溶剂、催化剂、碱购于阿拉 丁科技有限公司，细胞株购于ATCC(American Type Culture Collection)，10％胎牛血清(FBS)购于Hyclone，1640培养基购于美国Gibco。
需要说明的是，本发明的有机溶剂、还原剂、弱碱以及强碱等原料包括但不限于下文实施例中所记载的具体物质，本领域技术人员可以根据以下可选择的技术方案进行选择：
第一有机溶剂为二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)和二甲基甲酰胺 (N,N-Dimethylformamide，DMF)中的一种或两种组合。第一有机溶剂为高沸点的DMSO 和DMF，避免溶剂参与至反应。第二有机溶剂为甲醇、乙醇、二氧六环和四氢呋喃中的 一种或多种组合。第二有机溶剂的反应涉及到强还原剂，因而选用不会参与反应的甲醇、 乙醇、二氧六环和四氢呋喃，避免使用常见卤代烃、DMSO和DMF等会参与反应的溶 剂。第三有机溶剂为二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或两种组合。第三有机溶剂参与的反 应为三氟化硼乙醚催化的亲电取代反应，用二氯甲烷或三氯甲烷作为溶剂能稳定中间体 的形成，促进反应的发生，避免其他种类的有机溶剂会导致反应的失败，无法得到目标 化合物。第四有机溶剂为四氢呋喃和乙醚中的一种或两种组合。第四有机溶剂参与的反 应涉及到有机强碱，例如正丁基锂，因此只能选用四氢呋喃和乙醚这两种不会与有机强 碱发生反应的有机溶剂，避免其他种类有机溶剂加入会与有机强碱发生反应，而产生极 大的危险性。第五有机溶剂为丙酮和乙腈中的一种或两种组合。第五有机溶剂参与的反 应涉及到强氧化剂高锰酸钾，因而以丙酮和乙腈作为溶剂，避免有机溶剂与该强氧化剂 发生反应、导致反应失败无法得到目标化合物。第六有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、 乙腈和DMF中的一种或多种组合。第六有机溶剂参与的反应涉及到三氟甲磺酸酐，故采 用非质子性溶剂二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈或DMF，避免质子性溶剂参与反应且导致中 间体的溶解性不佳。第七有机溶剂为四氢呋喃、DMF、乙醚和乙腈中的一种或多种组合。 第七有机溶剂参与的反应为亲电取代反应，以四氢呋喃、DMF、乙醚或乙腈作为溶剂可 避免参与反应。第八有机溶剂为乙酸和丙酸中的一种或两种组合。第八有机溶剂参与的 反应需要弱酸性环境，且必须对底物有较好的溶解性，因此只能选用这两种溶剂。第九 有机溶剂为四氢呋喃、乙腈和DMF中的一种或多种组合。第九有机溶剂涉及到底物的芳 构化，因此不能选用会参与反应的卤代烃以及质子性溶剂，故只能选用四氢呋喃、乙腈 或DMF。
第一弱碱为碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾和磷酸钠中的一种或多种组合。第一弱碱作为缚酸剂，以除去反应中产生的卤化氢，且不能碱性太强发生消除反应，因此只能选择这 几种组合。第二弱碱为吡啶、三乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或多种组合。第二弱碱 涉及到与三氟甲磺酸酐形成活性中间体，并且兼具缚酸剂的作用，因此，只能选择这几 种组合。强碱为正丁基锂、仲丁基锂或叔丁基锂。必须要用这几种金属锂试剂来拔除芳 香烃上的溴原子，只能有这三种选择。
第一还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾和氢化铝锂中的一种或多种组合。该反应涉及到 醛基的还原，且不能将卤素原子脱去，因此只能选择这几种还原剂。第二还原剂为氰基硼氢化钠。该反应为酸性条件下的还原胺化反应，因此只能选择氰基硼氢化钠为还原剂。
本发明实施例的基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂以磷原子取代的胺基 罗丹明与马来酰亚胺进行反应得到。其合成路线如图1(a)、图1(b)和图1(c)所示， 三种化合物的合成过程大致相同，区别在于：
图1(a)为具有式(Ⅰ)的基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂的合成路线，其以间溴苯胺为起始原料，经过与1，4-二溴丁烷进行亲电取代反应制得间体A1。 图1(b)为具有式(Ⅱ)的基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂的合成路线， 式(Ⅱ)化合物的起始原料为6-溴吲哚，经过与碘甲烷进行亲电取代反应得到中间体B1， 而后与氰基硼氢化钠进行还原反应制得中间体B2。图1(c)为具有式(Ⅲ)的基于磷原 子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂的合成路线，式(Ⅲ)化合物的起始原料为间溴苯 胺，经过与丙酮进行芳构化反应制得中间体C1，而后与碘甲烷进行亲电取代反应制得第 二中间体C2。随后，分别用制得的各自形式的中间体进行同样的反应，从而制得最终的 三种不同形式的染色试剂。
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1：
本实施例的具有基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂的制备方法，包括以 下步骤：
(1)合成中间体A1
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000071
将间溴苯胺(1.0mmol)、1，4-二溴丁烷(1.5mol)和碳酸钾(3.0mmol)在乙腈(5mL)中混合搅拌12小时，随后加入100mL水。分离有机层，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取水 层。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，用200-300目 硅胶柱层析纯化。用石油醚/乙酸乙酯(20：1)洗脱，得到中间体A1为淡黄色液体，产 率为68％。
(2)合成中间体A2
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000081
在氮气保护下，将A1(1mmol)加入到三氯氧磷(2g，21mmol，60％分散在矿物油 中)和DMF的混合溶液中，将得到的溶液在0℃搅拌1小时，然后缓慢将混合物加热至 70摄氏度并搅拌过夜。随后加入水使反应猝灭。分离有机层，用二氯甲烷(30mL×3)萃 取水层。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，用200-300 目硅胶柱层析纯化。用石油醚/乙酸乙酯(6:1)洗脱，得到中间体A2为白色固体，产率 为82％。
(3)合成中间体A3
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000082
将化合物A2(1mmol),硼氢化钠(2mmol)加入10.0mL甲醇中，室温反应8小时， 薄层色谱监测反应完全后，将反应混合物倒入100mL水中，用二氯甲烷萃取。有机层用 盐水、水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，得到中间体A3为白色固体， 产率为98％。
(4)合成中间体A4
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000083
在二氯甲烷(10mL)中加入化合物A1(1mmol)和A3(1mmol)后，将三氟化硼 乙醚溶液(2mmol)滴入搅拌液中。然后将混合物在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱 监控反应完全后，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用石油醚/乙酸乙 酯(5:1)洗脱，得到浅黄色固体A4，产率为67％。
(5)合成中间体A5
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000084
在氮气保护下，向反应瓶中加入A4(10mmol)，随后加入无水四氢呋喃(40mL) 溶解化合物A1(1mmol)，待体系冷却至零下七十八摄氏度，将正丁基锂溶液(11mmol) 滴入搅拌液中，然后将混合物在零下七十八摄氏度下搅拌约1小时，加入二氯苯基磷(5.5 mmol)，升温至室温反应12小时，而后加入10ml过氧化氢，以薄层色谱监控反应完全 后，像体系中加入100ml水，二氯甲烷萃取，旋蒸除去溶剂，得到浅黄色液体A5。
(6)合成中间体A6
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000091
在丙酮(50mL)中加入化合物A5(1mmol)，待体系冷却至零度时，分批加入四 氯苯醌(3mmol)。然后将混合物在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后， 抽滤除去四氯苯醌，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用石油醚/乙酸 乙酯(2:1)洗脱，得到浅黄色固体A6，产率为32％。
(7)合成具有式(Ⅰ)的基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂：化合物 A7
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000092
在二氯甲烷(50mL)中加入化合物A6(1mmo)和吡啶(8mmol)，待体系冷却至 零度时，加入三氟甲磺酸酐(3mmol)，继续搅拌1小时。然后将丙胺(10mmol)加入 体系之中，在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后，旋蒸除去溶剂，粗品 经200-300目硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(60:1)洗脱，得到酒红色固体A7，即 具有式(Ⅰ)的基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂，产率为57％。
本实施例制得的能够实时监测溶酶体介导的脂滴自噬过程的磷罗丹明衍生物染色试 剂的氢谱、碳谱和高分辨质谱分别如图2(a)-图2(c)所示。
实施例2：
本实施例与实施例1基本相同，区别在于起始原料替换为6-溴吲哚制得的B中间体， 其合成路线如图1(b)所示，其包括以下步骤：
(1)合成中间体B1
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000093
将6-溴吲哚(1.0mmol)、碘甲烷(1.5mol)和碳酸钾(2.0mmol)在乙腈(5mL) 中混合搅拌12小时，随后加入100mL水。分离有机层，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取水 层。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，用200-300目 硅胶柱层析纯化。用石油醚/乙酸乙酯(10：1)洗脱，得到中间体B1为淡黄色液体，产 率为75％。
(2)合成中间体B2
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000101
将B1(1.0mmol)和氰基硼氢化钠(5.0mmol)在醋酸(5mL)中混合搅拌12小时， 随后加入100mL水。分离有机层，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取水层。将有机萃取物用 盐水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，用200-300目硅胶柱层析纯化。用 石油醚/乙酸乙酯(10：1)洗脱，得到中间体B2，产率为58％。
(3)合成中间体B3
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000102
在氮气保护下，将B2(1mmol)加入到三氯氧磷(2g，21mmol，60％分散在矿物油 中)和DMF的混合溶液中，将得到的溶液在0℃搅拌1小时，然后缓慢将混合物加热至 70摄氏度并搅拌过夜。随后加入水使反应猝灭。分离有机层，用二氯甲烷(30mL×3)萃 取水层。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，用200-300 目硅胶柱层析纯化。用石油醚/乙酸乙酯(6:1)洗脱，得到中间体B3。
(4)合成中间体B4
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000103
将化合物B3(1mmol),硼氢化钠(2mmol)加入10.0mL甲醇中，室温反应8小时， 薄层色谱监测反应完全后，将反应混合物倒入100mL水中，用二氯甲烷萃取。有机层用 盐水、水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，得到中间体B4。
(5)合成中间体B5
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000104
在二氯甲烷(10mL)中加入化合物B2(1mmol)和B4(1mmol)后，将三氟化硼 乙醚溶液(2mmol)滴入搅拌液中。然后将混合物在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱 监控反应完全后，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用石油醚/乙酸乙 酯(5:1)洗脱，得到中间体B5。
(6)合成中间体B6
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000111
在氮气保护下，向反应瓶中加入B5(10mmol)，随后加入无水四氢呋喃(40mL) 溶解化合物B5(1mmol)，待体系冷却至零下七十八摄氏度，将正丁基锂溶液(11mmol) 滴入搅拌液中，然后将混合物在零下七十八摄氏度下搅拌约1小时，加入二氯苯基磷(5.5 mmol)，升温至室温反应12小时，以薄层色谱监控反应完全后，像体系中加入100ml 水，二氯甲烷萃取，旋蒸除去溶剂，得到中间体B6。
(7)合成中间体B7
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000112
在丙酮(50mL)中加入化合物B6(1mmol)，待体系冷却至零度时，分批加入四 氯苯醌(3mmol)。然后将混合物在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后， 抽滤除去四氯苯醌，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用石油醚/乙酸 乙酯(2:1)洗脱，得到中间体B7。
(8)合成具有式(Ⅱ)的基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂：化合物 B8
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000113
在二氯甲烷(50mL)中加入化合物B7(1mmo)和吡啶(8mmol)，待体系冷却至 零度时，加入三氟甲磺酸酐(3mmol)，继续搅拌1小时。然后将丙胺(10mmol)加入 体系之中，在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后，旋蒸除去溶剂，粗品 经200-300目硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(60:1)洗脱，得到化合物B8。
本实施例制得的能够实时监测溶酶体介导的脂滴自噬过程的磷罗丹明衍生物染色试 剂的氢谱、碳谱和高分辨质谱分别如图3(a)-图3(c)所示。
实施例3：
本实施例与实施例1基本相同，区别在将起始原料替换为间溴苯胺制得的C中间体， 其合成路线如下：
(1)合成中间体C1
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000121
将间溴苯胺(1.0mmol)、丙酮(10mol)和碘单质(0.01mmol)在乙腈(5mL)中 混合搅拌12小时，随后加入100mL水。分离有机层，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取水层。 将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，用200-300目硅胶 柱层析纯化。用石油醚/乙酸乙酯(10：1)洗脱，得到中间体C1为淡黄色液体，产率为 47％。
(2)合成中间体C2
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000122
将C1(1mol)、碘甲烷(1mol)和碳酸钾(3.0mmol)在乙腈(5mL)中混合搅拌 12小时，随后加入100mL水。分离有机层，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取水层。将有机 萃取物用盐水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，用200-300目硅胶柱层析 纯化。用石油醚/乙酸乙酯(20：1)洗脱，得到中间体C2。
(3)合成中间体C3
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000123
在氮气保护下，将C2(1mmol)加入到三氯氧磷(2g，21mmol，60％分散在矿物油 中)和DMF的混合溶液中，将得到的溶液在0℃搅拌1小时，然后缓慢将混合物加热至 70摄氏度并搅拌过夜。随后加入水使反应猝灭。分离有机层，用二氯甲烷(30mL×3)萃 取水层。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，用200-300 目硅胶柱层析纯化。用石油醚/乙酸乙酯(6:1)洗脱，得到中间体C3。
(4)合成中间体C4
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000124
将化合物C3(1mmol),硼氢化钠(2mmol)加入10.0mL甲醇中，室温反应8小时， 薄层色谱监测反应完全后，将反应混合物倒入100mL水中，用二氯甲烷萃取。有机层用 盐水、水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，得到中间体C4。
(5)合成中间体C5
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000131
在二氯甲烷(10mL)中加入化合物C2(1mmol)和C4(1mmol)后，将三氟化硼 乙醚溶液(2mmol)滴入搅拌液中。然后将混合物在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱 监控反应完全后，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用石油醚/乙酸乙 酯(5:1)洗脱，得到中间体C5。
(6)合成中间体C6
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000132
在氮气保护下，向反应瓶中加入C5(10mmol)，随后加入无水四氢呋喃(40mL) 溶解化合物C5(1mmol)，待体系冷却至零下七十八摄氏度，将正丁基锂溶液(11mmol) 滴入搅拌液中，然后将混合物在零下七十八摄氏度下搅拌约1小时，加入二氯苯基磷(5.5 mmol)，升温至室温反应12小时，以薄层色谱监控反应完全后，像体系中加入100ml 水，二氯甲烷萃取，旋蒸除去溶剂，得到中间体C6。
(7)合成中间体C7
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000133
在丙酮(50mL)中加入化合物C6(1mmol)，待体系冷却至零度时，分批加入四 氯苯醌(3mmol)。然后将混合物在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后， 抽滤除去四氯苯醌，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用石油醚/乙酸 乙酯(2:1)洗脱，得到中间体C7。
(8)合成具有式(Ⅱ)的基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂：化合物 C8
合成路线如下：
Figure BDA0002701270690000141
在二氯甲烷(50mL)中加入化合物C7(1mmo)和吡啶(8mmol)，待体系冷却至 零度时，加入三氟甲磺酸酐(3mmol)，继续搅拌1小时。然后将丙胺(10mmol)加入 体系之中，在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后，旋蒸除去溶剂，粗品 经200-300目硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(60:1)洗脱，得到化合物C8。
本实施例制得的能够实时监测溶酶体介导的脂滴自噬过程的磷罗丹明衍生物染色试 剂的氢谱、碳谱和高分辨质谱分别如图4(a)-图4(c)所示。
试验例1 紫外吸收光谱
将上述实施例1-3制得的能够实时监测溶酶体介导的脂滴自噬过程的磷罗丹明衍生 物染色试剂分别配制成10mM的DMSO母液。分别配为1、2、4、6、8、10uL的PBS 溶液，扫描紫外吸收值，绘图。实施例1的染色试剂的紫外吸收光谱如图5所示，实施 例2的染色试剂的紫外吸收光谱如图6所示，实施例3的染色试剂的紫外吸收光谱如图7 所示。如图所示，实施例1和2有两个吸收峰。其中一个在λ＝375nm附近，另一个在λ＝480 nm附近出现，实施例3有三个吸收峰，分别在λ＝325nm，λ＝375nm，λ＝510nm。
试验例2 荧光光谱光谱
将实施例1、2、3制得的染色试剂配为10mM的DMSO母液。分别加入PBS溶液 测定其荧光光谱，得到荧光发射曲线。在PBS的溶液中，待测物实施例1、2、3的最大 发射波长发生明显红移，尤其是实施例2和3，其最大发射波长到了近红外发射区域。其 中，实施例1的染色试剂的荧光强度如图8，实施例2的染色试剂的荧光强度如图9，实 施例3的染色试剂的荧光强度如图10。
试验例3 MTS细胞毒性实验
处于对数生长期的HepG2细胞接种于96孔培养板中，每孔接种10000个细胞，用 含10％胎牛血清(FBS)、1％双抗的(青霉素-链霉素，1000KU/L)的DMEM(H)培养 基在37℃，5％CO2条件下培养过夜。待细胞完全贴壁，加入不同浓度梯度的实施例1、2、 3制得的染色试剂，每个浓度设3个复孔，同时设空白对照组。加染色试剂后继续培养 24小时，MTS法检测细胞的抑制率，结果如图11所示。在20μM的高浓度下，实施例 1、2、3对HepG2细胞都有较高细胞毒性。然而，当浓度降低到到1.25μM，细胞存活 率基本没有受到影响。
试验例4 对HepG2细胞溶酶体染色的激光共聚焦成像
将HepG2细胞在35毫米培养皿中培养一夜。在一定浓度下染一定时间后(在 DMSO<0.1vol％的1mL培养基中加入0.1μL 1mM的化合物母液),震荡摇晃5秒-30秒钟， 在激光共聚焦显微镜下用适当的激发和发射滤光片对染料进行成像：实施例1，λex＝488 nm，λem＝540-680nm；实施例2，λex＝488nm，λem＝540-720nm；实施例3，λex＝543nm， λem＝560-720nm。结果如图12-14所示。同时，由于探针的较高的量子产率，可以基于 此实现超低浓度的溶酶体成像。
综上所述，本发明以磷原子取代的罗丹明骨架作为溶酶体染料的基础，通过合理的 芳香胺的调控设计，得到了基于磷原子罗丹明衍生物骨架的近红外发射波长的实时监测 溶酶体介导的自噬过程的荧光染色试剂，该类试剂在快速靶向染色的同时，能够超高的光稳定性，有较高的生物相容性，不会对活细胞的生理活动产生干扰，能够实现活细胞 内溶酶体介导的生理过程的实时追踪与成像。此外，由于该染色试剂具有近红外发射的 特性，具有背景荧光低，成像信噪比高的表现。本发明的制备方法收率高、反应条件温 和，制得的染色试剂斯托克斯位移大、靶向性高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原 则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂，其特征在于，具有式(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示结构：
Figure FDA0002701270680000011
其中，R1为C1-C10烷基链或芳香基团。
2.根据权利要求1所述的染色试剂，其特征在于，R1为丙基、苯基、萘基或吡啶基。
3.根据权利要求1所述的染色试剂，其特征在于，所述染色试剂为：
Figure FDA0002701270680000012
4.制备权利要求1所述的具有式(Ⅰ)的基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1.1)将间溴苯胺和1，4-二溴丁烷溶于第一有机溶剂中并加入第一弱碱加热搅拌，反应得到中间体A1；
(1.2)在惰性气氛下将所述中间体A1加入至三氯氧磷和DMF的混合溶液中搅拌，然后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，得到中间体A2；
(1.3)将所述中间体A2和第一还原剂加入至第二有机溶剂中搅拌，然后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，得到中间体A3；
(1.4)将所述中间体A1和所述中间体A3加入至第三有机溶剂，加入三氟化硼乙醚搅拌，反应得到中间体A4；
(1.5)将所述中间体A4溶于第四有机溶剂并将溶液冷却至0℃以下，加入强碱，在搅拌下加入二氯苯基磷，升温至室温反应，然后加入过氧化氢，反应完全后将得到的反应液用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，得到中间体A5；
(1.6)将所述中间体A5溶于第五有机溶剂中，在搅拌下加入四氯苯醌继续搅拌，反应得到中间体A6；
(1.7)将所述中间体A6溶于第六有机溶剂中，在搅拌下加入第二弱碱，再加入三氟甲磺酸酐，在搅拌下加入R1NH2，制得具有式(Ⅰ)的基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂；其中，R1NH2为C1-C10烷基胺或芳香胺。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
步骤(1.1.)中：搅拌时间为10-14h；所述第一有机溶剂为DMSO和DMF中的一种或两种组合，所述第一弱碱为碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾和磷酸钠中的一种或多种组合；
步骤(1.2)中：在0℃充分搅拌后升温至60-80℃并搅拌过夜；
步骤(1.3)中：在室温下搅拌6-10h；所述第一还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾和氢化铝锂中的一种或多种组合，所述第二有机溶剂为甲醇、乙醇、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种组合；
步骤(1.4)中：在室温下搅拌5-7h；所述第三有机溶剂为二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或两种组合；
步骤(1.5)中：将所述溶液进一步冷却至-70～-80℃，搅拌时间为45-80min，在室温下反应10-14h；所述第四有机溶剂为四氢呋喃和乙醚中的一种或两种组合，所述强碱为正丁基锂、仲丁基锂或叔丁基锂；
步骤(1.6)中：加入四氯苯醌之前，将体系温度冷却至0℃，然后加入四氯苯醌搅拌5-7h；所述第五有机溶剂为丙酮和乙腈中的一种或两种组合；
步骤(1.7)中：加入三氟甲磺酸酐之前，将体系温度冷却至0℃，然后加入三氟甲磺酸酐搅拌45-80min，加入R1NH2后在室温下搅拌5-7h；所述第六有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈和DMF中的一种或多种组合，所述第二弱碱为吡啶、三乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或多种组合。
6.制备权利要求1所述的具有式(Ⅱ)的基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(2.1)将6-溴吲哚溶于第七有机溶剂中在搅拌条件下加入碘甲烷和第一弱碱反应，得到中间体B1；
(2.2)将所述中间体B1溶于第八有机溶剂中并在搅拌条件下加入第二还原剂，得到中间体B2；
(2.3)将所述中间体B2加入至三氯氧磷和DMF的混合溶液中搅拌，反应得到中间体B3；
(2.4)将所述中间体B3和第一还原剂加入至第二有机溶剂中搅拌，反应得到中间体B4；
(2.5)将所述中间体B2和所述中间体B4加入至第三有机溶剂，加入三氟化硼乙醚搅拌，反应得到中间体B5；
(2.6)将所述中间体B5溶于第四有机溶剂并将溶液冷却至0℃以下，加入强碱，在搅拌下加入二氯苯基磷，升温至室温反应，然后加入过氧化氢，反应完全后将得到的反应液用二氯甲烷萃取，得到中间体B6；
(2.7)将所述中间体B6溶于第五有机溶剂中，在搅拌下加入四氯苯醌继续搅拌，反应得到中间体B7；
(2.8)将所述中间体B7溶于第六有机溶剂中，在搅拌下加入第二弱碱，再加入三氟甲磺酸酐，在搅拌下加入R1NH2，制得具有式(Ⅱ)的基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂；其中，R1NH2为C1-C10烷基胺或芳香胺。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
步骤(2.1.)中：所述第七有机溶剂为四氢呋喃、DMF、乙醚和乙腈中的一种或多种组合，所述第一弱碱为碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾和磷酸钠中的一种或多种组合；
步骤(2.2)中：所述第八有机溶剂为乙酸、丙酸和水中的一种或多种组合，所述第二还原剂氰基硼氢化钠；
步骤(2.4)中：所述第一还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾和氢化铝锂中的一种或多种组合，所述第二有机溶剂为甲醇、乙醇、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种组合；
步骤(2.5)中：所述第三有机溶剂为二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或两种组合；
步骤(2.6)中：所述第四有机溶剂为四氢呋喃和乙醚中的一种或两种组合，所述强碱为正丁基锂、仲丁基锂或叔丁基锂；
步骤(2.7)中：所述第五有机溶剂为丙酮和乙腈中的一种或两种组合；
步骤(2.8)中：所述第六有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈和DMF中的一种或多种组合，所述第二弱碱为吡啶、三乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或多种组合。
8.制备权利要求1所述的具有式(Ⅲ)的基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(3.1)将将间溴苯胺、丙酮和碘单质溶于第九有机溶剂中，加入第一弱碱加热搅拌，反应得到中间体C1；
(3.2)将所述中间体C1溶于第七有机溶剂，搅拌下，加入所述第一弱碱和碘甲烷，反应得到中间体C2；
(3.3)将所述中间体C2加入至三氯氧磷和DMF的混合溶液中搅拌，反应得到中间体C3；
(3.4)将所述中间体C3和第一还原剂加入至第二有机溶剂中搅拌，反应得到中间体C4；
(3.5)将所述中间体C2和所述中间体C4加入至第三有机溶剂，加入三氟化硼乙醚搅拌，反应得到中间体C5；
(3.6)将所述中间体C5溶于第四有机溶剂并将溶液冷却至0℃以下，加入强碱，在搅拌下加入二氯苯基磷，随后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷萃取，得到中间体C6；
(3.7)将所述中间体C6溶于第五有机溶剂中，在搅拌下加入四氯苯醌继续搅拌，反应得到中间体C7；
(3.8)将所述中间体C7溶于第六有机溶剂中，在搅拌下加入第二弱碱，再加入三氟甲磺酸酐，在搅拌下加入R1NH2，制得具有式(Ⅲ)的基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂；其中，R1NH2为C1-C10烷基胺或芳香胺。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
步骤(3.1.)中：所述第九有机溶剂为四氢呋喃、乙腈和DMF中的一种或多种组合，所述第一弱碱为碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾和磷酸钠中的一种或多种组合；
步骤(3.2)中：所述第七有机溶剂为四氢呋喃、DMF、乙醚和乙腈中的一种或多种组合；
步骤(3.4)中：所述第一还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾和氢化铝锂中的一种或多种组合，所述第二有机溶剂为甲醇、乙醇、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种组合；
步骤(3.5)中：所述第三有机溶剂为二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或两种组合；
步骤(3.6)中：所述第四有机溶剂为四氢呋喃和乙醚中的一种或两种组合，所述强碱为正丁基锂、仲丁基锂或叔丁基锂；
步骤(3.7)中：所述第五有机溶剂为丙酮和乙腈中的一种或两种组合；
步骤(3.8)中：所述第六有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈和DMF中的一种或多种组合，所述第二弱碱为吡啶、三乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或多种组合。
10.根据权利要求1-3任一项所述的基于磷原子取代罗丹明衍生物骨架的染色试剂在溶酶体介导的脂滴自噬成像中的应用。
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