JPWO2016117700A1 - ターゲット分析チップおよびターゲット分析方法 - Google Patents
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Abstract
Description
前記基板が、ターゲットを含む試料と試薬とを反応させる反応部、標識検出の対象領域である検出部、および前記反応部と前記検出部とを連通する流路を有し、
前記試薬は、担体を有し、
前記担体は、前記ターゲットに結合する標識プローブが固定化されており、且つ前記ターゲットとの結合体を形成するものであり、
前記流路が、前記担体の前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段を有し、
前記移動制御手段が、前記流路における疎水性の内壁を有し、
前記移動制御手段により、前記結合体は、前記流路の疎水性により生じる抵抗力(R)より大きい遠心力(C2)を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できることを特徴とする。
前記反応部に、試料および試薬を導入する工程、
前記反応部において、前記試料と、前記標識プローブが固定化された担体とを接触させ、前記試料中のターゲットと前記標識プローブとを結合反応させることにより、前記ターゲットと前記標識プローブとの結合体を形成する工程、
前記反応部における結合体を、前記流路の内壁の疎水性により生じる抵抗力(R)より大きい遠心力(C2)によって、前記検出部に移動させる工程、および、
前記検出部において、前記ターゲットが結合した前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程を含むことを特徴とする。
前記試料導入部における前記試料は、前記遠心力(C2)未満の遠心力(C1)によって、前記反応部に移動できる。
前記検出部において、前記標識のシグナル変化を検出する。
前記検出部に紫外光を照射し、波長450〜510nmの蛍光シグナルを検出する。
本発明のターゲット分析チップは、基板を有し、
前記基板が、ターゲットを含む試料と試薬とを反応させる反応部、標識検出の対象領域である検出部、および前記反応部と前記検出部とを連通する流路を有し、
前記試薬は、担体を有し、
前記担体は、前記ターゲットに結合する標識プローブが固定化されており、且つ前記ターゲットとの結合体を形成するものであり、
前記流路が、前記担体の前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段を有し、
前記移動制御手段が、前記流路における疎水性の内壁を有し、
前記移動制御手段により、前記結合体は、前記流路の疎水性により生じる抵抗力(R)より大きい遠心力(C2)を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できることを特徴とする。
本実施形態の分析チップは、前記反応部が、試料が導入される試料導入部を兼ねる形態である。前記試料導入部は、例えば、前記反応部の上面の開口として形成できる。本実施形態の分析チップは、例えば、前記試料導入部を別途設ける必要がなく、前記分析チップをコンパクトにできる。
本実施形態の分析チップは、前記反応部と独立して、試料が導入される試料導入部を有する形態である。前記本実施形態の分析チップにおいて、前記試料導入部は、例えば、前記試料導入部と前記反応部との間が、第1流路で連通され、下記条件(3)を満たす。本実施形態の分析チップによれば、例えば、2回の遠心で簡便にターゲットの分析ができる。本実施形態の分析チップは、例えば、前記基板が、さらに前記試料が導入される試料導入部および前記試料導入部と前記反応部とを連通する流路を含み、前記試料導入部における前記試料は、前記遠心力(C2)未満の遠心力(C1)によって、前記反応部に移動できる分析チップということもできる。また、本実施形態の分析チップによれば、前記第1流路にフィルタを配置することで、夾雑物を含む試料等についても、前処理による夾雑物の除去を経ずに分析することができる。
(3)前記試料導入部に導入された試料は、遠心力(C1)によって、前記反応部に移動し、前記反応部の前記担体は、前記遠心力(C1)によって、前記検出部に実質的に移動しない
本発明のターゲット分析方法は、前述のように、前記本発明のターゲット分析チップを用い、
前記反応部に、試料および試薬を導入する工程(導入工程)、
前記反応部において、前記試料と、前記標識プローブが固定化された担体とを接触させ、前記試料中のターゲットと前記標識プローブとを結合反応させることにより、前記ターゲットと前記標識プローブとの結合体を形成する工程(反応工程)、
前記反応部における結合体を、前記流路の内壁の疎水性により生じる抵抗力(R)より大きい遠心力(C2)によって、前記検出部に移動させる工程(担体移動工程)、および、
前記検出部において、前記ターゲットが結合した前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程(分析工程)を含むことを特徴とする。
R:抵抗力(N)
γ:試料および試薬の混合物の表面張力(N/m)
θ:第2流路の内壁と試料および試薬の混合物との接触角
w:第2流路の幅(m)
h:第2流路の高さ(m)
Δt:回転半径の始点r1から回転半径の終点r2に分析用担体が移動するのに要する時間(sec)
μ:試料および試薬の混合物の粘度(Pa×s)
ρl:試料および試薬の混合物の密度(kg/m3)
ρs:分析用担体の密度(kg/m3)
R:分析用担体の半径(m)
ω:回転の角速度(rad/sec)
r1:回転半径の始点(遠心時の軸から反応部までの最短距離)(m)
r2:回転半径の終点(軸から検出部までの最長距離)(m)
本実施形態は、前記実施形態1の分析チップを用い、前記標識プローブとして、前記蛍光標識プローブを用い、前記反応部に前記試薬が配置され、前記ターゲットとしてターゲットRNAを分析する場合の分析方法の一例である。なお、以下の図1から図4において、同一部分には、同一符号を付している。
反応部13
直径1〜30mm(例えば、8mm)
導入する試料の体積1〜1000μL(例えば、50μL)
第2流路14
長さ10〜5000μm(例えば、2500μm)
反応部13端の幅 100〜5000μm(例えば、1000μm)
反応部13端の深さ100〜5000μm(例えば、2000μm)
検出部15端の幅 10〜1000μm(例えば、150μm)
検出部15端の深さ10〜1000μm(例えば、150μm)
検出部15
長さ10〜1000μm(例えば、220μm)
幅 10〜1000μm(例えば、150μm)
深さ10〜1000μm(例えば、150μm)
容積0.001〜1000nL(例えば、5nL)
本実施形態は、前記実施形態2の分析チップを用い、前記ターゲットとしてターゲットRNAを分析する場合の分析方法の一例である。本実施形態の分析方法は、前記実施形態1の分析チップに代えて、前記実施形態2のチップを用いた以外は、前記実施形態3の分析方法と同様であり、特に言及しない限り、その説明を援用できる。
試料導入部11
直径1〜10mm(例えば、5mm)
導入する試料の体積1〜1000μL(例えば、50μL)
反応部13
直径1〜30mm(例えば、8mm)
第2流路14
長さ10〜5000μm(例えば、2500μm)
反応部13端の幅 100〜5000μm(例えば、1000μm)
反応部13端の深さ100〜5000μm(例えば、2000μm)
検出部15端の幅 10〜1000μm(例えば、150μm)
検出部15端の深さ10〜1000μm(例えば、150μm)
検出部15
長さ10〜1000μm(例えば、220μm)
幅 10〜1000μm(例えば、150μm)
深さ10〜1000μm(例えば、150μm)
容積0.001〜1000nL(例えば、5nL)
図4に示す分析チップを作製し、サンプル中のmiRNAの分析を行った。
以下に示す方法により、図4の分析チップの上基板10bを作製した。なお、前記分析チップについて、各部位の大きさおよび材質は、以下の通りとした。
試料導入部11:直径6mmの円形貫通孔
反応部13:深さ2mm、直径8mm、円形
第1流路12:長さ2mm、幅1mm、深さ1mm
検出部15:幅0.15mm、深さ0.15mm、長さ0.3mm、直方体形状
第2流路14:長さ3.3mm、幅0.5mm、上流側から下流側に向かって、深さが1mmから0.15mmにスロープ状に変化
材質:ポリジメチルシロキサン(PDMS)製
蛍光標識プローブとして、ピレンで標識化したプローブ(ピレンRNAプローブ)を以下のようにして作製した。miRNAであるlet−7aに対して相補的な配列(AAC AU ACA ACC UAC UAC CUC A(配列番号1))からなるポリリボヌクレオチドを合成した。そして、前記RNA中の2箇所のシトシン(前記配列における下線部の塩基)をピレンで修飾し、5’末端の塩基をソラレンで修飾した。これをピレンRNAプローブとした。
前記ビーズ、マンニトール、ウシ血清アルブミンを、それぞれ、蒸留水に、0.05w/v%、2w/v%、1w/v%となるように混合して、反応試薬液を調製した。
厚み0.17mmのホウケイ酸ガラス板の表面に、前記反応試薬液5μLを滴下し、さらに、滴下した前記反応試薬液の上に、直径0.5mmのステンレス球を載せた後、前記ガラス板を、温度25℃、湿度0%の恒温恒湿器内で24時間インキュベートし、前記反応試薬液を乾燥させるとともに、前記ステンレス球を前記ガラス板上に固定した。
前記(1)の前記流路構造体について、流路の形成面(前記ガラス板との貼り合わせ面)を酸素プラズマ処理した。そして、処理後の前記流路構造体と前記ガラス板とを貼り合せ、分析チップを作製した。前記両者の貼り合わせは、前記流路構造体の反応部と前記ガラス基板上の前記反応試薬との位置が対向するようにして、行った。
Let−7a 1pgを、10mmol/L リン酸緩衝液(pH7.4)0.1mLに混合して、miRNAサンプルを調製した。そして、前記miRNAサンプル50μLを、前記分析チップの試料導入部11に滴下した後、前記分析チップを図2に示す遠心装置2のステージ23に固定化した。前記分析チップを、1500rpm(回転半径50mm)で10秒間回転させ、図3に示すように矢印Y方向に遠心力を発生させ、前記分析チップにおいて、前記miRNAサンプルを、試料導入部11から反応部13(矢印X方向)に移動させた。この際、前記分析チップにおいて、反応部13と検出部15とを連通する第2流路14は、その断面積が第1流路12の断面積よりも小さく、また、前記分析チップの素材PDMSが疎水性(蒸留水に対する接触角が110°)であることから、第2流路14の管抵抗(抵抗力(R))が第1流路12の管抵抗よりも大きいため、前記遠心力では、前記miRNAサンプルは、第1流路12を通過するものの、第2流路14を通過できない。このため、前記miRNAサンプルは、試料導入部11から反応部13へと移動するものの、第2流路14へは進入せず、反応部13に留まる。
図1に示す分析チップを作製し、サンプル中のmiRNAの分析を行った。
以下に示す方法により、図1の分析チップの上基板10bを作製した。なお、前記分析チップについて、各部位の大きさおよび材質は、以下の通りとした以外は、実施例1(1)〜(5)と同様にして、分析チップを作製した。
反応部13:深さ2mm、直径8mm、円形、直径6mmの円形貫通孔
検出部15:幅0.15mm、深さ0.15mm、長さ0.3mm、直方体形状
第2流路14:長さ3.3mm、幅0.5mm、上流側から下流側に向かって、深さが1mmから0.15mmにスロープ状に変化
材質:ポリジメチルシロキサン(PDMS)製
Let−7aを所定濃度(0mol/L、50もしくは200fmol/L、または2、20もしくは200pmol/L)となるように、10mmol/L リン酸緩衝液(pH7.4)に混合して、miRNAサンプルを調製した。そして、前記miRNAサンプル50μLを、前記分析チップの反応部13に滴下した後、前記分析チップを図2に示す遠心装置2のステージ23に固定化した。
異なる深さの検出部を有する分析チップと異なる直径を有するビーズを使用し、前記ビーズを前記検出部に回収できることを確認した。
検出部15の深さを40、70、100または150μmとし、前記ピレンRNAプローブを固定化したビーズに代えて、直径300もしくは800nm、または5もしくは10μmのローダミン蛍光標識シリカ製ビーズ(micromod Partikeltechnologie GmbH社製)を用いた以外は、前記実施例2(1)と同様に、分析チップを作製した。
前記リン酸緩衝液50μLを、前記分析チップの反応部13に滴下した後、前記分析チップを図2に示す遠心装置2のステージ23に固定化した。
第2流路14の側面が、反応部13から検出部側15に向かってテーパー状に狭まる曲面であり、前記曲面の曲率半径が異なる分析チップと異なる濃度の界面活性剤を使用し、前記ビーズを前記検出部に回収できることを確認した。
図7(A)〜(C)に示すように、第2流路14の側面を、反応部13から検出部15側に向かってテーパー状に狭まる曲面とし、検出部15の深さを100μmとし、前記ピレンRNAプローブを固定化したビーズに代えて、300μmまたは5μmのローダミン標識シリカ製ビーズを用いた以外は、前記実施例2(1)と同様に、分析チップを作製した。なお、図7(A)〜(C)の分析チップにおいて、テーパー状に狭まる曲面における各曲面の曲率半径Rは、それぞれ、1.5、3、および4.5mmとした。
0.5%Tween20(登録商標)またはTriton(商標)X−100を含む10mmol/L リン酸緩衝液(pH7.4)50μLを前記分析チップの反応部13に滴下後、前記実施例3(2)と同様にして、検出部15に前記ビーズを集積させた。そして、蛍光顕微鏡を用い、前記分析チップの検出部15の先端に集積した前記ビーズに、波長510−560nmの励起光を照射し、前記ビーズの集積部分の波長490nm以上の蛍光強度の総和(総蛍光量)を算出した。また、前記ビーズ添加前に、同様にして、総蛍光量を算出し、前記ビーズ添加後に算出された総蛍光量から前記ビーズ添加前に算出された総蛍光量を除くことで、総蛍光量を補正した(補正後の総蛍光量)。
2 遠心装置
10a 下基板
10b 上基板
10、20 基板
11 試料導入部
12 第1流路
13 反応部
14 第2流路
15 検出部
21 モーター
22 軸
23 ステージ
24a、24b 固定部
Claims (21)
- 基板を有し、
前記基板が、ターゲットを含む試料と試薬とを反応させる反応部、標識検出の対象領域である検出部、および前記反応部と前記検出部とを連通する流路を有し、
前記試薬は、担体を有し、
前記担体は、前記ターゲットに結合する標識プローブが固定化されており、且つ前記ターゲットとの結合体を形成するものであり、
前記流路が、前記担体の前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段を有し、
前記移動制御手段が、前記流路における疎水性の内壁を有し、
前記移動制御手段により、前記結合体は、前記流路の疎水性により生じる抵抗力(R)より大きい遠心力(C2)を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できることを特徴とする、ターゲット分析チップ。 - 前記流路が、前記反応部側から前記検出部側に向かって、狭窄する構造である、請求項1記載の分析チップ。
- 前記検出部の高さが、1〜500μmである、請求項1または2記載の分析チップ。
- 前記検出部の内部空間の容積が、前記反応部の内部空間の容積よりも小さい、請求項1から3のいずれか一項に記載の分析チップ。
- 前記担体が、ビーズである、請求項1から5のいずれか一項に記載の分析チップ。
- 前記ビーズの直径が、100nm〜4μmである、請求項5記載の分析チップ。
- 前記担体が、シリカ製である、請求項1から6のいずれか一項に記載の分析チップ。
- 前記流路の側面が、前記反応部から前記検出部側に向かってテーパー状に狭まる曲面である、請求項1から7のいずれか一項に記載の分析チップ。
- 前記標識プローブの標識が、前記標識プローブが前記ターゲットに結合することにより、シグナル変化する物質である、請求項1から8のいずれか一項に記載の分析チップ。
- 前記標識が、ピレンを含む物質である、請求項9記載の分析チップ。
- 前記標識プローブが、さらにソラレンで修飾されたプローブである、請求項10記載の分析チップ。
- 前記ターゲットが、マイクロRNAである、請求項1から11のいずれか一項に記載の分析チップ。
- 前記標識プローブの量が、1zmol〜1nmolである、請求項1から12のいずれか一項に記載の分析チップ。
- 前記試薬が、さらに界面活性剤を含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の分析チップ。
- 前記反応部が、前記試料が導入される試料導入部を兼ねる、請求項1から14のいずれか一項に記載の分析チップ。
- 前記基板が、さらに前記試料が導入される試料導入部および前記試料導入部と前記反応部とを連通する流路を含み、
前記試料導入部における前記試料は、前記遠心力(C2)未満の遠心力(C1)によって、前記反応部に移動できる、請求項1から15のいずれか一項に記載の分析チップ。 - 前記試料導入部と前記反応部とを連通する流路が、さらにフィルタを有する、請求項16記載の分析チップ。
- 請求項1から17のいずれか一項に記載のターゲット分析チップを用い、
前記反応部に、試料および試薬を導入する工程、
前記反応部において、前記試料と、前記標識プローブが固定化された担体とを接触させ、前記試料中のターゲットと前記標識プローブとを結合反応させることにより、前記ターゲットと前記標識プローブとの結合体を形成する工程、
前記反応部における結合体を、前記流路の内壁の疎水性により生じる抵抗力(R)より大きい遠心力(C2)によって、前記検出部に移動させる工程、および、
前記検出部において、前記ターゲットが結合した前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程を含むことを特徴とする、ターゲット分析方法。 - 前記反応部において、前記試料と前記担体とを含む混合物を撹拌する、請求項18記載の分析方法。
- 前記標識プローブの標識が、前記標識プローブが前記ターゲットに結合することにより、シグナル変化する物質であり、
前記検出部において、前記標識のシグナル変化を検出する、請求項18または19記載の分析方法。 - 前記標識が、ピレンを含む物質であり、
前記検出部に紫外光を照射し、波長450〜510nmの蛍光シグナルを検出する、請求項20記載の分析方法。
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