CN107429209A - 目标分析芯片以及目标分析方法 - Google Patents

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Abstract

提供能够在不进行PCR的情况下直接检测以微RNA为代表的目标的新的目标分析芯片以及分析方法。本发明的目标分析芯片的特征在于，具有基板，所述基板具有使含有目标的试样和试剂反应的反应部、作为标记检测的对象区域的检测部、以及连通所述反应部和所述检测部的流路，所述试剂具有载体，所述载体固定有与所述目标结合的标记探针，并且所述载体形成与所述目标的结合体，所述流路具有移动控制单元，该移动控制单元控制所述载体的从所述反应部向所述检测部的移动，所述移动控制单元具有所述流路中的疏水性的内壁，通过所述移动控制单元，所述结合体在施加比由所述流路的疏水性产生的阻力(R)大的离心力(C2)的情况下，能够经由所述流路而移动到所述检测部。

Description

目标分析芯片以及目标分析方法
技术领域
本发明涉及目标分析芯片以及目标分析方法。
背景技术
最近，血中微RNA等RNA和疾病之间的关联性受到关注，为了疾病的早期发现等，尝试将所述RNA的检测用于医疗中。
作为微RNA的定量方法，例如，报告了通过聚合酶链反应(PCR)来特异性扩增并检测目标的微RNA的方法(专利文献1)。但是，由于PCR是必须的，因此需要用于进行温度控制的装置、逆转录至DNA等，从而操作变繁杂。另外，在所述方法中，从少量的试样中包含的RNA，通过逆转录来获取DNA，进一步进行PCR，由此进行扩增。但是，这样的逆转录PCR是所述试样中的RNA的间接性检测，并不是直接性检测，因此在定量分析时，存在精度不充分的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利5192229号公报
发明内容
发明要解决的问题
因此，本发明的目的在于，提供一种例如无需PCR、且用于直接检测以微RNA为代表的目标的新的目标分析芯片以及分析方法。
用于解决问题的手段
为了解决所述本发明的问题，本发明的目标分析芯片(以下，也称为“分析芯片”)的特征在于，
所述目标分析芯片具有基板，
所述基板具有使包含目标的试样和试剂反应的反应部、作为标记检测的对象区域的检测部、以及连通所述反应部和所述检测部的流路，
所述试剂具有载体，
在所述载体固定有与所述目标结合的标记探针，并且形成与所述目标的结合体，
所述流路具有移动控制单元，该移动控制单元控制所述载体从所述反应部向所述检测部的移动，
所述移动控制单元具有所述流路中的疏水性的内壁，
通过所述移动控制单元，所述结合体在被施加比由所述流路的疏水性产生的阻力(R)大的离心力(C2)的情况下，能够经由所述流路而移动到所述检测部。
本发明的目标分析方法(以下，也称为“分析方法”)的特征在于，
使用所述本发明的目标分析芯片，
所述目标分析方法包括以下步骤：
向所述反应部导入试样以及试剂的工序；
在所述反应部中，使所述试样和固定有所述标记探针的载体接触，并使所述试样中的目标和所述标记探针结合反应，由此形成所述目标和所述标记探针的结合体的工序；
通过比由所述流路的内壁的疏水性产生的阻力(R)大的离心力(C2)来使所述反应部中的结合体向所述检测部移动的工序；以及
在所述检测部中，检测与所述目标结合的所述标记探针的标记，由此分析所述试样中的目标的工序。
发明效果
根据本发明，能够在不使用PCR的情况下，直接分析试样中的目标。另外，在使用固定有所述标记探针的载体的本发明中，所述流路具有所述疏水性的内壁并作为所述移动控制单元，由此能够控制所述载体从所述反应部向所述检测部的移动，通过向所述目标和所述标记探针的结合体施加比由所述流路的内壁的疏水性产生的阻力(R)大的离心力(C2)，例如能够以高浓度的状态回收到所述检测部中。因此，在试样中的目标的分析中，能够实现良好的灵敏性以及精度，例如，即使在供应给所述目标分析芯片的试样为微量的情况下，也能够进行分析。因此，本发明例如在进行以微RNA为代表的目标的分析的医疗领域等中有用。
附图说明
图1是示出本发明的目标分析芯片的一个例子的示意图，(A)是立体图，(B)是俯视图，(C)是(A)的I-I方向的截面图；
图2是示出离心装置的一个例子的截面图；
图3是示出在离心装置中配置了目标分析芯片的状态的一个例子的示意图；
图4是示出本发明的目标分析芯片的一个例子的示意图，(A)是立体图，(B)是俯视图，(C)是(A)的I-I方向的截面图；
图5是示出实施例2中的平均荧光强度的图；
图6的(A)是示出实施例3中的平均荧光强度的图，(B)是示出实施例3中的吸光度的图；
图7是实施例4中使用的分析芯片的内部的截面图；
图8是示出实施例4中的校正后的总荧光量的图。
具体实施形式
在本发明的分析芯片中，例如，所述流路具有移动促进单元，该移动促进单元促进所述载体从所述反应部侧向所述检测部侧的移动。
在本发明的分析芯片例如是所述流路从所述反应部侧朝向所述检测部侧截面积变小的结构。
在本发明的分析芯片例如是所述流路从所述反应部侧朝向所述检测部侧狭窄的结构。
在本发明的分析芯片中，例如，所述检测部的内壁进一步为疏水性。
在本发明的分析芯片中，例如，所述检测部的内部空间的容积小于所述试样的体积。
在本发明的分析芯片中，例如，所述检测部的高度为1～500μm。
在本发明的分析芯片中，例如，所述检测部的内部空间的容积还小于所述反应部的内部空间的容积。
在本发明的分析芯片中，例如，所述载体为珠子。所述珠子的直径例如小于100微米，为100nm～4μm。
在本发明的分析芯片中，例如，所述载体由二氧化硅制作。
在本发明的分析芯片中，例如，所述流路的侧面是从所述反应部向所述检测部侧以锥形形状变窄的曲面。
在本发明的分析芯片中，例如，所述标记探针的标记是通过所述标记探针与所述目标的结合而信号变化的物质。
在本发明的分析芯片中，例如，所述标记是包含芘的物质。
在本发明的分析芯片中，例如，所述标记探针进一步为由补骨脂素修饰的探针。
在本发明的分析芯片中，例如，目标为微RNA。
在本发明的分析芯片中，例如，所述标记探针的量为1zmol～1nmol。
在本发明的分析芯片中，例如，所述检测部由透光性部件形成。
在本发明的分析芯片中，例如，所述试剂还包含表面活性剂。
在本发明的分析芯片中，例如，所述反应部兼作导入所述试样的试样导入部。
在本发明的分析芯片中，例如，所述基板进一步包括导入所述试样的试样导入部、以及连通所述试样导入部和所述反应部的流路，
所述试样导入部中的所述试样能够通过比所述离心力(C2)小的离心力(C1)来移动到所述反应部。
在本发明的分析芯片中，例如，连通所述试样导入部和所述反应部的流路还具有过滤器。
在本发明的分析方法中，例如在所述反应部中搅拌所述试样和所述载体的混合物。
在本发明的分析方法中，例如，所述标记探针的标记是通过所述标记探针和所述目标的结合而信号变化的物质，
在所述检测部中，检测所述标记的信号变化。
在本发明的分析方法中，例如，所述标记是包含芘的物质，
向所述检测部照射紫外光，并检测波长450～510nm的荧光信号。
在本发明的分析方法中，例如，分析对象的目标是微RNA。
[1]目标分析芯片
本发明的目标分析芯片的特征在于，
具有基板，
所述基板具有使包含目标的试样和试剂反应的反应部、作为标记检测的对象区域的检测部、以及连通所述反应部和所述检测部的流路，
所述试剂具有载体，
所述载体固定有与所述目标结合的标记探针、且形成与所述目标的结合体，
所述流路具有移动控制单元，该移动控制单元控制所述载体从所述反应部向所述检测部的移动，
所述移动控制单元具有所述流路中的疏水性的内壁，
通过所述移动控制单元，所述结合体在被施加比由所述流路的疏水性产生的阻力(R)大的离心力(C2)的情况下，能够经由所述流路而向所述检测部移动。
在本发明的分析芯片中，通过所述流路具有所述疏水性的内壁并作为所述移动控制单元，来能够控制所述载体从所述反应部向所述检测部的移动，由此例如，不发生从所述反应部向所述检测部的自发的毛细管现象，而是通过预定的离心力来发生毛细管现象。因此，本发明的分析芯片例如还可以被称为不产生从所述反应部向所述检测部方向的自发的毛细管现象、而是通过预定的离心力来发生毛细管现象的芯片。在本发明的分析芯片中，从所述反应部向所述检测部的移动受到控制的载体例如可以是形成有所述结合体的载体以及未形成所述结合体的载体中的一者，也可以是两者，优选为两者。
本发明的分析芯片是用于所述本发明的分析方法中的芯片，能够引用后面叙述的本发明的分析方法中的说明。本发明中的分析例如还包含定性分析以及定量分析中的任何含义。
在本发明的分析芯片中，所述反应部以及所述检测部例如向一个方向依次配置。在本发明的分析芯片中，将面方向上的、从所述反应部朝向所述检测部的方向还称为“长边方向”、或者所述试样以及所述载体的“移动方向”，将面方向上的、相对于所述长边方向的垂直方向还称为“宽度方向”，并且，将相对于所述面方向的垂直方向(相对于所述长边方向以及所述宽度方向的垂直方向)还称为“厚度方向”或者“深度方向”。另外，如后面叙述，在本发明的分析芯片包含试样导入部的情况下，在本发明的分析芯片中，所述试样导入部、所述反应部以及所述检测部例如优选向一个方向依次配置。在该情况下，在本发明的分析芯片中，将面方向的、从所述试样导入部经由所述反应部而朝向所述检测部的方向还称为“长边方向”或者所述试样及所述载体的“移动方向”。在本发明中，下面将固定有所述标记探针的载体还称为“分析用载体”。另外，在本发明中，将连通所述反应部和所述检测部的流路还称为“第二流路”，将连通所述试样导入部和所述反应部的流路还称为“第一流路”。
(实施形式1)
本实施形式的分析芯片是所述反应部兼作导入试样的试样导入部的形式。所述试样导入部例如能够作为所述反应部的上侧面的开口而形成。本实施形式的分析芯片例如无需单独设置所述试样导入部，能够使所述分析芯片紧凑化。
在本实施形式的分析芯片中，所述基板例如可以包含下基板和上基板。在该情况下，例如，优选通过层积所述下基板和所述上基板，来形成所述反应部、所述第二流路以及所述检测部。
作为第一具体例，例如可以举出如下形式：所述下基板的上表面(与所述上基板之间的层积表面)是平坦的，所述上基板具有成为向所述反应部导入试样的开口的贯通孔，所述上基板的下表面(与所述下基板之间的层积表面)具有成为所述反应部、所述第二流路以及所述检测部的凹部，所述贯通孔与所述凹部连接。在该情况下，通过层积所述下基板和所述上基板，由此通过所述上基板的贯通孔和所述下基板的上表面来形成所述开口，通过所述上基板的凹部和所述下基板的上表面，来以连通的方式形成所述反应部、所述第二流路以及所述检测部。
作为第二具体例，例如可以举出如下形式：所述上基板的下表面(与所述下基板之间的层积表面)是平坦的，所述下基板具有成为向所述反应部导入试样的开口的贯通孔，所述下基板的上表面(与所述上基板之间的层积表面)具有成为所述反应部、所述第二流路以及所述检测部的凹部，所述贯通孔与所述凹部连接。在该情况下，通过层积所述下基板和所述上基板，由此通过所述下基板的贯通孔和所述上基板的下表面来形成所述开口，通过所述下基板的凹部和所述上基板的下表面来以连通的方式形成所述反应部、所述第二流路以及所述检测部。
在本实施形式的分析芯片中，对所述反应部的大小以及形状没有特别限制。
所述反应部例如为其底面由所述下基板的上表面形成、其上侧面由所述上基板的下表面形成的形式。所述反应部例如为中空的柱状(还称为筒状)，具体而言，优选以所述分析芯片的厚度方向为轴方向的柱状。所述柱状例如为圆柱状、棱柱状等。所述反应部例如也可以具有空气孔，所述空气孔例如在所述反应部的上侧面侧，在所述上基板上作为贯通孔而形成。
在本实施形式的分析芯片中，所述第二流路例如为其底面由所述下基板的上表面形成、其上侧面由所述上基板的下表面形成的形式。所述第二流路是中空，具体而言，所述第二流路是以所述分析芯片的长边方向为轴方向的中空。在所述第二流路中，与所述轴方向垂直的截面(中空的截面)例如为正圆、椭圆等的圆形；正方形、长方形等的多边形。
所述第二流路例如优选具有移动促进单元，该移动促进单元促进所述分析用载体从所述反应部侧向所述检测部侧的移动。通过具有所述移动促进单元，例如有效地移动所述分析用载体，能够在所述检测部中回收所述分析用载体。对所述第二流路中的所述移动促进单元，没有特别的限制，例如，如后面叙述，还可以是从所述反应部侧向所述检测部侧截面积变小的结构。
关于所述第二流路，例如可以举出从所述反应部侧向所述检测部侧截面积变小的结构。所述结构例如还可以是从所述反应部侧向所述检测部侧狭窄的结构。所述第二流路的截面积例如为与所述分析芯片的长边方向垂直的截面的面积，是所述第二流路中的中空的截面的面积。
关于所述截面积，从所述反应部侧向所述检测部侧，例如截面积可以连续性地变小，截面积也可以非连续性(阶梯性)地变小。作为具体例，所述第二流路的、例如与轴方向平行的截面形状可以是从所述反应部侧向所述检测部侧以锥形形状变窄的形状。具体而言，所述第二流路的、例如从所述分析芯片的侧面观察的截面的形状可以是从反应部侧向所述检测部侧以锥形形状变窄的形状，从所述分析芯片的上表面(或者下表面)观察的截面形状可以是从反应部侧向所述检测部侧以锥形形状变窄的形状，也可以是两者。
所述第二流路的侧面例如优选为从所述反应部向所述检测部侧以锥形形状变窄的曲面。通过将所述第二流路的侧面形成这样的形状，能够有效地移动所述分析用载体，并能够在所述检测部中回收所述分析用载体。从能够将所述分析用载体更有效地回收到所述检测部的观点来看，所述曲面的曲率半径R例如为1～5mm、1.5～4.5mm、3mm左右(例如，2.5～3.5mm)。所述曲面的曲率半径R例如为以上述锥形形状变窄的曲面的曲率半径。
如前面所述，所述第二流路具有控制所述分析用载体从所述反应部向所述检测部的移动的移动控制单元。通过所述移动控制单元，所述反应部中的结合体(形成了结合体的载体)在被施加比由所述流路的疏水性产生的阻力(R)大的离心力(C2)的情况下，能够经由所述第二流路而移动到所述检测部。具体而言，在所述第二流路作为所述移动控制单元具有疏水性的内壁，由此没有向所述结合体施加比由所述流路的疏水性产生的阻力(R)大的离心力(C2)的情况下，例如，由于不产生从所述反应部向所述检测部的自发的毛细管现象，因此能够将所述分析用载体维持在所述反应部，在向所述结合体施加比所述阻力(R)大的离心力(C2)的情况下，发生从所述反应部向所述检测部的毛细管现象，因此能够使所述结合体从所述反应部向所述检测部移动。因此，在本发明的分析芯片中，疏水性是指，例如，不发生由自发的毛细管现象引起的液体部分从所述反应部向所述检测部的移动的程度的疏水性。在本发明中，除了所述结合体之外，未形成所述结合体的分析用载体例如在被施加所述离心力(C2)的情况下，还能够经由所述流路向所述检测部移动。所述第二流路的疏水性的内壁例如如后面叙述，通过由疏水性部件形成所述第二流路，能够附以疏水性。在所述第二流路中，例如，可以是上下面以及侧面的所有内壁为疏水性，也可以是一部分的内壁为疏水性。作为具体例，在通过上基板和下基板来形成所述分析芯片的情况下，例如，可以是由所述上基板形成的第二流路的内壁是疏水性的，可以是由所述下基板形成的第二流路的内壁是疏水性的，也可以是由所述上基板以及所述下基板形成的第二流路的内壁是疏水性的。在本实施形式的分析芯片中，还可以是使所述检测部的内壁为疏水性，所述移动控制单元包含所述检测部的疏水性的内壁。关于所述阻力(R)以及离心力(C2)，后面进行叙述。
对所述第二流路的内部空间的大小，没有特别的限制。所述第二流路的高度(深度)例如为1～3000μm、100～500μm。所述第二流路的宽度例如为1～3000μm、100～500μm。所述第二流路的高度以及宽度例如分别为所述第二流路的内部空间中的高度以及宽度。
在本实施形式的分析芯片中，对所述检测部的形状，没有特别的限制。所述检测部例如可以是中空的，是所述第二流路的延长。即，在本发明的分析芯片中，所述检测部例如在与所述反应部连通的所述第二流路中，可以是所述反应部和相反侧的末端区域。对所述检测部的形状，没有特别的限制，与所述轴方向垂直的截面(例如，中空的截面)例如为正圆、椭圆等的圆形；正方形、长方形等的多边形。
所述检测部的内部空间的容积例如优选小于所述试样的体积。由此，将所述检测部的容积例如设计成比所述试样相对小，能够将所述检测部中的所述分析用载体的浓度设计成相对高。所述检测部的内部空间的容积相对于所述试样的体积，例如为1×102分之一～1×106分之一(例如，1×104分之一)。另外，所述检测部的容积的下限例如优选超过配置于所述反应部的所述分析用载体总量的体积。所述检测部的内部空间的容积例如优选小于所述反应部的内部空间的容积。由此，将所述检测部容积设计得比所述反应部的内部空间的容积相对小，能够将所述检测部中的所述分析用载体的浓度设计成相对高。所述检测部的内部空间的容积相对于所述反应部的内部空间的容积，例如为1×10分之一～1×106分之一、1×102分之一～1×105分之一(例如，1×104分之一)。对所述检测部的高度(深度)，没有特别的限制，例如可以举出1～3000μm、10～300μm、100μm左右(例如，50～150μm)等。通过将所述检测部设为这样的高度，例如在向所述检测部移动的载体中的、能够检测出的标记的比率进一步增加。对所述检测部的宽度，没有特别的限制，例如为1～3000μm、10～300μm。所述检测部的高度以及宽度例如分别为所述检测部的内部空间中的高度以及宽度。
在本实施形式的分析芯片中，如前面叙述，所述反应部具有固定了与所述目标结合的标记探针的载体(所述分析用载体)。另外，所述分析用载体是形成与后面叙述的目标的结合体的载体。所述标记探针是由标记物质修饰(以下，也称为“标记”)的探针。作为所述探针，例如可以举出RNA、DNA、RNA/DNA等，优选为RNA。所述RNA例如可以是非修饰RNA，可以是修饰RNA，也可以包含两者。作为所述修饰RNA，例如可以举出2’-O-甲基RNA等。另外，所述DNA例如可以是修饰DNA，可以是非修饰DNA，也可以包含两者。所述探针例如可以包含人工核酸单体。作为所述人工核酸单体，例如可以举出PNA(肽核酸)、LNA(Locked NucleicAcid，锁核酸)、ENA(2’-O,4’-C-Ethylenebridged Nucleic Acids，乙烯基桥核酸)等。对由所述标记物质的所述探针的修饰方法，没有特别的限制，能够采用公知的方法。所述探针例如基于分析对象的目标而能够适当设计。在所述目标为所述目标核酸的情况下，作为所述标记探针的序列，例如可以举出与所述目标核酸部分或者完全互补的序列。对所述标记探针的标记位置，没有特别的限制，例如可以是所述标记探针的3’末端的碱基，可以是5’末端的碱基，也可以是除了这些以外的碱基。
对所述标记物质，没有特别的限制，例如可以举出荧光标记物质、放射性标记物质等。对所述荧光标记物质，没有特别的限制，例如可以举出荧光团等的荧光物质等。作为所述荧光标记物质、例如可以举出荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等，作为市售的荧光标记物质，例如可以举出Pacific Blue(注册商标，分析探针公司制)、BODIPY FL(注册商标，分子探针公司制)、Fluore Prime(商品名，安发玛西亚公司制)、Fluoredite(商品名，密理博公司制)、FAM(注册商标、ABI公司制)、Cy3以及Cy5(商品名，安发玛西亚公司制)、TAMRA(注册商标，分子探针公司制)等。
在所述标记探针为由所述荧光标记物质标记的荧光标记探针的情况下，所述荧光标记探针的荧光标记物质例如优选为通过所述荧光标记探针与所述目标(例如，目标核酸，目标RNA)结合而信号变化的物质。所述信号例如为荧光信号。只要是这样的荧光标记，例如就无需分离与所述目标结合的所述荧光标记探针和未与所述目标结合的所述荧光标记探针，能够进一步提高分析精度，并且进一步简单化。
作为所述荧光标记物质的具体例，例如可以举出包含芘的物质(以下，也称为“含芘物质”)。所述荧光标记物质例如可以包含芘，也可以是芘本身。在所述荧光标记物质为含芘物质的情况下，关于所述荧光标记探针的设计，例如能够引用日本专利第4238381号的记载。所述含芘物质例如优选修饰尿苷残基和/或胞苷残基，具体而言，优选与尿苷残基的2’位的羟基和/或胞苷残基的2’位的羟基共价结合。所述荧光标记探针例如优选为包含所述含芘物质共价结合的尿苷的RNA、或者包含所述含芘物质共价结合的尿苷和/或胞苷的DNA或DNA/RNA。由所述含芘物质修饰的所述荧光标记探针例如与所述目标核酸(例如，目标RNA)结合，并通过形成双链结构来发出荧光。因此，通过检测所述荧光的信号，能够进行所述目标核酸的分析。所述荧光例如能够通过紫外光照射的激发来发光。所述照射光的波长例如为325～350nm(例如，340nm)，荧光的检测波长例如为450～510nm(例如，480nm)。
所述荧光标记探针例如优选进一步由补骨脂素修饰。在所述荧光标记探针具有补骨脂素的情况下，例如在向所述荧光标记探针和所述目标核酸的双链照射紫外光时，在所述双链中，所述荧光标记探针的补骨脂素与所述目标核酸中的尿嘧啶残基共价结合。因此，能够进一步稳定所述目标核酸和所述荧光标记探针的双链结合，例如对于所述分析芯片，即使在实施如后面叙述的各种处理的期间，也能够充分地防止所述目标核酸从所述荧光标记探针中解离，并且还能够进一步提高灵敏性。
对固定所述标记探针的所述载体，没有特别的限制，例如可以举出由比重大于1、且由具有透光性的材料形成的载体。作为具体例，所述载体例如为由硅胶制作的载体、由二氧化硅制作的载体、由琼脂糖制作的载体、由玻璃(例如，硼硅玻璃、钙玻璃)制作的载体、由聚苯乙烯制作的载体、丙烯酸树脂载体、由聚乙烯醇树脂制作的载体、由聚碳酸酯制作的载体等。另外，所述载体例如可以是磁性载体。在所述载体为所述磁性载体的情况下，例如，能够通过磁力来在所述反应部中移动所述磁性载体，由此如后面叙述，能够在所述反应部中搅拌所述试样和所述分析用载体的混合物。对所述载体的大小，没有特别的限制。对所述载体的形状，没有特别的限制，例如可以举出椭圆、正圆等的球状，作为具体例，可以举出球状珠子等珠子。在所述载体为所述珠子的情况下，其直径的下限例如为0.1μm(100nm)、200nm、250nm、300nm，上限例如小于100μm、10μm以下、5μm以下、4μm以下、1μm以下、800nm以下、400nm以下，其范围例如为100nm～4μm、100～800nm、0.2μm～0.8μm、250～400nm。在所述检测部的高度为1～500μm的情况下，向所述检测部移动的所述载体的比率增加、并且能够检测的标记的比率进一步增加，因此所述载体的直径例如优选为100nm～4μm、100～800nm、250～400nm。
在所述分析用载体中，对固定到所述载体的所述标记探针的量，没有特别的限制，例如，可以作为按照所述载体的表面积的量而适当地设定。对配置于所述分析用芯片的标记探针的量，没有特别的限制，例如，可以根据包含于试样中的目标的量来适当决定。所述标记探针的量例如为1zmol～1nmol、1amol～100pmol、10amol～10pmol。另外，对配置于所述反应部的所述分析用载体的量，没有特别的限制，例如，可以作为按照所述反应部的底部的面积的量而适当地决定。
在本发明的分析芯片中，例如，作为所述试剂，可以具有所述分析用载体。本发明的分析芯片例如可以与所述分析芯片独立地具有所述分析用载体，也可以在所述分析芯片内具有所述分析用载体。在前者的情况下，本发明的分析芯片例如可以称为目标分析试剂盒。在后者的情况下，所述反应部例如具有所述分析用载体。在该情况下，所述分析用载体例如可以在所述反应部中处于游离状态。另外，所述分析用载体例如可以在所述反应部(所述反应部的内壁)中处于以能够游离的方式固定的状态。在后者的情况下，所述分析用载体例如优选通过水溶性材料来固定到所述反应部。在该情况下，例如，从所述反应部的开口导入试样，由此所述分析用载体从所述反应部(所述反应部的内壁)中游离。作为所述水溶性材料，例如可以举出聚乙烯醇、羧甲基纤维素、甲基纤维素等纤维素衍生物，聚丙烯酸聚合物、聚丙烯酰胺、聚环氧乙烷、淀粉、明胶等水溶性聚合物，蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖等低糖类等。
在本实施形式的分析芯片中，例如，作为所述试剂，除了所述分析用载体之外，还可以包含其他物质。对所述其他物质，没有特别的限制，例如，可以举出表面活性剂、缓冲剂、碱类、水溶性高分子、糖类等。作为所述表面活性剂，例如可以举出非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂等，从促进所述目标和所述标记探针的反应的观点出发，优选非离子型表面活性剂。作为所述非离子型表面活性剂，例如可以举出Tween20(注册商标)、Triton(商标)X-100、蔗糖脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、脂肪酸烷醇酰胺、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚等。
在本发明的分析芯片中，所述反应部还可以具有搅拌元件。在该情况下，通过所述搅拌元件，能够在所述反应部中搅拌所述试样和配置于所述反应部中的所述分析用载体的混合液，并能够有效地使所述试样中的目标和固定于所述分析用载体的标记探针接触。作为所述搅拌元件，例如能够使用磁性搅拌元件，作为具体例，例如可以举出磁性珠子等的搅拌器等。对所述搅拌元件的材料，没有特别的限制，例如优选SUS等磁性体。所述搅拌元件的形状例如为球形。其大小例如为直径0.1～5mm(例如，1mm)。
在本发明的分析芯片中，对所述基板的材质，没有特别的限制，例如，可以使用石英玻璃、硼硅玻璃等玻璃，PDMS(聚二甲基硅氧烷)、聚苯乙烯、丙烯酸树脂、环烯烃类树脂、聚对苯二甲酸二乙醇酯等树脂等，并优选使用后面叙述的疏水性部件。另外，如前面叙述，在所述基板具有所述下基板和所述上基板的情况下，所述两基板例如可以是相同部件，也可以是不同的部件。
在本实施形式的分析芯片中，所述检测部例如由透光性部件形成，优选为紫外透光性部件。作为所述透光性部件，例如可以举出石英玻璃、硼硅玻璃等玻璃、PDMS等树脂等。
在本实施形式的分析芯片中，如前面叙述，所述第二流路的内壁是疏水性。关于所述疏水性的内壁，例如可以通过使用疏水性部件并作为所述基板来构成，也可以通过在所述基板的表面层积疏水性部件来构成，也可以通过将所述基板的表面改性成疏水性来构成。作为所述疏水性部件，例如，可以举出PDMS(聚二甲基硅氧烷)、聚苯乙烯、丙烯酸树脂、环烯烃类树脂、氟类树脂等疏水性树脂等。另外，对向疏水性的改性方法，没有特别的限制，可以采用公知的方法。
(实施形式2)
本实施形式的分析芯片是与所述反应部独立、并具有导入试样的试样导入部的形式。在所述本实施形式的分析芯片中，关于所述试样导入部，例如所述试样导入部和所述反应部之间由第一流路连通，并满足下述条件(3)。根据本实施形式的分析芯片，例如，能够通过两次离心来简单地进行目标的分析。在本实施形式的分析芯片中，例如，所述基板还包括试样导入部以及流路，该试样导入部导入所述试样，该流路连通所述试样导入部和所述反应部，所述试样导入部中的所述试样也可以是能够通过比所述离心力(C2)小的离心力(C1)来向所述反应部移动的分析芯片。另外，根据本实施形式的分析芯片，通过在所述第一流路配置过滤器，即使针对包含夹杂物的试样等，也能够不经过由前处理进行的夹杂物的去除而进行分析。
(3)导入到所述试样导入部的试样通过离心力(C1)来移动到所述反应部，所述反应部的所述载体实质上不会通过所述离心力(C1)而向所述检测部移动。
在本实施形式的分析芯片中，除了所述反应部不具有开口、具有所述试样导入部以及所述第一流路之外，与所述实施形式1的分析芯片相同，除非另有说明，能够引用其说明。
在本实施形式的分析芯片中，所述基板例如可以包含下基板和上基板。在该情况下，例如优选通过层积所述下基板和所述上基板来形成所述试样导入部、所述第一流路、所述反应部、所述第二流路以及所述检测部。
作为第一具体例，例如可以举出如下形式：所述下基板的上表面(与所述上基板之间的层积表面)是平坦的，所述上基板具有成为所述试样导入部的贯通孔，所述上基板的下表面(与所述下基板之间的层积表面)具有成为所述第一流路、所述反应部、所述第二流路以及所述检测部的凹部，所述贯通孔和所述凹部连接。在该情况下，层积所述下基板和所述上基板，由此通过所述上基板的贯通孔和所述下基板的上表面来形成所述试样导入部，通过所述上基板的凹部和所述下基板的上表面来以连通的方式形成所述第一流路、所述反应部、所述第二流路以及所述检测部。
作为第二具体例，例如可以举出如下形式：所述上基板的下表面(与所述下基板之间的层积表面)是平坦的，所述下基板具有成为所述试样导入部的贯通孔，所述下基板的上表面(与所述上基板之间的层积表面)具有成为所述第一流路、所述反应部、所述第二流路以及所述检测部的凹部，所述贯通孔和所述凹部连接。在该情况下，层积所述下基板和所述上基板，由此通过所述下基板的贯通孔和所述上基板的下表面来形成所述试样导入部，通过所述下基板的凹部和所述上基板的下表面来以连通形成所述第一流路、所述反应部、所述第二流路以及所述检测部。
在本发明的分析芯片中，对所述试样导入部、所述反应部以及所述第一流路的大小及形状，没有特别的限制。
作为所述试样导入部，例如可以举出其底面由所述下基板的上表面形成，上部由所述上基板的贯通孔开口的形式。所述试样导入部例如为有底、且中空的柱状(也称为筒状)，具体而言，优选将所述分析芯片的厚度方向作为轴方向的柱状。所述柱状例如为圆柱状、棱柱状等。
所述反应部例如为其底面由所述下基板的上表面形成，其上侧面由所述上基板的下表面形成的形式。所述反应部例如为中空的柱状(也称为筒状)，具体而言，优选将所述分析芯片的厚度方向作为轴方向的柱状。所述柱状例如为圆柱状、棱柱状等。所述反应部例如可以具有空气孔，所述空气孔例如可以在所述反应部的上侧面侧作为贯通孔而形成在所述上基板上。
连结所述试样导入部和所述反应部的所述第一流路例如为其底面由所述下基板的上表面形成，其上侧面由所述上基板的下表面形成的形式。所述第一流路是中空的，具体而言，所述第一流路是以所述分析芯片的长边方向为轴方向的中空。所述第一流路的与所述轴方向垂直的截面(中空的截面)例如为正圆、椭圆等圆形；正方形、长方形等多边形。
所述第一流路例如还可以具有过滤器。通过具有所述过滤器，例如，针对包含夹杂物的试样等，也可以不经过由前处理进行的夹杂物的去除而进行分析。对所述过滤器的种类，没有特别的限制，例如可以举出滤纸、无纺织布、玻璃纤维等具有纤维结构的过滤器，具有海绵状的多孔性结构的过滤器，具有多孔性的膜结构的过滤器等。对所述第一流路中的所述过滤器的配置位置，没有特别的限制，可以选取任意位置。
在本发明的分析芯片中，如前面叙述，例如由于设置于离心装置并施加离心力，优选还具有配置至所述离心装置的配置部位。
导入到本发明的分析芯片的试样是包含目标的试样，但本发明并不限于此，所述试样例如可以是不包含目标的试样、不能确定是否包含目标的试样等。对所述试样的形式，没有特别的限制，例如为液体试样。作为所述液体试样，例如可以举出源自活体的待测体，并且可以是所述待测体的稀释液、悬浮液等。作为所述待测体，例如可以举出血液、尿、胃液、痰、羊水、腹水等体液，大肠、肺等组织，口腔内细胞、生殖细胞、指甲、毛等的细胞等。作为所述血液，例如可以举出全血、血浆、血清、溶血液等。作为所述液体试样，例如可以使用进行了前处理的试样使用。对所述前处理，没有特别的限制，例如可以举出使目标(例如，RNA、DNA等核酸等)从包含于所述待测体中的细胞释放的处理等。
对导入到本发明的分析芯片的试样的量，没有特别的限制，针对每个所述分析芯片，例如为1～100μL(例如，50μL)。
对通过本发明的分析芯片来分析的目标的种类，没有特别的限制，例如可以举出目标核酸等。作为所述目标核酸，例如可以举出目标RNA、目标DNA等。作为所述目标RNA，例如可以举出微RNA、源自病毒的RNA、信使RNA等。作为所述目标DNA，例如可以举出基因组DNA或者其断片、cDNA、血中游离DNA、血中循环肿瘤细胞等的血液中包含的源自细胞的DNA等。
[2]目标分析方法
本发明的目标分析方法的特征在于，如前面叙述，
使用所述本发明的目标分析芯片，
所述目标分析方法包括以下步骤：
将试样以及试剂导入到所述反应部的工序(导入工序)；
在所述反应部中，使所述试样和固定有所述标记探针的载体接触，并使所述试样中的目标和所述标记探针结合反应，由此形成所述目标和所述标记探针的结合体的工序(反应工序)；
通过比由所述流路的内壁的疏水性产生的阻力(R)大的离心力(C2)来将所述反应部中的结合体移动到所述检测部的工序(载体移动工序)；以及
在所述检测部中，通过检测与所述目标结合的所述标记探针的标记来分析所述试样中的目标的工序(分析工序)。
本发明的目标分析方法是使用所述本发明的目标分析芯片的方法，能够引用所述本发明的目标分析芯片中的说明。本发明的目标分析方法例如不包含PCR工序。
在所述导入工序中，如前面叙述，向所述反应部导入试样以及试剂。在所述导入工序中，所述试样以及所述试剂例如从所述分析芯片的所述反应部的开口导入。对所述试样以及所述试剂的导入顺序，没有特别的限制，例如，可以在所述试样的导入之前或之后导入所述试剂，也可以同时导入两者。另外，如前面叙述，在所述反应部具有所述分析用载体的情况下，在所述导入工序中，例如，替代所述试样以及所述试剂而导入所述试样。并且，在所述反应部中，如前面叙述，在固定有所述分析用载体的情况下，所述试样被导入，由此例如解除所述分析用载体的固定化从而游离。
在作为所述分析芯片而与所述反应部独立地具有所述试样导入部的情况下，所述分析方法例如可以替代所述导入工序而包括向所述试样导入部导入试样的工序(试样导入工序)、以及通过比所述离心力(C2)小的离心力(C1)来将被导入到所述试样导入部的试样移动到所述反应部的工序(试样移动工序)。在所述试样导入工序中，所述试样例如从所述分析芯片的所述试样导入部的开口导入。
在所述试样移动工序中，例如，如前面叙述，通过离心力(C1)来使被导入到所述试样导入部的试样向所述反应部移动。所述离心力(C1)例如为小于后面叙述的载体移动工序中的离心力(C2)的离心力。通过设置成比所述离心力(C2)小的离心力(C1)，例如，所述反应部的所述分析用载体实际上不会向所述检测部移动。对所述离心力(C1)的下限，没有特别的限制。在所述反应部中，如前面叙述，在固定有所述分析用载体的情况下，所述试样被导入，由此例如所述分析用载体的固定化被解除从而游离。
在本发明中，例如能够通过使用离心装置来施加向所述分析芯片的离心力。在该情况下，所述分析芯片例如优选进一步具有向所述离心装置的配置部位。并且，例如，在所述配置部位中，能够将所述分析芯片配置在所述离心装置，并通过所述离心装置来向所述分析芯片施加离心力。
在所述反应工序中，如前面叙述，在所述反应部中，使所述试样和固定有所述标记探针的载体接触，并使所述试样中的目标和所述标记探针结合反应，由此形成所述目标和所述标记探针的结合体。这时，在所述反应部中，例如，优选搅拌导入到所述反应部的试样或从所述试样导入部移动的试样和所述载体的混合物。对所述搅拌的方法，没有特别限制。
作为所述搅拌方法，例如可以举出使用了所述搅拌元件的方法。在该情况下，优选的是，所述分析芯片的所述反应部还具有所述搅拌元件，通过所述搅拌元件来在所述反应部中搅拌所述混合物。关于使用了所述搅拌元件的搅拌，例如可以通过在所述分析芯片的外部配置磁铁并由所述磁铁移动所述搅拌元件的方式来进行。关于所述搅拌元件，例如，可以自转，可以公转，也可以随意移动。
作为所述搅拌方法，例如可以举出使用如前面叙述的磁性载体作为固定所述标记探针的载体的方法。在该情况下，能够将固定有所述标记探针的磁性载体同样用作所述搅拌元件。具体而言，可以在所述分析芯片的外部配置磁铁、并由所述磁铁移动所述磁性载体的方式进行。关于所述磁性载体，例如，可以自转，可以公转，也可以随意移动。
另外，作为所述搅拌方法，例如可以举出利用离心装置的方法。例如，如前面叙述，由于试样从所述试样导入部向所述反应部的移动或者所述载体从所述反应部向所述检测部的移动中利用离心力，因此例如能够将所述分析芯片设置在离心装置并使用。因此，在所述反应工序中，也可以通过离心所述分析芯片来搅拌。所述离心例如可以为同一方向的离心，也可以是交替性逆向旋转的离心。
在所述反应工序中，对所述试样和所述分析用载体的接触条件(例如，温度、时间等)，没有特别限制。
接着，如前面叙述，所述载体移动工序是通过比由所述流路的内壁的疏水性产生的阻力(R)大的离心力(C2)来将所述反应部中的所述结合体移动到所述检测部的工序。另外，如前面叙述，所述离心力(C2)大于所述离心力(C1)，因此所述载体移动工序也可以是例如通过比所述离心力(C1)大的离心力(C2)来将所述反应部中的所述结合体移动到所述检测部的工序。
所述阻力(R)例如能够根据所述第二流路的内壁的疏水性程度来适当地计算出。作为具体例，所述阻力(R)例如能够根据所述试样以及所述试剂的混合物的表面张力、所述第二流路的内壁和所述试样及所述试剂的混合物的接触角、所述分析芯片的第二流路的宽度以及高度等来计算出，具体而言，由下述式(1)表示。在所述第二流路的内壁和所述试样及所述试剂的混合物的接触角(θ)为90°以上的情况下，所述阻力(R)例如能够由下述式(1)适当地计算出。
R＝-2whγcosθ(1/w+1/h)…(1)
R：阻力(N)
γ：试样以及试剂的混合物的表面张力(N/m)
θ：第二流路的内壁和试样及试剂的混合物的接触角
w：第二流路的宽度(m)
h：第二流路的高度(m)
对所述离心力(C2)，没有特别限制，例如，只要使所述结合体移动到所述检测部即可。在本发明的分析方法中，所述试样以及所述试剂的混合物例如通过所述离心力(C2)而被导入到所述第二流路。进一步，通过所述离心力(C2)，所述混合物中的所述分析用载体(例如，结合体)聚集到所述分析芯片的检测部中的所述第二流路的相反端侧。这时，所述分析用载体聚集到所述检测部时所需的时间(Δt)例如能够通过所述混合物的粘度、密度、所述分析用载体的密度、所述分析用载体的半径、离心时的旋转速度、旋转半径的始点以及终点等来计算出，具体而言，由下述式(2)表示。根据下述式(2)，例如，在期望的离心时间内能够计算(推定)出将所述分析用载体聚集到所述检测部时的分析用载体的密度以及半径、离心力(C2)，即，旋转半径以及旋转速度(旋转的角速度)。
Δt＝[18μ/(4ω2R2(ρs-ρl))]ln(r2/r1)…(2)
Δt：分析用载体移动从旋转半径始点r1至旋转半径的终点r2为止时所需的时间(sec)
μ：试样以及试剂的混合物的粘度(Pa×s)
ρl：试样以及试剂的混合物的密度(kg/m3)
ρs：分析用载体的密度(kg/m3)
R：分析用载体的半径(m)
ω：旋转的角速度(rad/sec)
r1：旋转半径的始点(从离心时的轴至反应部为止的最短距离)(m)
r2：旋转半径的终点(从轴至检测部为止的最长距离)(m)
接着，所述分析工序是在所述检测部中通过检测与所述目标结合的所述标记探针的标记来分析所述试样中的目标的工序。对所述标记的检测，没有特别限制，例如，能够根据所述标记的种类来适当地决定。
关于所述标记探针的所述标记，例如优选如前面叙述通过所述标记探针和所述目标的结合来信号变化的物质。在该情况下，在所述分析工序中，例如在所述检测部中检测所述标记的信号变化。作为具体例，在所述标记为所述含芘物质的情况下，向所述检测部照射紫外光，并检测源自芘的荧光信号。所述荧光信号的检测条件例如如前面叙述。
以下，使用附图对作为本发明的实施形式的、本发明的分析芯片以及使用它的本发明的分析方法的具体例进行说明。此外，在作为所述分析芯片使用所述实施形式1的分析芯片或者所述实施形式2的分析芯片、作为所述标记探针使用所述荧光标记探针、作为所述目标来分析目标RNA的情况下的分析方法为例子进行了说明，但本发明并不限于这些例示。
(实施形式3)
本实施形式是在使用所述实施形式1的分析芯片、使用所述荧光标记探针作为所述标记探针、在所述反应部配置所述试剂、作为所述目标来分析目标RNA的情况下的分析方法的一个例子。此外，从以下的图1至图4中，对相同部分附以相同符号。
图1是示出本发明的分析芯片的一个例子的示意图，(A)是立体图，(B)是俯视图、(C)是所述(A)的I-I方向截面图。
如图1所示，分析芯片1’具有由下基板10a和上基板10b构成的基板10。上基板10b具有贯通孔、以及下表面的凹部13、14、15，它们通过上基板10b和下基板10a的层积来分别构成反应部的开口、反应部13、第二流路14、检测部15。反应部13和检测部15由第二流路14连通。在图1的(C)中，箭头X示出分析芯片1’中的试样的流动方向(分析芯片1’的长边方向)。
对分析芯片1’的大小，没有特别限制，可以例示以下的条件。
反应部13
直径1～30mm(例如，8mm)
导入的试样的体积1～1000μL(例如，50μL)
第二流路14
长度10～5000μm(例如，2500μm)
反应部13端的宽度100～5000μm(例如，1000μm)
反应部13端的深度100～5000μm(例如，2000μm)
检测部15端的宽度10～1000μm(例如，150μm)
检测部15端的深度10～1000μm(例如，150μm)
检测部15
长度10～1000μm(例如，220μm)
宽度10～1000μm(例如，150μm)
深度10～1000μm(例如，150μm)
容积0.001～1000nL(例如，5nL)
如图1所示，第二流路14是从反应部13侧向检测部15侧变窄的狭窄形状。具体而言，从分析芯片1’的上表面观察时，如图1的(B)所示，从反应部13侧向检测部15侧从两侧以锥形形状变窄，并且在从分析芯片1’的侧面观察时，如图1的(C)所示，第二流路14是从反应部13侧向检测部15侧上侧面以锥形形状变窄的形状。
在分析芯片1’的反应部13配置有所述分析用载体(未图示)。如前面叙述，所述分析用载体优选由所述水溶性材料固定。
使用了分析芯片1’的试样中的RNA的分析例如能够如以下的方式进行。在以下的实施形式中，是所述荧光标记探针的荧光标记为含芘物质，固定有所述荧光标记探针的载体为磁性载体的情况下的一个例子。
首先，从所述开口向分析芯片1’的反应部13导入试样。并且，通过配置于分析芯片1’的外部的磁铁来使反应部13中的所述分析用载体(分析用磁性载体)自转，由此在反应部13中，使试样和所述分析用载体接触。由此，所述试样中的目标RNA和所述分析用载体中的所述荧光标记探针结合。
接着，使分析芯片1’，通过离心力(C2)来从反应部13经由第二流路14使所述分析用载体向检测部15移动。并且，从分析芯片1’的上方向向检测部15照射紫外光(例如，340nm)，以预定波长(例如，480nm)通过光检测器来检测由目标RNA和所述荧光标记探针的结合发出的源自芘的荧光。由芘修饰的所述荧光标记探针仅仅在与目标RNA结合的状态下发出荧光，因此通过源自芘的荧光的有无以及量来表示目标RNA的有无及量和相关关系。因此，能够通过所述荧光的检测来定性分析或者定量分析目标RNA。
在本发明中，关于针对所述分析芯片的离心力，如前面叙述，例如能够使用离心装置。图2以及图3是示出离心装置的一个例子的示意图。
图2是离心装置的截面图，离心装置2具有基板20、马达21、轴22以及平台23。在平台23上具有用于固定配置的所述分析芯片的固定部24a、24b。图3是离心装置2的平台23的上侧面的俯视图。
对向离心装置2的所述分析芯片的配置，例如以下方式进行。首先，在平台23上配置分析芯片1’。这时，以分析芯片1’的反应部侧成为轴22侧的方式配置。并且，通过固定部24a、24b来将分析芯片1’固定到平台23。接着，驱动马达21，使平台23以轴22为中心旋转。由此，从分析芯片1’的反应部侧向检测部侧施加箭头Y方向的离心力，能够在分析芯片1’中向箭头X方向进行所述试样的移动或者所述分析用载体的移动。
(实施形式4)
本实施形式是使用所述实施形式2的分析芯片、且将目标RNA作为所述目标而进行分析的情况下的分析方法的一个例子。在本实施形式的分析方法中，除了替代所述实施形式1的分析芯片而使用所述实施形式2的芯片以外，与所述实施形式3的分析方法相同，除非另有说明，能够引用其说明。
图4是示出本发明的分析芯片的一个例子的示意图，(A)是立体图，(B)是俯视图，(C)是所述(A)的I-I方向截面图。
如图4所示，分析芯片1具有由下基板10a和上基板10b构成的基板10。上基板10b具有贯通孔11、以及下表面的凹部12、13、14、15，它们通过上基板10b和下基板10a的层积来分别构成试样导入部11、以及第一流路12、反应部13、第二流路14、检测部15。试样导入部11和反应部13由第一流路12连通，反应部13和检测部15由第二流路14连通。在图4的(C)中，箭头X表示分析芯片1中的试样的流动方向(分析芯片1的长边方向)。
对分析芯片1的大小，没有特别限制，能够例示以下的条件。
试样导入部11
直径1～10mm(例如，5mm)
导入的试样的体积1～1000μL(例如，50μL)
反应部13
直径1～30mm(例如，8mm)
第二流路14
长度10～5000μm(例如，2500μm)
反应部13端的宽度100～5000μm(例如，1000μm)
反应部13端的深度100～5000μm(例如，2000μm)
检测部15端的宽度10～1000μm(例如，150μm)
检测部15端的深度10～1000μm(例如，150μm)
检测部15
长度10～1000μm(例如，220μm)
宽度10～1000μm(例如，150μm)
深度10～1000μm(例如，150μm)
容积0.001～1000nL(例如，5nL)
如图4所示，第二流路14是从反应部13侧向检测部15侧变窄的狭窄形状。具体而言，从分析芯片1的上表面观察时，如图4的(B)所示，从反应部13侧向检测部15侧从两侧以锥形形状变窄，并且从分析芯片1的侧面观察时，如图4的(C)所示，是从反应部13侧向检测部15侧上侧面以锥形形状变窄的形状。
分析芯片1的反应部13中配置有所述分析用载体(未图示)。如前面叙述，所述分析用载体优选由所述水溶性材料固定。
使用了分析芯片1的试样中的RNA的分析，例如能够如以下的方式进行。在以下的实施形式中，所述荧光标记探针的荧光标记是含芘物质，并且是在固定有所述荧光标记探针的载体为磁性载体情况下的一个例子。
首先，向分析芯片1的试样导入部11导入试样。并且，使分析芯片1离心，通过离心力(C1)来使试样从试样导入部11经由第一流路12向反应部13移动。并且，在离心结束之后，通过配置于分析芯片1的外部的磁铁来使反应部13中的所述分析用载体(分析用磁性载体)自转，由此在反应部13中使所述试样和所述分析用载体接触。由此，所述试样中的目标RNA和所述分析用载体中的所述荧光标记探针结合。
接着，使分析芯片1离心，通过离心力(C2)来使所述分析用载体从反应部13经由第二流路14向检测部15移动。并且，从分析芯片1的上方向向检测部15照射紫外光(例如，340nm)，以预定波长(例如，480nm)通过光检测器来检测由目标RNA和所述荧光标记探针的结合发出的源自芘的荧光。由芘修饰的所述荧光标记探针仅仅在与目标RNA结合的状态下发出荧光，因此通过源自芘的荧光的有无以及量来表示目标RNA的有无及量和相关关系。因此，能够通过所述荧光的检测来对目标RNA进行定性分析或者定量分析。
在本发明中，关于针对所述分析芯片的离心力，如前面叙述，例如能够使用离心装置。
关于向离心装置2的所述分析芯片的配置，例如如以下的方式进行。首先，在平台23上配置分析芯片1。这时，以分析芯片1的试样导入部侧成为轴22侧的方式配置。并且，由固定部24a、24b将分析芯片1固定到平台23。接着，驱动马达21，使平台23以轴22为中心旋转。由此，从分析芯片1的试样导入部侧向检测部侧施加箭头Y方向的离心力，能够在分析芯片1中向箭头X方向进行所述试样的移动或者所述分析用载体的移动。
实施例
接着，对本发明的实施例进行说明。此外，本发明并不局限于下述的实施例。
(实施例1)
制作图4所示的分析芯片，并进行样品中的miRNA的分析。
(1)流路结构体的制造
通过以下所示的方法，制作了图4的分析芯片的上基板10b。此外，关于所述分析芯片，各部位的大小以及材质为如下。
试样导入部11：直径6mm的圆形贯通孔
反应部13：深度2mm、直径8mm、圆形
第一流路12：长度2mm、宽度1mm、深度1mm
检测部15：宽度0.15mm、深度0.15mm、长度0.3mm、长方体形状
第二流路14：长度3.3mm、宽度0.5mm、从上游侧向下游侧深度从1mm至0.15mm以倾斜形状变化
材质：由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作
首先，为了制作所述结构的流路结构体，通过切割加工来制作作为模型的铝制流路金属模具。并且，将PDMS预聚物溶液流入到所述流路金属模具，放入70℃的烘箱中一个小时，并进行热固化。在热固化之后，从所述流路金属模具中轻轻地剥离固化的PDMS成型体，并获得所述流路结构体。所述PDMS预聚物混合液如下调制：在以重量比10：1均匀地混合PDMS的预聚物和固化剂(商品名SILPOT(东丽道康宁制)的主剂和固化剂)之后，将该混合液添加到干燥箱并进行减压处理，并去除混合时发生的气泡。
(2)芘RNA探针的固定化
作为荧光标记探针，如以下的方式制作由芘标记的探针(芘RNA探针)。针对作为miRNA的let-7a，合成由互补序列(AACAUACAACCUACUACCUCA(序列号1))构成的核糖核苷酸。并且，由芘修饰所述RNA中的两处位置的胞嘧啶(所述序列中的下线部的碱基)，由补骨脂素修饰5’末端的碱基。将这个作为芘RNA探针。
接着，如以下的方式将所述芘RNA探针固定到珠子。作为珠子，使用了直径为1μm、表面由羧基修饰的二氧化硅制珠子(商品名sicastar、Fischer Science制)。通过在包含1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和羟基丁二酰亚胺的水溶液中混合所述珠子来使所述珠子的羧基活性化。所述水溶液中的所述珠子的量为10mg，所述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的量为38mg，所述羟基丁二酰亚胺的量为3mg。并且，在活性化之后，为了去除未与所述珠子的羧基反应的所述1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和所述羟基丁二酰亚胺，三次反复进行所述水溶液的离心、上清的去除、以及蒸馏水的添加一系列清洗操作。此后，通过在10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中混合所述芘RNA探针和所述珠子来使所述芘RNA探针和所述珠子表面的活性化羧基反应，在所述珠子表面固定所述芘RNA探针。在所述磷酸缓冲液中，所述芘RNA探针的量为0.1nmol。并且，为了去除未固定在所述珠子表面的所述芘RNA探针，三次反复进行如下清洗操作：使包含所述珠子和所述芘RNA探针的所述磷酸缓冲液离心，去除上清，此后进一步添加蒸馏水。由此，制作出固定有芘RNA探针的珠子。
(3)反应试剂液的调制
分别将所述珠子、甘露醇、牛血清白蛋白混合到蒸馏水中，使得变成0.05w/v％、2w/v％、1w/v％，由此调制反应试剂液。
(4)所述反应试剂的固定化
向厚度0.17mm的硼硅玻璃板的表面滴落所述反应试剂液5μL，进一步在滴落的所述反应试剂液之上载置直径0.5mm的不锈钢球之后，在温度25℃、湿度0％的恒温恒湿器内孵育所述玻璃板24小时，并使所述反应试剂液干燥，并将所述不锈钢球固定到所述玻璃板上。
(5)分析芯片
关于所述(1)的所述流路结构体，对流路的形成面(与所述玻璃板之间的粘贴面)进行氧气等离子体处理。并且，将处理之后的所述流路结构体粘贴到所述玻璃板，并制作分析芯片。所述两者的粘贴以所述流路结构体的反应部和所述玻璃基板上的所述反应试剂的位置对置的方式进行。
(6)分析
将Let-7a1pg混合到10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)0.1mL中，并调制miRNA样品。并且，在将所述miRNA样品50μL滴落到所述分析芯片的试样导入部11之后，将所述分析芯片固定到图2所示的离心装置2的平台23。以1500rpm(旋转半径50mm)使所述分析芯片旋转10秒钟，如图3所示向箭头Y方向产生离心力，在所述分析芯片中，将所述miRNA样品从试样导入部11移动到反应部13(箭头X方向)。这时，在所述分析芯片中，连通反应部13和检测部15的第二流路14的截面积小于第一流路12的截面积，另外，所述分析芯片的材料PDMS是疏水性(相对于蒸馏水的接触角为110°)，因此第二流路14的管阻力(阻力(R))比第一流路12的管阻力大，从而在所述离心力中，所述miRNA样品能通过第一流路12，但不能通过第二流路14。因此，所述miRNA样品从试样导入部11向反应部13移动，并且不进入第二流路14，而是滞留在反应部13中。
接着，向所述分析芯片的反应部13照射波长365nm的LED，并使反应部13内的所述不锈钢球通过磁力来旋转(200rpm)，通过所述miRNA样品来溶解所述反应试剂，并使所述miRNA和所述反应试剂混合。进行该操作10分钟。通过所述混合，使所述miRNA样品中的let-7a和所述反应试剂(固定有所述芘RNA探针的珠子)结合，通过波长365nm的LED照射，使所述芘RNA探针的补骨脂素和let-7a共价结合。由此，稳定所述两者的结合，并能够防止所述两者的分离，因此能够有效地在所述反应试剂的珠子表面上捕获所述miRNA样品中的let-7a。
接着，以4000rpm(旋转半径50mm)旋转所述分析芯片60秒钟，将反应部13内的所述珠子移动到检测部15。所述珠子的比重是2左右，具有比所述miRNA样品大的比重，因此聚集到检测部15。所述反应试剂中的珠子的总容积是5nL，因此在具有边长0.15mm的正方形的截面的检测部15中，在离下游的前端的长度为0.2～0.3mm的区域聚集所述珠子。
并且，使用荧光显微镜，向聚集在所述分析芯片的检测部15的前端的所述珠子照射波长340nm的激发光，并测定波长480nm的荧光强度。
(实施例2)
制造图1所示的分析芯片，并进行样品中的miRNA的分析。
(1)分析芯片
通过以下所示的方法，制作图1的分析芯片的上基板10b。此外，关于所述分析芯片，除了将各部位的大小以及材质作成如下之外，与实施例1的(1)～(5)相同，制作了分析芯片。
反应部13：深度2mm、直径8mm、圆形、直径6mm的圆形贯通孔
检测部15：宽度0.15mm、深度0.15mm、长度0.3mm、长方体形状
第二流路14：长度3.3mm、宽度0.5mm、从上游侧向下游侧深度从1mm至0.15mm以倾斜形状变化
材质：由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作
(2)分析
将Let-7a混合到10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)中，使得变成预定浓度(0mol/L、50或200fmol/L、或者2、20或200pmol/L)，由此调制miRNA样品。并且，在将所述miRNA样品50μL滴落到所述分析芯片的反应部13之后，将所述分析芯片固定到图2所示的离心装置2的平台23。
向所述分析芯片的反应部13照射波长365nm的LED，并通过磁力来旋转(200rpm)反应部13内的所述不锈钢球，通过所述miRNA样品来溶解所述反应试剂，并使所述miRNA和所述反应试剂混合。进行该操作10分钟。通过所述混合，使所述miRNA样品中的let-7a和所述反应试剂(固定有所述芘RNA探针的珠子)结合，通过波长365nm的LED照射，使所述芘RNA探针的补骨脂素和let-7a共价结合。由此，能够稳定所述两者的结合，并防止所述两者的分离，因此能够有效地将所述miRNA样品中的let-7a捕获到所述反应试剂的珠子表面。
接着，以4000rpm(旋转半径50mm)旋转所述分析芯片60秒钟，使反应部13内的所述珠子向检测部15移动。所述珠子的比重是2左右，具有比所述miRNA样品大的比重，因此聚集到检测部15。所述反应试剂中的珠子的总体积是5nL，因此在具有边长0.15mm的正方形的截面的检测部15中，在离下游的前端的长度为0.2～0.3mm的区域聚集所述珠子。
并且，使用荧光显微镜，向聚集到所述分析芯片的检测部15的前端的所述珠子照射波长340nm的激发光，并测定波长480nm的平均荧光强度。
图5中示出该结果。图5是示出平均荧光强度的图。在图5中，(A)示出所有miRNA样品的结果，(B)示出0～2pmol/L的miRNA样品的结果。另外，在图5中，横轴示出miRNA的浓度，纵轴示出平均荧光强度。如图5的(A)以及(B)所示，平均荧光强度依赖miRNA的浓度而增加。另外，根据所述分析芯片，可知能够在不使用PCR的情况下检测出50fmol/L的极低浓度的miRNA。从这些结果中可知如下情况：根据本发明的分析芯片以及分析方法，在试样中的目标的分析中能够实现良好的灵敏性以及精度。
(实施例3)
已确认如下情况：使用与具有不同深度的检测部的分析芯片不同的直径的珠子，能够将所述珠子回收到所述检测部。
(1)分析芯片
除了将检测部15的深度设为40、70、100或者150μm，替代固定有所述芘RNA探针的珠子而使用直径300或800nm、或者5或10μm的由罗丹明荧光标记二氧化硅制作的珠子(micromod Partikeltechnologie GmbH社制作)以外，与所述实施例2的(1)同样，制作分析芯片。
(2)分析
在将所述磷酸缓冲液50μL滴落到所述分析芯片的反应部13之后，将所述分析芯片固定到图2所示的离心装置2的平台23。
通过磁力来旋转(200rpm)所述分析芯片的反应部13内的所述不锈钢球，通过所述miRNA样品来溶解所述反应试剂。进行该操作10分钟。接着，以4000rpm(旋转半径50mm)旋转所述分析芯片60秒钟，使反应部13内的所述珠子向检测部15移动。
并且，使用荧光显微镜，向聚集到所述分析芯片的的检测部15的前端的所述珠子照射波长510～560nm的激发光，并测定波长490nm以上的平均荧光强度以及吸光度。
图6中示出这些结果。图6是示出平均荧光强度或者吸光度的图。在图6中，(A)示出平均荧光强度的结果，(B)示出吸光度的结果，图中的三角形(△)示出300nm珠子的结果，菱形(◇)示出800nm的珠子的结果，圆形(○)示出5μm的珠子的结果，叉号(×)示出10μm的珠子的结果。另外，在图6的(A)中，横轴表示检测部15的深度，纵轴表示平均荧光强度，在(B)中，横轴表示检测部15的深度，纵轴表示吸光度。如图6的(A)所示，在任何直径的珠子中，随着检测部15的深度的增加，平均荧光强度增加。另外，可知如下情况：在各珠子之中，300nm的珠子在检测部15的深度增加时的平均荧光强度的增加比率高、且增加比率为固定值，尤其能够作为所述载体而被适当地使用。另外，如图6的(B)所示，在任何直径的珠子中，随着检测部15的深度的增加，吸光度也增加。另外，可知如下情况：300nm、5μm及10μm的珠子即使在检测部15的深度为任何深度的情况下，吸光度也减少，例如，通过光学方法来检测标记时，能够减少检测遗漏。
(实施例4)
确认了如下情况：第二流路14的侧面是从反应部13向检测部侧15以锥形形状变窄的曲面，使用所述曲面的曲率半径不同的分析芯片和不同的浓度的表面活性剂，能够将所述珠子回收到所述检测部。
(1)分析芯片
如图7的(A)～(C)所示，除了将第二流路14的侧面设为从反应部13向检测部15侧以锥形形状变窄的曲面、将检测部15的深度设为100μm、替代固定有所述芘RNA探针的珠子而使用300μm或5μm的罗丹明标记二氧化硅制珠子以外，与所述实施例2的(1)同样，制作分析芯片。此外，在图7的(A)～(C)的分析芯片中，以锥形形状变窄的曲面中的各曲面的曲率半径R分别为1.5、3及4.5mm。
(2)分析
在将包含0.5％Tween20(注册商标)或者Triton(商标)X-100的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)50μL滴落到所述分析芯片的反应部13之后，与所述实施例3的(2)同样，使所述珠子聚集到检测部15。并且，使用荧光显微镜，向聚集到所述分析芯片的检测部15的前端的所述珠子照射波长510～560nm的激发光，并计算出所述珠子的聚集部分的波长490nm以上的荧光强度的总和(总荧光量)。另外，在添加所述珠子之前，同样计算出总荧光量，并且从添加所述珠子之后计算出的总荧光量中减去添加所述珠子之前计算出的总荧光量，由此对总荧光量进行校正(校正之后的总荧光量)。
图8中示出该结果。图8是示出校正之后的总荧光量的图，(A)是在使用5μm的珠子时的结果，(B)是在使用300nm的珠子时的结果。在图8中，横轴表示表面活性剂的的种类，纵轴表示校正之后的总荧光量。可知如下情况：如图8所示，即使第二流路14的侧面是具有任何曲率半径的曲面，校正之后的总荧光量也高，能够有效地回收所述珠子。另外，如图8所示，在包含表面活性剂的情况下，相对于不包含表面活性剂的情况，校正之后的总荧光量明显增加。即，可以通过使用表面活性剂作为所述试剂，来能够有效地回收所述珠子。
以上，参照实施形式对本发明进行了说明，但本发明不局限于上述实施形式。本领域技术人员能够在本发明的发明内对本发明的构成或者细节进行各种变更。
该申请主张以2015年1月22日申请的日本申请特愿2015-010639为基础的优先权，并引入其公开的所有内容。
产业上的可用性
根据本发明，能够在不使用PCR的情况下直接分析试样中的目标。另外，在使用固定有所述标记探针的载体的本发明中，所述流路具有所述疏水性的内壁并作为所述移动控制单元，由此能够控制从所述反应部向所述检测部的所述载体的移动，通过向所述目标和所述标记探针的结合体施加比由所述流路的内壁的疏水性产生的阻力(R)大的离心力(C2)，例如能够以高浓度的状态回收到所述检测部。因此，在试样中的目标的分析中，能够实现灵敏性以及精度，例如，即使在供于所述目标分析芯片的试样为微量的情况下，也能够进行分析。因此，本发明有利于进行例如以微RNA为代表的目标的分析的医疗领域等中。
符号说明
1、1’...分析芯片，2...离心装置，10a...下基板，10b...上基板，10、20...基板，11...试样导入部，12...第一流路，13...反应部，14...第二流路，15...检测部，21...马达，22...轴，23...平台，24a、24b...固定部。
SEQUENCE LISTING
<110> 爱科来株式会社
国立大学法人京都工艺纤维大学
<120> 目标分析芯片以及目标分析方法
<130> TF14071WO
<150> JP2015-010639
<151> 2015-01-22
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> probe
<400> 1
aacauacaac cuacuaccuc a 21

Claims (21)

1.一种目标分析芯片，其特征在于，
所述目标分析芯片具有基板，
所述基板具有使包含目标的试样和试剂反应的反应部、作为标记检测的对象区域的检测部、以及连通所述反应部和所述检测部的流路，
所述试剂具有载体，
在所述载体固定有与所述目标结合的标记探针，并且形成与所述目标的结合体，
所述流路具有移动控制单元，该移动控制单元控制所述载体从所述反应部向所述检测部的移动，
所述移动控制单元具有所述流路中的疏水性的内壁，
通过所述移动控制单元，所述结合体在被施加比由所述流路的疏水性产生的阻力(R)大的离心力(C2)的情况下，能够经由所述流路而移动到所述检测部。
2.根据权利要求1所述的分析芯片，其中，
所述流路为从所述反应部侧向所述检测部侧变窄的结构。
3.根据权利要求1或2所述的分析芯片，其中，
所述检测部的高度为1～500μm。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分析芯片，其中，
所述检测部的内部空间的容积小于所述反应部的内部空间的容积。
5.根据权利要求1至5中任一项所述的分析芯片，其中，
所述载体是珠子。
6.根据权利要求5所述的分析芯片，其中，
所述珠子的直径是100nm～4μm。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的分析芯片，其中，
所述载体是二氧化硅制的。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的分析芯片，其中，
所述流路的侧面是从所述反应部向所述检测部侧以锥形形状变窄的曲面。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的分析芯片，其中，
所述标记探针的标记是通过所述标记探针与所述目标的结合而信号变化的物质。
10.根据权利要求9所述的分析芯片，其中，
所述标记是含有芘的物质。
11.根据权利要求10所述的分析芯片，其中，
所述标记探针是进一步由补骨脂素修饰的探针。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的分析芯片，其中，
所述目标是微RNA。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的分析芯片，其中，
所述标记探针的量是1zmol～1nmol。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的分析芯片，其中，
所述试剂还包含表面活性剂。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的分析芯片，其中，
所述反应部兼作导入所述试样的试样导入部。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的分析芯片，其中，
所述基板还包括导入所述试样的试样导入部、以及连通所述试样导入部和所述反应部的流路，
所述试样导入部中的所述试样能够通过比所述离心力(C2)小的离心力(C1)来移动到所述反应部。
17.根据权利要求16所述的分析芯片，其中，
连通所述试样导入部和所述反应部的流路还具有过滤器。
18.一种目标分析方法，其特征在于，
使用权利要求1至17中任一项所述的目标分析芯片，
所述目标分析方法包括以下步骤：
向所述反应部导入试样以及试剂的工序；
在所述反应部中使所述试样和固定有所述标记探针的载体接触，并使所述试样中的目标和所述标记探针结合反应，由此形成所述目标和所述标记探针的结合体的工序；
通过比由所述流路的内壁的疏水性产生的阻力(R)大的离心力(C2)来使所述反应部中的结合体向所述检测部移动的工序；以及
在所述检测部中检测与所述目标结合的所述标记探针的标记，由此分析所述试样中的目标的工序。
19.根据权利要求18所述的分析方法，其中，
在所述反应部中搅拌包含所述试样和所述载体的混合物。
20.根据权利要求18或19所述的分析方法，其中，
所述标记探针的标记是通过所述标记探针与所述目标的结合而信号变化的物质，
在所述检测部中检测所述标记的信号变化。
21.根据权利要求20所述的分析方法，其中，
所述标记是含有芘的物质，
向所述检测部照射紫外光，并检测波长450～510nm的荧光信号。
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