JPWO2015098989A1

JPWO2015098989A1 - 血液脳関門を通過する新規抗トランスフェリン受容体抗体

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Publication number: JPWO2015098989A1
Application number: JP2015554972A
Authority: JP
Inventors: 啓之薗田; 秀人森本; 友理越村; 正文木下; 春奈高木; 佳子由井
Original assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2013-12-25
Filing date: 2014-12-24
Publication date: 2017-03-23
Anticipated expiration: 2034-12-24
Also published as: US9994641B2; US20160369001A1; EP3088518A1; JP6616189B2; WO2015098989A1; EP3450557A1; EP3088518A4

Abstract

血液脳関門を通過し得る新規抗トランスフェリン受容体抗体，及び血中に投与して中枢神経系において機能させるべき蛋白質と当該抗体との融合蛋白質，及びそれらの製造法が開示されている。当該融合蛋白質は，配列番号１，２及び３からなる群から選択される何れかのアミノ酸配列を認識する抗ヒトトランスフェリン受容体抗体と，そのアミノ酸配列とそのＣ末端側に結合した他の蛋白質のアミノ酸配列とを含んでなる。

Description

本発明は，中枢神経系（ＣＮＳ）において機能させるべき蛋白質の血液脳関門輸送に関し，詳しくは，特定の抗トランスフェリン受容体抗体，それらの抗体の何れかと中枢神経系において機能させるべき蛋白質とを融合させてなる融合蛋白質，及び，中枢神経系において機能させるべきタンパク質を特定の抗トランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質の形で投与することによる，当該蛋白質を中枢神経系に送達して機能させる方法に関する。

脳室周囲器官（松果体，脳下垂体，最後野等）を含む幾つかの領域を除く脳の大半の組織に血液を供給する毛細血管は，筋肉等その他の組織に存在する毛細血管と異なり，これを形成している内皮細胞が強固な細胞間接合によって結合し合っている。そのため，血液から脳への物質の受動移動が妨げられ，例外はあるものの，脂溶性の高い物質，又は分子量が小さく（200〜500ダルトン以下）且つ生理pH付近において電気的に中性な物質以外，毛細血管から脳へ移行しにくい。このような，脳内毛細血管の内皮細胞を介した，血液と脳の組織液との間の物質交換を制限する機構は，血液脳関門（Blood Brain Barrier又はBBB）と呼ばれている。また，血液脳関門は，脳のみならず，血液と脳及び脊髄を含む中枢神経系の組織液との間の物質交換を制限している。

血液脳関門の存在により，中枢神経系の細胞の大半は，血中のホルモン，リンホカイン濃度の変動等の影響を受けることなく，その生化学的な恒常性が保たれる。

しかしながら，血液脳関門の存在は，薬剤開発のうえで問題を提起する。例えば，神経成長因子（ＮＧＦ）は，中枢神経系においてコリン作動性ニューロンに作用し，アポトーシスによる細胞死を防止して細胞の生存維持に機能していると考えられ，アルツハイマー病の痴ほう症治療薬として期待されたが，神経成長因子は，分子量が10kDを超えることから，血液脳関門を通過せず脳内に存在する患部に到達しないので，アルツハイマー病の治療剤として機能を発揮しないとされた。また，α−Ｌ−イズロニダーゼの欠損に起因する遺伝性代謝疾患である，ムコ多糖症Ｉ型（ハーラー症候群）に対しては，組換えα−Ｌ−イズロニダーゼを静脈内補充する酵素補充療法が，その治療法として行われているが，ハーラー症候群において顕著な中枢神経系（ＣＮＳ）の異常に対しては，酵素が血液脳関門を通過できないことから有効でない。

そのような中枢神経系において作用させるべき蛋白質等の高分子物質に血液脳関門を通過させるための方法が，種々開発されている。例えば，神経成長因子の場合，これをリポソームに内包させ，リポソームと脳内毛細血管の内皮細胞の細胞膜との融合により，血液脳関門を通過させる方法が試みられているが，実用化に至っていない（非特許文献１）。α−Ｌ−イズロニダーゼの場合，１回当たりに投与される酵素の量を増加させて酵素の血中濃度を高めることにより，血液脳関門における酵素の受動輸送を高める試みが行われ，ハーラー症候群の動物モデルを用いて，この手法により中枢神経系（ＣＮＳ）の異常が緩解することが示されている（非特許文献２）。

また，高分子物質を髄腔内又は脳内に直接投与する試みも行われている。例えば，ハーラー症候群（ムコ多糖症Ｉ型）の患者の髄腔内にヒトα−Ｌ−イズロニダーゼを投与する方法（特許文献１），ニーマン−ピック病の患者の脳室内にヒト酸スフィンゴミエリナーゼを投与する方法（特許文献２），ハンター症候群のモデル動物の脳室内にイズロン酸２−スルファターゼ（I2S）を投与する方法（特許文献３）が報告されている。このような手法によれば，確実に中枢神経系に薬剤を作用させることができると考えられる一方，侵襲性が高い。

血液脳関門を通して高分子物質を脳内に到達させる方法として，脳内毛細血管の内皮細胞上に存在する膜蛋白質と親和性を持つように高分子物質を修飾し膜蛋白質と複合体を形成させてエンドサイト―シスにより血液脳関門を通過させる方法が種々報告されている。脳内毛細血管の内皮細胞上に存在する膜蛋白質としては，例えば，インスリン，トランスフェリン，インスリン様成長因子（IGF-I，IGF-II），LDL，及びレプチンに対する受容体が挙げられる。

例えば，神経成長因子（NGF）をインスリンとの融合蛋白質の形で合成し，この融合蛋白質をインスリン受容体との結合を介して血液脳関門を通過させる技術が報告されている（特許公報４〜６）。また，神経成長因子（NGF）を抗インスリン受容体抗体との融合蛋白質の形で合成し，この融合蛋白質をインスリン受容体との結合を介して血液脳関門を通過させる技術が報告されている（特許文献４及び７）。また，神経成長因子（NGF）をトランスフェリンとの融合蛋白質の形で合成し，この融合蛋白質をトランスフェリン受容体（TfR）との結合を介して血液脳関門を通過させる技術が報告されている（特許文献８）。また，神経成長因子（NGF）を抗トランスフェリン受容体抗体（抗TfR抗体）との融合蛋白質の形で合成し，この融合蛋白質をトランスフェリン受容体との結合を介して血液脳関門を通過させる技術が報告されている（特許文献４及び９）。

抗トランスフェリン受容体抗体を用いた技術について更にみると，薬剤を抗TfR抗体と結合させて血液脳関門を通過させる技術において，抗TfR抗体の重鎖C末端側にリンカーを介して軽鎖を結合させた一本鎖抗体を使用できることが報告されている（非特許文献３）。また，hTfRとの解離定数が30nM〜1μMの抗hTfR抗体が，薬剤をして血液脳関門を通過させる技術において好適に利用できることが報告されている（特許文献１０）。また，I2S等のリソソーム酵素を抗hTfR抗体と結合させた融合蛋白質とすることにより，リソソーム酵素をして血液脳関門を通過させることができることが報告されている（特許文献１１）。抗hTfR抗体とリポソームを組合わせて，抗hTfR抗体を表面に有するリポソームに薬剤を内包させることにより，薬剤をして血液脳関門を通過させる技術についても報告がある（特許文献１２，１３）。

上記抗体との融合蛋白質を医薬として利用することを考えた場合，投与開始後に，その抗体に対する免疫反応等の過剰反応が生じて薬剤の投与が困難となる場合も考えられる。従って，そのような場合に備えて，既知の抗体とは別の抗体との融合蛋白質を準備しておくことは，過剰反応による治療の中止という問題を回避する上で極めて意義が高い。

特表２００７−５０４１６６号公報特表２００９−５２５９６３号公報特開２０１２−６２３１２号公報米国特許５１５４９２４号公報特開２０１１−１４４１７８号公報米国特許２００４／０１０１９０４号公報特表２００６−５１１５１６号公報特開Ｈ０６−２２８１９９号公報特許第５９７７３０７号公報ＷＯ２０１２／０７５０３７特表２０１３−５０７１３１号公報ＷＯ１９９１／０４０１４ＷＯ２０１３／０５９６１７

Xie Y. et al., J Control Release. 105. 106-19(2005) Ou L. et al., Mol Genet Metab.(2013) Li JY. Protein Engineering. 12. 787-96(1999)

上記背景の下で，本発明の目的は，血液脳関門を通過し得る新規抗トランスフェリン受容体抗体，及び血中に投与して中枢神経系において機能させるべき蛋白質と当該抗体との融合蛋白質，及びそれらの製造法若しくは使用法を提供することである。

上記目的に向けた研究において，本発明者らは，鋭意検討を重ねた結果，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であって，当該抗体と融合させることによりリソソーム酵素をして血液脳関門を通過させることができる，新規抗体を見出し本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を提供する。
１．配列番号１，２及び３からなる群から選択される何れかのアミノ酸配列を認識する抗ヒトトランスフェリン受容体抗体。
２．該配列番号１，２及び３からなる群から選択されるアミノ酸配列中の少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基よりなる部分を認識する，上記１の抗ヒトトランスフェリン受容体抗体。
３．上記１又は２の何れかの抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であって，
軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，
そのＣ末端側に第１のリンカー配列として結合した１５〜２５個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と，
更にそのＣ末端側に結合した，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含んでなる１本鎖抗体である，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体。
４．配列番号４，５，６及び７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる，上記３の抗ヒトトランスフェリン受容体抗体。
５．上記１〜４の何れかの抗ヒトトランスフェリン受容体抗体と，そのＣ末端側に結合した他の蛋白質のアミノ酸配列とを含んでなる，融合蛋白質。
６．上記１〜４の何れかの抗ヒトトランスフェリン受容体抗体と，
そのＣ末端側に第２のリンカー配列として結合した３〜５０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と，
更にそのＣ末端側に結合した他の蛋白質のアミノ酸配列とを含んでなる，融合蛋白質。
７．該他の蛋白質がリソソーム酵素である，上記５又は６の融合蛋白質。
８．該リソソーム酵素がヒトイズロン酸−２−スルファターゼである，上記７の融合蛋白質。
９．上記１〜４の何れかの抗ヒトトランスフェリン受容体抗体をコードするＤＮＡ。
１０．上記５〜８の何れかの融合蛋白質をコードするＤＮＡ。
１１．上記１０のＤＮＡを組み込んだ哺乳動物発現用ベクター。
１２．上記１１の哺乳動物発現用ベクターで形質転換させた哺乳動物細胞。
１３．該哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である，上記１２の細胞。

本発明によれば，中枢神経系（ＣＮＳ）において機能させようとする蛋白質，特に生理活性蛋白質を，抗ヒトトランスフェリン受容体との融合蛋白質とすることにより血液脳関門を通過させることができる形で提供でき，従って，それらの生理活性蛋白質を血中に投与して直接中枢神経系に作用させることが可能である。

図１Ａは，形質転換大腸菌クローンM11により産生されたhI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質をマウスに尾静脈投与したときの脳分布試験の結果を，rhI2Sでの結果と共に示す。縦軸は脳ホモジネート中のI2S濃度（μg/湿重量）を示す（各群2匹の平均値）。図１Ｂは，形質転換大腸菌クローンM27により産生されたhI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質をマウスに尾静脈投与したときの脳分布試験の結果を，rhI2Sでの結果と共に示す。縦軸は脳ホモジネート中のI2S濃度（μg/湿重量）を示す（各群2匹の平均値）。図１Ｃは，形質転換大腸菌クローンB84により産生されたhI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質をマウスに尾静脈投与したときの脳分布試験の結果を，rhI2Sでの結果と共に示す。縦軸は脳ホモジネート中のI2S濃度（μg/湿重量）を示す（各群2匹の平均値）。図２は，ハンター症候群病態モデルマウスを用いたhI2S-sc抗TfR抗体融合蛋白質の薬効評価の結果を示す図。縦軸は，ビヒクルを投与したマウスの脳内に蓄積したグリコサミノグリカンの量を100％としたときの，rhI2Sを投与したマウス及びhI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質を投与したマウスにおける，グリコサミノグリカンの蓄積量（％）を示す（値は各群3匹の平均値）。

本発明において，「１本鎖抗体」というときは，免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含む配列，そのＣ末端に第１のリンカー配列，更にそのＣ末端側に免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列を有し，特定の抗原に特異的に結合する抗体のことをいう。免疫グロブリン軽鎖の可変領域は，抗原と直接接触し抗体の特異性を決定する相補性決定領域（CDR）を３つ有している。同様に，免疫グロブリン重鎖の可変領域も，CDRを３つ有している。これらのCDRは，抗原と直接接触し抗体の特異性を決定する領域である。従って，１本鎖抗体には，免疫グロブリン重鎖の３つのCDRが全てと，免疫グロブリン軽鎖の３つのCDRの全てとが含まれることが好ましい。

但し，CDRのアミノ酸配列には，１本鎖抗体の抗原に対する親和性が著しく損なわれない限り，１又は数個のアミノ酸を置換，挿入，決失させる等の変異を導入してもよく，また，変異を導入することにより，１本鎖抗体と抗原の親和性を適宜調整することができる。例えば，１本鎖抗体と抗原との親和性が高く，水性液中での解離定数が著しく低い場合，これを生体内に投与したときに，１本鎖抗体が抗原と解離せず，その結果，機能上の不都合が生じる可能性がある。このような場合に，CDRに変異を導入することにより，解離定数を，元の抗体の２〜５倍，５〜10倍，10〜100倍等と段階的に調整し，目的に合致した最も好ましい１本鎖抗体を獲得し得る。逆に，当該変異の導入により，解離定数を，元の抗体の1/2〜1/5倍，1/5〜1/10倍，1/10〜1/100倍等と段階的に調整することもできる。このような解離定数の調整は，１本鎖抗体をコードする遺伝子をファージミドに組み込み，これを用いてカプシド表面上に１本鎖抗体をさせたファージを作成し，変異原等を作用させることにより１本鎖抗体をコードする遺伝子上に変異を導入させながらファージを増殖させ，増殖させたファージから，所望の解離定数を有する１本鎖抗体を発現するファージを，一定条件下で抗原カラムを用いて精製することで，得ることができる。

なお，本発明において，「１本鎖抗体の抗原に対する親和性」とは，抗原を特異的に認識して結合する１本鎖抗体の性質のことをいい，「１本鎖抗体が抗原に対して親和性を有する」とは，１本鎖抗体が，生理的条件下で，好ましくは0.1nM〜5μM，更に好ましくは1nM〜1μMの解離定数で，抗原に特異的に結合する性質を有することをいう。

１本鎖抗体をコードする遺伝子は，抗原で免疫した動物から得た脾細胞又は末梢血単核球、若しくは試験管内において抗原で免疫した脾細胞又は末梢血単核球から抽出したmRNAを鋳型としてcDNAを合成し，このcDNAを鋳型として，PCRにより免疫グロブリン軽鎖をコードするDNA断片と免疫グロブリン重鎖をコードするDNA断片とをそれぞれ増幅し，次いで，免疫グロブリン軽鎖をコードするDNA断片の3’末端側に，第１のリンカー配列をコードするDNA配列を挟んで，免疫グロブリン重鎖をコードするDNA断片が連結するように増幅させて構築することができる。逆に，免疫グロブリン重鎖をコードするDNA断片の3’末端側に，第１のリンカー配列をコードするDNA配列を挟んで，免疫グロブリン軽鎖をコードするDNA断片が連結するように増幅させて，１本鎖抗体をコードする遺伝子を構築することもできる。このようにして構築した１本鎖抗体をコードする遺伝子は，動物細胞内で発現できるように，5’末端側に開始コドンが配置される。このとき，免疫グロブリン軽鎖と重鎖のcDNAの間に配置される第１のリンカー配列をコードするDNA配列は，好ましくは15〜25個，より好ましくは15〜20個，さらに好ましくは15個のアミノ酸残基から構成されるペプチド鎖を第１のリンカー配列としてコードするものである。かかる第１のリンカー配列は，リンカー配列により連結された免疫グロブリンの軽鎖と重鎖が抗原を認識し得る立体配置をとることができる限り，そのアミノ酸配列に制限はないが，好ましくは，グリシンとセリンから構成されるものであり，例えば，配列番号８で示されるアミノ酸配列（Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser）を有するものである。

本発明において，「１本鎖抗ヒトトランスフェリン受容体抗体」，「１本鎖抗hTfR抗体」又は「sc抗hTfR抗体」というときは，上記の１本鎖抗体の中で，ヒトトランスフェリン受容体を抗原として，これに特異的に結合するものをいう。このような１本鎖抗hTfR抗体をコードする遺伝子は，上記の１本鎖抗体をコードする遺伝子を作成する手法において，hTfR，又はhTfRを構成するペプチド鎖の部分アミノ酸配列を有する，13〜25個のアミノ酸からなるペプチド鎖を抗原として試験管内で免疫した脾臓又は末梢血単核球，若しくは、かかるペプチド鎖を抗原として免疫した動物から得た脾細胞又は末梢血単核球から抽出したmRNAを鋳型として合成したcDNAから，作製することができる。このとき用いられるhTfRを構成するペプチド鎖としては，生理的条件下でhTfRに特異的に結合する抗hTfR抗体が得られるものである限り特に限定はないが，次のアミノ酸配列を有するペプチド鎖：
(1) Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys Lys Asp Phe Glu（配列番号１）
(2) Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly（配列番号２），及び
(3) Val Gly Ala Thr Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser（配列番号３）
が好適に使用できる。

従って，本発明の１本鎖抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の好ましい形態は，ヒトトランスフェリン受容体を構成するペプチド鎖中の一部分をなす配列番号１〜３で示すアミノ酸配列を認識して特異的に結合するものであり，より好ましくは配列番号１〜３で示すアミノ酸配列中の少なくとも10個の連続するアミノ酸残基よりなる配列を認識するものであり，更に好ましくは，配列番号１〜３で示すアミノ酸配列中の13個の連続するアミノ酸残基よりなる配列を認識するものである。

上記手法で作成された１本鎖抗hTfR抗体をコードする遺伝子は，多様なDNA配列を有する免疫グロブリン遺伝子からPCRにより増幅された増幅産物群として得られたものであるので，その中から，所望の１本鎖抗hTfR抗体をコードする遺伝子を単離する必要がある。従って，所望の性質を有する１本鎖抗hTfR抗体をコードする遺伝子をスクリーニングするため，それらPCRによる増幅等をして作成された１本鎖抗hTfR抗体をコードする遺伝子を，一旦，哺乳動物細胞，酵母等の真核生物又は大腸菌等の原核生物細胞用の発現ベクターに組み込み，１本鎖抗hTfR抗体cDNAライブラリを作成する必要がある。次いで，このライブラリを用いてホスト細胞を形質転換して１本鎖抗hTfR抗体を発現させ，発現させた１本鎖抗hTfR抗体と抗原との親和性を測定して，所望の親和性を有する１本鎖抗hTfR抗体を発現するホスト細胞を単離することにより，所望の１本鎖抗hTfR抗体をコードする遺伝子を単離，特定することができる。１本鎖抗hTfR抗体とhTfRの親和性は，生理的条件下での解離定数が1nM〜1μMであることが好ましいが，これに限らず，１本鎖抗hTfR抗体の用途によって，その親和性は適宜調整される。

本発明において，「Sc抗hTfR抗体融合蛋白質」というときは，上記の１本鎖抗hTfR抗体のＣ末端側に，第２のリンカー配列を介して又は直接に，他の任意の蛋白質が融合したものをいう。そのようなSc抗hTfR抗体融合蛋白質は，他の蛋白質をコードするcDNAの5’末端側に，直接，又はリンカー配列をコードするDNA断片を挟んで，所望のhTfRに対する親和性を有する１本鎖抗hTfR抗体をコードするcDNAを連結したDNA断片を，哺乳動物細胞，酵母等の真核生物又は大腸菌等の原核生物細胞用の発現ベクターに組み込み，これらの細胞中で発現させることにより得ることができる。このとき，１本鎖抗hTfR抗体と他の蛋白質に配置される第２のリンカー配列は，好ましくは3〜50個，より好ましくは13〜17個，さらに好ましくは15個のアミノ酸から構成されるペプチド鎖である。そのような第２のリンカー配列は，当該リンカー配列により連結された１本鎖抗hTfR抗体がhTfRと親和性を保持し，且つ当該リンカー配列により連結された他の蛋白質が，生理的条件下で当該蛋白質の生理活性を発揮できる限り，そのアミノ酸配列に制限はないが，好ましくは，グリシンとセリンから構成されるものであり，例えば，配列番号９で示されるアミノ酸配列（Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser）を有するものである。

Sc抗hTfR抗体融合蛋白質は，ヒト体内に投与された場合，脳内毛細血管の内皮細胞上に発現するhTfRと結合し，エンドサイトーシス等の機構により血液脳関門を通過して脳内に取り込まれる。従って，脳内で機能させるべき蛋白質をSc抗hTfR抗体と融合させたSc抗hTfR抗体融合蛋白質をヒトの血中に投与した場合，通常なら血液脳関門を通過することができず脳内で機能させることが期待できない蛋白質でも，脳内に到達させてその機能を発揮させることができるようになる。従って，Sc抗hTfR抗体融合蛋白質は， Sc抗hTfR抗体と融合させる蛋白質を適宜選択することにより，アルツハイマー病，パーキンソン病，ハンチントン舞踏病，筋委縮性側索硬化症，脳腫瘍，脳障害を伴うリソソーム病，糖原病等の疾患に対する治療剤として利用できる。例えば，Sc抗hTfR抗体と融合させた神経成長因子（NGF-Sc抗hTfR抗体）は，アルツハイマー病の痴ほう症治療薬として，Sc抗hTfR抗体と融合させたα−Ｌ−イズロニダーゼはハーラー症候群の脳障害治療剤として，Sc抗hTfR抗体と融合させたイズロン酸−２−スルファターゼはハンター症候群の脳障害治療剤として使用できる。

その他，Sc抗hTfR抗体と融合させて薬効を発揮できる蛋白質としては，脳由来神経栄養因子（BDNF），毛様体神経栄養因子（CNTF），グリア細胞株神経栄養因子（GDNF），各種ニュートロフィン，アクチビン，塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF），上皮細胞増殖因子（EGF），各種サイトカイン，インターフェロンα，インターフェロンβ，インターフェロンγ，インターロイキン６，顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF），顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF），マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF），PD-1等が挙げられる。

以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。

〔マウス１本鎖抗hTfR抗体cDNAライブラリの作製〕
マウス脾臓から得た細胞を分割し，これを，ヒトトランスフェリン受容体（hTfR）を構成するペプチド鎖の部分アミノ酸配列を有する３種類のペプチド，すなわち，ペプチド１（アミノ酸配列を配列番号１で示す），ペプチド２（アミノ酸配列を配列番号２で示す），ペプチド３（アミノ酸配列を配列番号３で示す）及びこれらペプチドを組合わせたものを用いて，体外免疫法によりそれぞれ免疫した。体外免疫法は概略以下の手法で行った。15mLの遠沈管にペプチドをそれぞれ１nmolと，アジュバントとして，Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン10mg/mLを５μL添加し，次いで，マウス脾臓から得た細胞を1.5×10⁷個添加して室温で15分間静置した。次いで，IL-4，IL-13，抗−CD40抗体及びLPS を，終濃度がそれぞれ10ng/mL，10ng/mL，１μg/mL及び40μg/mLとなるように添加してから40% FBS含有RPMI1640培地を3.5mL添加し，5％CO₂存在下，37℃で2日間培養した。更に，IL-21を，終濃度が10ng/mLとなるように添加し，同条件下で更に3日間培養した。

免疫後の細胞から全RNAを抽出し，これを鋳型として１本鎖cDNAを合成した。１本鎖cDNAからPCRにより免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のcDNAをそれぞれ増幅した。免疫グロブリン軽鎖の増幅には，下記の配列番号１０〜２７に示す塩基配列を有するフォワードプライマー：
(1) VL-FW1：ttcatggcggactacaaagayatccagctgactcagcc（配列番号１０）
(2) VL-FW2：ttcatggcggactacaaagayattgttctcwcccagtc（配列番号１１）
(3) VL-FW3：ttcatggcggactacaaagayattgtgmtmactcagtc（配列番号１２）
(4) VL-FW4：ttcatggcggactacaaagayattgtgytracacagtc（配列番号１３）
(5) VL-FW5：ttcatggcggactacaaagayattgtratgacmcagtc（配列番号１４）
(6) VL-FW6：ttcatggcggactacaaagayattmagatramccagtc（配列番号１５）
(7) VL-FW7：ttcatggcggactacaaagayattcagatgaydcagtc（配列番号１６）
(8) VL-FW8：ttcatggcggactacaaagayatycagatgacacagac（配列番号１７）
(9) VL-FW9：ttcatggcggactacaaagayattgttctcawccagtc（配列番号１８）
(10) VL-FW10：ttcatggcggactacaaagayattgwgctsacccaatc（配列番号１９）
(11) VL-FW11：ttcatggcggactacaaagayattstratgacccartc（配列番号２０）
(12) VL-FW12：ttcatggcggactacaaagayrttktgatgacccarac（配列番号２１）
(13) VL-FW13：ttcatggcggactacaaagayattgtgatgacbcagkc（配列番号２２）
(14) VL-FW14：ttcatggcggactacaaagayattgtgataacycagga（配列番号２３）
(15) VL-FW15：ttcatggcggactacaaagayattgtgatgacccagwt（配列番号２４）
(16) VL-FW16：ttcatggcggactacaaagayattgtgatgacacaacc（配列番号２５）
(17) VL-FW17：ttcatggcggactacaaagayattttgctgactcagtc（配列番号２６）
(18) VL-FW18：ttcatggcggactacaaagatgctgttgtactcaggaatc（配列番号２７）
と，下記の配列番号２８〜３２に示す塩基配列を有するリバースプライマー：
(19) VL-RV1：ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccacgtttgatttccagcttgg（配列番号２８）
(20) VL-RV2：ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccacgttttatttccagcttgg（配列番号２９）
(21) VL-RV3：ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccacgttttatttccaactttg（配列番号３０）
(22) VL-RV4：ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccacgtttcagctccagcttgg（配列番号３１）
(23) VL-RV5：ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccacctaggacagtcagtttgg（配列番号３２）
とを用いた。

なお，塩基配列中，「r」はg又はaを，「y」はt又はcを，「m」はa又はcを，「k」はg又はtを，「s」はg又はcを，「w」はa又はtを，「b」はg，c又はtを，「d」はa，g又はtを，「v」はa，g又はcを，それぞれ表す。

また，免疫グロブリン重鎖の増幅には，下記の配列番号３３〜５１に示す塩基配列を有するフォワードプライマー：
(1) VH-FW1：ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAKgTRMAgCTTCAggAgTC（配列番号３３）
(2) VH-FW2：ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAggTBCAgCTBCAgCAgTC（配列番号３４）
(3) VH-FW3：ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCCAggTgCAgCTgAAgSASTC（配列番号３５）
(4) VH-FW4：ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAggTCCARCTgCAACARTC（配列番号３６）
(5) VH-FW5：ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCCAggTYCAgCTBCAgCARTC（配列番号３７）
(6) VH-FW6：ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCCAggTYCARCTgCAgCAgTC（配列番号３８）
(7) VH-FW7：ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCCAggTCCACgTgAAgCAgTC（配列番号３９）
(8) VH-FW8：ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAggTgAASSTggTggAATC（配列番号４０）
(9) VH-FW9：ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAVgTgAWgYTggTggAgTC（配列番号４１）
(10) VH-FW10：ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAggTgCAgSKggTggAgTC（配列番号４２）
(11) VH-FW11：ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAKgTgCAMCTggTggAgTC（配列番号４３）
(12) VH-FW12：ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAggTgAAgCTgATggARTC（配列番号４４）
(13) VH-FW13：ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAggTgCARCTTgTTgAgTC（配列番号４５）
(14) VH-FW14：ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgARgTRAAgCTTCTCgAgTC（配列番号４６）
(15) VH-FW15：ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAAgTgAARSTTgAggAgTC（配列番号４７）
(16) VH-FW16：ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCCAggTTACTCTRAAAgWgTSTg（配列番号４８）
(17) VH-FW17：ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCCAggTCCAACTVCAgCARCC（配列番号４９）
(18) VH-FW18：ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgATgTgAACTTggAAgTgTC（配列番号５０）
(19) VH-FW19：ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAggTgAAggTCATCgAgTC（配列番号５１）
と，下記の配列番号５２〜５５に示す塩基配列を有するリバースプライマー：
(20) VH-RV1：ggCAAgCTTTACCTgCAgCgAggAAACggTgACCgTggT（配列番号５２）
(21) VH-RV2：ggCAAgCTTTACCTgCAgCgAggAgACTgTgAgAgTggT（配列番号５３）
(22) VH-RV3：ggCAAgCTTTACCTgCAgCgCAgAgACAgTgACCAgAgT（配列番号５４）
(23) VH-RV4：ggCAAgCTTTACCTgCAgCgAggAgACggTgACTgAggT（配列番号５５）
とを用いた。

次いで，上記PCRにより増幅させて得た免疫グロブリンの軽鎖cDNAと重鎖cDNAとを等モル混和してPCRを行い，軽鎖cDNAの3’側に，第１のリンカー配列として配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するペプチド鎖をコードする塩基配列を介して，重鎖cDNAが結合した１本鎖抗hTfR抗体をコードするcDNAを増幅させた。次いで，増幅させて得た１本鎖抗hTfR抗体をコードするcDNAを鋳型として，配列番号５６に示す塩基配列（ggcgaattcatggcggactacaaag）を有するフォワードプライマーと配列番号５７に示す塩基配列（ggcaagctttactgcagcg）を有するリバースプライマーとを用いてPCRを行った。得られた増幅産物をEcoRI/HindIIIで切断し，この増幅産物がコードするペプチド鎖のＮ末端側にマルトース結合蛋白質が融合するように，大腸菌発現用プラスミドの pMAL-c2E（New England Biolabs社）のEcoRI/HindIIIに組み込み，これを，マウス１本鎖抗hTfR抗体cDNAライブラリとした。なお，このcDNAライブラリの作成は，国際公開公報WO 2009/072660及び特開2012-29685に記載の方法に準じて行った。

〔ヒト１本鎖抗hTfR抗体cDNAライブラリの作製〕
上記マウス１本鎖抗hTfR抗体cDNAライブラリの作製と同様の手法により，ペプチド１（配列番号１），ペプチド２（配列番号２），ペプチド３（配列番号３）及びこれらペプチドを組合わせたものを用いて，ヒト末梢血単核球（ロンザ社）を体外免疫法により免疫して全RNAを抽出し，これを鋳型として，ヒト１本鎖抗hTfR抗体cDNAライブラリを作成した。

〔１本鎖抗hTfR抗体cDNAライブラリのスクリーニング〕
大腸菌（JM109）を，マウス及びヒト１本鎖抗hTfR抗体cDNAライブラリにより形質転換させた後，アンピシリン（Amp）を含むLBプレートに播種し，37℃で一晩培養した。翌日，プレート上に形成されたコロニーを一つずつ採取し，96穴プレートに予め分注したOvernight Express^TM Instant LB Medium（Novagen社）に植菌した。これを37℃で一晩振とう培養した後，Popculture Reagent (Novagen社) を1/10量加えて溶菌し，次いで等量のTBS-Tを添加して遠心し，上清を回収した。この上清をサンプル溶液とした。

96穴プレートの各穴に5μg/mLの組換えヒトTfR（rhTfR）（Sino Biological社）又はウシガンマグロブリン（バイオラッド社）を50μL加え，4℃で一晩静置した。溶液を除去した後，各穴を300μL のTBS-Tで1回洗浄した。次いで，各穴に１% BSA溶液を300μL加えて30分室温で静置した。溶液を除去した後，各穴に上記のサンプル液を100μLずつ加えて室温で２時間静置した。溶液を除去した後，各穴を300μL のTBS-Tで３回洗浄し，次いで50μL のHRP標識抗MBP抗体（ノバジェン社）を添加し１時間室温で静置した。溶液を除去した後，各穴を300μL のTBS-Tで３回洗浄し，次いで50μL のPOD基質溶液（ナカライテスク社）を添加し，10〜15分室温で反応させた。100μL の0.2N HCl溶液を添加して反応を停止し，プレートリーダーで450nmの吸光度を測定して，rhTfRと親和性の高い１本鎖抗rhTfR抗体を発現するクローン（rhTfR高親和性クローン）を特定した。マウス１本鎖抗hTfR抗体cDNAライブラリからは，rhTfR高親和性クローンとして，M11，M23及びM27の3種類のクローンが得られた。また，ヒト１本鎖抗hTfR抗体cDNAライブラリからは，rhTfR高親和性クローンとして，1種のクローン（B84）が得られた。

なお，クローンM11はペプチド２（配列番号２）及びペプチド３（配列番号３），クローンM23はペプチド２（配列番号２）及びペプチド３（配列番号３），クローンM27はペプチド２（配列番号２）及びペプチド３（配列番号３），クローンB84はペプチド１（配列番号１）で，それぞれ免疫した細胞由来の１本鎖抗hTfR抗体ライブラリをスクリーニングして得られたものであった。従って，クローンM11，クローンM23及びクローンM27は，ペプチド２又はペプチド３のアミノ酸配列の全部又は一部をエピトープとして認識するマウス１本鎖抗hTfR抗体を発現するクローンであり，クローンB84はペプチド１のアミノ酸配列の全部又は一部をエピトープとして認識するヒト１本鎖抗hTfR抗体を発現するクローンである。

〔rhTfR高親和性クローンの解析〕
上記スクリーニングで得た4種のrhTfR高親和性クローンから，発現ベクターを精製し，各クローンがコードする１本鎖抗rhTfR抗体のアミノ酸配列を解析した。その結果，クローンM11は配列番号４，クローンM23は配列番号５，クローンM27は配列番号６，クローンB84は配列番号７にそれぞれ示すアミノ酸配列を有する１本鎖抗rhTfR抗体をコードすることが判った。

〔ヒトイズロン酸−２−スルファターゼと１本鎖抗rhTfR抗体との融合蛋白質の作成〕
上記４種のrhTfR高親和性クローンから，発現ベクターを精製し，これをEcoRI/HindIIIで消化してアガロースゲル電気泳動に供し，１本鎖抗rhTfR抗体をコードする約700bpのDNA断片を切り出し，次いで，このDNA断片をpET32aベクターのEcoRI/HindIIIに組み込んだ。こうして得られたベクターを用いて大腸菌（JM109）を形質転換させた後，アンピシリン（Amp）を含むLBプレートに播種し，37℃で一晩培養した。翌日，プレート上に形成されたコロニーをLB培地で培養した後，クローン毎にベクターを回収した。

回収したベクターをBglII/NotIで消化してアガロースゲル電気泳動に供し，１本鎖抗rhTfR抗体をコードする約700bpのDNA断片を切り出した。ヒト胎盤cDNAライブラリ（タカラバイオ）を鋳型として，第一反応に用いる外側プライマーセット：
(a) I2S-f： ACGCCTATTGCTGCAGGATG（配列番号５８），及び
(b) I2S-r：AAACGACCAGCTCTAACTCC（配列番号５９），並びに
第二反応に用いる内側プライマーセット：
(c) I2S-f2：ATActcgagGCCACCATGCCGCCACCCCGG（配列番号６０），及び
(d) I2S-r2：TTCTTATgcggccgcTCAAGGCATCAACAA（配列番号６１）
の２つのプライマーセットを用いてネスティッドPCRを行い，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（hI2S）をコードする cDNAを含むDNA断片を増幅させた。この増幅産物を，XhoIとNotIで消化し，哺乳動物発現ベクターpE-neo7のXhoIとNotIサイトに組込み，pE-neo-I2Sを得た。なお，pE-neo7は，国際公開公報WO 2012/101998に記載の方法で作成した。

pE-neo-hI2SをBglII/NotIで消化し，これに上記のBglII/NotIで消化した１本鎖抗hTfR抗体をコードする約700bpのDNA断片を組み込み，hI2SのN末端側に１本鎖抗hTfR抗体が融合した融合蛋白質（hI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質）を哺乳動物細胞内で発現することのできるベクターを構築した。こうして得られたベクターを用いて大腸菌（JM109）を形質転換させた後，アンピシリン（Amp）を含むLBプレートに播種し，37℃で一晩培養した。翌日，プレート上に形成されたコロニーをLB培地で培養した後，コロニー毎にベクターを回収した。CHO細胞を，回収したベクターにより，エレクトロポレーション法を用いて形質転換させた後，ネオマイシン存在下で１週間選択培養して，hI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質を発現する薬剤耐性細胞を，クローン毎に得た。

クローン毎に得た薬剤耐性細胞を，200mLのOptiCHO培地（Invitrogen社）を含む１L三角フラスコで培養し，培養７日目に培養上清を回収した。回収した培養上清を0.22μm膜フィルターで粒子を除去し，平衡化バファー (20mM HEPES, 100mM NaCl, pH7.0)で平衡化させたHiTrap Q HP Sepharose カラム（カラム容量：5mL）に付加した。次いで，カラムを５倍容の平衡化バファー洗浄し，平衡化バファーと溶出バファー(20mM HEPES, 500mM NaCl, pH6.0)の直線グラジエントでhI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質を溶出させた。hI2Sの酵素活性の高い画分を纏めて，30kDa cutoffの限外濾過膜濃縮カラムを用いて約10倍に濃縮後，-80℃で保存した。なお，hI2Sの酵素活性の測定は，国際公開公報WO 2012/101998に記載の方法に準じて行った。

〔hI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質のマウスでの脳分布試験〕
雄性C57BL/6Nマウスへ，組換えhI2S及びクローン毎（M11，M23，M27，及びB84）に得た上記精製したhI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質を３及び６mg/kgの用量で尾静脈内投与した (ｎ＝２／群)。投与から７時間後に，マウスをイソフルランで麻酔し，マウスの静脈から生理食塩水を潅流させた後，脳を採取した。採取した脳を，Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich Co. LLC.) を含むT-PER Tissue Protein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific K.K.) でホモジネートし，遠心して上清を回収した。回収した上清と，ビオチン化抗hI2Sモノクローナル抗体及びSulfo化抗hI2Sモノクローナル抗体とを混和し，室温で１時間反応させて，ビオチン化抗I2Sモノクローナル抗体，hI2S-scrhTfR抗体融合タンパク及びSulfo化hI2Sモノクローナル抗体の複合体を形成させた。次いで，上記複合体を含む反応液をStreptavidin Gold Plates (Meso Scale Diagnostics, LLC.) へ添加し1時間反応させて，上記複合体を，ビオチンとストレプロアビジンとの結合を介して，プレート上へ結合させた。プレートを洗浄後，SECTOR Imager 6000 （Meso Scale Diagnostics, LLC.）を用いて，プレートに電流を流すことにより上記複合体中のSulfo標識体に電気化学的刺激を与え，このときSulfo標識体から発せられる蛍光強度を測定することにより，hI2S-scrhTfR融合タンパクの濃度を測定した。なお，組換えhI2Sは，国際公開公報WO2012/101998に記載の方法に準じて調製したものを使用した。

〔hI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質のハンター症候群病態モデルマウスを用いた薬効評価〕
ハンター症候群の病態モデルマウスである，雄性イズロン酸２−スルファターゼ遺伝子ノックアウトマウスに，ビヒクル（生理食塩水），組換えhI2S（rhI2S），及びクローンM11のhI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質を３ mg/kgの用量で，３日に１回，計３回，尾静脈内投与した (n=3/群)。最終投与から３日後にマウスをイソフルランで麻酔して放血致死させた後，脳を採取した。採取した脳を直ちに液体窒素中で急速凍結し，その後凍結乾燥した。次いで，凍結乾燥した脳を粉砕し，粉砕した脳組織を0.5 mol/Lトリス塩酸緩衝液 (pH 7.5) 中に懸濁させ，これにアクチナーゼＥを添加して60℃で16時間静置し，タンパク質を消化させた。次いで，遠心して上清を回収し，Wieslab sGAG quantitative kit (Euro-Diagnostica AB) を用いアルシアンブルー比色定量法により，上清中に含まれるhI2Sの基質であるグリコサミノグリカンの濃度を定量した。

〔結果１： hI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質のマウスでの脳分布試験〕
rhI2Sを投与したマウスでは，脳ホモジネート中のI2S濃度は，３及び６mg/kg投与群ともに，0.01μg/g湿重量未満であった。一方，クローン毎に得たhI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質を投与したマウスでは，脳ホモジネート中のI2S濃度が，rhI2Sを投与したマウスと比較して，10〜20倍の高値を示した（図１Ａ〜図１Ｃ，クローンM23については示さず）。また，４種のクローン中，クローンB84のhI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質を投与したマウスでの脳ホモジネート中のI2S濃度が，最も高値であった（図１Ｂ）。この結果は，４種のクローンのsc抗hTfR抗体が，これらをhI2Sと融合させたとき，hI2Sを脳に効率良く輸送する機能を有することを示すものである。

〔結果２：hI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質のハンター症候群病態モデルマウスを用いた薬効評価〕
組換えhI2Sを投与したマウスでは，ビヒクルを投与したマウスと比較して，脳内に蓄積したグリコサミノグリカンの減少はほとんど観察されなかったが，hI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質を投与したマウスでは，グリコサミノグリカンの脳内での蓄積量が，ビヒクルを投与したマウスと比較して，約83%に減少した（図２）。この結果は，クローンM11のhI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質が，ハンター症候群病態モデルマウスの脳内に蓄積したグリコサミノグリカンを分解できることを示すものである。従って，hI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質は，ハンター症候群の患者に投与したときに，患者の脳内に蓄積したグリコサミノグリカンを分解することにより，ハンター症候群における中枢神経障害を緩解し得る。

本発明は，所望の生理活性蛋白質を，血液脳関門通過可能な１本鎖抗rhTfR抗体との融合蛋白質の形で，且つ通過後に中性神経系において機能し得る蛋白質として提供できるため，血中に投与し中枢神経系において作用させるべき蛋白質を提供するものとして有用性が高い。

Claims

配列番号１，２及び３からなる群から選択される何れかのアミノ酸配列を認識する抗ヒトトランスフェリン受容体抗体。
該配列番号１，２及び３からなる群から選択されるアミノ酸配列中の少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基よりなる部分を認識する，請求項１の抗ヒトトランスフェリン受容体抗体。
請求項１又は２の何れかの抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であって，
軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，
そのＣ末端側に第１のリンカー配列として結合した１５〜２５個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と，
更にそのＣ末端側に結合した，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含んでなる１本鎖抗体である，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体。
配列番号４，５，６及び７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる，請求項３の抗ヒトトランスフェリン受容体抗体。
請求項１〜４の何れかの抗ヒトトランスフェリン受容体抗体と，そのＣ末端側に結合した他の蛋白質のアミノ酸配列とを含んでなる，融合蛋白質。
請求項１〜４の何れかの抗ヒトトランスフェリン受容体抗体と，
そのＣ末端側に第２のリンカー配列として結合した３〜５０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と，
更にそのＣ末端側に結合した他の蛋白質のアミノ酸配列とを含んでなる，融合蛋白質。
該他の蛋白質がリソソーム酵素である，請求項５又は６の融合蛋白質。
該リソソーム酵素がヒトイズロン酸−２−スルファターゼである，請求項７の融合蛋白質。
請求項１〜４の何れかの抗ヒトトランスフェリン受容体抗体をコードするＤＮＡ。
請求項５〜８の何れかの融合蛋白質をコードするＤＮＡ。
請求項１０のＤＮＡを組み込んだ哺乳動物発現用ベクター。
請求項１１の哺乳動物発現用ベクターで形質転換させた哺乳動物細胞。
該哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である，請求項１２の細胞。