JPWO2015098989A1 - 血液脳関門を通過する新規抗トランスフェリン受容体抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
1.配列番号1,2及び3からなる群から選択される何れかのアミノ酸配列を認識する抗ヒトトランスフェリン受容体抗体。
2.該配列番号1,2及び3からなる群から選択されるアミノ酸配列中の少なくとも10個の連続するアミノ酸残基よりなる部分を認識する,上記1の抗ヒトトランスフェリン受容体抗体。
3.上記1又は2の何れかの抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であって,
軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と,
そのC末端側に第1のリンカー配列として結合した15〜25個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と,
更にそのC末端側に結合した,重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含んでなる1本鎖抗体である,抗ヒトトランスフェリン受容体抗体。
4.配列番号4,5,6及び7からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる,上記3の抗ヒトトランスフェリン受容体抗体。
5.上記1〜4の何れかの抗ヒトトランスフェリン受容体抗体と,そのC末端側に結合した他の蛋白質のアミノ酸配列とを含んでなる,融合蛋白質。
6.上記1〜4の何れかの抗ヒトトランスフェリン受容体抗体と,
そのC末端側に第2のリンカー配列として結合した3〜50個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と,
更にそのC末端側に結合した他の蛋白質のアミノ酸配列とを含んでなる,融合蛋白質。
7.該他の蛋白質がリソソーム酵素である,上記5又は6の融合蛋白質。
8.該リソソーム酵素がヒトイズロン酸−2−スルファターゼである,上記7の融合蛋白質。
9.上記1〜4の何れかの抗ヒトトランスフェリン受容体抗体をコードするDNA。
10.上記5〜8の何れかの融合蛋白質をコードするDNA。
11.上記10のDNAを組み込んだ哺乳動物発現用ベクター。
12.上記11の哺乳動物発現用ベクターで形質転換させた哺乳動物細胞。
13.該哺乳動物細胞がCHO細胞である,上記12の細胞。
(1) Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys Lys Asp Phe Glu(配列番号1)
(2) Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly(配列番号2),及び
(3) Val Gly Ala Thr Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser(配列番号3)
が好適に使用できる。
マウス脾臓から得た細胞を分割し,これを,ヒトトランスフェリン受容体(hTfR)を構成するペプチド鎖の部分アミノ酸配列を有する3種類のペプチド,すなわち,ペプチド1(アミノ酸配列を配列番号1で示す),ペプチド2(アミノ酸配列を配列番号2で示す),ペプチド3(アミノ酸配列を配列番号3で示す)及びこれらペプチドを組合わせたものを用いて,体外免疫法によりそれぞれ免疫した。体外免疫法は概略以下の手法で行った。15mLの遠沈管にペプチドをそれぞれ1nmolと,アジュバントとして,N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン10mg/mLを5μL添加し,次いで,マウス脾臓から得た細胞を1.5×107個添加して室温で15分間静置した。次いで,IL-4,IL-13,抗−CD40抗体及びLPS を,終濃度がそれぞれ10ng/mL,10ng/mL,1μg/mL及び40μg/mLとなるように添加してから40% FBS含有RPMI1640培地を3.5mL添加し,5%CO2存在下,37℃で2日間培養した。更に,IL-21を,終濃度が10ng/mLとなるように添加し,同条件下で更に3日間培養した。
(1) VL-FW1:ttcatggcggactacaaagayatccagctgactcagcc(配列番号10)
(2) VL-FW2:ttcatggcggactacaaagayattgttctcwcccagtc(配列番号11)
(3) VL-FW3:ttcatggcggactacaaagayattgtgmtmactcagtc(配列番号12)
(4) VL-FW4:ttcatggcggactacaaagayattgtgytracacagtc(配列番号13)
(5) VL-FW5:ttcatggcggactacaaagayattgtratgacmcagtc(配列番号14)
(6) VL-FW6:ttcatggcggactacaaagayattmagatramccagtc(配列番号15)
(7) VL-FW7:ttcatggcggactacaaagayattcagatgaydcagtc(配列番号16)
(8) VL-FW8:ttcatggcggactacaaagayatycagatgacacagac(配列番号17)
(9) VL-FW9:ttcatggcggactacaaagayattgttctcawccagtc(配列番号18)
(10) VL-FW10:ttcatggcggactacaaagayattgwgctsacccaatc(配列番号19)
(11) VL-FW11:ttcatggcggactacaaagayattstratgacccartc(配列番号20)
(12) VL-FW12:ttcatggcggactacaaagayrttktgatgacccarac(配列番号21)
(13) VL-FW13:ttcatggcggactacaaagayattgtgatgacbcagkc(配列番号22)
(14) VL-FW14:ttcatggcggactacaaagayattgtgataacycagga(配列番号23)
(15) VL-FW15:ttcatggcggactacaaagayattgtgatgacccagwt(配列番号24)
(16) VL-FW16:ttcatggcggactacaaagayattgtgatgacacaacc(配列番号25)
(17) VL-FW17:ttcatggcggactacaaagayattttgctgactcagtc(配列番号26)
(18) VL-FW18:ttcatggcggactacaaagatgctgttgtactcaggaatc(配列番号27)
と,下記の配列番号28〜32に示す塩基配列を有するリバースプライマー:
(19) VL-RV1:ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccacgtttgatttccagcttgg(配列番号28)
(20) VL-RV2:ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccacgttttatttccagcttgg(配列番号29)
(21) VL-RV3:ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccacgttttatttccaactttg(配列番号30)
(22) VL-RV4:ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccacgtttcagctccagcttgg(配列番号31)
(23) VL-RV5:ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccacctaggacagtcagtttgg(配列番号32)
とを用いた。
(1) VH-FW1:ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAKgTRMAgCTTCAggAgTC(配列番号33)
(2) VH-FW2:ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAggTBCAgCTBCAgCAgTC(配列番号34)
(3) VH-FW3:ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCCAggTgCAgCTgAAgSASTC(配列番号35)
(4) VH-FW4:ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAggTCCARCTgCAACARTC(配列番号36)
(5) VH-FW5:ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCCAggTYCAgCTBCAgCARTC(配列番号37)
(6) VH-FW6:ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCCAggTYCARCTgCAgCAgTC(配列番号38)
(7) VH-FW7:ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCCAggTCCACgTgAAgCAgTC(配列番号39)
(8) VH-FW8:ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAggTgAASSTggTggAATC(配列番号40)
(9) VH-FW9:ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAVgTgAWgYTggTggAgTC(配列番号41)
(10) VH-FW10:ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAggTgCAgSKggTggAgTC(配列番号42)
(11) VH-FW11:ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAKgTgCAMCTggTggAgTC(配列番号43)
(12) VH-FW12:ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAggTgAAgCTgATggARTC(配列番号44)
(13) VH-FW13:ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAggTgCARCTTgTTgAgTC(配列番号45)
(14) VH-FW14:ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgARgTRAAgCTTCTCgAgTC(配列番号46)
(15) VH-FW15:ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAAgTgAARSTTgAggAgTC(配列番号47)
(16) VH-FW16:ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCCAggTTACTCTRAAAgWgTSTg(配列番号48)
(17) VH-FW17:ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCCAggTCCAACTVCAgCARCC(配列番号49)
(18) VH-FW18:ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgATgTgAACTTggAAgTgTC(配列番号50)
(19) VH-FW19:ggCggCggCggCTCCggTggTggTggATCCgAggTgAAggTCATCgAgTC(配列番号51)
と,下記の配列番号52〜55に示す塩基配列を有するリバースプライマー:
(20) VH-RV1:ggCAAgCTTTACCTgCAgCgAggAAACggTgACCgTggT(配列番号52)
(21) VH-RV2:ggCAAgCTTTACCTgCAgCgAggAgACTgTgAgAgTggT(配列番号53)
(22) VH-RV3:ggCAAgCTTTACCTgCAgCgCAgAgACAgTgACCAgAgT(配列番号54)
(23) VH-RV4:ggCAAgCTTTACCTgCAgCgAggAgACggTgACTgAggT(配列番号55)
とを用いた。
上記マウス1本鎖抗hTfR抗体cDNAライブラリの作製と同様の手法により,ペプチド1(配列番号1),ペプチド2(配列番号2),ペプチド3(配列番号3)及びこれらペプチドを組合わせたものを用いて,ヒト末梢血単核球(ロンザ社)を体外免疫法により免疫して全RNAを抽出し,これを鋳型として,ヒト1本鎖抗hTfR抗体cDNAライブラリを作成した。
大腸菌(JM109)を,マウス及びヒト1本鎖抗hTfR抗体cDNAライブラリにより形質転換させた後,アンピシリン(Amp)を含むLBプレートに播種し,37℃で一晩培養した。翌日,プレート上に形成されたコロニーを一つずつ採取し,96穴プレートに予め分注したOvernight ExpressTM Instant LB Medium(Novagen社)に植菌した。これを37℃で一晩振とう培養した後,Popculture Reagent (Novagen社) を1/10量加えて溶菌し,次いで等量のTBS-Tを添加して遠心し,上清を回収した。この上清をサンプル溶液とした。
上記スクリーニングで得た4種のrhTfR高親和性クローンから,発現ベクターを精製し,各クローンがコードする1本鎖抗rhTfR抗体のアミノ酸配列を解析した。その結果,クローンM11は配列番号4,クローンM23は配列番号5,クローンM27は配列番号6,クローンB84は配列番号7にそれぞれ示すアミノ酸配列を有する1本鎖抗rhTfR抗体をコードすることが判った。
上記4種のrhTfR高親和性クローンから,発現ベクターを精製し,これをEcoRI/HindIIIで消化してアガロースゲル電気泳動に供し,1本鎖抗rhTfR抗体をコードする約700bpのDNA断片を切り出し,次いで,このDNA断片をpET32aベクターのEcoRI/HindIIIに組み込んだ。こうして得られたベクターを用いて大腸菌(JM109)を形質転換させた後,アンピシリン(Amp)を含むLBプレートに播種し,37℃で一晩培養した。翌日,プレート上に形成されたコロニーをLB培地で培養した後,クローン毎にベクターを回収した。
(a) I2S-f: ACGCCTATTGCTGCAGGATG(配列番号58),及び
(b) I2S-r:AAACGACCAGCTCTAACTCC(配列番号59),並びに
第二反応に用いる内側プライマーセット:
(c) I2S-f2:ATActcgagGCCACCATGCCGCCACCCCGG(配列番号60),及び
(d) I2S-r2:TTCTTATgcggccgcTCAAGGCATCAACAA(配列番号61)
の2つのプライマーセットを用いてネスティッドPCRを行い,ヒトイズロン酸−2−スルファターゼ(hI2S)をコードする cDNAを含むDNA断片を増幅させた。この増幅産物を,XhoIとNotIで消化し,哺乳動物発現ベクターpE-neo7のXhoIとNotIサイトに組込み,pE-neo-I2Sを得た。なお,pE-neo7は,国際公開公報WO 2012/101998に記載の方法で作成した。
雄性C57BL/6Nマウスへ,組換えhI2S及びクローン毎(M11,M23,M27,及びB84)に得た上記精製したhI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質を3及び6mg/kgの用量で尾静脈内投与した (n=2/群)。投与から7時間後に,マウスをイソフルランで麻酔し,マウスの静脈から生理食塩水を潅流させた後,脳を採取した。採取した脳を,Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich Co. LLC.) を含むT-PER Tissue Protein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific K.K.) でホモジネートし,遠心して上清を回収した。回収した上清と,ビオチン化抗hI2Sモノクローナル抗体及びSulfo化抗hI2Sモノクローナル抗体とを混和し,室温で1時間反応させて,ビオチン化抗I2Sモノクローナル抗体,hI2S-scrhTfR抗体融合タンパク及びSulfo化hI2Sモノクローナル抗体の複合体を形成させた。次いで,上記複合体を含む反応液をStreptavidin Gold Plates (Meso Scale Diagnostics, LLC.) へ添加し1時間反応させて,上記複合体を,ビオチンとストレプロアビジンとの結合を介して,プレート上へ結合させた。プレートを洗浄後,SECTOR Imager 6000 (Meso Scale Diagnostics, LLC.) を用いて,プレートに電流を流すことにより上記複合体中のSulfo標識体に電気化学的刺激を与え,このときSulfo標識体から発せられる蛍光強度を測定することにより,hI2S-scrhTfR融合タンパクの濃度を測定した。なお,組換えhI2Sは,国際公開公報WO2012/101998に記載の方法に準じて調製したものを使用した。
ハンター症候群の病態モデルマウスである,雄性イズロン酸2−スルファターゼ遺伝子ノックアウトマウスに,ビヒクル(生理食塩水),組換えhI2S(rhI2S),及びクローンM11のhI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質を3 mg/kgの用量で,3日に1回,計3回,尾静脈内投与した (n=3/群)。最終投与から3日後にマウスをイソフルランで麻酔して放血致死させた後,脳を採取した。採取した脳を直ちに液体窒素中で急速凍結し,その後凍結乾燥した。次いで,凍結乾燥した脳を粉砕し,粉砕した脳組織を0.5 mol/Lトリス塩酸緩衝液 (pH 7.5) 中に懸濁させ,これにアクチナーゼEを添加して60℃で16時間静置し,タンパク質を消化させた。次いで,遠心して上清を回収し,Wieslab sGAG quantitative kit (Euro-Diagnostica AB) を用いアルシアンブルー比色定量法により,上清中に含まれるhI2Sの基質であるグリコサミノグリカンの濃度を定量した。
rhI2Sを投与したマウスでは,脳ホモジネート中のI2S濃度は,3及び6mg/kg投与群ともに,0.01μg/g湿重量未満であった。一方,クローン毎に得たhI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質を投与したマウスでは,脳ホモジネート中のI2S濃度が,rhI2Sを投与したマウスと比較して,10〜20倍の高値を示した(図1A〜図1C,クローンM23については示さず)。また,4種のクローン中,クローンB84のhI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質を投与したマウスでの脳ホモジネート中のI2S濃度が,最も高値であった(図1B)。この結果は,4種のクローンのsc抗hTfR抗体が,これらをhI2Sと融合させたとき,hI2Sを脳に効率良く輸送する機能を有することを示すものである。
組換えhI2Sを投与したマウスでは,ビヒクルを投与したマウスと比較して,脳内に蓄積したグリコサミノグリカンの減少はほとんど観察されなかったが,hI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質を投与したマウスでは,グリコサミノグリカンの脳内での蓄積量が,ビヒクルを投与したマウスと比較して,約83%に減少した(図2)。この結果は,クローンM11のhI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質が,ハンター症候群病態モデルマウスの脳内に蓄積したグリコサミノグリカンを分解できることを示すものである。従って,hI2S-sc抗hTfR抗体融合蛋白質は,ハンター症候群の患者に投与したときに,患者の脳内に蓄積したグリコサミノグリカンを分解することにより,ハンター症候群における中枢神経障害を緩解し得る。
Claims (13)
- 配列番号1,2及び3からなる群から選択される何れかのアミノ酸配列を認識する抗ヒトトランスフェリン受容体抗体。
- 該配列番号1,2及び3からなる群から選択されるアミノ酸配列中の少なくとも10個の連続するアミノ酸残基よりなる部分を認識する,請求項1の抗ヒトトランスフェリン受容体抗体。
- 請求項1又は2の何れかの抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であって,
軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と,
そのC末端側に第1のリンカー配列として結合した15〜25個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と,
更にそのC末端側に結合した,重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含んでなる1本鎖抗体である,抗ヒトトランスフェリン受容体抗体。 - 配列番号4,5,6及び7からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる,請求項3の抗ヒトトランスフェリン受容体抗体。
- 請求項1〜4の何れかの抗ヒトトランスフェリン受容体抗体と,そのC末端側に結合した他の蛋白質のアミノ酸配列とを含んでなる,融合蛋白質。
- 請求項1〜4の何れかの抗ヒトトランスフェリン受容体抗体と,
そのC末端側に第2のリンカー配列として結合した3〜50個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と,
更にそのC末端側に結合した他の蛋白質のアミノ酸配列とを含んでなる,融合蛋白質。 - 該他の蛋白質がリソソーム酵素である,請求項5又は6の融合蛋白質。
- 該リソソーム酵素がヒトイズロン酸−2−スルファターゼである,請求項7の融合蛋白質。
- 請求項1〜4の何れかの抗ヒトトランスフェリン受容体抗体をコードするDNA。
- 請求項5〜8の何れかの融合蛋白質をコードするDNA。
- 請求項10のDNAを組み込んだ哺乳動物発現用ベクター。
- 請求項11の哺乳動物発現用ベクターで形質転換させた哺乳動物細胞。
- 該哺乳動物細胞がCHO細胞である,請求項12の細胞。
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