JPWO2015068759A1 - 動物細胞の運動方向の制御基材、当該基材を用いた細胞の識別方法及び細胞の分離方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、動物細胞の運動方向を制御するための制御基材であって、該基材表面は複数の溝部を有し、該溝部は相対する壁部と底部から形成され、該溝部を形成する相対する壁部は柱状凸部を複数有するものであり、該柱状凸部の頂部は相対する壁部に形成される2つの柱状凸部の頂部の間を向いて形成されると共にこれら頂部が同じ方向を向いていることを特徴とする、動物細胞の運動方向の制御基材を提供する。
Description
本発明は、細胞の運動能の差異を利用して細胞を識別する又は分離するための、動物細胞の運動方向の制御基材及び当該基材を用いた細胞の識別方法及び細胞の分離方法に関する。
本願は、２０１３年１１月６日に日本に出願された、特願２０１３−２２９８９８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１３年１１月６日に日本に出願された、特願２０１３−２２９８９８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
血液、リンパ液又は液体培地などの移動可能な環境下に置かれた細胞は、化学物質や増殖因子などの化学的刺激、電気的刺激、接触刺激などの物理的刺激、その他の外的要因に応答して移動する（遊走する）性質を有している。この細胞の運動能に着目し、細胞の遊走を促す刺激を選択して使用することで、異種細胞群から任意の細胞を特異的に識別したり、分離したりする方法や、そのための機器、器具あるいは材料などが研究開発されている。
化学物質に対する細胞の化学走性（ケモタキシス）による細胞遊走の制御はこれまでに多数の研究例があり、応用としての化学走性を用いた細胞診断も実用化に至っている。化学走性を利用した細胞を分離・診断する方法の例としては、多孔質なフィルターで上下に仕切られたボイデンチャンバーを用いた方法が挙げられる。この方法は、ボイデンチャンバーのフィルター下の区画に特定の細胞を引き寄せる化学物質を置き、フィルター上の区画に様々な細胞を播くことによって、フィルター下の区画方向への細胞の移動を観察したり、移動した細胞を採取したりすることを可能にする。
しかし、ケモタキシスを用いた細胞分離方法は、細胞を化学物質や増殖因子で刺激するために、対象となる細胞の分化、増殖、機能発現などの各細胞の性状に影響を与えて、刺激前後の細胞の性状を変化させてしまうおそれがある。すなわちケモタキシスは対象となる細胞の性状を不安定にさせる傾向があり、刺激後の細胞を生体に投与するような細胞治療や診断において、ケモタキシスの利用は不利である。
一方、シリコン等の適当な材質から作製されるいわゆる「足場」（スキャホールド）を細胞に提供することで、足場上を移動する細胞の遊走能の差を利用して細胞を識別又は分離する方法も提唱されている。例えば、フォトレジスト技術を用いてシリコン基材上にマイクロオーダーの正三角柱の規則的パターンを成形した基材や、表面に突起物を形成させた基材に細胞を播種することで、細胞の遊走方向を制御する方法が報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。
足場を刺激とした細胞遊走の誘導は、ケモタキシスとは異なり刺激前後の細胞の性状を変化させる可能性が低く、足場の構造的性質又は特徴と細胞の遊走能や方向制御に関する研究が進められている。
「三次元パターンを利用した細胞遊走の制御」、第３３回分子生物学会年会・第８３回日本生化学大会合同大会、２０１０年１１月１９日。
「三次元パターンを利用した新規細胞走性の開発」、戦略目標「プロセスインテグレーションによる次世代ナノシステムの創製」、３研究領域合同公開シンポジウム、２０１３年１０月１７日。
本発明は、化学物質や増殖因子、抗体などを用いたケモタキシスではなく、特徴的なマイクロパターンを有する基材を足場として細胞に提供し、細胞の遊走能を利用して細胞を識別又は分離する新たな基材と方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、細胞が足場の突起部を好んで遊走することに着目し、突起を一定方向に連続して並べることで細胞の遊走方向を制御することができることを見いだし、下記の各発明を完成させた。
（１）動物細胞の運動方向を制御するための制御基材であって、該基材表面は複数の溝部を有し、該溝部は相対する２つの壁部と底部から形成され、該溝部を形成する相対する２つの壁部は柱状凸部を連続して有し、該柱状凸部は、
イ）その凸が水平方向断面で少なくとも一つの頂部となる形状であり、ならびに ロ）相対する壁部に形成される柱状凸部と互い違いの位置に設けられる
ことを特徴とする、動物細胞の運動方向の制御基材。
（２）一つの壁部において隣接する柱状凸部の頂部の間隔が３μｍ〜２０μｍである、（１）に記載の基材。
（３）前記壁部の高さが１０〜４０μｍである、（１）又は（２）に記載の基材。
（４）前記相対する壁部の間の距離が２μｍ〜２０μｍである、（１）〜（３）のいずれか一項に記載の基材。
（５）前記凸の方向が相対する壁部の距離方向に対して一方向に傾いている、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の基材。
（６）前記凸の方向が相対する壁部の垂線方向に対して１０度〜８０度の方向を向いている、（５）に記載の基材。
（７）前記柱状凸部の水平方向断面形状が６角形以下の多角形である、（１）〜（６）のいずれか一項に記載の基材。
（８）基材がシリコン、ガラス、プラスチック及び金属よりなる群から選択される材料で形成される、（１）〜（７）のいずれかに一項に記載の基材。
（９）２以上の異なる種類の細胞を運動能に基づいて識別する方法であって、（１）〜（８）のいずれか一項に記載の基材の溝部の一端に前記２種以上の異なる種類の細胞を含む細胞懸濁液を添加する工程、基材を前記細胞が生存可能な条件に保持する工程及び保持後の基材上の溝方向に沿って細胞の種類を識別する工程を含む、前記識別方法。
（１０）２以上の異なる種類の細胞を運動能に基づいて分離する方法であって、（１）〜（８）のいずれか一項に記載の基材の溝部の一端に前記２種以上の異なる種類の細胞を含む細胞懸濁液を添加する工程、基材を前記細胞が生存可能な条件に保持する工程及び保持後の基材上の細胞を回収する工程を含む、前記分離方法。
イ）その凸が水平方向断面で少なくとも一つの頂部となる形状であり、ならびに ロ）相対する壁部に形成される柱状凸部と互い違いの位置に設けられる
ことを特徴とする、動物細胞の運動方向の制御基材。
（２）一つの壁部において隣接する柱状凸部の頂部の間隔が３μｍ〜２０μｍである、（１）に記載の基材。
（３）前記壁部の高さが１０〜４０μｍである、（１）又は（２）に記載の基材。
（４）前記相対する壁部の間の距離が２μｍ〜２０μｍである、（１）〜（３）のいずれか一項に記載の基材。
（５）前記凸の方向が相対する壁部の距離方向に対して一方向に傾いている、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の基材。
（６）前記凸の方向が相対する壁部の垂線方向に対して１０度〜８０度の方向を向いている、（５）に記載の基材。
（７）前記柱状凸部の水平方向断面形状が６角形以下の多角形である、（１）〜（６）のいずれか一項に記載の基材。
（８）基材がシリコン、ガラス、プラスチック及び金属よりなる群から選択される材料で形成される、（１）〜（７）のいずれかに一項に記載の基材。
（９）２以上の異なる種類の細胞を運動能に基づいて識別する方法であって、（１）〜（８）のいずれか一項に記載の基材の溝部の一端に前記２種以上の異なる種類の細胞を含む細胞懸濁液を添加する工程、基材を前記細胞が生存可能な条件に保持する工程及び保持後の基材上の溝方向に沿って細胞の種類を識別する工程を含む、前記識別方法。
（１０）２以上の異なる種類の細胞を運動能に基づいて分離する方法であって、（１）〜（８）のいずれか一項に記載の基材の溝部の一端に前記２種以上の異なる種類の細胞を含む細胞懸濁液を添加する工程、基材を前記細胞が生存可能な条件に保持する工程及び保持後の基材上の細胞を回収する工程を含む、前記分離方法。
本発明によれば、本発明の基材上に細胞懸濁液を播種することで、細胞本来の機能を維持したまま細胞の識別又は分離を行うことができる。また、この基材上での細胞の分離過程や移動した細胞数を顕微鏡その他の機器を用いてモニタリングすれば、細胞懸濁液中や生体組織中の各細胞種の存在量、がん細胞の浸潤性の評価などを行うことができる。
また、本発明は細胞を遊走させるために化学物質、増殖因子、抗体などを用いる必要がないことから、細胞の性状を維持したまま細胞を分離することが可能となり、細胞診断、細胞治療に望まれる安全な細胞を供給することが可能となる。
本発明は、動物細胞の運動方向を制御するための制御基材であって、該基材表面は複数の溝部を有し、該溝部は相対する２つの壁部と底部から形成され、該溝部を形成する相対する２つの壁部は柱状凸部を連続して有し、該柱状凸部は、
イ）その凸が水平方向断面で少なくとも一つの頂部となる形状であり、ならびに
ロ）相対する壁部に形成される柱状凸部と互い違いの位置に設けられる
ことを特徴とする、動物細胞（以下細胞と称する）の運動方向の制御基材に関する。なお、本発明にいう細胞の運動とは細胞の移動すなわち遊走を意味する。
イ）その凸が水平方向断面で少なくとも一つの頂部となる形状であり、ならびに
ロ）相対する壁部に形成される柱状凸部と互い違いの位置に設けられる
ことを特徴とする、動物細胞（以下細胞と称する）の運動方向の制御基材に関する。なお、本発明にいう細胞の運動とは細胞の移動すなわち遊走を意味する。
本発明の基材に適当な溶媒に懸濁した細胞を播種すると、運動能の高い細胞は自ら遊走を開始して、溝部に進入ないし落下した後、壁部の連続する柱状凸部の頂部を伝って溝部を一方向に遊走するようになる。一方、運動能の低い細胞は、基板上に播種された場所から殆ど又は僅かにしか動かず、その結果、運動能の高い細胞と運動能の低い細胞とが、基材の上で互いに離れて位置するようになる。本発明の基材は、この様に細胞の運動方向すなわち細胞の遊走方向を制御するための基材である。
本発明の基材における壁部及び溝部の代表的な態様を図１及び図２に示す。以下、図面を用いて説明する。
図１及び図２では、網掛け部分が基材を真上から見たときの２以上の相対する壁部１を表し、相対する壁部の間の無色部（空間）が溝部を表している。また、図示の便宜上、紙面の奥方向に位置する底部の記載は省略されている。また、図１の態様の基材の斜視図を図３に示す。
図１及び図２では、網掛け部分が基材を真上から見たときの２以上の相対する壁部１を表し、相対する壁部の間の無色部（空間）が溝部を表している。また、図示の便宜上、紙面の奥方向に位置する底部の記載は省略されている。また、図１の態様の基材の斜視図を図３に示す。
図１に示される態様の発明における壁部１は、壁部１を水平方向に切断したときの断面形状が三角形である柱状凸部２を壁部１の両面に連続して有する。壁部１の柱状凸部２は、相対する壁部１の２つの柱状凸部の頂部３の間を向いて形成され、その結果、相対する壁部１に形成される柱状凸部２と互い違いの位置に設けられる。柱状凸部２は、底部から立ち上がるように壁部１と一体的に形成された壁部１の部分構造である（図３の斜視図参照）。
「相対する壁部に形成される柱状凸部と互い違いの位置に設けられる」とは、「相対する２つの壁部１に対する垂線４を描いたときに、２つの壁部１の柱状凸部２のうち相対する壁部１に最も近接するそれぞれの頂部が一の垂線上には存在しない様に形成される」とも表すことができる。
また、「その凸が水平方向断面で少なくとも一つの頂部となる形状であり」とは、「柱状凸部は少なくとも一つの角を有する」とも表すことができる。本発明における壁部１の柱状凸部２の形状（壁部１を水平方向に切断したときの断面形状）は、細胞が遊走する際の掛かりとなる頂部を少なくとも一つ有する他は、特に制限はない。本発明の頂部は、柱状凸部２の形状（壁部を水平方向に切断したときの断面形状）が多角形である場合には、９０度以下、好ましくは６０度以下、より好ましくは３０度以下の角度を有する角であればよい。
本発明における柱状凸部２は、壁部１の伸展方向に向かって連続して存在する。その繰り返しピッチは、柱状凸部の頂部３の間隔７で表すことができる。本発明の基材では、柱状凸部の頂部３の間隔が３μｍ〜２０μｍ、好ましくは１０μｍ〜１５μｍの範囲となるように、柱状凸部２が形成されることが好ましい。
柱状凸部２の高さは、壁部１の高さと同程度であればよい。
柱状凸部２の高さは、壁部１の高さと同程度であればよい。
また本発明において、凸の方向は相対する壁部の距離方向に対して一方向に傾いていることが好ましい。図１に示される態様では、相対する壁部１の柱状凸部２の一辺５（三角形の斜辺）は、いずれも壁部１の垂線に対して傾き６を伴って図の右方向を向くように形成されている。本発明における柱状凸部２は、傾き６が１０度〜８０度、好ましくは３０度から７５度の範囲となるように形成されることが好ましい。この凸が向いている方向に細胞の遊走方向が制御される。
本発明における壁部１の高さ（溝部の深さ）は、５μｍ〜４０μｍ、好ましくは２０〜３０μｍとなるように調節されることが好ましい。壁部１の高さ（溝部の深さ）が５μｍを下回ると、溝部を遊走する細胞が壁部１の上部に登ってしまう頻度が増加して遊走方向の制御効率が低下する傾向にある。なお、壁部１の高さを４０μｍより高くしても遊走方向の制御に関しては特に不都合はなく、その上限は基材の製作技術に依存する。
本発明における相対する壁部１は、それらの間の距離が２μｍ〜２０μｍ、好ましくは５μｍ〜１５μｍとなるように形成されることが好ましい。ここにいう距離とは、一方の壁部１の柱状凸部の頂部３をつなぐ面と他方の壁部１の柱状凸部の頂部３をつなぐ面との間の距離８を意味する。距離が上記範囲を超えると、細胞の遊走速度が低下する傾向がある。
本発明における壁部の幅９は、２０μｍ〜６０μｍ、好ましくは３０〜５０μｍとなるように調節されることが好ましい。幅が上限を超える場合、基材に播種された細胞が溝部に移動ないし落下しにくくなり、細胞の識別又は分離操作により長い時間を要する可能性がある。
本発明の基材の別の態様を示す図２の各符号は、図１の符号と対応している。図２の態様の壁部１は、壁部１を水平方向に切断したときの断面形状が台形となる柱状凸部２を壁の両面に複数有する。この態様において、一方の壁部１の柱状凸部の頂部３（台形のうち相対する壁部に最も近接する角）は、他方の壁部２の２つの柱状凸部の頂部３の間を向いて形成され、該頂部は互い違いの位置に形成されている。また、相対する壁部１の柱状凸部２の凸は、いずれも図の右方向を向くように形成されている。
なお、図１及び図２に態様における柱状凸部２は、その形状（壁部を水平方向に切断したときの断面形状）が多角形として表されているが、本発明における柱状凸部２は曲線で形成される断面形状、例えば半楕形状又は波型形状を有するものであってもよい。またその柱状凸部２の頂部は、９０度以下、好ましくは６０度以下、より好ましくは３０度以下の角度を有するものであっても、これらと同程度の曲率を有するヘアピン状の頂部であってもよい。また、前述の頂部の間隔、壁部の距離、高さ及び幅は、一つの基材において及び一つの壁部において均一であっても、又は上記範囲内で異なっていてもよい。例えば、一つの基材中に頂部の間隔、高さ及び／又は幅が互いに異なる壁部が存在してもよく、また一つの壁部の頂部の間隔又は幅が部分的に異なっていてもよい。
本発明の基材の材料としては、ミクロンオーダーの微細構造を形成することが可能な材料であれば特に限定はないが、シリコン、ガラス、プラスチック、金属などを好適な材料として挙げることができる。シリコン又はガラスは微細構造を形成するためのフォトリソグラフィ技術を利用して本発明の基材を作成することが可能である。
特に好ましい基材の材料は、フォトリソグラフィ技術を用いてミクロンオーダーの微細構造を形成することが可能なシリコンウェーハである。
シリコンウェーハ上に微細構造を形成するためのフォトリソグラフィ技術は、フォトマスクの作成やウェーハ状でのパターン成形その他の工程を含め、半導体素子やプリント基材などの製造分野において広く知られた技術であり、ポジ型フォトレジスト、ネガ型フォトレジストを含む多くの方法が開発されておる。本発明の基材の作製に対しては、シリコンウェーハ等を対象としたフォトリソグラフィ技術であればいずれも利用可能である。
なお、フォトリソグラフィ技術を用いてシリコンウェーハから本発明の基材を作製する場合、本発明の基材の壁部の高さ（溝部の深さ）を確保するために、ボッシュ法などのディープエッチングを行うことが好ましい。
本発明の基材においては適当な液体溶媒好ましくは液体培地に懸濁された細胞が基材に播種され、溝部内を細胞が移動する。そのため、例えばシリコンウェーハを材料としてフォトリソグラフィ技術で作製された基材などの表面が疎水性である基材は、その表面を親水化処理して使用することが好ましい。この様な表面が親水性の付与された基材は、本発明の好ましい態様の一つである。
基材の表面を親水化する方法は、用いる素材に応じて既知の方法を採用すればよく、例えばシリコンウェーハから作製された基材に対しては、Ｏ２プラズマ法、界面活性剤処理法などを採用することができる。
上記のフォトリソグラフィ技術によって作製されるシリコンウェーハをベースとした基材は、これを別の素材にパターンを移すための鋳型としても利用することができる。例えば、上記基材に適当なプラスチック、熱硬化性樹脂或いは熱可塑性樹脂を溶融あるいは溶媒に溶解して、流し込んで固化させることで、プラスチック等を素材とした本発明の基材を作成することもできる。あるいは、可塑性材料にシリコンウェーハでできた基材を押し当てることでパターンを可塑性材料に転写してもよい。また、金属を材料とする場合は、マイクロレーザー加工などによって、金属に対して直接的に本発明のパターンを形成して、本発明の基材として作製してもよい。
本発明は、さらに別の態様として、前述の基材の溝部の一端に２種以上の異なる種類の細胞を含む細胞懸濁液を添加する工程、基材を前記細胞が生存可能な条件に保持する工程及び保持後の基材上の溝方向に沿って細胞の種類を識別する工程を含む、２以上の異なる種類の細胞を運動能に基づいて識別する方法を提供する。
またもう一つの態様として、前述の基材の溝部の一端に前記２種以上の異なる種類の細胞を含む細胞懸濁液を添加する工程、基材を前記細胞が生存可能な条件に保持する工程及び保持後の基材上の細胞を回収する工程を含む、２以上の異なる種類の細胞を運動能に基づいて分離する方法も提供する。
上記方法における基材の溝部の一端とは、前述の壁部の柱状凸部の頂部が向いている（傾いている）方向とは逆の方向の端部を意味し、図１及び図２に示される基材を用いる方法を例にすれば、図の左側に位置する端部である。
また、さらに別の態様として、前述の基材上（壁部上）の少なくとも一部を覆うように、カバーガラス等の被覆部材を基材上に載置した上で、被覆されていない基材上に少なくとも１種以上の細胞を含む細胞懸濁液を添加し、その後、被覆部材を除去して細胞の遊走を開始させることもできる（図１５）。
本発明の方法の典型例は、基材を適当な液体、好ましくは分離対象となる細胞の生存に好適な液体培地や緩衝液に基材を浸し、基材の溝部が伸展する方向の一端に対象となる細胞を含む懸濁液を播種し、細胞が生存可能な条件、例えば３７℃前後の温度と好気的な環境下に数時間〜数日間静置させることで行われる。具体的には、本発明の基材をシャーレ等の容器に置き、ＤＭＥＭ培地その他の動物細胞の培養に用いられる適当な液体培地を基材の上側表面が僅かに浸る程度にシャーレに加えた後、基材の溝部が伸展する方向の一端に細胞懸濁液を滴下し、これを細胞培養条件下に１０時間〜２４時間静置すればよい。
培地、緩衝液及び静置条件は、識別又は分離対象となる細胞に応じてその細胞に好適なものとして当業者に知られているものを選択すればよい。また細胞は、顕微鏡を用いた細胞の外観観察、光学的特性を利用した観察、細胞に特異性を有する蛍光試薬や抗体などの化学物質を用いた細胞標識その他の、細胞の識別に一般的に用いられる方法を適用することで識別することができる。また遊走能の違いによって基材上の異なる部位に局在することとなった細胞は、その一方又は両方をそれぞれ適当な方法によって回収することで互いを分離することができる。
本発明の基材を用いることで、運動能の高い細胞と運動能の低い細胞とを特別な化学物質を使用することなく識別又は分離することができる。例えば、癌化した細胞は正常細胞と比較して運動能が高いといわれていることから、例えばバイオプシー等によって摘出あるいは回収した検体から調製される細胞懸濁液を本発明の基材上に播種することで、移動する細胞に着目して細胞の性状を調べることで、癌の診断等を行うことができると期待される。
また、一般にｉＰＳ細胞は運動能が低く、特定の細胞へと分化誘導された細胞は高い運動能を発揮するといわれていることから、本発明の基材を利用することで、ｉＰＳ細胞から分化誘導された目的の細胞と未分化に留まっているｉＰＳ細胞とを識別し、又は分離することが可能になる。特に本発明の方法によれば、細胞の分離に遊走の方向性を制御するための化学物質は必ずしも必要ではなく、分離の前後において細胞の性状が変化する可能性は極めて小さいか殆どない。この様な分離技術は細胞診断、細胞治療に望まれる安全な細胞を供給することが可能となる点で有利である。
さらに、本発明の基材を血管ステントやカテーテル、人工関節などの医療材料に応用することで、生体内に埋め込まれた医療材料の表面で運動性の低い細胞を材料表面に留める一方で運動性の高い細胞を基材から脱離させることができ、医療材料の表面を望ましい細胞で被覆して生体適合性を高めることが可能になると期待される。
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
＜実施例１＞
（１）三次元パターン基材の作製
２５個の１ｍｍ角のエリアを有するクオーツフォトマスク（ミタニマイクロニクス社製）の各エリアに対して、図４に示される基本構造を有し、かつａ〜ｈに示される各部寸法及び角度が互いに異なる１５種類のパターン１〜１５のフォトマスクを用意した。
（１）三次元パターン基材の作製
２５個の１ｍｍ角のエリアを有するクオーツフォトマスク（ミタニマイクロニクス社製）の各エリアに対して、図４に示される基本構造を有し、かつａ〜ｈに示される各部寸法及び角度が互いに異なる１５種類のパターン１〜１５のフォトマスクを用意した。
９００ｎｍの熱酸化皮膜付きのシリコン基材（１０ｍｍ×１０ｍｍ）上にＨＭＤＳ（ヘキサメチルジシラザン；東京応化工業社製）及びレジスト組成物ＯＦＰＲ−５０００ＬＢ（東京応化工業社製）をスピンコート（１０００ｒｐｍ、５秒〜４０００ｒｐｍ、４５秒）した。プリベーク（１１０℃、２分間）後、露光装置ＭＡ−２０（ミカサ社製）に、先に用意したクオーツフォトマスクとレジスト膜がコートされたシリコン基材をセットし、１．５秒間露光した。
露光後のシリコン基材を現像液ＮＭＤ−３（東京応化工業社製）に浸漬し現像した。光学顕微鏡により、レジスト膜パターンのチェックを行い、シリコン基材上にレジスト膜パターンが作製されていることを確認した。ポストベーク（１３０℃、２０分間）を行った後、シリコン基材のレジスト膜で覆われていない部分のＳｉＯ２を反応性イオンエッチング装置ＲＩＥ−１０−ＮＲＶ（サムコ社製）を用いて除去した。ＦＥ−ＳＥＭ ＪＳＭ−６７００ＦＴ（日本電子社製）によってＳｉＯ２が除去できていることを確認後、ＲＩＥ−１０−ＮＲＶ（サムコ社製）を用いてＯ２クリーニング(５０ｓｃｃｍ、３Ｐａ、３分間）の後、アセトン中で３０秒間超音波洗浄してレジスト膜を完全に除去した。
ＩＣＰドライエッチング装置（ＭＵＣ−２１、住友精密工業社製）によりＳｉを深くエッチングした（ＳＦ６、５０ｓｃｃｍ、Ｃ４Ｈ８、５０ｓｃｃｍ、５００Ｗ、２２分、４．７Ｐａ）。マスクとして用いたＳｉＯ２をＨＦで除去した。ＦＥ−ＳＥＭＪＳＭ−６７００ＦＴ（日本電子社製）によってシリコン基材の断面を観察したところ、深さ２３μｍの溝が形成されていることが確認された。
カラーレーザー３Ｄ顕微鏡ＶＫ−９７００（ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて、得られた三次元パターンの形状の観察を行った。この時、５０倍の対物レンズ（ニコン社製）を用いてＲｅａｌ Ｐｅａｋ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＲＰＤ）を行いながら高精細モードで観察した。この観察により、フォトマスクで用意したパターン１〜１５においていずれも、連続する三角柱形状の柱状凸部を有する複数の壁部が所定の範囲でずれて向かい合った壁部が何列にも配列したパターンを有する、本発明の基材１〜１５が作製されたことが確認された。基材１〜１５の各パターンを図５〜図７にまとめて示す。
基材１〜１５のパターン形状像を形態分析し、基材毎に、図４のａ〜ｈで示される部位の長さをそれぞれ異なる６箇所について計測し、各部位の平均値と標準偏差を算出した。その結果を表１に表す。
（２）三次元パターンの親水化と滅菌、表面の脱気
（１）で作製した基材１〜１５を、ＲＩＥ−１０ＮＲＶ（サムコ社製）を用いてＯ２クリーニング(５０ｓｃｃｍ、３Ｐａ、８分間）して、基材に水に対する親水性を付加した。基材１〜１５を１２０℃で２０分間滅菌した後、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン及びストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地（以下、ＤＭＥＭ培地と略記する）を加えた３５ｍｍセルカルチャーディッシュの底に沈め、−０．０９Ｍｐａで１分間、軽く振とうしながら脱気を行った。光学顕微鏡による反射像観察で気泡が完全に除去できていることが確認された。この親水化された基材１〜１５を、以下の実験に使用した。
（１）で作製した基材１〜１５を、ＲＩＥ−１０ＮＲＶ（サムコ社製）を用いてＯ２クリーニング(５０ｓｃｃｍ、３Ｐａ、８分間）して、基材に水に対する親水性を付加した。基材１〜１５を１２０℃で２０分間滅菌した後、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン及びストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地（以下、ＤＭＥＭ培地と略記する）を加えた３５ｍｍセルカルチャーディッシュの底に沈め、−０．０９Ｍｐａで１分間、軽く振とうしながら脱気を行った。光学顕微鏡による反射像観察で気泡が完全に除去できていることが確認された。この親水化された基材１〜１５を、以下の実験に使用した。
＜実施例２＞
（１）ＮＩＨ３Ｔ３細胞のＰＫＨ２６染色
ＤＭＥＭ培地を加えた３５ｍｍセルカルチャーディッシュの底に実施例１（２）で作製した基材を沈め、−０．０９Ｍｐａで１分間、軽く振とうしながら脱気を行い、培地交換を行った後、そのまま１２時間培地に浸漬して静置した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を１×１０４個／ｃｍ2で三次元パターン基材の入ったディッシュに播種し、２時間培養後、ＰＫＨ２６（シグマアルドリッチ社、５００倍希釈）に４分間室温で浸漬した。ＦＢＳでＰＫＨ２６の反応を止めた後、培地で洗浄した。ＰＫＨ２６によるＮＩＨ３Ｔ３細胞の染色から洗浄操作が終了するまでにかける時間は約０．２５時間である。これらの手順はＰＫＨ２６の染色プロトコールを参考に改変して使用した。
（１）ＮＩＨ３Ｔ３細胞のＰＫＨ２６染色
ＤＭＥＭ培地を加えた３５ｍｍセルカルチャーディッシュの底に実施例１（２）で作製した基材を沈め、−０．０９Ｍｐａで１分間、軽く振とうしながら脱気を行い、培地交換を行った後、そのまま１２時間培地に浸漬して静置した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を１×１０４個／ｃｍ2で三次元パターン基材の入ったディッシュに播種し、２時間培養後、ＰＫＨ２６（シグマアルドリッチ社、５００倍希釈）に４分間室温で浸漬した。ＦＢＳでＰＫＨ２６の反応を止めた後、培地で洗浄した。ＰＫＨ２６によるＮＩＨ３Ｔ３細胞の染色から洗浄操作が終了するまでにかける時間は約０．２５時間である。これらの手順はＰＫＨ２６の染色プロトコールを参考に改変して使用した。
ＰＫＨ２６で染色されたＮＩＨ３Ｔ３細胞が接着した基材を、培地で満たされたＧｌａｓｓ Ｂａｓｅ Ｄｉｓｈ １２φ（ＩＷＡＫＩ社製）に移し、このディッシュの底のガラス窓の部分に反転させて置いた。このとき、各基材の四つの頂点がガラス窓の枠にかかるようにして、細胞播種面とガラスの間に十分な隙間が空くようにして、細胞培養面に培地を拡散させた。この状態で、更に１．７５時間、ＤＭＥＭ培地で培養した後、ＳｔａｇｅＴｏｐ（登録商標） Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ＩＮＵ−ＺＩＬＣＳ（ＴＯＫＡＩ ＨＩＴ社製）が取り付けられた蛍光顕微鏡ＯｂｓｅｒｖｅｒＺ１（Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて３０分間隔で７２時間にわたり、タイムラプス観察を行った。観察は１０倍の対物レンズを用い、指定された定点(８７１μｍ×６９０μｍ）の三次元パターンの反射像とＰＫＨ２６、でラベルされた細胞の蛍光像をＣＣＤカメラにより撮影した。各定点において得られた画像から動画を作成し、動画から細胞の遊走する方向を確認した。その結果、基材１〜１５全てについて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞が、柱状凸部の頂部が突出している方向（図４の右方向）にのみ遊走していることが確認された。代表的な基材６〜９を撮影したものに、細胞の軌跡をデジタル処理して加えた写真を図８Ａに示す。また、図８Ｂとして、図８Ａ中の基材パターン及び細胞軌跡が明確となるよう、図８Ａを模式化した図を示す。
（２）二種類の生きた細胞のＰＫＨ２６およびＰＫＨ６７染色
ＤＭＥＭ培地を加えた３５ｍｍセルカルチャーディッシュの底に実施例１（２）で作製した基材を沈め、−０．０９Ｍｐａで１分間、軽く振とうしながら脱気を行い、培地交換を行った後、そのまま１２時間培地に浸漬して静置した。ＨｅＬａ細胞及びＨａＣａＴ細胞をそれぞれ１×１０４個／ｃｍ2で基材の入ったディッシュに播種し、ＤＭＥＭ培地で９．７５時間培養後、ＰＫＨ６７（２５０倍希釈）に４分間室温で浸漬した。ＦＢSでＰＫＨ６７の反応を止めた後、培地で洗浄した。ＰＨＫ６７による細胞染色から洗浄操作が終了するまでにかける時間は約０．２５時間である。これらの手順はＰＨＫ６７の染色プロトコールを参考に改変して使用した。
ＤＭＥＭ培地を加えた３５ｍｍセルカルチャーディッシュの底に実施例１（２）で作製した基材を沈め、−０．０９Ｍｐａで１分間、軽く振とうしながら脱気を行い、培地交換を行った後、そのまま１２時間培地に浸漬して静置した。ＨｅＬａ細胞及びＨａＣａＴ細胞をそれぞれ１×１０４個／ｃｍ2で基材の入ったディッシュに播種し、ＤＭＥＭ培地で９．７５時間培養後、ＰＫＨ６７（２５０倍希釈）に４分間室温で浸漬した。ＦＢSでＰＫＨ６７の反応を止めた後、培地で洗浄した。ＰＨＫ６７による細胞染色から洗浄操作が終了するまでにかける時間は約０．２５時間である。これらの手順はＰＨＫ６７の染色プロトコールを参考に改変して使用した。
次に、トリプシンで剥離させたＮＩＨ３Ｔ３細胞をＤＭＥＭ培地で洗浄し、ＰＫＨ２６（２５０倍希釈）に４分間室温で浸漬した。ＦＢＳでＰＫＨ２６の反応を止めた後、培地で洗浄した。ＰＫＨ２６で染色されたＮＩＨ３Ｔ３細胞１×１０４個／ｃｍ２を、ＰＫＨ６７で染色されたＨｅＬａ細胞及びＨａＣａＴ細胞が接着した基材に播種した。ＰＫＨ２６による細胞染色から洗浄操作が終了するまでにかける時間は約０．２５時間である。
５．７５時間、ＤＭＥＭ培地で培養した後、培地で満たされたＧｌａｓｓ Ｂａｓｅ Ｄｉｓｈ １２φに移し、このディッシュの底のガラス窓の部分に反転させて置いた。このとき、各基材の四つの頂点がガラス窓の枠にかかるようにして、細胞播種面とガラスの間に十分な隙間が空くようにして、細胞培養面に培地を拡散させた。この状態で、（１）と同様にしてタイムラプス観察を行った。
ＨａＣａＴ細胞（緑色及び黒塗りの△で示される）とＮＩＨ３Ｔ３細胞（赤色及び〇で表示される）を同じ基材に播種して、７２時間にわたって定点連続観察したものに、細胞の軌跡をデジタル処理して加えた写真を図９Ａに示す。また、図９Ｂとして、図９Ａ中の基材パターン及び細胞軌跡が明確となるよう、図９Ａを模式化した図を示す。
この写真から分かるように、ＨａＣａＴ細胞（△）は殆ど遊走しないのに対しＮＩＨ３Ｔ３細胞（〇）はいずれも右方向に遊走した。この結果は、本発明の基材を用いることでＨａＣａｔ細胞とＮＩＨ３Ｔ３細胞とを識別又は分離することが可能であることを示すものである。
この写真から分かるように、ＨａＣａＴ細胞（△）は殆ど遊走しないのに対しＮＩＨ３Ｔ３細胞（〇）はいずれも右方向に遊走した。この結果は、本発明の基材を用いることでＨａＣａｔ細胞とＮＩＨ３Ｔ３細胞とを識別又は分離することが可能であることを示すものである。
（３）サンプルの固定化とＤＡＰＩ染色、観察
（１）及び（２）のタイムラプス観察を行った後の細胞を含む基材５〜９を４%パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液に浸して、細胞を固定化した。ＤＡＰＩ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、２０００倍希釈）を用いて２０分間、室温で細胞核を染色し、ＥＵＫＩＴＴ（登録商標）（Ｏ．Ｋｉｎｄｌｅｒ製）を用いてカバーガラス上に封入した。接着細胞の観察は共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ−１０００Ｄ（オリンパス社製）を用いて行われた。このとき対物レンズは４０倍のレンズあるいは１００倍のレンズを用いた。この細胞核の蛍光像とパターンおよび細胞の反射像を三次元的に形態観察した。細胞の蛍光染色はファロイジン−Ａｌｅｘａ５４６によって行われた。三次元的な観察は基材表面近傍から０．５μｍ間隔で３０μｍの深さまで行われた。基材上の細胞を真上から見た像と、その基材上の断面図を作成した。真上から見た細胞および基材の像は、全ての焦点を足しあわせたものである。その結果を図１０に示す。
（１）及び（２）のタイムラプス観察を行った後の細胞を含む基材５〜９を４%パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液に浸して、細胞を固定化した。ＤＡＰＩ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、２０００倍希釈）を用いて２０分間、室温で細胞核を染色し、ＥＵＫＩＴＴ（登録商標）（Ｏ．Ｋｉｎｄｌｅｒ製）を用いてカバーガラス上に封入した。接着細胞の観察は共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ−１０００Ｄ（オリンパス社製）を用いて行われた。このとき対物レンズは４０倍のレンズあるいは１００倍のレンズを用いた。この細胞核の蛍光像とパターンおよび細胞の反射像を三次元的に形態観察した。細胞の蛍光染色はファロイジン−Ａｌｅｘａ５４６によって行われた。三次元的な観察は基材表面近傍から０．５μｍ間隔で３０μｍの深さまで行われた。基材上の細胞を真上から見た像と、その基材上の断面図を作成した。真上から見た細胞および基材の像は、全ての焦点を足しあわせたものである。その結果を図１０に示す。
図１０から、本発明の基材に播種された細胞は、柱状凸部の頂部を伝いながら溝部を遊走していることが確認された。
（４）一種類の細胞の遊走の方向性の確認
細胞が一方向に動いたのかどうかを厳密に判断するために、実施例２の（１）の基材上でのＮＩＨ３Ｔ３細胞の遊走方向を観察した。
各基材（１ｍｍ×１ｍｍ）の観察領域を、左（Ｌ）領域と右（Ｒ）領域をさらにそれぞれＡ〜Ｃ領域の三段に分けた（図１１）。
細胞が一方向に動いたのかどうかを厳密に判断するために、実施例２の（１）の基材上でのＮＩＨ３Ｔ３細胞の遊走方向を観察した。
各基材（１ｍｍ×１ｍｍ）の観察領域を、左（Ｌ）領域と右（Ｒ）領域をさらにそれぞれＡ〜Ｃ領域の三段に分けた（図１１）。
各基材を写真に撮り、上記各領域に存在する細胞数をカウントし、Ａ〜ＣそれぞれのＲ領域とＬ領域に存在する全細胞数に対してＲ領域及びＬ領域の細胞数の存在比率を求めた。さらに、Ａ〜ＣのＲ領域及びＬ領域の存在比率の平均値および標準偏差を算出した。
その結果を図１２に示す。図中、各群の左側（網掛け）棒グラフが、全細胞数に対するＬ領域に存在する細胞数の比率を示し、各群の右側（白抜き）棒グラフが、全細胞数に対するＲ領域に存在する細胞数の比率を示す。エラーバーは標準偏差である。
また、基材９を撮影した写真を図１３に示す。
その結果を図１２に示す。図中、各群の左側（網掛け）棒グラフが、全細胞数に対するＬ領域に存在する細胞数の比率を示し、各群の右側（白抜き）棒グラフが、全細胞数に対するＲ領域に存在する細胞数の比率を示す。エラーバーは標準偏差である。
また、基材９を撮影した写真を図１３に示す。
基材９では細胞はＲ領域に大きく偏在していることが確認された。また基材１〜１５において細胞がＲ領域に有意に偏在していることが確認された。
（５）二種類の細胞の遊走の方向性の確認
前記（４）と同様にして、実施例２の（２）の基材上のＨａＣａＴ細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞の遊走の方向性を確認した。基材４を撮影した写真を図１４に示す。
ＨａＣａＴ細胞（緑色、白矢印で示す）は殆ど遊走が見られないのに対してＮＩＨ３Ｔ３細胞（赤色、矢印無し）はＲ領域へと遊走していることが確認された。
前記（４）と同様にして、実施例２の（２）の基材上のＨａＣａＴ細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞の遊走の方向性を確認した。基材４を撮影した写真を図１４に示す。
ＨａＣａＴ細胞（緑色、白矢印で示す）は殆ど遊走が見られないのに対してＮＩＨ３Ｔ３細胞（赤色、矢印無し）はＲ領域へと遊走していることが確認された。
（６）二種類の細胞の遊走の方向性の確認２
前記（４）と同様にして、実施例２の（２）の基材上のＨａＣａＴ細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞の遊走の方向性を確認した。基材４を撮影した写真を図１６に示す。
左図に示すＬ領域では、多くのＨａＣａＴ細胞（緑色、矢印無し）が認められたが、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（赤色、白矢印で示す）はごく僅かに存在していたのみだった。一方、右図に示すＲ領域では、撮影視野中の全ての細胞がＮＩＨ３Ｔ３細胞（赤色、矢印無し）であった。
この結果から、ＨａＣａＴ細胞は殆ど遊走していない一方、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の大多数はＲ領域へと遊走していることが確認された。
前記（４）と同様にして、実施例２の（２）の基材上のＨａＣａＴ細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞の遊走の方向性を確認した。基材４を撮影した写真を図１６に示す。
左図に示すＬ領域では、多くのＨａＣａＴ細胞（緑色、矢印無し）が認められたが、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（赤色、白矢印で示す）はごく僅かに存在していたのみだった。一方、右図に示すＲ領域では、撮影視野中の全ての細胞がＮＩＨ３Ｔ３細胞（赤色、矢印無し）であった。
この結果から、ＨａＣａＴ細胞は殆ど遊走していない一方、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の大多数はＲ領域へと遊走していることが確認された。
本発明は、細胞本来の機能を維持したまま細胞の識別又は分離を行うことができる技術を提供するものであり、細胞懸濁液中や生体組織中の各細胞種の存在量、がん細胞の浸潤性の評価などを行うことができる。また、本発明は細胞を遊走させるために化学物質、増殖因子、抗体などを用いる必要がないことから、細胞の性状を維持したまま細胞を分離することが可能となり、細胞診断、細胞治療に望まれる安全な細胞を供給することが可能となる。
１ 壁部
２ 柱状凸部
３ 柱状凸部の頂部
４ 相対する２つの壁部に対する垂線
５ 柱状凸部の一辺
６ 壁部の垂線に対しての傾き
７ ２つの柱状凸部の頂部の間隔
８ 一方の壁部の柱状凸部の頂部をつなぐ面と他方の壁部の柱状凸部の頂部をつなぐ面との間の距離
９ 壁部の幅
２ 柱状凸部
３ 柱状凸部の頂部
４ 相対する２つの壁部に対する垂線
５ 柱状凸部の一辺
６ 壁部の垂線に対しての傾き
７ ２つの柱状凸部の頂部の間隔
８ 一方の壁部の柱状凸部の頂部をつなぐ面と他方の壁部の柱状凸部の頂部をつなぐ面との間の距離
９ 壁部の幅
Claims (10)
- 動物細胞の運動方向を制御するための制御基材であって、該基材表面は複数の溝部を有し、該溝部は相対する２つの壁部と底部から形成され、該溝部を形成する相対する２つの壁部は柱状凸部を連続して有し、該柱状凸部は、
イ）その凸が水平方向断面で少なくとも一つの頂部となる形状であり、ならびに
ロ）相対する壁部に形成される柱状凸部と互い違いの位置に設けられる
ことを特徴とする、動物細胞の運動方向の制御基材。 - 一つの壁部において隣接する柱状凸部の頂部の間隔が３μｍ〜２０μｍである、請求項１に記載の基材。
- 前記壁部の高さが１０〜４０μｍである、請求項１又は２に記載の基材。
- 前記相対する壁部の間の距離が２μｍ〜２０μｍである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の基材。
- 前記凸の方向が相対する壁部の距離方向に対して一方向に傾いている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の基材。
- 前記凸の方向が相対する壁部の垂線方向に対して１０度〜８０度の方向を向いている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の基材。
- 前記柱状凸部の水平断面形状が６角形以下の多角形である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の基材。
- 基材がシリコン、ガラス、プラスチック及び金属よりなる群から選択される材料で形成される、請求項１〜７のいずれかに一項に記載の基材。
- ２以上の異なる種類の細胞を運動能に基づいて識別する方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の基材の溝部の一端に前記２種以上の異なる種類の細胞を含む細胞懸濁液を添加する工程、基材を前記細胞が生存可能な条件に保持する工程及び保持後の基材上の溝方向に沿って細胞の種類を識別する工程を含む、前記識別方法。
- ２以上の異なる種類の細胞を運動能に基づいて分離する方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の基材の溝部の一端に前記２種以上の異なる種類の細胞を含む細胞懸濁液を添加する工程、基材を前記細胞が生存可能な条件に保持する工程及び保持後の基材上の細胞を回収する工程を含む、前記分離方法。
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