TW201522618A - 動物細胞運動方向之控制基材、使用有該基材之細胞識別方法及細胞分離方法 - Google Patents

動物細胞運動方向之控制基材、使用有該基材之細胞識別方法及細胞分離方法 Download PDF

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TW201522618A
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Abstract

本發明係提供一種動物細胞運動方向之控制基材，係用以控制動物細胞運動方向的控制基材，其特徵在於：該基材表面具有多個槽部，該槽部係由相對的壁部與底部所形成，形成該槽部之相對的壁部具有多個柱狀凸部，該柱狀凸部之頂部被形成為朝向在相對的壁部所形成之2個柱狀凸部的頂部之間，並且該等頂部係朝向相同的方向。

Description

動物細胞運動方向之控制基材、使用有該基材之細胞識別方法及細胞分離方法
本發明係關於供利用細胞運動能力的差異來辨識或者分離細胞之，動物細胞運動方向之控制基材及使用有該基材之細胞辨識方法及細胞分離方法。
本申請案係基於2013年11月6日在日本所提申之日本特願2013-229898號主張優先權，將其之內容引用於此。
背景技術
被放置於血液、淋巴液或液體培養基等能移動之環境下的細胞，具有應答於化學物質或生長因子等化學刺激、電刺激、接觸刺激等物理刺激，及其他外部因素而移動之(遷移之)性質。著眼該細胞運動能力，透過選擇促使細胞遷移的刺激並使用，已研究開發從異種類細胞群專一性地辨識、分離任選的細胞之方法或者，供該用途之機器、器具或者材料等。
因細胞對於化學物質之化學趨向性(趨化性)所 致之細胞遷移的控制至今有許多的研究例，作為應用之使用了化學趨向性的細胞診斷亦達到實用化。就利用了化學趨向性之將細胞予以分離/診斷的方法之例而言，可舉使用了以多孔質的過濾器來隔開為上下的博伊登室(Boyden chamber)的方法。該方法係在博伊登室的過濾器下的劃分放置會吸引特定細胞的化學物質，將各種各樣的細胞播在過濾器上的劃分，藉此使得觀察往過濾器下之劃分方向之細胞的移動、採取經移動之細胞成為可能。
惟，使用了趨化性之細胞分離方法，因係以化學物質或生長因子來刺激細胞，會對成為對象之細胞的分化、增生、機能表現等各細胞性狀造成影響，而有使得刺激前後細胞的性狀變化之虞。即，趨化性會有使得成為對象之細胞的性狀不穩定的傾向，而在將刺激後的細胞投予至生體般的細胞治療或診斷而言，趨化性的利用係不利的。
另一方面，亦提倡：藉由對細胞提供由矽等適當材質所製作之所謂的「腳手架」(支架)，利用在腳手架上移動之細胞之遷移能力的差別來辨識或分離細胞的方法。例如，已報告有：藉由將細胞播種在使用光阻技術在矽基材上成形了微米級(micro order)正三角柱的規則圖案之基材，或者在表面使形成了突起物之基材，來控制細胞遷移方向的方法(非專利文獻1、非專利文獻2)。
以腳手架為刺激之細胞遷移的誘導係與趨化性不同，使刺激前後細胞的性狀變化的可能性低，正進行關於腳手架之結構的性質或特徴與細胞遷移能力及方向控制 的研究。
先行技術文獻 專利文獻
非專利文獻1「利用了三維圖案之細胞遷移的控制」，第33次分子生物學會年會/第83次日本生化學大會合同大會，2010年11月19日。
非專利文獻2「利用了三維圖案之新穎細胞趨性的開發」，戰略目標「因製程整合所致之次世代奈米系統的創製」，3研究領域聯合公開討論會，2013年10月17日。
發明揭示
本發明係以提供下述為目的：並非係使用了化學物質及生長因子、抗體等之趨化性，對細胞提供具有特徴的微圖案之基材作為腳手架，利用細胞的遷移能力來辨識或分離細胞之新的基材與方法。
本發明人等著眼於細胞偏好腳手架的突起部而遷移，發現到藉由將突起在固定方向上連續地排列而能夠控制細胞的遷移方向，而完成了下述各發明。
(1)一種動物細胞運動方向之控制基材，其係供控制動物細胞運動方向的控制基材，其特徴在於：該基材表面具有多個槽部，該槽部係由相對的2個壁部與底部所形成，且形成該槽部之相對的2個壁部係連續地具有柱狀凸 部，該柱狀凸部係，甲)其之凸起係在水平方向截面上成為至少一個頂部的形狀，且乙)係被設置於與在相對的壁部所形成之柱狀凸部呈交錯的位置。
(2)如(1)記載之基材，在其中一個壁部中鄰接之柱狀凸部之頂部的間隔係3μm~20μm。
(3)如(1)或(2)記載之基材，其中前述壁部的高度係10~40μm。
(4)如(1)~(3)中任一項記載的基材，其中前述相對的壁部之間的距離係2μm~20μm。
(5)如(1)~(4)中任一項記載的基材，其中前述凸起的方向對於相對之壁部的距離方向係朝一方向傾斜。
(6)如(5)記載之基材，其中前述凸起的方向對於相對之壁部的垂直線方向係朝向10度~80度的方向。
(7)如(1)~(6)中任一項記載的基材，其中前述柱狀凸部之水平方向截面形狀係6角形以下的多角形。
(8)如(1)~(7)中任一項記載的基材，其中基材係以選自於由矽、玻璃、塑料及金屬構成之群組之材料所形成。
(9)一種基於運動能力來辨識2個以上不同種類之細胞的方法，前述辨識方法包含下述步驟：添加包含前述2種以上不同種類之細胞的細胞懸浮液至如(1)~(8)中任一項記載之基材之槽部的一端的步驟、將基材保持在前述細胞能夠生存之條件下的步驟，以及沿著保持後之基材上的槽方向 來辨識細胞之種類的步驟。
(10)一種基於運動能力來分離2個以上不同種類之細胞的方法，前述分離方法包含下述步驟：添加包含前述2種以上不同種類之細胞的細胞懸浮液至如(1)~(8)中任一項記載之基材之槽部的一端的步驟、將基材保持在前述細胞能夠生存之條件下的步驟，以及回收保持後之基材上之細胞的步驟。
依據本發明，藉由將細胞懸浮液播種至本發明基材上，能夠在維持細胞原來之機能的情況下進行細胞的辨識或分離。又，使用顯微鏡或其他機器來監控在該基材上之細胞的分離過程或經移動的細胞數的話，能夠進行細胞懸浮液中或生物組織中各細胞種類的存在量、癌細胞浸潤性的評價等。
又，本發明由於不需使用化學物質、生長因子、抗體等以使細胞遷移的緣故，在維持細胞性狀的情況下分離細胞成為可能，而變得能夠供給在細胞診斷、細胞治療所期望之安全的細胞。
1‧‧‧壁部
2‧‧‧柱狀凸部
3‧‧‧柱狀凸部的頂部
4‧‧‧對於相對的2個壁部的垂直線
5‧‧‧柱狀凸部之一邊
6‧‧‧對於壁部垂直線的傾角
7‧‧‧2個柱狀凸部之頂部的間隔
8‧‧‧連接其中一方壁部之柱狀 凸部的頂部之面與連接另一方壁部之柱狀凸部的頂部之面之間的距離
9‧‧‧壁部的寬度
圖1係示意性地顯示本發明之一態樣之基材微細結構的圖。
圖2係示意性地顯示本發明其他態樣之基材之微細結構的圖。
圖3係於圖1所示之基材的透視圖。
圖4顯示於本發明基材之製作使用之光罩的基本圖案。
圖5顯示基材1~5之圖案的顯微鏡照片。
圖6顯示基材6~10之圖案的顯微鏡照片。
圖7顯示基材11~15之圖案的顯微鏡照片。
圖8A係表示了經播種至本發明基材之NIH3T3細胞的移動軌跡(圖中的線)的顯微鏡照片。
圖8B係表示了經播種至本發明基材之NIH3T3細胞的移動軌跡(圖中的線)之顯微鏡照片(圖8A)的示意圖。
圖9A係表示了經播種至本發明基材之NIH3T3細胞與HaCaT細胞之移動軌跡的顯微鏡照片。圖中，分別地綠色係表示HaCaT細胞，紅色與線係表示NIH3T3細胞與其之軌跡。
圖9B係表示了經播種至本發明基材之NIH3T3細胞與HaCaT細胞之移動軌跡的顯微鏡照片(圖9A)的示意圖。
圖10係表示在本發明基材的槽部移動之NIH3T3細胞的顯微鏡照片。
圖11係示意性地顯示本發明基材之區域的圖。
圖12係表示在基材1~15中在基板的R區域及L區域所觀察的NIH3T3細胞數的圖表。
圖13係表示基材9之R區域及L區域之NIH3T3細胞的顯微鏡照片。
圖14係表示基材4之R區域及L區域之HaCaT細胞及NIH3T3細胞的顯微鏡照片。圖中，分別地綠色(箭頭)係表示HaCaT細胞，而紅色(無記號)係表示NIH3T3細胞。
圖15係示意性地顯示本發明其他態樣之基材的結構及使用方法的圖。
圖16係顯示基材4之R區域及L區域之HaCaT細胞及NIH3T3細胞的顯微鏡照片。
較佳實施例之詳細說明 用以實施發明之最佳形態
本發明係關於一種動物細胞(以下稱為細胞)運動方向之控制基材，其係用以控制動物細胞運動方向的控制基材，其特徴在於：該基材表面具有多個槽部，該槽部係由相對的2個壁部與底部所形成，且形成該槽部之相對的2個壁部係連續地具有柱狀凸部，該柱狀凸部係：甲)其之凸起係在水平方向截面上成為至少一個頂部的形狀，且乙)係被設置於與在相對的壁部所形成之柱狀凸部呈交錯的位置。此外，所謂於本發明所稱之細胞的運動係意味細胞的移動，即遷移。
要是將已懸浮於適當溶劑的細胞播種至本發明的基材，則運動能力高的細胞自己開始遷移，進入或落下於槽部之後，成為會順著壁部之連續的柱狀凸部之頂部而在槽部於一方向上遷移。另一方面，運動能力低的細胞，幾乎不從被播種至基板上的場所移動或只略微移動，其結果，運動能力高的細胞與運動能力低的細胞，成為彼此分 離地位置在基材之上。如此，本發明之基材係供控制細胞運動方向，即，細胞的遷移方向的基材。
將本發明基材中的壁部及槽部的代表性態樣顯示於圖1及圖2。以下，使用圖式來進行說明。
就圖1及圖2來說，網底部分係表示從正上方看基材時2個以上相對的壁部1，相對的壁部之間的無色部分(空間)係表示槽部。又，為方便圖示，省略了位置於紙面裏側方向之底部的記載。又，將圖1態樣之基材的透視圖顯示於圖3。
於圖1所示之態樣的發明中壁部1係於壁部1的兩面連續地具有柱狀凸部2，該柱狀凸部2係將壁部1在水平方向切割之時截面形狀為三角形者。壁部1的柱狀凸部2係被形成為朝向相對之壁部1的2個柱狀凸部的頂部3之間，其結果，係被設置於與在相對的壁部1所形成之柱狀凸部2呈交錯的位置。柱狀凸部2係以從底部立起的方式與壁部1一體地被形成之壁部1的部分結構(參照圖3的透視圖)。
所謂「被設置於與在相對的壁部所形成之柱狀凸部呈交錯的位置」，亦可表示為「以使得在描繪了對於相對的2個壁部1的垂直線4時，2個壁部1的柱狀凸部2之中最接近於相對的壁部1之各個的頂部不存在於一條垂直線上的方式所形成」。
又，所謂「其凸起係在水平方向截面上成為至少一個頂部的形狀」，亦可表示「柱狀凸部係至少具有一個角」。在本發明中壁部1之柱狀凸部2的形狀(在水平方向上切割了壁部1時的截面形狀)，在至少具有一個會成為細胞 遷移之際之卡絆處(掛)的頂部外，沒有特別制限。當柱狀凸部2之形狀(在水平方向上切割了壁部時的截面形狀)係多角形的狀況時，本發明的頂部係具有90度以下，較佳係60度以下，更佳係30度以下之角度的角即可。
在本發明中柱狀凸部2係朝向壁部1的延伸方向連續地存在。其之重複間距係能以柱狀凸部之頂部3的間隔7來表示。就本發明基材而言，較佳係以使得柱狀凸部之頂部3的間隔係3μm~20μm，較佳係10μm~15μm的範圍，來形成柱狀凸部2。
柱狀凸部2的高度係與壁部1的高度為相同的程度即可。
又，在本發明中，較佳係凸起的方向對於相對之壁部的距離方向係朝一方向傾斜。就於圖1所示之態樣而言，相對之壁部1之柱狀凸部2的一邊5(三角形的斜邊)，任一者皆係被形成使得對於壁部1的垂直線伴有傾角6而朝向圖的右方。在本發明中之柱狀凸部2，較佳係被形成使得傾角6係10度~80度，較佳係30度至75度的範圍。細胞的遷移方向被控制在該凸起朝向的方向。
較佳係調節使得在本發明中壁部1的高度(槽部的深度)成為5μm~40μm，較佳係20~30μm。壁部1之高度(槽部的深度)要是低於5μm，則在槽部遷移之細胞登上至壁部1上部的頻率增加而控制遷移方向的效率有降低的傾向。此外，即便加高壁部1的高度高於40μm，關於遷移方向的控制亦沒有特別的不便，該上限係取決於基材的製作 技術。
較佳係形成使得本發明中相對的壁部1其等之間的距離成為2μm~20μm，較佳係5μm~15μm。所謂此處所稱之距離係意味連接其中一方壁部1之柱狀凸部的頂部3之面與連接另一方壁部1之柱狀凸部的頂部3之面之間的距離8。要是距離超過上述範圍，則細胞的遷移速度有降低的傾向。
較佳係調節使得在本發明中之壁部的寬度9成為20μm~60μm，較佳係30~50μm。當寬度超過上限的狀況時，被播種於基材之細胞變得難以移動或落下至槽部，而有因細胞的辨識或分離操作需要長時間的可能性。
顯示本發明之基材之其他態樣之圖2的各符號，係與圖1的符號對應。圖2態樣之壁部1係在壁的兩面具有多個之柱狀凸部2，該柱狀凸部2係在水平方向上切割了壁部1時截面形狀成為梯形者。於該態樣中，其中一方壁部1之柱狀凸部的頂部3(梯形中最接近於相對的壁部的角)，係被形成為朝向另一方之壁部2之2個柱狀凸部的頂部3之間，該頂部係被形成在呈交錯的位置。又，相對之壁部1之柱狀凸部2的凸起，任一者皆係被形成為朝向圖的右方。
此外，於圖1及圖2態樣中柱狀凸部2，其形狀(在水平方向上切割了壁部之時的截面形狀)係以多角形所表示，但，在本發明中柱狀凸部2亦可係具有以曲線所形成的截面形狀，例如半橢圓形狀或波形形狀者。又該柱狀凸部2的頂部可為具有90度以下，較佳係60度以下，更佳係30度 以下之角度者，亦可係具有與該等相同程度之曲率之髮夾狀的頂部。又，前述頂部的間隔、壁部的距離、高度及寬度可在一個基材中及在一個壁部中均一，或者亦可在上述範圍內係不同的。例如，於一個基材中可存在頂部的間隔、高度及/或寬度彼此不同的壁部，或亦可一個壁部之頂部的間隔或寬度部分地不同。
就本發明之基材的材料而言，係能夠形成微米級微細結構之材料的話未特別限定，可舉：矽、玻璃、塑料、金屬等作為適宜的材料。矽或玻璃係能夠利用供形成微細結構的光微影技術來作成本發明之基材。
特佳之基材的材料係能夠使用光微影技術來形成微米級微細結構的矽晶圓。
供在矽晶圓上形成微細結構的光微影技術(含光罩的作成及在晶圓狀的圖案成形及其他步驟)，係在半導體元件及印刷基材等製造領域中廣泛已知的技術，正開發包含正型光阻、負型光阻的許多方法。對本發明之基材的製作來說，係以矽晶圓等為對象的光微影技術的話能利用任一者。
此外，使用光微影技術來從矽晶圓製作本發明之基材的狀況時，為了確保本發明基材之壁部的高度(槽部的深度)，較佳係進行波希法等深蝕刻。
就本發明之基材而言，已懸浮於適當的液體溶劑(較佳係液體培養基)的細胞播種至基材，細胞在槽部內移動。因此，例如以矽晶圓為材料透過光微影技術所製作之 基材等的表面係疏水性的基材，較佳係將其之表面進行親水化處理再使用。此般表面經賦予親水性之基材係本發明較佳態樣的一個。
使基材的表面親水化的方法係因應使用之素材來採用既知的方法即可，例如對於從矽晶圓所製作之基材而言，可採用O2電漿法、界面活性劑處理法等。
以上述之藉由光微影技術所製作之矽晶圓為基底的基材，亦可將其作為供將圖案移至其他素材的鑄模來利用。例如，亦可透過將適當的塑料、熱固性樹脂或熱塑性樹脂熔融或者溶解於溶劑，使流入於上述基材而固化，來作成以塑料等為素材之本發明基材。或者，亦可藉由將以矽晶圓製成之基材按壓於塑性材料來將圖案轉印至塑性材料。又，以金屬作為材料的狀況時，亦可藉由微雷射加工等，直接地對金屬形成本發明的圖案，來製作作為本發明之基材。
就其他的態樣而言，本發明提供一種基於運動能力來辨識2個以上不同種類之細胞的方法，其包含下述步驟：將包含2種以上不同種類之細胞的細胞懸浮液添加至前述基材之槽部的一端的步驟、將基材保持在前述細胞能夠生存之條件下的步驟，以及沿著保持後之基材上的槽方向來辨識細胞之種類的步驟。
又，就又一個態樣而言，亦提供一種基於運動能力來分離2個以上不同種類之細胞的方法，其包含下述步驟：將包含前述2種以上不同種類之細胞的細胞懸浮液添加 至前述基材之槽部的一端的步驟、將基材保持在前述細胞能夠生存之條件下的步驟，以及將保持後之基材上的細胞予以回收的步驟。
上述方法中所謂基材之槽部的一端，係意味與前述壁部之柱狀凸部的頂部朝向著的方向(傾斜的)方向係相反方向的端部，以使用於圖1及圖2所示之基材的方法為例，係位置於圖之左側的端部。
又，進一步就其他態樣而言，亦能夠以覆蓋前述基材上(壁部上)的至少一部分的方式，將蓋玻璃等被覆構件載置於基材上之後，將包含至少1種以上之細胞的細胞懸浮液添加至未被被覆之基材上，其後，除去被覆構件而使細胞的遷移開始(圖15)。
本發明之方法的典型例係將基材浸泡在適當的液體，較佳係將基材浸泡在對成為分離對象之細胞的生存係適宜的液體培養基或緩衝液中，將包含成為對象之細胞的懸浮液播種至基材之槽部延伸方向的一端，能透過使靜置在細胞能夠生存的條件，例如37℃左右的溫度與好氧的環境下數小時~數日來進行。具體而言，將本發明基材置於培養皿等容器，將DMEM培養基或其他能使用於動物細胞之培養之適當的液體培養基以基材的上側表面略微浸泡的程度添加至培養皿後，將細胞懸浮液滴下至基材的槽部延伸之方向的一端，將其靜置在細胞培養條件下10小時~24小時即可。
培養基、緩衝液及靜置條件，因應成為辨識或分 離對象之細胞來選擇此技術領域之從業人員已知者作為對該細胞係適宜者即可。又，細胞係能夠透過應用使用了顯微鏡之細胞外觀觀察、利用了光學特性的觀察、使用了對細胞具有專一性之螢光試劑或抗體等化學物質的細胞標識及其他之一般使用於細胞辨識的方法來進行辨識。又，依遷移能力的不同而成為局部存在於基材上不同部位的細胞係能夠藉由透過適當的方法來分別回收其之一者或兩者而彼此分離。
透過使用本發明基材，不使用特別的化學物質即可辨識或分離運動能力高的細胞與運動能力低的細胞。例如，由於據稱與正常細胞相比，已癌化的細胞運動能力係高的緣故，例如將從藉活組織檢查法等而摘除或回收了的檢體所製備之細胞懸浮液，播種至本發明基材上，藉此期待能夠透過著眼於移動的細胞而調查細胞性狀，而進行癌的診斷等。
又，一般來說，由於據稱iPS細胞運動能力低，而被分化誘導為特定細胞的細胞會發揮高的運動能力的緣故，透過利用本發明基材，變得能夠辨識或分離已從iPS細胞被分化誘導之目標細胞與停留在未分化的iPS細胞。特別係依據本發明之方法，對細胞分離並不一定需要供控制遷移之方向性的化學物質，在分離前後細胞性狀變化的可能性極小或是幾乎沒有。這樣的分離技術，在變得能夠供給在細胞診斷、細胞治療所期望之安全的細胞的觀點來看係有利的。
進一步，藉由將本發明基材應用於血管支架或導管、人工關節等醫療材料，在被埋入生體內之醫療材料的表面上將運動性低的細胞留在材料表面，另一方面能夠使運動性高的細胞從基材脫離，而期待將醫療材料的表面以所欲的細胞進行被覆而變得能夠提高生體適合性。
藉由以下之實施例進一步詳細地說明本發明。
實施例 <實施例1> (1)三維圖案基材的製作
對於具有25個1mm見方之區域的石英光罩(Mitani Micronics公司(Mitani Micronics Co.,Ltd.)製)的各區域，準備了具有於圖4所示之基本結構，以及於a~h所示之各部尺寸及角度互異之15種類之圖案1~15的光罩。
在附有900nm之熱氧化皮膜之矽基材(10mm×10mm)上來旋塗(1000rpm，5秒~4000rpm，45秒)了HMDS(六甲基二矽氮烷；東京應化工業公司製)及光阻組成物OFPR-5000LB(東京應化工業公司製)。預烘(110℃，2分鐘)後，將先前已準備之石英光罩與已塗佈光阻膜的矽基材置於曝光裝置MA-20(Mikasa公司製)，曝光1.5秒。
將曝光後之矽基材浸漬於顯影液NMD-3(東京應化工業公司製)進行了顯影。藉由光學顯微鏡，進行光阻膜圖案的檢查，確認了在矽基材上製作有光阻膜圖案。進行了後烘烤(130℃，20分鐘)之後，使用反應性離子蝕刻裝置RIE-10-NRV(Samco公司製)來除去矽基材未以光阻膜所覆 蓋之部分的SiO2。藉由FE-SEM JSM-6700FT(日本電子公司製)來確認已除去SiO2後，使用RIE-10-NRV(Samco公司製)O2清潔法(50sccm，3Pa，3分鐘)之後，在丙酮中進行30秒間超音波洗淨來完全除去了光阻膜。
透過ICP乾式蝕刻裝置(MUC-21，住友精密工業公司製)來將Si深深的蝕刻(SF6，50sccm，C4H8，50sccm，500W，22分，4.7Pa)。以HF來除去作為遮罩而使用的SiO2。藉由FE-SEMJSM-6700FT(日本電子公司製)來觀察了矽基材的截面時，確認到形成有深度23μm的槽。
使用彩色雷射3D顯微鏡VK-9700(KEYENCE公司製)來進行所獲得之三維圖案之形狀的觀察。此時，使用50倍的物鏡(尼康公司製)一邊進行真實頂點偵測(Real Peak Detection)(RPD)一邊以高清晰模式來觀察。透過此觀察，確認到具有如下述圖案之本發明基材1~15被製作出來：在藉由光罩準備好之圖案1~15之任一者中，配置有若干列多個壁部以規定的範圍偏移相向之壁部的圖案，且該等多個壁部具有連續之三角柱形狀的柱狀凸部。將基材1~15的各圖案匯總顯示於圖5~圖7。
形態分析基材1~15的圖案形狀的影像，對各個基材，分別針對不同之6處所計測圖4之以a~h所表之部位的長度，算出了各部位的平均值與標準差。將該結果顯示於表1。
【表1】
【表3】
(2)三維圖案的親水化與滅菌、表面的脫氣
將於(1)製作出之基材1~15，使用RIE-10NRV(Samco公司製)來進行O2清潔法(50sccm，3Pa，8分鐘)，而對基材附加了對水的親水性。將基材1~15以120℃滅菌20分鐘之後，沈到已添加含10%FBS、1%盤尼西林及鏈黴素的DMEM培養基(以下，簡記為DMEM培養基)之35mm細胞培養皿之底部，在-0.09Mpa下一邊輕輕地振盪1分鐘一邊進行了脫氣。在藉由光學顯微鏡進行之反射像觀察中確認到氣泡已完全地除去。將該已受親水化之基材1~15使用於以下的實驗。
<實施例2> (1)NIH3T3細胞之PKH26染色
將於實施例1(2)製作出之基材沈至已添加DMEM培養基之35mm細胞培養皿的底部，在-0.09Mpa下一邊輕輕地振盪1分鐘一邊進行脫氣，進行了培養基交換之後，就此浸漬 在培養基12小時並靜置。將NIH3T3細胞以1×104個/cm2來播種至附有三維圖案基材的皿中，培養2小時後，在PKH26(Sigma Aldrich公司，稀釋500倍)中於室溫下浸漬了4分鐘。以FBS停止PKH26的反應之後，以培養基來洗淨。從藉由PKH26進行之NIH3T3細胞的染色至洗淨操作結束為止所費的時間約係0.25小時。該等程序係以PKH26的染色規程為參考並改變再使用。
將接著有經以PKH26所染色之NIH3T3細胞之基材移至充滿了培養基的Glass Base Dish 12 φ(IWAKI公司製)，使之反轉並放置在該皿之底部的玻璃窗部分。此時，使得各基材四個頂點掛在玻璃窗的框上，並以使得在細胞播種面與玻璃之間空出充分的空隙來使培養基擴散至細胞培養面。在該狀態下，進一步以DMEM培養基來培養了1.75小時後，使用安裝有StageTop(註冊商標)Incubation INU-ZILCS(TOKAI HIT公司製)之螢光顯微鏡ObserverZ1(Zeiss公司製)以30分鐘為間隔跨度72小時進行了時移觀察。觀察係使用10倍的物鏡，藉由CCD照相機來撮影所指定之定點(871μm×690μm)之三維圖案的反射像與利用PKH26所標記之細胞的螢光影像。由在各定點所獲得之圖像作成動畫，從動畫確認了細胞遷移的方向。其結果，針對全部基材1~15，確認到NIH3T3細胞係僅向柱狀凸部之頂部突出的方向(圖4的右方)遷移。將對撮影了代表性基材6~9者，加了數位處理細胞軌跡之照片顯示於圖8A。又，就圖8B言之，為了使圖8A中基材圖案及細胞軌跡明 確，顯示已示意化圖8A之圖。
(2)二種類之活細胞的PKH26及PKH67染色
將於實施例1(2)製作出之基材沈至已添加DMEM培養基之35mm細胞培養皿的底部，在-0.09Mpa下一邊輕輕地振盪1分鐘一邊進行脫氣，進行了培養基交換之後，就此浸漬在培養基12小時並靜置。以1×104個/cm2分別將HeLa細胞及HaCaT細胞播種至附有基材的皿，以DMEM培養基培養9.75小時後，在PKH67(稀釋250倍)在室溫下浸漬了4分鐘。以FBS停止PKH67的反應之後，以培養基來洗淨。從藉由PHK67進行之細胞染色至洗淨操作結束為止所費的時間約係0.25小時。該等程序係以PHK67的染色規程為参考並改變而使用。
其次，將利用胰蛋白酶使剝離之NIH3T3細胞以DMEM培養基來洗淨，在PKH26(稀釋250倍)中在室溫下浸漬了4分鐘。以FBS停止PKH26的反應之後，以培養基來洗淨。將以經PKH26所染色之NIH3T3細胞1×104個/cm2，播種至接著有以經PKH67所染色之HeLa細胞及HaCaT細胞的基材。從由PKH26進行之細胞染色至洗淨操作結束為止所費的時間約係0.25小時。
以DMEM培養基培養了5.75小時之後，移至充滿了培養基的Glass Base Dish 12 φ，使之反轉並放置在該皿之底部的玻璃窗的部分。此時，使得各基材四個頂點掛在玻璃窗的框上，並以使得在細胞播種面與玻璃之間空出充分的空隙來使培養基擴散至細胞培養面。在該狀態下，與 (1)同樣地進行而進行了時移觀察。
將HaCaT細胞(以綠色及塗黑的△所表示)與NIH3T3細胞(以紅色及□所表示)播種至相同基材，對跨度72小時定點連續觀察者加了數位處理細胞軌跡的照片顯示於圖9A。又，就圖9B言之，為使圖9A中基材圖案及細胞軌跡明確，顯示經示意化圖9A的圖。
從該照片可了解到，HaCaT細胞(△)幾乎沒有遷移，相對於此，NIH3T3細胞(□)任一者皆係向右方遷移。該結果係顯示：藉由使用本發明基材將HaCat細胞與NIH3T3細胞予以辨識或分離係可能的。
(3)樣本的固定化與DAPI染色、觀察
將包含進行了(1)及(2)之時移觀察後之細胞的基材5~9浸泡在4%多聚甲醛磷酸(paraformaldehyde phosphoric acid)緩衝液，固定化細胞。使用DAPI(Dojindo Laboratories公司，稀釋2000倍)在室溫下染色細胞核20分鐘，使用EUKITT(註冊商標)(O.Kindler製)來封入至蓋玻璃上。接著細胞的觀察係使用共軛焦雷射掃描顯微鏡FV-1000D(Olympus公司製)所進行。此時物鏡係使用40倍的鏡頭或100倍的鏡頭。三維地形態觀察了該細胞核之螢光影像與圖案及細胞的反射像。細胞的螢光染色係藉由鬼筆環肽(phalloidin)-Alexa546所進行。三維的觀察係自基材表面附近以0.5μm間隔來進行至30μm的深度為止。作成了從正上方看基材上之細胞的影像與該基材上的截面圖。從正上方看到之細胞及基材的影像係總和了所有的焦點者。將 該結果顯示於圖10。
從圖10確認到：被播種於本發明基材的細胞，一邊順著柱狀凸部的頂部一邊在槽部遷移。
(4)一種類細胞遷移之方向性的確認
為了嚴格地判斷細胞是否在一方向上移動了，觀察了在實施例2之(1)的基材上之NIH3T3細胞的遷移方向。
將各基材(1mm×1mm)的觀察區域，分為左(L)區域與右(R)區域並進一步分別分為A~C區域的三段(圖11)。
將各基材攝於照片，計數存在於上述各區域的細胞數，求得R區域及L區域之細胞數相對於存在於各個A~C之R區域與L區域之總細胞數的存在比率。進一步，算出了A~C之R區域及L區域之存在比率的平均值及標準差。
將其結果顯示於圖12。圖中，各群左側(網底)長條圖係表示存在於L區域之細胞數相對於總細胞數的比率，各群右側(空心)長條圖係表示存在於R區域之細胞數相對於總細胞數的比率。誤差條係標準差。
又，將撮影了基材9所得之照片顯示於圖13。
就基材9而言確認到，細胞係大大地偏向存在於R區域。又，確認到在基材1~15中，細胞係顯著地偏向存在於R區域。
(5)二種類細胞遷移之方向性的確認
與前述(4)同樣地進行，確認了實施例2之(2)基材上之HaCaT細胞及NIH3T3細胞之遷移的方向性。將撮影基材4所得之照片顯示於圖14。
確認到HaCaT細胞(以綠色、白箭頭表示)係幾乎未見遷移，而相對於此，NIH3T3細胞(紅色、無箭頭)係往R區域遷移。
(6)二種類細胞遷移之方向性的確認2
與前述(4)同樣地進行，確認了實施例2之(2)基材上之HaCaT細胞及NIH3T3細胞之遷移的方向性。將撮影了基材4所得之照片顯示於圖16。
在顯示於左圖之L區域而言，看到許多HaCaT細胞(綠色、無箭頭)，但NIH3T3細胞(以紅色、白箭頭表示)係僅極微量地存在。另一方面，在顯示於右圖之R區域而言，撮影視野中所有的細胞係NIH3T3細胞(紅色、無箭頭)。
由該結果來看，確認到HaCaT細胞係幾乎不遷移，而另一方面，NIH3T3細胞的大多數係往R區域遷移。
產業上的可利用性
本發明係提供一種在維持細胞原來的機能的情況下能夠進行細胞之辨識或分離之技術者，能夠進行細胞懸浮液中或生物組織中各細胞種類的存在量、癌細胞之浸潤性的評價等。又，本發明由於不需要為了使細胞遷移而使用化學物質、生長因子、抗體等，而變得能夠在維持細胞之性狀的情況下來分離細胞，而成為能夠供給在細胞診斷、細胞治療所期望之安全的細胞。
1‧‧‧壁部
2‧‧‧柱狀凸部
3‧‧‧柱狀凸部的頂部
4‧‧‧對於相對的2個壁部的垂直線
5‧‧‧柱狀凸部之一邊
6‧‧‧相對於壁部垂直線的傾角
7‧‧‧2個柱狀凸部之頂部的間隔
8‧‧‧連接其中一方壁部之柱狀凸部的 頂部之面與連接另一方壁部之柱狀 凸部的頂部之面之間的距離
9‧‧‧壁部的寬度

Claims (10)

  1. 一種動物細胞運動方向之控制基材，其係用以控制動物細胞運動方向的控制基材，其特徵在於：該基材表面具有多個槽部，該槽部係由相對的2個壁部與底部所形成，且形成該槽部之相對的2個壁部係連續地具有柱狀凸部，該柱狀凸部係，甲)其之凸起係在水平方向截面上成為至少一個頂部的形狀，且乙)係被設置於與在相對的壁部所形成之柱狀凸部呈交錯的位置。
  2. 如請求項1之基材，其中在一個壁部中鄰接之柱狀凸部之頂部的間隔係3μm~20μm。
  3. 如請求項1或2之基材，其中前述壁部的高度係10~40μm。
  4. 如請求項1或2之基材，其中前述相對的壁部之間的距離係2μm~20μm。
  5. 如請求項1或2之基材，其中前述凸起的方向對於相對之壁部的距離方向係朝一方向傾斜。
  6. 如請求項1或2之基材，其中前述凸起的方向對於相對之壁部的垂直線方向係朝向10度~80度的方向。
  7. 如請求項1或2之基材，其中前述柱狀凸部之水平截面形狀係6角形以下的多角形。
  8. 如請求項1或2之基材，其中基材係以選自於由矽、玻 璃、塑料及金屬構成之群組之材料所形成。
  9. 一種基於運動能力來辨識2個以上不同種類之細胞的方法，前述辨識方法包含下述步驟：添加包含前述2種以上不同種類之細胞的細胞懸浮液至如請求項1或2之基材之槽部的一端的步驟、將基材保持在前述細胞能夠生存之條件下的步驟，以及，沿著保持後之基材上的槽方向辨識細胞之種類的步驟。
  10. 一種基於運動能力來分離2個以上不同種類之細胞的方法，前述分離方法包含下述步驟：添加包含前述2種以上不同種類之細胞的細胞懸浮液至如請求項1或2之基材之槽部的一端的步驟、將基材保持在前述細胞能夠生存之條件下的步驟，以及，回收保持後之基材上之細胞的步驟。
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