JPWO2013146779A1 - ラマン散乱分光法による神経検出法 - Google Patents
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Abstract
Description
項1. 神経の検出方法であって、以下の工程1〜工程4:
工程1:試料に励起光を照射する工程
工程2:試料からのラマン散乱光を検出する工程;
工程3:工程2により検出されたラマン散乱光の特定範囲内の波数の強度比を算出する、あるいは前記強度比の特徴を抽出し多変量解析及び/又は統計解析する工程、
工程4:前記強度比又は多変量解析及び/又は統計解析結果を指標として、無髄神経を含む神経を特異的に表示する工程
を含むことを特徴とする、神経の検出方法。
項2. 前記強度比が、2855cm−1又はその前後のピーク波数範囲と2933cm−1又はその前後のピーク波数範囲の強度比、あるいは、2887cm−1又はその前後のピーク波数範囲と2933cm−1又はその前後のピーク波数範囲の強度比である、項1に記載の検出方法。
項3. 前記強度比の分子と分母の組み合わせが以下の(i)〜(iii)のいずれかである、項2に記載の検出方法:
(i) 分子が2855 cm-1のとき、分母は2859〜3024cm-1、3068〜3100cm-1の波数範囲のいずれかの波数
(ii) 分子が2887 cm-1のとき、分母は2899〜3024cm-1の波数範囲のいずれかの波数、
(iii) 分子が2933 cm-1のとき、分母は2813〜2912cm-1、2940〜3021cm-1、3073〜3089cm-1の波数範囲のいずれかの波数。
項4. 前記強度比が、2855cm−1と2933cm−1の強度比、あるいは2887cm−1と2933cm−1の強度比である、項1〜3のいずれかに記載の検出方法。
項5. 試料が手術を受けている患者あるいは患者から採取した組織である、項1〜4のいずれかに記載の検出方法。
項6. 神経が無髄神経を含む、項1〜5のいずれかに記載の検出方法。
項7. 試料に励起光を照射する励起光照射手段、
試料からのラマン散乱光を検出する手段、
受光したラマン散乱光を各波長/波数のスペクトル成分に分光する分光部と、
ラマン散乱光の特定波長/特定波数の強度比を算出する強度比算出手段または前記強度比の特徴を抽出し多変量解析及び/又は統計解析する解析手段と、
前記強度比又は多変量解析及び/又は統計解析結果を指標として、無髄神経を含む神経を特異的に表示する手段
を含むことを特徴とする、無髄神経を含む神経の検出装置。
項8. 前記光源がレーザ光源である、項7に記載の検出装置。
項9. ラマンスペクトルを検出する検出器を備えている、項7又は8に記載の検出装置。
工程1:試料に励起光を照射する工程
工程2:試料からのラマン散乱光を検出する工程;
工程3:工程2により検出されたラマン散乱光の特定範囲内の波数の強度比を算出する、あるいは前記強度比の特徴を抽出し多変量解析及び/又は統計解析する工程、
工程4:前記強度比又は多変量解析及び/又は統計解析結果を指標として、無髄神経を含む神経を特異的に表示する工程
を含むことを特徴とする、神経の検出方法を提供するものである。
実験装置の概要図を図1に示す。
スリット走査型ラマン散乱顕微鏡:RAMAN-11, Nanophoton社
冷却CCDカメラ:Pixis 400BR, Princeton Instruments社, -70度, 1340x400 pixels
対物レンズ:UPLSAPO,Olympus社,x60, NA = 1.2
(1)組織試料
ラット組織
健常Wistarラットを麻酔薬過剰投与による安楽死後,各組織を取得した。
肋間神経を含む胸部組織,迷走神経を含む食道付近の組織,大腿神経およびその周囲組織,腹腔神経叢,小脳
種類:Wistarラット
年齢:Young-adult(8〜10週齢)
ヒト組織
前立腺全摘除術を受けた患者の前立腺周囲組織を取得した。胃癌摘除術を受けた患者の迷走神経胃枝を含む組織を取得した。
取得した組織は,Frozen Section Compound(FSC22, Leica)に包埋し,ドライアイス-アセトンにより急速凍結した。測定時まで,-80度のディープフリーザーで保存した。
凍結組織を5μmの厚さで切片にし,スライドガラスとカバーガラスで挟み,計測を行った。
生体組織のラマンスペクトルには,自家蛍光が重畳する。そこで,自家蛍光の影響を除外するため,Nanophoton社製ラマン顕微鏡用ソフトウェアにより自家蛍光スペクトルを推定し,自家蛍光の影響を除算した。具体的には,modified least-squares fifth-order polynomial curve fitting (Lieber CA, Mahadevan-Jansen A (2003) Automated Method for Subtraction of Fluorescence from Biological Raman Spectra. Appl Spectrosc 57 (11):1363-1367)を適用し,これを10回繰り返すことで自家蛍光を推定した。
また,ラマンシフトが既知のエタノールのラマンスペクトルを用いて,分光器の波長較正を行った。
様々な神経のラマンスペクトルを図2に、神経、その他組織のラマンスペクトルを図3に示す。
有髄神経,無髄神経,結合組織,脂肪組織,筋組織(横紋筋),血管(中膜)のラマンスペクトルを取得し,各ラマンシフトにおける強度比に有意差があるかどうかを調査した。
上式によって計算した強度比を2種の組織(図の上に記述した“結合組織 vs 有髄神経”など))において複数点計測し,その2種の計測群に対してt検定による統計解析を行い,P値を算出した。
例)解析対象:有髄神経と脂肪組織
ω1:2850 cm-1, ω2:2933 cm-1に対して
強度比計算
図12、図13中,左軸2850 cm-1 (ω1),下軸2933 cm-1 (ω2)に対応する点にP値をプロット。
ω1やω2をずらして同様のこと(強度比計算,t検定)を繰り返す。
各ラマンシフトの強度比に対するP値をプロットしたものを図12、図13に示す。通常,P<0.05であれば有意差があると言える。故に,図12,13中において白い部分の範囲であれば有意差があると言える。この白い部分の領域であれば,強度比による組織鑑別が可能である。この白い部分の領域であれば、工程3,工程4で神経を特異的に表示することができる。本発明の好ましい実施形態では、2855cm−1又はその前後のピーク波数範囲と2933cm−1又はその前後のピーク波数範囲の強度比、あるいは、2887cm−1又はその前後のピーク波数範囲と2933cm−1又はその前後のピーク波数範囲の強度比を用いることができる。ここで、2855cm−1又はその前後のピーク波数範囲、2933cm−1又はその前後のピーク波数範囲、2887cm−1又はその前後のピーク波数範囲の「前後のピーク波数範囲」は、白い部分の領域の範囲で2933cm−1、2855cm−1、2933cm−1の波数を変更できることを意味する。
様々な波長においても神経検出が可能であることを示すために,励起光波長671nmにおけるラマンスペクトルを計測した(図14).参考として,励起光波長532nmでの計測結果を図15に示す。
Claims (9)
- 神経の検出方法であって、以下の工程1〜工程4:
工程1:試料に励起光を照射する工程
工程2:試料からのラマン散乱光を検出する工程;
工程3:工程2により検出されたラマン散乱光の特定範囲内の波数の強度比を算出する、あるいは前記強度比の特徴を抽出し多変量解析及び/又は統計解析する工程、
工程4:前記強度比又は多変量解析及び/又は統計解析結果を指標として、無髄神経を含む神経を特異的に表示する工程
を含むことを特徴とする、神経の検出方法。 - 前記強度比が、2855cm−1又はその前後のピーク波数範囲と2933cm−1又はその前後のピーク波数範囲の強度比、あるいは、2887cm−1又はその前後のピーク波数範囲と2933cm−1又はその前後のピーク波数範囲の強度比である、請求項1に記載の検出方法。
- 前記強度比の分子と分母の組み合わせが以下の(i)〜(iii)のいずれかである、請求項2に記載の検出方法:
(i) 分子が2855 cm-1のとき、分母は2859〜3024cm-1、3068〜3100cm-1の波数範囲のいずれかの波数
(ii) 分子が2887 cm-1のとき、分母は2899〜3024cm-1の波数範囲のいずれかの波数、
(iii) 分子が2933 cm-1のとき、分母は2813〜2912cm-1、2940〜3021cm-1、3073〜3089cm-1の波数範囲のいずれかの波数。 - 前記強度比が、2855cm−1と2933cm−1の強度比、あるいは2887cm−1と2933cm−1の強度比である、請求項1〜3のいずれかに記載の検出方法。
- 試料が手術を受けている患者あるいは患者から採取した組織である、請求項1〜4のいずれかに記載の検出方法。
- 神経が無髄神経を含む、請求項1〜5のいずれかに記載の検出方法。
- 試料に励起光を照射する励起光照射手段、
試料からのラマン散乱光を検出する手段、
受光したラマン散乱光を各波長/波数のスペクトル成分に分光する分光部と、
ラマン散乱光の特定波長/特定波数の強度比を算出する強度比算出手段または前記強度比の特徴を抽出し多変量解析及び/又は統計解析する解析手段と、
前記強度比を指標として無髄神経を含む神経を特異的に表示する手段
を含むことを特徴とする、無髄神経を含む神経の検出装置。 - 前記光源がレーザ光源である、請求項7に記載の検出装置。
- ラマンスペクトルを検出する検出器を備えている、請求項7又は8に記載の検出装置。
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