JPWO2013133402A1 - 核酸中の一塩基多型の検出方法 - Google Patents
核酸中の一塩基多型の検出方法 Download PDFInfo
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Abstract
（Ａ）少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸／そのアンチセンス鎖、に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該バルジの隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該バルジにナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブと、（Ｂ）前記評価対象核酸とを混合し、ハイブリダイズした際にナフチリジン誘導体化合物に基づくシグナルを検出し、前記一塩基多型を評価することを特徴とする、核酸中の一塩基多型の検出方法。本発明の検出方法によれば、核酸中の一塩基多型を、簡便な操作で、低コストで、高感度に検出することができる。
Description
本発明は、標的となる核酸中の一塩基多型を検出する方法及びそのキットに関する。さらに詳しくは、標的となる核酸中の一塩基多型を、簡便に、高感度に検出する方法及びそのキットに関する。
一塩基多型（ＳＮＰ）は、ゲノムＤＮＡ上に存在する個体間の違いであり、ヒト等における種々の疾患や種々の表現形質の違いを生じうる。従って、かかるＳＮＰは、遺伝子疾患の解析、個体間の識別等に利用されている。
現在、一塩基多型（ＳＮＰ）の検出に使われているリアルタイムＰＣＲ法としては、例えば、Ｔａｑ Ｍａｎ（登録商標）法、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ法が挙げられる。Ｔａｑ Ｍａｎ（登録商標）法は、非常に感度の良い方法であるが、検出に用いるＴａｑ Ｍａｎ（登録商標）プローブの設計、合成が煩雑であり、検出コストが高い。また、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ法は、二本鎖ＤＮＡとの結合により蛍光強度が増大することを利用した簡便な方法であるが、非特異的な増幅による二本鎖の形成も「ポジティブ」として検出されるため、検出エラーが大きく、アレル特異性を上げるために用いるプライマーを最適化することが課題である。これらの方法におけるプライマーは、設計ソフトを用いてある程度適正なプライマーを設計した後、アレル特異性が最も高くなるようにプライマーの配列やＰＣＲの条件を最適化して用いているが、個々のゲノムによる最適化が必要になるため、最適条件を見つけることが大変な作業となっている。
これに対して、本発明者らは、ナフチリジン環を含む化合物が、バルジ構造に特異的に結合することにより、結合前の吸収極大の波長からシフトし、かつ、該バルジ塩基に隣接するヌクレオチドと対をなすヌクレオチド残基の種類により蛍光強度が変動するという蛍光特性を利用した、ヘアピンプライマーＰＣＲ（ＨＰ−ＰＣＲ）法を報告している（特許文献１参照）。具体的には、先ず、ナフチリジン環を含む化合物が特異的に結合するバルジ領域を導入したヘアピン構造を５’末端に有するプライマーを調製し、次に、ＰＣＲにより、対象核酸とハイブリダイズさせてバルジ構造を含むデュプレックスを形成させる。そこに、該ナフチリジン環含有化合物を添加してバルジ構造に結合させることで、吸収極大の波長がシフトし、蛍光強度の変動として観測される。
特許文献１の方法では、ヘアピン構造を有するプライマーが安価で容易に入手可能であり、かつ、該プライマーとサンプルとナフチリジン環含有化合物を混合するだけという簡便な操作により行なうことができる。しかしながら、ナフチリジン環含有化合物とバルジ構造との結合には、下記に示す
ナフチリジン環含有化合物 ＋ ＤＮＡ ⇔ ナフチリジン環含有化合物・ＤＮＡ
という平衡が存在しているため、ＰＣＲ時には過剰のナフチリジン環含有化合物を要することになる。そのため、バルジ構造に非結合のナフチリジン環含有化合物の蛍光がバックグランドとして検出されるため、検出感度を下げるという問題があった。
ナフチリジン環含有化合物 ＋ ＤＮＡ ⇔ ナフチリジン環含有化合物・ＤＮＡ
という平衡が存在しているため、ＰＣＲ時には過剰のナフチリジン環含有化合物を要することになる。そのため、バルジ構造に非結合のナフチリジン環含有化合物の蛍光がバックグランドとして検出されるため、検出感度を下げるという問題があった。
本発明の課題は、標的となる核酸中の一塩基多型及び遺伝子を、簡便に、かつ、高感度に検出する方法及びそのキットを提供することにある。
本発明者らが検討を重ねた結果、ＰＣＲに用いるヘアピン構造を有するプライマーの特定位置にナフチリジン環含有化合物を予め結合させることによって、ＰＣＲの進行により該ヘアピン構造が開いてバルジ構造が消失すると、ナフチリジン環含有化合物が遊離して蛍光を回復するので、蛍光ラベルしたプライマーのみの蛍光強度変化をモニタリングすることが可能となり、検出エラーを大きく減少することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔２〕に関する。
〔１〕 （Ａ）ｉ）少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、又は
ｉｉ）少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ
と、
（Ｂ）前記評価対象核酸と、
を混合し、
前記核酸プローブと評価対象核酸とがハイブリダイズした際に前記シトシンバルジ又はチミンバルジが消失することによる２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物に基づくシグナルを検出し、
前記一塩基多型を評価することを特徴とする、核酸中の一塩基多型の検出方法。
〔２〕 ｉ’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、及び
ｉｉ’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、
及び、
ｉ’’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、
ｉｉ’’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、
を含有してなる、前記〔１〕記載の核酸中の一塩基多型の検出方法に用いるためのキット。
〔１〕 （Ａ）ｉ）少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、又は
ｉｉ）少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ
と、
（Ｂ）前記評価対象核酸と、
を混合し、
前記核酸プローブと評価対象核酸とがハイブリダイズした際に前記シトシンバルジ又はチミンバルジが消失することによる２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物に基づくシグナルを検出し、
前記一塩基多型を評価することを特徴とする、核酸中の一塩基多型の検出方法。
〔２〕 ｉ’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、及び
ｉｉ’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、
及び、
ｉ’’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、
ｉｉ’’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、
を含有してなる、前記〔１〕記載の核酸中の一塩基多型の検出方法に用いるためのキット。
本発明の検出方法によれば、核酸中の一塩基多型を低コストで、簡便に、かつ、高感度に検出することができるという優れた効果が奏される。また、本発明の一塩基多型の検出方法は蛍光増大型のＰＣＲ検出法であり、プライマーのデザインが簡単で、競合するプライマーをＰＣＲチューブ内に存在させる事によってアレル特異性を大きく向上させることができることから、他の遺伝子の増幅をモニターしてしまう点、アレル特異性を高める為に条件を検討しなければならない点、更にプライマーのデザインが難しい点など従来技術の問題点を解決することが可能となる。
本発明の一塩基多型の検出方法は、ヘアピン構造を５’末端に有するアレル特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法であって、該プライマーがヘアピン構造の特定位置にナフチリジン環含有化合物を予め結合させたプローブである点に特徴を有する。
ナフチリジン環含有化合物をバルジ近傍に化学的に固定化すると、ナフチリジン環含有化合物の絶対量はプライマー量と等価となるため、遊離型の場合に比べて、溶液中に過剰に存在するナフチリジン環含有化合物の蛍光強度によるバックグラウンドの増加といった問題がなくなる。
また、本発明では、バルジ前後の塩基対が特定の塩基対の場合に、ナフチリジン環含有化合物がバルジに結合した際の蛍光を消光するという現象を利用する。即ち、バルジ前後を特定の塩基対とすることにより、ＰＣＲ前ではナフチリジン環含有化合物による蛍光強度を小さい状態にしておく。次いで、ＰＣＲ反応が進行してポリメラーゼによりヘアピン構造が開かれると、バルジに結合していたナフチリジン環含有化合物がＤＮＡ二本鎖外に移動して、元来有する蛍光が観測されるようになる。
本発明の一塩基多型の検出方法では、（Ａ）特定の核酸プローブと（Ｂ）評価対象核酸とを混合し、前記核酸プローブと評価対象核酸とがハイブリダイズした際に生じるシグナルを検出する。
本発明で用いられる核酸プローブとしては、以下の態様が挙げられる。
ｉ）少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が導入されてなる核酸プローブ、
ｉｉ）少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ
ｉ）少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が導入されてなる核酸プローブ、
ｉｉ）少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ
なお、本明細書において、「塩基」とは、特に断りのない限り、デオキシリボヌクレオチドをいう。従って、本明細書において、「シトシン」（Ｃ）、「チミン」（Ｔ）、「アデニン」（Ａ）、及び「グアニン」（Ｇ）は、特に断りのない限り、それぞれのデオキシリボヌクレオチド、即ち、それぞれ、「２’−デオキシシチジン」「２’−デオキシチミジン」、「２’−デオキシアデノシン」及び「２’−デオキシグアノシン」を意味する。
また、本明細書において、「少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸」とは、少なくとも一つ、好ましくは１〜５個の一塩基多型が存在することが確認されている核酸であって、特に断りのない限り、一塩基多型の位置に存在するヌクレオチドは、野生型ヌクレオチド及び変異型ヌクレオチドのいずれをも含む。さらに、本明細書において、「一塩基多型存在位置の野生型ヌクレオチド」とは、一塩基多型が確認されている部位のヌクレオチドであって、いわゆる正常型の塩基配列中のかかる部位のヌクレオチドをいい、「一塩基多型存在位置の変異型ヌクレオチド」とは、一塩基多型が確認されている部位のヌクレオチドであって、いわゆる変異型の塩基配列中のかかる部位のヌクレオチドをいう。
さらに、本明細書において、「シトシンバルジ又はチミンバルジ」とは、二本鎖を形成しているＤＮＡにおいて、一方に対して、他方がシトシン又はチミンが余剰となり塩基対を形成しない領域のことをいう。よって、かかるシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列（ヘアピン配列ともいう）とは、該ヘアピン配列の５’末端と３’末端の末端塩基同士から順に、自己配列内におけるハイブリダイズによって二本鎖を形成してヘアピン構造を形成しながら、かつ、該二本鎖の途中においてシトシンバルジ又はチミンバルジを有する二本鎖（デュプレックス）が形成され得るような配列を有するものであればよい。具体的には、例えば、一本鎖ＤＮＡの両末端同士がハイブリダイズしてシトシンバルジ又はチミンバルジを有する二本鎖を形成し、シトシンバルジ又はチミンバルジの領域よりも中央に存在するＤＮＡは一本鎖のまま存在しているものが挙げられる。
本発明で用いられる核酸プローブは、その骨格に、前記評価対象核酸そのもの又はそのアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有する部分を含む。より詳しくは、評価対象核酸の種類に応じて、野生型（正常型）の評価対象核酸及びそのアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有する部分、変異型の評価対象核酸及びそのアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有する部分を含むものが含まれる。さらに、評価対象核酸の一塩基多型の種類に応じて、一塩基多型の存在位置に野生型ヌクレオチドを含むもの、一塩基多型の存在位置に変異型ヌクレオチドを含むものが含まれる。なお、「アンチセンス鎖」とは、特定の塩基配列（以下、センス鎖という）に対し相補的な塩基配列を有し、かつセンス鎖にハイブリダイズし得るヌクレオチドをいう。
次いで、本発明における核酸プローブは、前記評価対象核酸又はそのアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有するものに、さらにその５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されている（図１参照）。本明細書において、前記付加された配列を「タグ構造」と記載することもある。なお、核酸プローブにおける塩基配列は、特に限定なく、チオホスファイト法、フォスフォアミダイト法等の公知の方法に従って、所望の配列を有するものに調製することができ、例えば、評価対象核酸そのもの又はそのアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列に、自己配列内において該配列の５’末端と３’末端の末端塩基同士から順にハイブリダイズによって二本鎖を形成してヘアピン構造を形成しながら、かつ、該二本鎖の途中においてシトシンバルジ又はチミンバルジを有する二本鎖（デュプレックス）を形成し得るタグ構造の塩基配列、を付加した塩基配列を設計して調製することができる。タグ構造の塩基配列としては、前記ヘアピン構造を形成するのであれば特に限定されず、例えば、
5' - ATCATGCTTTTGCCATGAT - 3'（配列番号１）
に示すような配列が挙げられる。かかる配列において、例えば、５’末端から５番目のＴに後述の２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化され、３’末端から６番目のＣがバルジ構造を形成する。
5' - ATCATGCTTTTGCCATGAT - 3'（配列番号１）
に示すような配列が挙げられる。かかる配列において、例えば、５’末端から５番目のＴに後述の２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化され、３’末端から６番目のＣがバルジ構造を形成する。
本発明におけるタグ構造は、シトシンバルジ又はチミンバルジを含むヘアピン構造を呈するが、該シトシンバルジ又はチミンバルジには、２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されている。なお、本明細書において、シトシンバルジ又はチミンバルジへの化合物の固定化とは、該バルジにおいて塩基対を形成しないシトシン又はチミンに結合して固定化される態様、該バルジに隣接する塩基と結合してバルジ領域に固定化される態様、及び、両方に結合して固定化される態様のいずれをも含む。
本発明における２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物としては、式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、第１級アミン残基、第２級アミン残基、又は第３級アミン残基を示す）
で表される化合物が挙げられる。
で表される化合物が挙げられる。
前記第１級アミン残基としては、−ＮＨ２基が挙げられる。また、前記第２級アミン残基としては、例えば、−ＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２基、−ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ２基、−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ２基、−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ３）基等が挙げられる。さらに、前記第３級アミン残基としては、例えば、−Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ２）２ＮＨ２基等が挙げられる。本発明においては、シトシンバルジ又はチミンバルジとの水素結合形成の観点から、第２級アミン残基が好ましく、Ｒ１及びＲ２のいずれもが第２級アミン残基であることがより好ましい。
前記２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物としては、具体的には、例えば、下記式（ＩＩ）：
で表されるＮ，Ｎ’−ビス−３−アミノプロピル−２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジン（以下、ＤＡＮＰと記載することもある）が挙げられる。
Ｎ，Ｎ’−ビス−３−アミノプロピル−２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジン（ＤＡＮＰ）は、ナフチリジン環のＮ１、Ｎ８位の窒素側にドナー、アクセプター、アクセプター、ドナーの順で水素結合があるので、二本鎖ＤＮＡ、好ましくはシトシンバルジ又はチミンバルジと１：１の量論比で安定な複合体を形成する。
また、ＤＡＮＰは、例えば、１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の紫外可視吸収スペクトルの測定において〔図２（ａ）参照〕、単独では３６４ｎｍに吸収極大を示すが、例えば、シトシンバルジＤＮＡと結合すると吸光度が減少し、かつ、吸収極大が３０ｎｍ長波長側の３９４ｎｍに、チミンバルジＤＮＡと結合すると同じく吸収極大が３９０ｎｍにシフトするという特性を有する。さらに、ＤＡＮＰ単独の吸収極大に相当する波長３６４ｎｍで励起した蛍光スペクトルの測定では〔図２（ｂ）参照〕、単独では３９４ｎｍに最大発光を示すが、例えば、シトシンバルジＤＮＡと結合すると４２４ｎｍ付近に幅広い発光が観察され、チミンバルジＤＮＡと結合するとシトシンバルジＤＮＡ結合時と同様の波長に幅広い発光が弱い強度ながらも確認される。このようにＤＡＮＰ−シトシンバルジ結合、ＤＡＮＰ−チミンバルジ結合が示す特徴的な発光により、ＤＡＮＰ単独、ＤＡＮＰ−シトシンバルジ結合、ＤＡＮＰ−チミンバルジ結合のそれぞれが識別できる。なお、ここでのシトシンバルジ又はチミンバルジ結合時の光特性は、シトシンバルジＤＮＡ又はチミンバルジＤＮＡの隣接に位置する塩基の種類に限定されるものではないが、吸収極大の波長は２〜３ｎｍ程度変動する場合もある。
ＤＡＮＰは、特開２００４−２６２８２７号公報に記載の方法により合成したものを用いてもよい。
なお、本発明においては、前記ＤＡＮＰと同等の性質、即ち、例えば、蛍光を生じ、バルジへの結合能を有し、かつバルジとの結合により吸収極大波長がシフトするとともに、アレルにより蛍光強度が変化する性質を示すものであれば、前記ＤＡＮＰの誘導体化合物を用いることができる。かかる誘導体化合物の例としては、下記式（ＩＩＩ）：
〔式中、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子又はアミノ基であり、ｌ、ｍ、及びｎは、それぞれ独立して１〜６の自然数を示す〕
で表される化合物、下記式（ＩＶ）：
で表される化合物、下記式（ＩＶ）：
〔式中、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水素原子又はアミノ基であり、ｏ及びｐは、それぞれ独立して１〜６の自然数を示す〕
で表される化合物等が挙げられる。
で表される化合物等が挙げられる。
式（ＩＩＩ）に示される化合物において、前記Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子又はアミノ基であり、蛍光を生じ、バルジへの結合能を有し、かつバルジとの結合により吸収極大波長がシフトするとともに、アレルにより蛍光強度が変化する性質を十分に発揮させる観点から、好ましくは、一方がアミノ基であることが望ましい。また、前記ｌ、ｍ、及びｎは、それぞれ独立して１〜６の自然数である。蛍光を生じ、バルジへの結合能を有し、かつバルジとの結合により吸収極大波長がシフトするとともに、アレルにより蛍光強度が変化する性質を十分に発揮させる観点から、前記ｌが、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、好ましくは６以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは４以下であり、具体的には、好ましくは２〜６、より好ましくは３〜５、さらに好ましくは３〜４である。また、前記と同様の観点から、前記ｍが、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、好ましくは６以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは４以下であり、具体的には、好ましくは２〜６、より好ましくは３〜５、さらに好ましくは３〜４である。さらに、前記と同様の観点から、前記ｎが、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、好ましくは６以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは４以下であり、具体的には、好ましくは２〜６、より好ましくは３〜５、さらに好ましくは３〜４である。
式（ＩＶ）に示される化合物において、前記Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水素原子又はアミノ基であり、蛍光を生じ、バルジへの結合能を有し、かつバルジとの結合により吸収極大波長がシフトするとともに、アレルにより蛍光強度が変化する性質を十分に発揮させる観点から、好ましくは、少なくとも一方がアミノ基であることが望ましい。また、前記ｏ及びｐは、それぞれ独立して１〜６の自然数である。蛍光を生じ、バルジへの結合能を有し、かつバルジとの結合により吸収極大波長がシフトするとともに、アレルにより蛍光強度が変化する性質を十分に発揮させる観点から、前記ｏが、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、好ましくは６以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは４以下であり、具体的には、好ましくは２〜６、より好ましくは３〜５、さらに好ましくは３〜４である。また、前記同様の観点から、前記ｐが、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、好ましくは６以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは４以下であり、具体的には、好ましくは２〜６、より好ましくは３〜５、さらに好ましくは３〜４である。
また、本発明においては、前記２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物として、下記式（Ｖ）：
で表されるＮ，Ｎ’−ビス−３−アミノブチル−２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンも好適に用いられる。
式（Ｖ）で表される化合物も、ＤＡＮＰと同様に、二本鎖ＤＮＡ、好ましくはシトシンバルジ又はチミンバルジと１：１の量論比で安定な複合体を形成する。
式（Ｖ）で表される化合物の紫外可視吸収スペクトルは、ＤＡＮＰと同様のスペクトルであり、バルジとの結合による吸収極大波長の変動もＤＡＮＰと同程度である。
なお、式（Ｖ）で表される化合物は、公知の方法に従って合成することができる。
前記２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物をシトシンバルジ又はチミンバルジへ固定化する方法としては、特に限定はなく、ＤＮＡ上に化合物を修飾する公知の方法、例えば、活性カルボン酸とアミンの反応を用いたポストモディフィケーション方法が挙げられる。具体的には、例えば、図３に示すように、標的のＤＮＡ及び２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物をそれぞれ合成後、該ＤＮＡを２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物の溶液（例えば、アセトニトリル溶液）中に、室温中、好ましくは１５〜３０℃で、１０〜２０分間浸漬し、必要により精製することにより、２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物をシトシンバルジ又はチミンバルジに水素結合させて固定化することができる。
また、前記タグ構造において、シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置には、グアニン残基が導入されている。即ち、２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されたシトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置には、グアニン−シトシン（Ｇ−Ｃ）塩基対が形成されている。一般に、芳香族分子が二本鎖ＤＮＡに挿入されると、該分子の電子状態は挿入箇所の隣接塩基のスタッキング相互作用から影響を受けることが知られている。よって、これにより、前記２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物がシトシンバルジ又はチミンバルジに結合した際に生じる蛍光を消光することが可能となる。本発明においては、グアニン残基による消光効果を確実なものとする観点から、シトシンバルジ又はチミンバルジのグアニン−シトシン（Ｇ−Ｃ）塩基対が形成される側とは反対側の隣接塩基と該バルジのシトシン又はチミンとによって、２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されることが好ましい。
例えば、シトシンバルジＤＮＡにＤＡＮＰを結合させた一本鎖ＤＮＡの場合（ｓｓＤＮＡ）、前記シトシンバルジＤＮＡ−ＤＡＮＰを有する塩基配列とバルジ領域以外は相補的で、かつ、バルジ隣接位置にグアニン残基が導入された塩基配列によるデュプレックスの場合（Ｃ−ｂｕｌｇｅ）、前記シトシンバルジＤＮＡ−ＤＡＮＰを有する塩基配列と完全相補な塩基配列によるデュプレックスの場合（ｆｕｌｌ−ｍａｔｃｈ）について、１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の紫外可視吸収スペクトルの測定において〔図４（ａ）参照〕、それぞれの吸収極大が、ＤＡＮＰ単独で３６４ｎｍ、ｓｓＤＮＡとｆｕｌｌ−ｍａｔｃｈがいずれも３８０ｎｍであるのに対し、Ｃ−ｂｕｌｇｅは４００ｎｍであることが分かる。また、ＤＡＮＰ単独の吸収極大に相当する波長３６４ｎｍで励起した蛍光スペクトルの測定では〔図４（ｂ）参照〕、ＤＡＮＰ単独で極大発光が３９３ｎｍ、強度が５８であるの対し、ｓｓＤＮＡ、ｆｕｌｌ−ｍａｔｃｈ、Ｃ−ｂｕｌｇｅはいずれも極大発光が４１０ｎｍであるが、各強度は１６、２０、６とＣ−ｂｕｌｇｅが最も弱く、ＤＡＮＰ単独の１０分の１程度であることが分かる。このように、２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物をシトシンバルジ又はチミンバルジバルジに固定化した際に、その隣接位置にグアニン残基を導入することにより、２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物の発光が消光される。
前記核酸プローブの長さは、バルジＤＮＡについて、十分な安定性及び高い配列特異性を十分に発揮させる観点から、好ましくは１５ヌクレオチド残基以上、より好ましくは２０ヌクレオチド残基以上であり、好ましくは４５ヌクレオチド残基以下、より好ましくは４０ヌクレオチド残基以下である。
本発明の一塩基多型の検出方法では、前記した光特性を有する（Ａ）核酸プローブと（Ｂ）評価対象核酸とを混合してハイブリダイズさせて、ＰＣＲの進行に伴うシトシンバルジ又はチミンバルジが消失することによる２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物に基づくシグナルを検出する。即ち、本発明の検出方法では、図５に示すように、調製された（Ａ）核酸プローブと（Ｂ）評価対象核酸を混合してハイブリダイズが進行することにより〔図５（１）参照〕、（Ａ）核酸プローブのヘアピン構造が開かれてシトシンバルジ又はチミンバルジのバルジ構造が消失し〔図５（２）参照〕、バルジ構造に結合していた２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が二本鎖外に存在することになるので〔図５（３）参照〕、該２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物の蛍光強度を測定する〔図５（４）参照〕。
（Ａ）核酸プローブと（Ｂ）評価対象核酸との混合は、そのモル比〔（Ａ）／（Ｂ）〕が１／１程度となるよう行なわれれば、二本鎖形成を十分に行ない、十分な蛍光強度を得られることから好ましいが、評価対象核酸の種類や量によって、一概に決定されない。
混合の際のｐＨ条件は、２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物のシグナル、バルジへの該化合物の結合に基づく吸収極大波長のシフト、蛍光強度等の検出を効率よく行なう観点、ならびに、核酸の安定性の観点から、好ましくは５以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは６．５以上であり、２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物のバルジ構造からの遊離を十分に行なう観点及び十分な蛍光強度を発揮させる観点から、好ましくは９以下、より好ましくは８以下、さらに好ましくは７．５以下である。
前記混合の際には、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等が用いられうる。
本明細書において、ハイブリダイズとは、ある配列を有する核酸分子と、その核酸分子の少なくとも一部分に対し相補的な核酸分子が互いに相補的な塩基配列に基づき水素結合を介して会合することを意味する。本発明におけるハイブリダイズは、例えば、１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは１０〜１００ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ５〜８、好ましくはｐＨ６〜７の緩衝溶液、好ましくはリン酸緩衝液中で行うことが望ましい。なお、ハイブリダイズが可能となる条件は、公知技術に従って、適宜最適化できる。
シトシンバルジ又はチミンバルジが消失することによる２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物に基づくシグナルとしては、蛍光シグナルが好ましい。蛍光シグナルは、遊離の２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物と、シトシンバルジ又はチミンバルジに結合し更に隣接塩基のグアニンによって消光された時の２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物とに由来する蛍光強度の差を十分に大きくする観点から、シトシンバルジ及びチミンバルジのいずれもの場合にも、好ましくは４００〜４８０ｎｍ、より好ましくは４５０ｎｍ付近における蛍光強度である。なお、励起波長は２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物の種類に基づいて、適宜、調整できる。
かくして、本発明により、２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物を用いることにより、蛍光物質等の標識物質を別途添加することなく、一塩基多型を検出することができるという優れた効果が奏される。そのため、本発明の検出方法では、伸長反応、増幅反応、酵素反応（例えば、前記伸長反応、増幅反応、ミスマッチ核酸の分解反応等）条件の検討、電気泳動条件の検討、標識物質による標識等の複雑な工程を行なうことなく、簡便に、一塩基多型を検出することができる。さらに、前記２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物は、ＰＣＲ反応前は隣接位にグアニン残基を有するシトシンバルジ又はチミンバルジに結合して消光されるため、バックグラウンドシグナルレベルを低減させ、高感度での一塩基多型の検出が可能になる。
本発明の検出方法の別の態様としては、
１）一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む野生型評価対象核酸と、該野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、
２）一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む変異型評価対象核酸と、該変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、
３）前記野生型評価対象核酸と、前記変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、及び
４）前記変異型評価対象核酸と、前記野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、
のそれぞれをハイブリダイズさせた際の２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物に基づくシグナルに基づき、評価対象核酸における一塩基多型を同定する。
１）一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む野生型評価対象核酸と、該野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、
２）一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む変異型評価対象核酸と、該変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、
３）前記野生型評価対象核酸と、前記変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、及び
４）前記変異型評価対象核酸と、前記野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、
のそれぞれをハイブリダイズさせた際の２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物に基づくシグナルに基づき、評価対象核酸における一塩基多型を同定する。
具体的には、例えば、評価対象核酸の一塩基多型の存在位置において、本願発明における核酸プローブとのハイブリダイズが行なわれた場合のみ、２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物に基づく強い強度の蛍光が発光され、それ以外は２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物がプローブ内のシトシンバルジ又はチミンバルジと結合して該蛍光が消光されているため、該プローブにおける一塩基多型の存在部位の塩基対の種類から、より高感度に一塩基多型の評価を行なうことができる。
また、本発明では、本発明の核酸中の一塩基多型の検出方法に用いるためのキットを提供する。本発明のキットは、前記核酸プローブを含有することを特徴とし、本発明の検出方法を効率よく簡便に低コストで行なうことができ、核酸中の一塩基多型を、低コストで、簡便な操作により、効率よく、高感度で検出することができるという優れた効果を発揮する。
具体的には、
ｉ’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、及び
ｉｉ’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、
及び
ｉ’’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、及び
ｉｉ’’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、
を含有する。
ｉ’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、及び
ｉｉ’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、
及び
ｉ’’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、及び
ｉｉ’’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、
を含有する。
本発明のキットには、前記核酸プローブを安定的に保持するための試薬、例えば、緩衝液等を適宜含有していてもよい。
また、本発明のキットの提供形態は、適切な核酸プローブ、必要な試薬等、本発明の検出方法を行なうに適した試薬全てを、本発明の検出方法を行なうに適した容量及び／又は形態で含有した１つの容器として提供される形態であってもよく、核酸プローブ、試薬等をそれぞれ別の容器により提供される形態であってもよい。また、かかるキットには、キットに含まれる成分を用いて、本発明の検出方法を行なうための手順等を記載した説明書が含有されていてもよい。
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。
試験例１
シトシンバルジ、チミンバルジ、グアニンバルジ、又はアデニンバルジを有する塩基配列にＤＡＮＰを結合させた塩基配列の蛍光強度を測定した。
シトシンバルジ、チミンバルジ、グアニンバルジ、又はアデニンバルジを有する塩基配列にＤＡＮＰを結合させた塩基配列の蛍光強度を測定した。
配列番号２で示される１０ｍｅｒの鋳型核酸（ｘｃＤ１）の合成をＮＨＳ−Ｃａｒｂｏｘｙ−ｄＴ アミダイト（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて、ＤＮＡ自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｙｃｔｅｍｓ社製）で所望の配列のものを合成した。なお、アデニンアミンダイトとグアニンアミンダイトは、脱保護が容易であるため、パック（ｐａｃ）を保護されたものを使用した。ＤＮＡ自動合成機上では切り出し・脱保護を行わず、ＣＰＧ樹脂にＤＮＡが結合している段階でＣＰＧビーズを含むカラムを取り出した。このカラムの両端にシリンジを１本ずつ繋ぎ、前記ＤＡＮＰ溶液１ｍＬをシリンジ２本中で反復移動し、そのまま２０分程度反応させた。その後、真空ポンプで乾燥し、エッペンドルフ（登録商標）チューブにビーズを移し、これに１ｍＬの２８％アンモニア水によって処理し、３時間室温で放置することにより、切り出し・脱保護を行った。その後は、ＣＰＧビーズを濾過で取り除き、スピードバックによって濃縮し、ＨＰＬＣ精製を行って、ＤＡＮＰが５’末端から５塩基目に位置するＴの５位に結合したプローブｘｃＤ１（配列番号２）〕を調製した。なお、得られたプローブの確認は、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＭＳを用いて行なった。次に、配列番号３〜６で示されるシトシンバルジ、チミンバルジ、グアニンバルジ、又はアデニンバルジを形成し得る塩基配列を同様に合成した。
(template) xcD1: 5' -TCCATGCAAC- 3'（配列番号２）
(C bulge) cD1-1: 5' -GTTGCCATGGA- 3'（配列番号３）
(A bulge) cD1-3: 5' -GTTGACATGGA- 3'（配列番号４）
(G bulge) cD1-4: 5' -GTTGGCATGGA- 3'（配列番号５）
(T bulge) cD1-5: 5' -GTTGTCATGGA- 3'（配列番号６）
(template) xcD1: 5' -TCCATGCAAC- 3'（配列番号２）
(C bulge) cD1-1: 5' -GTTGCCATGGA- 3'（配列番号３）
(A bulge) cD1-3: 5' -GTTGACATGGA- 3'（配列番号４）
(G bulge) cD1-4: 5' -GTTGGCATGGA- 3'（配列番号５）
(T bulge) cD1-5: 5' -GTTGTCATGGA- 3'（配列番号６）
得られたバルジを形成し得る核酸（配列番号３〜６）と鋳型核酸（配列番号２）とをエッペンチューブ内でハイブリダイズさせた後、１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に４．５μＭとなる溶液を調製し、波長３８０ｎｍで励起した蛍光スペクトルを測定した。結果を図６に示す。
図６より、シトシンバルジの蛍光強度が一番弱く、次はチミンバルジ、グアニンバルジであり、アデニンバルジが最も強いことが分かる。
核酸プローブの調製例１
特開２００４−２６２８２７号公報に記載の方法により、アミノ基をＢｏｃ保護したＮ，Ｎ’−ビス−３−アミノプロピル−２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンを合成した後、４Ｎ ＨＣｌ溶液を用い、脱保護してＤＡＮＰ塩酸塩を得た。得られたＤＡＮＰ塩酸塩は、ジメチルスルホキシドに溶解後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを用いて中和し、ＤＡＮＰの溶液を調製した（濃度０．１Ｍ）。
特開２００４−２６２８２７号公報に記載の方法により、アミノ基をＢｏｃ保護したＮ，Ｎ’−ビス−３−アミノプロピル−２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンを合成した後、４Ｎ ＨＣｌ溶液を用い、脱保護してＤＡＮＰ塩酸塩を得た。得られたＤＡＮＰ塩酸塩は、ジメチルスルホキシドに溶解後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを用いて中和し、ＤＡＮＰの溶液を調製した（濃度０．１Ｍ）。
次に、ｐＵＣ１８（４６４位にグアニンのＳＮＰを有する）をテンプレートにしてＰＣＲを行うために、試験例１と同様にして、ＤＮＡ自動合成機を使ってＤＡＮＰがプローブの５’末端から５塩基目にあるＴの５位に結合したシトシンバルジ構造を形成し得るプローブ〔ｐｒｉｍｅｒ １（配列番号７）〕を調製した。なお、プローブの濃度の確認は酵素分解を用いて行った。
(primer 1): 5' -ATCATGCTTTTGCCATGATCAGGAAACAGCTATGAC- 3'（配列番号７）
(primer 1): 5' -ATCATGCTTTTGCCATGATCAGGAAACAGCTATGAC- 3'（配列番号７）
ＰＣＲの試験例１
得られた核酸プローブ（５’末端にシトシンバルジ構造を含んだへアピンタグを持つプライマー）（ｐｒｉｍｅｒ １）を用いて、ＰＣＲを行った。具体的には、ｐＵＣ１８をテンプレートとして、Ｑｉａｇｅｎ社のＴａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、へアピンタグを持つセンスプライマー（ｐｒｉｍｅｒ １）とへアピンタグを持たないアンチセンスプライマー〔Ｍ１３Ｍ３（配列番号８）〕をそれぞれ最終濃度０．５μＭ、ｐＵＣ１８を加えＰＣＲ溶液を調製した。このＰＣＲ溶液を９５℃ １分加熱後、１サイクル９５℃ １０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒の反応を４０サイクル行った。途中５回毎にサンプルを採取し、蛍光強度（励起波長３５５ｎｍ、発光波長４５０ｎｍ）を測定した。その結果、ＰＣＲの進行に伴い、蛍光強度の増大が観測された（図７）。
(primer 1): 5' -ATCATGCTTTTGCCATGATCAGGAAACAGCTATGAC- 3'（配列番号７）
(M13M3): 5' -GTTGTAAAACGACGGCCAGT- 3'（配列番号８）
得られた核酸プローブ（５’末端にシトシンバルジ構造を含んだへアピンタグを持つプライマー）（ｐｒｉｍｅｒ １）を用いて、ＰＣＲを行った。具体的には、ｐＵＣ１８をテンプレートとして、Ｑｉａｇｅｎ社のＴａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、へアピンタグを持つセンスプライマー（ｐｒｉｍｅｒ １）とへアピンタグを持たないアンチセンスプライマー〔Ｍ１３Ｍ３（配列番号８）〕をそれぞれ最終濃度０．５μＭ、ｐＵＣ１８を加えＰＣＲ溶液を調製した。このＰＣＲ溶液を９５℃ １分加熱後、１サイクル９５℃ １０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒の反応を４０サイクル行った。途中５回毎にサンプルを採取し、蛍光強度（励起波長３５５ｎｍ、発光波長４５０ｎｍ）を測定した。その結果、ＰＣＲの進行に伴い、蛍光強度の増大が観測された（図７）。
(primer 1): 5' -ATCATGCTTTTGCCATGATCAGGAAACAGCTATGAC- 3'（配列番号７）
(M13M3): 5' -GTTGTAAAACGACGGCCAGT- 3'（配列番号８）
ＰＣＲの試験例２
ＰＣＲの試験例１とテンプレートの量だけ変えてＰＣＲを行い、５回毎の蛍光強度（励起波長３５５ｎｍ、発光波長４５０ｎｍ）をＰＣＲ回数に対してプロットしたグラフが図８である。この図８の蛍光強度３８０の時のテンプレート量を縦軸にとり、横軸にＰＣＲサイクルをプロットしたものが図９となる。
ＰＣＲの試験例１とテンプレートの量だけ変えてＰＣＲを行い、５回毎の蛍光強度（励起波長３５５ｎｍ、発光波長４５０ｎｍ）をＰＣＲ回数に対してプロットしたグラフが図８である。この図８の蛍光強度３８０の時のテンプレート量を縦軸にとり、横軸にＰＣＲサイクルをプロットしたものが図９となる。
図８より、テンプレート濃度のみが違う溶液を調製しＰＣＲを行うと、テンプレートの濃度を反映した蛍光強度変化のプロファイルが観測されたことが分かる。また、図９より、図８の蛍光強度３８０の時のテンプレート量とＰＣＲサイクルをプロットした結果、ほぼ直線のグラフが得られたことから、これは少なくとも使ったテンプレートの濃度範囲内では定量ができる事が示唆される。
ＰＣＲの試験例３
ＰＣＲの試験例１において、テンプレートのＳＮＰサイトがグアニンからチミンに変異したテンプレートを用いて試験例１と同様にしてＰＣＲを行った。５回毎の蛍光強度（励起波長３５５ｎｍ、発光波長４５０ｎｍ）をＰＣＲ回数に対してプロットしたグラフが図１０である。図１０より、明らかにテンプレートがプライマーの３’末端とマッチの時と比べて蛍光強度の増大が小さく、このプライマーでＳＮＰ検出が可能である事が示唆される。
ＰＣＲの試験例１において、テンプレートのＳＮＰサイトがグアニンからチミンに変異したテンプレートを用いて試験例１と同様にしてＰＣＲを行った。５回毎の蛍光強度（励起波長３５５ｎｍ、発光波長４５０ｎｍ）をＰＣＲ回数に対してプロットしたグラフが図１０である。図１０より、明らかにテンプレートがプライマーの３’末端とマッチの時と比べて蛍光強度の増大が小さく、このプライマーでＳＮＰ検出が可能である事が示唆される。
ＰＣＲの試験例４
Ｎ，Ｎ’−ビス−３−アミノブチル−２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジン（式（Ｖ）で表される化合物）をＤＡＮＰの合成方法を参照にして合成したものを用いて、ＤＮＡ自動合成機を使って、核酸プローブの調製例１における配列番号７にて示される塩基配列において、ＤＡＮＰが結合したのと同じ位置に、式（Ｖ）で表される化合物を結合させた核酸プローブを調製した。次いで、ＰＣＲの試験例１と同様にして、ＰＣＲ反応を行って蛍光強度を測定した。なお、ＰＣＲの試験例１におけるＤＡＮＰの４０サイクル後の蛍光強度増加量を１００％とした場合の、相対蛍光強度を算出して示した（図１１）。
Ｎ，Ｎ’−ビス−３−アミノブチル−２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジン（式（Ｖ）で表される化合物）をＤＡＮＰの合成方法を参照にして合成したものを用いて、ＤＮＡ自動合成機を使って、核酸プローブの調製例１における配列番号７にて示される塩基配列において、ＤＡＮＰが結合したのと同じ位置に、式（Ｖ）で表される化合物を結合させた核酸プローブを調製した。次いで、ＰＣＲの試験例１と同様にして、ＰＣＲ反応を行って蛍光強度を測定した。なお、ＰＣＲの試験例１におけるＤＡＮＰの４０サイクル後の蛍光強度増加量を１００％とした場合の、相対蛍光強度を算出して示した（図１１）。
図１１より、式（Ｖ）で表される化合物についても、ＰＣＲの進行に伴って蛍光強度の増大が観測され、ＤＡＮＰよりも蛍光強度の増大程度が大きいものであった（１３０〜１４０％程度）。
本発明の検出方法によれば、核酸中の一塩基多型を、簡便な操作で、低コストで、高感度に検出することができる。また、一塩基多型に限らず他の遺伝子の検出ができる可能性が高い。従って、安価で、簡便で高感度な遺伝子診断、遺伝子解析等が可能になる。
配列表の配列番号１は、合成ＤＮＡ（核酸プローブのタグ構造）の塩基配列である。
配列表の配列番号２は、合成ＤＮＡ（鋳型配列）の塩基配列である。
配列表の配列番号３は、合成ＤＮＡ（シトシンバルジ）の塩基配列である。
配列表の配列番号４は、合成ＤＮＡ（チミンバルジ）の塩基配列である。
配列表の配列番号５は、合成ＤＮＡ（グアニンバルジ）の塩基配列である。
配列表の配列番号６は、合成ＤＮＡ（アデニンバルジ）の塩基配列である。
配列表の配列番号７は、合成ＤＮＡ（ｐｒｉｍｅｒ １）の塩基配列である。
配列表の配列番号８は、合成ＤＮＡ（Ｍ１３Ｍ３）の塩基配列である。
配列表の配列番号２は、合成ＤＮＡ（鋳型配列）の塩基配列である。
配列表の配列番号３は、合成ＤＮＡ（シトシンバルジ）の塩基配列である。
配列表の配列番号４は、合成ＤＮＡ（チミンバルジ）の塩基配列である。
配列表の配列番号５は、合成ＤＮＡ（グアニンバルジ）の塩基配列である。
配列表の配列番号６は、合成ＤＮＡ（アデニンバルジ）の塩基配列である。
配列表の配列番号７は、合成ＤＮＡ（ｐｒｉｍｅｒ １）の塩基配列である。
配列表の配列番号８は、合成ＤＮＡ（Ｍ１３Ｍ３）の塩基配列である。
Claims (5)
- （Ａ）ｉ）少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、又は
ｉｉ）少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ
と、
（Ｂ）前記評価対象核酸と、
を混合し、
前記核酸プローブと評価対象核酸とがハイブリダイズした際に前記シトシンバルジ又はチミンバルジが消失することによる２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物に基づくシグナルを検出し、
前記一塩基多型を評価することを特徴とする、核酸中の一塩基多型の検出方法。 - 下記１）〜４）：
１）一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む野生型評価対象核酸と、該野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、
２）一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む変異型評価対象核酸と、該変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、
３）前記野生型評価対象核酸と、前記変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、及び
４）前記変異型評価対象核酸と、前記野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブ、
の少なくとも一つをハイブリダイズさせ、その際の２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物に基づくシグナルに基づき、評価対象核酸における一塩基多型を同定する、請求項１記載の検出方法。 - シグナルが蛍光である請求項１又は２記載の検出方法。
- ２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が、下記式（ＩＩ）：
- ｉ’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、及び
ｉｉ’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、
及び、
ｉ’’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、
ｉｉ’’）少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該塩基配列の５’末端にシトシンバルジ又はチミンバルジを有するヘアピン構造の塩基配列が付加されたものであって、該シトシンバルジ又はチミンバルジの５’若しくは３’末端側に隣接した位置にグアニン残基が導入され、かつ、該シトシンバルジ又はチミンバルジに２，７−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が固定化されてなる核酸プローブ、
を含有してなる、請求項１〜４いずれかに記載の核酸中の一塩基多型の検出方法に用いるためのキット。
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