JPWO2012118097A1 - ヒアルロン酸産生能を有する細胞シート及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ウサギ(ニュージーランドホワイト種;日本チャールズリバー)をモデルとして、角膜が喪失されている場合を想定し、口腔粘膜上皮細胞をウサギから調製した。頬粘膜から、3〜5mm径の1断片を採取し、ディスパーゼ処理(1000U、4℃、4時間)、続けてトリプシン処理(0.25%、37℃、20分間)することで口腔粘膜細胞を得た。本培養細胞のコロニー形成率は0.3%と通常のウサギ口腔粘膜細胞より高い値を示した。得られた細胞を、別に作製した温度応答性培養器材(インサートタイプ、セルシード製)上に、インサート当たり5×105個、の細胞を播種した。インサートを設置する培養器材上には、常法に従ってマイトマイシンCによって増殖能をなくしたマウス3T3細胞をフィーダー細胞として培養した。口腔粘膜細胞の培養はDMEM/Ham’s 12(3:1、インヴィトロジェン製)に10%ウシ胎仔血清(FCS)ならびにインスリン(5μg/ml、インヴィトロジェン製)、コレラトキシン(1nM、和光純薬製)、ハイドロコルチゾン(0.4μg/ml、和光純薬製)、トリヨードチロニン(2nM/ml、MP BIOMEDICALS製)、トランスフェリン(5μg/ml、インヴィトロジェン製)、EGF(10ng/ml、インヴィトロジェン製)を添加した培地中で培養した。フィーダー細胞は、3T3は、2×104個の細胞を使用した。培養12日後に重層化した口腔粘膜細胞シートを温度応答性培養器材から冷却することで剥離させた。
ウサギ(ニュージーランドホワイト種;日本チャールズリバー)をモデルとして、角膜が喪失されている場合を想定し、角膜上皮細胞をウサギから調製した。眼球組織から、強角膜片を作製し、ディスパーゼ処理(3.0U、37℃、1時間)、続けてトリプシン処理(0.25%、37℃、15分間)することで角膜上皮細胞を得た。本培養細胞のコロニー形成率は3.5%と通常のウサギ角膜上皮細胞より高い値を示した。得られた細胞を、別に作製した温度応答性培養器材(インサートタイプ、セルシード製)上に、インサート当たり1×105個の細胞を播種した。インサートを設置する培養器材上には、常法に従ってマイトマイシンCによって増殖能をなくしたマウス3T3細胞をフィーダー細胞として培養した。角膜上皮細胞の培養はDMEM/Ham’s 12(3:1、インヴィトロジェン製)に10%ウシ胎仔血清(FCS)ならびにインスリン(5μg/ml、インヴィトロジェン製)、コレラトキシン(1nM、和光純薬製)、ハイドロコルチゾン(0.4μg/ml、和光純薬製)、トリヨードチロニン(2nM/ml、MP BIOMEDICALS製)、トランスフェリン(5μg/ml、インヴィトロジェン製)、EGF(10ng/ml、インヴィトロジェン製)を添加した培地中で培養した。フィーダー細胞は、3T3は、2×104個の細胞を使用した。培養12日後に重層化した角膜上皮細胞シートを温度応答性培養器材から冷却することで剥離させた。
実施例1で得られた口腔粘膜細胞シート1枚を、常法によってあらかじめ作製しておいた、ウサギ眼球の角膜輪部から幹細胞を取り除いた角膜幹細胞疲弊症モデルへ移植した。3週間後、患部を肉眼で観察したところ、口腔粘膜細胞シートは眼球に良好に生着しており、角膜の膨潤も認められなかった。その結果、移植部位の保湿性が高まり患部組織の状態が改善し、患部が効率良く治癒することが分かった。
実施例2で得られた角膜上皮細胞シート1枚を、常法によってあらかじめ作製しておいた、ウサギ眼球の角膜輪部から幹細胞を取り除いた角膜幹細胞疲弊症モデルへ移植した。3週間後、患部を肉眼で観察したところ、口腔粘膜細胞シートは眼球に良好に生着しており、角膜の膨潤も認められなかった。その結果、移植部位の保湿性が高まり患部組織の状態が改善し、患部が効率良く治癒することが分かった。
Claims (18)
- ヒアルロン酸を高産生する細胞シート。
- 水に対する上限もしくは下限臨界溶解温度が0〜80℃である温度応答性高分子で基材表面を被覆した細胞培養支持体からキャリアに密着させて剥離された、請求項1記載の細胞シート。
- 細胞が口腔粘膜細胞、角膜輪部上皮細胞、角膜上皮細胞、結膜上皮細胞、軟骨細胞、滑膜細胞、表皮角化細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、乳腺上皮細胞のいずれか1つ、もしくは2種以上の細胞が混合したものである、請求項1、2のいずれか1項記載の細胞シート。
- それぞれの細胞の幹細胞を含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の細胞シート。
- 2以上の細胞シートが積層化されたものである、請求項1〜4のいずれか1項記載の細胞シート。
- 0〜80℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で細胞を培養し、その後、培養液をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで培養した細胞をシート状で剥離させ、ヒアルロン酸産生能を高めることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項記載の細胞シートの製造方法。
- 細胞が口腔粘膜細胞、角膜輪部上皮細胞、角膜上皮細胞、結膜上皮細胞、軟骨細胞、滑膜細胞、表皮角化細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、乳腺上皮細胞のいずれか1つ、もしくは2種以上の細胞が混合したものである、請求項6記載の細胞シートの製造方法。
- 培養中に幹細胞の含有率を高める工程を伴う、請求項6、7のいずれか1項記載の細胞シートの製造方法。
- 剥離した細胞シートをさらに別の細胞シート上に積層化し、或いはその操作を繰り返すことで細胞シートを積層化する、請求項6〜8のいずれか1項記載の細胞シートの製造方法。
- 剥離方法が蛋白質分解酵素による処理を施されることなく細胞培養支持体から剥離されたものである、請求項6〜9のいずれか1項記載の細胞シートの製造方法。
- 剥離方法が培養終了時に培養細胞上にキャリアを密着させ、キャリアと共に剥離する方法である、請求項6〜10のいずれか1項記載の細胞シートの製造方法。
- 細胞が生体組織から採取されたものである、請求項6〜11の細胞シートの製造方法。
- 培養時に播種する細胞数が0.4×106〜2.5×106個/cm2である、請求項6〜12のいずれか1項記載の細胞シートの製造方法。
- 0〜80℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーがポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)である、請求項6〜13のいずれか1項記載の細胞シートの製造方法。
- 得られた細胞シートを生体内の所定部位に移植することを特徴とする、細胞シートの利用方法。
- 移植部位が生体内の皮膚、眼球、関節、血管壁組織、心臓弁組織である、請求項15記載の細胞シートの利用方法。
- 移植部位があらかじめ血管誘導を施した部位である、請求項15、16のいずれか1項記載の細胞シートの利用方法。
- 血管誘導法が、長期間にわたるFGF処理によるものである、請求項17記載の細胞シートの利用方法。
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