JPWO2012111684A1 - 自動細胞ハンドリングロボットにおける泡沫除去デバイス - Google Patents
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Abstract
Description
ところで、培養された細胞を患部に適用する場合、細胞を有用な形態で患部に留置しておくことが難しくこのために目的とする治療効果が得られないことがあった。これに対し、より確実に治療効果を獲得するために、治療に必要十分な量の細胞を患部に与えることが考えられたが、治療に必要十分な量の細胞を培養するためには、数週間など長時間にわたり培養を行う必要があった。また、このような長時間の細胞培養では培養された細胞の特性が培養途中で変わることがあり、このために移植に必要とされる量の細胞を取得できない場合があった。そこで、細胞を立体的に培養して患部の治療に必要十分な量の細胞の立体構造体を取得することが考えられたが(特許文献4)、手作業で細胞の立体構造体を形成する場合、効率に関する課題が多く、また、コンタミなど人為的な作業ミスが発生する可能性があった。
細胞塊をハンドリングするハンドリング手段と、
前記ハンドリング手段から供給される細胞塊を貯溜し、培養液が外部と流通できる微細孔を有する第1容器と、
前記第1容器を収容し、前記第1容器内の培養液よりも過剰量の培養液を前記第1容器の周囲に満たす第2容器と、
前記細胞塊を第1容器に供給した後、前記ハンドリング手段に残留した水滴又は泡沫を除去する除液手段と、を有することを特徴とする。
このハンドリング手段は液体(前記細胞塊を含む培養液)の吸引および吐出が可能なノズルを備えることが好ましい。また、このノズルには使い捨てチップを装着することもできる。
さらに、本発明の培養システムにおいて、前記第1容器は、貯溜された細胞塊を培養して細胞の立体構造体を成形するためのモールドであり、前記モールドの底部に、微細孔を有する部材(フィルタ)を設けたことを特徴とする。
さらに、本発明の培養システムでは、前記第1容器の開口部に、外側に開いた漏斗を有することを特徴とする。
さらに、本発明は、培養液の吸引及び吐出が可能なハンドリング手段に備えられたノズルの先端付近に前記吸引又は吐出の際生じた水滴又は泡沫を除去する水切り部材であって、前記ノズルが上下に通過できる大きさの孔が設けられた前記部材である。
前記部材は、前記水滴又は泡沫が前記孔付近の部材に接触することによりノズルの先端から前記水滴又は泡沫を除去するものである。上記部材は、培養容器の開口部に設置されることが好ましい。
このロボットは、使い捨てチップを用いて、空気圧による溶液の吸引及び吐出を行うことで、溶液中の細胞構造体をハンドリングするものである。
但し、本発明の水切り部材は、上記装置に使用する態様に限定されるものではなく、ピペットやチップを用いて細胞の吸引及び吐出を行うハンドリングの際にピペットやチップに付着した水滴又は泡沫を除去する状況が生じた場合であれば適用することができる。この場合、水切り部材は、例えば培養容器の開口部に設置することができる。
すなわち、本発明の培養システムは、
細胞塊をハンドリングするハンドリング手段と、
前記ハンドリング手段から供給される細胞塊を貯溜し、培養液が外部と流通できる微細孔を有する第1容器と、
前記第1容器を収容し、前記第1容器内の培養液よりも過剰量の培養液を前記第1容器の周囲に満たす第2容器と、
前記細胞塊を第1容器に供給した後、前記ハンドリング手段に残留した水滴又は泡沫を除去する除液手段と、を有することを特徴とするものである。
細胞塊をハンドリングする手段としては、細胞塊を操作できるものであれば限定されるものではなく、例えば細胞塊を吸排出可能な機構と、この機構を空間移動させる移動制御機構とを備えることができる。上記の細胞塊を吸排出する機構の代替として、例えば細胞塊をすくい上げ及び放出するショベル機構、並びにショベル機構を空間移動させる移動制御機構を備えることができる。
上述の吸排出機構としては、例えばノズルを挙げることができ、移動制御機構としてはXYZの3軸方向で吸排出機構を移動させるポジショニングデバイスを挙げることができる。このような移動制御機構としては、例えば水平多関節ロボットや垂直多関節ロボットなどの産業用ロボットを用いることができる。本発明においては、培養液の吸排出はシステムに備えられたノズルにより直接行なうことができるが、使い捨てのピペットチップをノズルに装着することが好ましい。
第2容器の形状も、第1容器と同様に特に制限されるものではなく、第1容器内の培養液よりも過剰量の培養液を収容できるものであればよい。このような第2容器の典型例としては、第1の容器を囲繞するように形成された器が挙げられる。第1容器と第2容器との間は培養液の流通が可能であり、これにより、第1容器内の細胞塊に第2容器中の培養液に含まれる栄養分などを供給することが可能となる。
ハンドリング装置3は、後述するノズル20(図6参照)、このノズル20を3次元的に移動制御する移動制御機構を備える。ノズル20の先には、例えば図6に示すようにチップ22を装着できるようにしてもよい。移動制御機構は、例えば水平方向(XY方向)へのノズル20の移動および垂直方向(Z方向)へのノズル20の移動を正確に制御して細胞塊のハンドリングが可能なようにノズル20の移動をコントロールする。ノズル20によってハンドリングされる細胞塊は、例えばウェルプレート4上のウェルに収容され、ノズル20はこのウェル内から細胞塊を吸い上げ、第2容器の中に設置された第1容器であるモールド27(図7参照)に排出して細胞塊をモールド27に収容させることができる。
培養器7の隣には防泡器8が配置され、防泡器8は、ハンドリング装置3から水滴を除去してストローク時における気泡の発生を防止し、ひいては第1容器内の気泡の発生を防止する。ハンドリング装置はノズル20を備えるため、防泡器8はこのノズル20から水滴を除去する機構を備える。
図2に示すように、防泡器8は水切り部材40を備える。水切り部材40にはノズル20のレイアウトに合わせて、例えば4つの除液孔40aが形成されており、各除液孔40aは、ノズル20に装着されたチップ22先端に残留する水滴又は泡沫を除去できるように、開口サイズが定められている。この除液孔40aの数はノズル20の数に合わせて適宜変更することができる。水切り部材40は、周囲が隔壁42に囲繞されるように配置され、この隔壁42によって、水切り部材40によりチップ22先端から除去される水滴が周囲へ飛散することを低減している。
図3(A)に示すように、水切り部材40にはチップ22先端から水滴を除去するための除液孔40aが形成されている。孔径はチップ22先端の外径に対して所定のクリアランス(水切り部材とチップ先端との距離)を隔てるように形成されており、このクリアランスによりチップ22先端が水切り部材40に接触せずにチップ22先端に溜まった水滴47のみが水切り部材40に移される。クリアランスは液体の量及び表面張力にもよるが10.0mm以下、9.0mm以下、8.0mm以下、7.0mm以下、6.0mm以下、5.0mm以下、4.0mm以下、3.0mm以下、2.0mm以下、又は1.0mm以下とすることができ、1.0mm以下が好適であり、0.5mm以下がより好ましい。このようなクリアランスを隔ててチップ22先端を除液孔に対して配置することで、図3(B)に示すように、チップ22先端から水滴を除去することができる。これにより、次に液体を培養器7の漏斗28に吐出するときに気泡が発生することを防止することができる。水切り部材40に移った水滴は防泡器8に貯留される。なお、先端が傷まない程度にチップを除液孔に接触させてチップ先端から水滴を除去してもよいが、この場合、チップのより正確な移動制御が必要となる。
ここで、水切りの順序は、細胞塊を第1容器に吐出する前に行なうことも、吐出した後に行なうことも、あるいはその両方とも行なうこともできる。
孔径はチップ全体が通過でき、かつ、チップ22先端の外径に対して所定のクリアランスを隔てるように形成されており、このクリアランスによりチップ22先端が水切り部材40に接触せずにチップ22先端に溜まった水滴47のみが水切り部材40に移される。このようにして、細胞のモールドへの吐出と水滴除去を1ストロークで行なうことができる。この態様の場合は、除去された水滴はそのまま部材を伝わって培養槽に滴下するが、水滴であれば第1容器内の培養液と混合され、泡沫であれば第1容器内の培養液表面に停滞するか消滅するため、続くストロークに影響はない。もちろん、コンタミの問題も生じない。
図4(A)に例示した水切り部材50では、チップ22の降下移動を正確にコントロールすることでチップ22先端から水滴を除去することができる。水切り部材50にはグリル(網状部)52が形成され、チップ22先端はこのグリル52に対して所定の間隔を隔てるように下降制御される。チップ22先端が下降した際のグリル52との間隔は、前記と同様に、10.0mm以下、9.0mm以下、8.0mm以下、7.0mm以下、6.0mm以下、5.0mm以下、4.0mm以下、3.0mm以下、2.0mm以下、又は1.0mm以下とすることができ、1.0mm以下が好適であり、0.5mm以下がより好ましい。このような間隔を隔ててチップ22先端をグリル52に対向させることにより、水滴がチップ22先端から水切り部材50に移り、チップ22先端から水滴を除去することができる。また、図4(B)に示すように、より細かな格子状のグリル56を水切り部材54に設けてもよい。このような水切り部材54を用いてもチップ22先端から水滴を除去することができる。容器1の上部に水切り部材を設ける態様においても、チップ22が通過できる孔を設け、チップと孔を形成する壁面とのクリアランスを制御することにより、チップ22先端部の水滴を除去することができる。
図5は防泡器に備えられた水切り部材を、除液孔の配列方向に沿って上部側から底部側に向けて切断した断面図である。図5(A)に示すように、水切り部材60の裏側には、除液孔60aに挿入されたチップ22先端の外周に近接するドレーナ65が設けられている。ドレーナ65には内側に向けて窄まった狭窄部65aが形成され、狭窄部65aがチップ22先端の外周に近接することができる。
ハンドリング機構3(図1参照)は、スカラロボットであり、例えば機構本体3aと、この機構本体3aに対して回動可能に一端が軸着された接続アーム3bと、接続アーム3bの他端に取り付けられた移動体3cとを有する。接続アーム3bの一端が機構本体3aに固定され、接続アーム3bの他端に移動体3cが取り付けられたことにより、移動体3cは回転軸Pに対して回動することができる。移動体3cは昇降移動可なノズルユニット16を備え、ノズルユニット16は移動体3cによる水平方向の移動と自身の昇降移動とによってXYZ方向に自在に移動して配置されることができる。
図6はハンドリング機構のノズルユニット16を部分的に拡大して示した斜視図である。図6に示すように、ハンドリング機構3はノズル20を有し、このノズル20を介してウェルプレート4上のウェル4aに収容された細胞塊を取り扱うことができる。ノズル20は重力方向に沿って下向きに配置され、外周に付着した水滴は先端側に流下するようになっている。
加圧/減圧供給用のポンプ(シリンダ)は、ノズルユニット16に備えられた個々のノズル20に接続され、個々のノズル20はポンプの精密な作動によって、吸引量および吐出量が正確にコントロールされる。
移動体3cはウェルプレート4の表面と平行な方向に移動して位置決めされ、移動体3cの位置決め後に、ノズルユニット16がウェルプレート4の上側から下側に向けて下降する。ノズルユニット16が下降すると、4つのノズル20の各先端に装着されたチップ22の先端がそれぞれウェル4aに進入し、ノズル20は直接的に又はチップ22を介してウェル4aに内容された細胞塊を含有した細胞懸濁液を吸引することができる。
図8は、漏斗、モールド、及び第2容器をモールド上部から底部に向かって切断した断面図である(細胞塊以外の断面)。図8に示すように、漏斗28の内側には擂鉢状に斜面が形成された収斂部28aが形成され、漏斗28はモールド27の上部に配置され密嵌されている。このように漏斗28の収斂部28aはモールド27内部に連通している。
モールド27内は流路29c(図8)を介して培養器7と連通し、培養器7は過剰量の液体を溜められるように形成されている。この培養器7内のボリュームサイズはモールド27内の容量に合わせて適宜定めることができる。
モールド27の外部には、例えばこのモールド27を囲繞するように培養器7が設けられ、この培養器7にはモールド27内に収容する培養液24よりも過剰量の培養液25を収容することができる。この培養器7内の培養液25がモールド27の底に形成されたフィルタの微細孔を通して流通することによりモールド内の培養液24を形成し、第1容器内の細胞塊23を培養することができる。
培養器7内に供給される培養液の量は、細胞が増殖・分化することができる限り特に限定されるものではないが、例えば、鋳型部27b内で直径4mm、厚さ5mmの細胞塊を培養する場合は、培養器7内の培養液の量は例えば10〜20ml必要であり、培養器7に供給する培養液は鋳型部27bの容量の少なくとも5〜10倍程度必要である。
図9は上部から底部に向けて切断されたモールド、およびモールド内に配置されたフィルタを拡大した断面図である。図9に示すように、モールド27はモールド本体35とこのモールド本体35に組み込まれたフィルタ37とから構成される。
モールド27は、漏斗28を介して流れ込んだスフェロイドなどの細胞塊を基にして細胞の立体構造体(細胞プラグ)を形成する。本発明の好ましい態様において、モールド27に収容された細胞は、表面張力により培養液と気相との境界に接して浮遊し、次の細胞塊が流れ込むことで、今度は流れ込んだ後の最上部の細胞が培養液と気相との境界部を構成する。これを繰り返すとともに、細胞塊を培養器7内に充たされた過剰な培養液によって培養させることにより、細胞の立体構造体を形成することができる。また、モールド27内部には開口部27aとフィルタ37とによって囲まれた鋳型部27bが形成され、この鋳型部27bの形状を変えることにより、任意形状の立体構造体を作製することができる。
高分子の発泡または多孔質材料としては、ポリエチレンまたはポリプロピレンなどのポリオレフィン系;ブタジエンまたはイソプレンなどのジエン系;ポリウレタン;ポリ塩化ビニル、アクリルアミド、ポリスチレンまたはポリビニルアルコールなどのビニル系重合体;ポリエーテル、ポリエステル、ポリカーボネートまたはナイロンなどの縮合体;シリコンおよびフッ素樹脂などの材料が適用できる。
線維芽細胞、幹細胞、血管内皮細胞、表皮細胞、上皮細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞は未分化間葉系幹細胞から容易に分化誘導ができ、関節軟骨細胞や骨細胞などの細胞も使用することができる。
このように本発明は、中胚葉系の組織を中心として、関節軟骨、骨のほか、乳房などの脂肪細胞、靭帯などにも応用することができる。
スフェロイドを介することにより、細胞周期において細胞は静止期に移行し、タンパク質の産生が増加すると考えられる。従って、本発明では、細胞を静止期に誘導するため、一旦スフェロイドにしてから所定の形状に形成することが好ましい。
動物由来物質からの細菌ウイルスなどの感染、供給時期や品質の安定性を考慮すると合成培地が好ましい。
合成培地としては、例えば、α−MEM(Mnimum Essential Medium)、DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)RPMI 1640培地、CMRC培地、HAM培地、DME/F12培地、MCDB培地、などを用いることができる。
これらの培地には、増殖因子や成長因子、ホルモンなどの生理活性物質、薬理作用を有するその他の種々の物質を適宜添加してもよい。このような物質を添加することにより、機能を付与したり変化させることができる。
ホルモンとしては、例えば、インシュリン、トランスフェリン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、チロキシン、3,3',5−トリヨードチロニン、1−メチル−3−ブチルキサンチン、プロゲステロン、などが挙げられる。
その他の生理活性物質として典型的には、例えば、アスコルビン酸(特に、L−アスコルビン酸)、ビオチン、パントテン酸カルシウム、アスコルビン酸二リン酸、ビタミンD等のビタミン類、血清アルブミン、トランスフェリン等のタンパク質、脂質、脂質酸源、リノール酸、コレステロール、ピルビン酸、DNAおよびRNA合成用ヌクレオシド、グルココルチコイド、レチノイン酸、β−グリセロホスフェート、モノチオグリセロールなどが挙げられる。
胚性幹細胞由来のスフェロイドの形成は、上記の培養条件のもとに実行することができる。以下に本発明のより詳細な態様について説明する。
図10に示すように、培養システム102は、ハンドリング手段であるハンドリング機構3、ウェルプレート4が載置される載置台105、装着チップボックス106、培養器7、防泡器8、使用済みチップの脱着チップボックス109、培地リザーバ10、電動シリンダ111、図示しない調温器、給排気機構などを備える。ハンドリング機構3、ウェルプレート4、載置台105、培養器7、チップボックス109、電動シリンダ111は、それぞれベース113上に固定され、周囲がカバー114によって覆われる。システム全体をカバー114によって覆うこともでき、これにより、外部から塵や埃が装置内部に侵入することが防止される。
ハンドリング機構3は、ベース113に固定された機構本体3aと、この機構本体3aに対して回動可能に一端が軸着された接続アーム3bと、接続アーム3bの他端に取り付けられた移動体3cとを有し、一端が機構本体3aに固定された接続アーム3bの他端に移動体3cが取り付けられたことにより、移動体3cは回転軸Pに対して回動することができる。
ハンドリング機構3の周囲には、装着チップボックス106を備えウェルプレート4の載置が自在な載置台105、培養器7、防泡器8、培地リザーバ10、脱着チップボックス109が配置されている。ここで、図10は水切り部材を設置した防泡器8と培養器7とを別々に配置した態様を示すが、培養器7に水切り部材を配置することもできる。
スフェロイドなどの細胞塊が収容されたウェルプレート4が載置台105上に載置され、ハンドリング機構3の移動体3cがウェルプレート4上に移動してノズルユニット16が下降する。ノズルユニット16が下降すると4つのノズル20に装着されたそれぞれのチップ22が対応するウェル4aに進入し、それぞれのウェル4aに収容された細胞塊が各チップ22内に吸引される。
このときの培養条件は、例えば温度37℃、5%二酸化炭素雰囲気である。所定の培養時間の経過後、治療に必要十分な量の立体構造体がモールド27の鋳型部27bに形成される。チップ22先端の水滴は防泡器8に具備された水切り部材40によって除去することができる。
立体構造体の形成後、モールド28上に装着されていた漏斗28を脱着し、さらに支持体29からモールド27を取り外すことで、モールド27内から細胞の立体構造体を取り出すことができる。
3 ハンドリング機構(ハンドリング手段)
4 ウェルプレート
4a ウェル
7 培養器(第2容器)
8 防泡器
16 ノズルユニット
20 ノズル
22 チップ
23 細胞塊
24 培養液
25 培養液
27 モールド(第1容器)
28 漏斗
29 支持体
35 モールド本体
37 フィルタ
37a 微細孔
40 水切り部材(除液手段)
40a 挿通開口
45 ドレーナ
50 ドレーナ
102 培養システム
105 載置台
109 チップボックス
111 電動シリンダ
Claims (8)
- 細胞塊をハンドリングするハンドリング手段と、
前記ハンドリング手段から供給される細胞塊を貯溜し、培養液が外部と流通できる微細孔を有する第1容器と、
前記第1容器を収容し、前記第1容器内の培養液よりも過剰量の培養液を前記第1容器の周囲に満たす第2容器と、
前記細胞塊を第1容器に供給した後、前記ハンドリング手段に残留した水滴又は泡沫を除去する除液手段と、を有することを特徴とする細胞塊の培養システム。 - 前記ハンドリング手段は前記細胞塊を含む培養液の吸引及び吐出が可能なノズルを備え、前記ノズルを介して細胞塊をハンドリングすることを特徴とする請求項1に記載の培養システム。
- 前記除液手段は、前記ノズルの先端が近接して前記吸引又は吐出の際生じた水滴又は泡沫をノズルの先端から除去する水切り部材を備えることを特徴とする請求項2に記載の培養システム。
- 前記第1容器は、貯溜された細胞塊を培養して細胞の立体構造体を成形するためのモールドであり、前記モールドの底部に、微細孔を有する部材を設けたことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の培養システム。
- 前記第1容器の開口部に、外側に開いた漏斗を有することを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の培養システム。
- 培養液の吸引及び吐出が可能なハンドリング手段に備えられたノズルの先端付近に前記吸引又は吐出の際生じた水滴又は泡沫を除去する水切り部材であって、前記ノズルが上下に通過できる大きさの孔が設けられた前記部材。
- 前記部材は、前記水滴又は泡沫が前記孔付近の部材に接触することによりノズルの先端から前記水滴又は泡沫を除去するものである請求項6に記載の部材。
- 培養容器の開口部に設置されるものである、請求項6又は7に記載の部材。
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