JP2021097690A - 細胞分離器具およびそれを使用する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】マイクロキャリアまたはスフェロイドが多孔質メッシュ内の細孔を塞ぐことを抑制し、多孔質メッシュを通る細胞培養培地の流れが遮断されにくい細胞分離器具、および細胞分離器具を使用する方法を提供する。【解決手段】液体中のマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を分離するように構成された細胞分離器具であって、第１のポート１０６は第１の区画１１２と連通しており、該第１のポートは多孔質メッシュ１０２の第一面側に位置しており、第２のポート１０８は前記空洞の第２の区画１１４と連通しており、該第２のポートは前記多孔質メッシュの第二面側に位置しており、前記多孔質メッシュは、該多孔質メッシュを通る液体の流れに対して実質的に垂直な向きまたは傾斜した向きを有するように前記空洞内に配置されている、細胞分離器具である。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の説明

本出願は、２０１５年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／２７０９５０号の優先権を主張して出願された特願２０１８−５３２６４１号の分割出願である。

本開示は、液体（例えば、細胞培養培地）中のマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を分離するための細胞分離器具およびその細胞分離器具を使用する方法に関する。

例えば、微分傾斜(differential gradient)遠心分離、音響共振、接線流濾過、スピンフィルターおよび円錐または傾斜板を使用した沈降を含む、細胞培養培地内にあるマイクロキャリアから細胞を分離するための公知の技術がいくつかある。これら公知の技術のほとんどは、高額な資本設備を必要とするか、または作動させるのが複雑である。細胞培養培地内にあるマイクロキャリアから、そしてことによると、スフェロイドから細胞を分離するための、それほど複雑ではない市販の器具の内の２つに、Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ ＦｉｌｔｅｒユニットおよびＨｙＱ Ｈａｒｖｅｓｔａｉｎｅｒがある。

このＳｔｅｒｉｆｌｉｐ Ｆｉｌｔｅｒユニットは、そのユニットを、細胞培養培地（マイクロキャリアを含む）を収容する標準型５０ミリリットル遠心分離管に取り付け、そのユニットをひっくり返し、この取り付けられた５０ミリリットル遠心分離管内に濾過された細胞が集まるように真空に引くことによって、作動するように設計されている。このＳｔｅｒｉｆｌｉｐ ＦｉｌｔｅｒユニットはＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅにより製造されている。

Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃにより製造されているＨｙＱ Ｈａｒｖｅｓｔａｉｎｅｒは、数百リットルの培地を収容することができ、細胞、マイクロキャリアおよび培地をその装置に灌流させるためにポンプに依存する。より詳しくは、このＨｙＱ Ｈａｒｖｅｓｔａｉｎｅｒは、灌流された培地の出口を有するより大型の構造化液体不透過性バッグ内にメッシュバッグを有する。細胞、マイクロキャリア、および培地の溶液がＨｙＱ Ｈａｒｖｅｓｔａｉｎｅｒ中にそこを通して灌流される前に、マイクロキャリアは繰り返し洗浄され、細胞は外部のバイオリアクター内でマイクロキャリアから酵素的に分離される。マイクロキャリアは、ＨｙＱ Ｈａｒｖｅｓｔａｉｎｅｒの内側メッシュバッグ内に保持され、細胞および培地は、内側メッシュバッグを通り、次いで、構造化外側バッグから細胞収集容器中に通過する。ＨｙＱ Ｈａｒｖｅｓｔａｉｎｅｒを使用するために要求される工程は、やっかいであるのが分かる。

これらの濾過ユニットおよび他の標準型濾過ユニットの全ては、多孔質メッシュを、細胞培養培地の流れに対して垂直であるように、水平配置に位置付ける。それゆえ、標準型濾過ユニットが使用される場合、マイクロキャリアまたはスフェロイドは水平に向けられた多孔質メッシュ上に着地し、その水平に向けられた多孔質メッシュ内の細孔を塞ぐので、水平に向けられた多孔質メッシュを通る細胞培養培地の流れは、遮断されやすい。この問題と他の問題が本開示により対処される。

細胞分離器具、およびその細胞分離器具を使用する方法が、本出願の独立請求項に記載されている。その細胞分離器具およびその細胞分離器具を使用する方法の有利な実施の形態が、従属請求項に記載されている。

１つの態様において、本開示は、液体中のマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を分離するように構成された細胞分離器具を提供する。その細胞分離器具は、第１のポート、第２のポート、および空洞を有する容器を備える。その細胞分離器具は、その空洞を第１の区画と第２の区画に分割するために空洞内に配置された多孔質メッシュをさらに備える。その第１のポートは空洞の第１の区画と連通している。さらに、その第１のポートは多孔質メッシュの第一面側に位置している。第２のポートは空洞の第２の区画と連通している。さらに、その第２のポートは多孔質メッシュの第二面側に位置している。その多孔質メッシュは、多孔質メッシュを通る液体の流れに対して実質的に垂直な向きまたは傾斜した向きを有するように空洞内に配置されている。新たな細胞分離器具が使用される場合、マイクロキャリアまたはスフェロイドは、従来の細胞分離器具の水平の多孔質メッシュにおけるように、重力により垂直なまたは傾斜した多孔質メッシュ内の細孔の大半をもはや塞がないので、垂直なまたは傾斜した多孔質メッシュを通る液体の流れは、従来の細胞分離器具におけるようには、もはや容易には塞がれないという点で、本開示の細胞分離器具は、垂直なまたは傾斜した多孔質メッシュを有することにより、従来の細胞分離器具を上回って著しく改善されている。

別の態様において、本開示は、その細胞分離器具を使用して、液体中のマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を分離する方法を提供する。その方法は、（ａ）細胞分離器具の容器の第１のポートを通じて液体を導入する工程であって、該容器は第２のポートおよび空洞をさらに有し、多孔質メッシュが、その多孔質メッシュを通る液体の流れに対して実質的に垂直なまたは傾斜した向きを有し、その空洞を第１の区画と第２の区画に分割するように、その空洞内に配置され、第１のポートが多孔質メッシュの第一面側に位置しており、第１のポートは空洞の第１の区画と連通しており、第２のポートは空洞の第２の区画と連通している工程、（ｂ）多孔質メッシュを通過する液体を第２のポートから排出する工程、（ｃ）多孔質メッシュを通過しないマイクロキャリアまたはスフェロイドを処理して、そのマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を放出する工程、および（ｄ）その細胞を第２のポートから排出させる工程を有してなる。新たな細胞分離器具が使用される場合、マイクロキャリアまたはスフェロイドは、従来の細胞分離器具の水平の多孔質メッシュにおけるように、重力により垂直なまたは傾斜した多孔質メッシュ内の細孔の大半をもはや塞がないので、垂直なまたは傾斜した多孔質メッシュを通る液体の流れは、従来の細胞分離器具におけるようには、もはや容易には塞がれないという点で、本開示の細胞分離器具は、垂直なまたは傾斜した多孔質メッシュを有することにより、従来の細胞分離器具を上回って著しく改善されている。

本開示の追加の態様は、一部には、下記の詳細な説明、図面およびいずれかの請求項に述べられており、一部は、その詳細な説明から導かれるか、もしくは本開示の実施によって分かる。先の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方とも、例示と説明に過ぎず、本開示を開示されたように制限するものではないことが理解されよう。

本開示のより完全な理解は、添付図面と共に解釈されたときに、以下の詳細な説明を参照することにより得られるであろう。

本開示の実施の形態による細胞分離器具の正面図 本開示の実施の形態による細胞分離器具内に配置される多孔質メッシュの側面図 本開示の実施の形態による、図１Ａに示された細胞分離器具を保持し、移動させるために使用できるリング・スタンドの正面図 本開示の実施の形態による、図１Ａに示された細胞分離器具の大部分を取り囲む筐体の斜視図 本開示の実施の形態による細胞分離器具の正面図 本開示の実施の形態による細胞分離器具内に配置される多孔質メッシュの側面図 本開示の実施の形態による、図２Ａに示された細胞分離器具に結合された外部システムの概略図 本開示の実施の形態による、図２Ａに示された細胞分離器具に結合された異なる外部システムの概略図 本開示の実施の形態にしたがって構成された細胞分離器具の概略図 本開示の実施の形態にしたがって構成された細胞分離器具の概略図 本開示の実施の形態にしたがって構成された細胞分離器具の概略図 本開示の実施の形態にしたがって構成された細胞分離器具の概略図 本開示の実施の形態にしたがって構成された細胞分離器具の概略図 本開示の実施の形態にしたがって構成された細胞分離器具の概略図 本開示の実施の形態にしたがって構成された細胞分離器具の概略図 本開示の実施の形態にしたがって構成された細胞分離器具の概略図 本開示の実施の形態にしたがって構成された細胞分離器具の概略図 本開示の実施の形態にしたがって構成された細胞分離器具の概略図 本開示の実施の形態にしたがって構成された細胞分離器具の概略図 本開示の実施の形態による、図６Ａに示された細胞分離器具に結合された外部システムの概略図 本開示の実施の形態にしたがって構成された細胞分離器具の概略図 本開示の実施の形態による、図６Ａに示された細胞分離器具に結合された外部システムの概略図 本開示の実施の形態による、液体中のマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を得るために、図１〜７に示された細胞分離器具を使用する方法の基本工程を示す流れ図

液体（例えば、細胞培養培地、緩衝食塩水）中のマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を分離するように構成された細胞分離器具がここに開示されている。その細胞分離器具は、第１のポート、第２のポート、および空洞を有する容器を備える。その細胞分離器具は、その空洞を第１の区画と第２の区画に分割するために空洞内に配置された多孔質メッシュ（液体透過性膜など）をさらに備える。その第１のポートは空洞の第１の区画と連通している。さらに、その第１のポートは多孔質メッシュの第一面側に位置している。第２のポートは空洞の第２の区画と連通している。さらに、その第２のポートは多孔質メッシュの第二面側に位置している。その多孔質メッシュは、多孔質メッシュを通る液体の流れに対して実質的に垂直な向きまたは水平の向き以外の傾斜した向きを有するように空洞内に配置されている。

その新たな細胞分離器具を使用して、液体（例えば、細胞培養培地、緩衝食塩水）中のマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を分離する方法も、ここに開示されている。その方法は、（ａ）細胞分離器具の容器の第１のポートに液体を導入する工程であって、該容器は第２のポートおよび空洞をさらに有し、多孔質メッシュが、その多孔質メッシュを通る液体の流れに対して実質的に垂直なまたは傾斜した向きを有し、その空洞を第１の区画と第２の区画に分割するように、その空洞内に配置され、第１のポートが多孔質メッシュの第一面側に位置しており、第１のポートは空洞の第１の区画と連通しており、第２のポートは空洞の第２の区画と連通している工程、（ｂ）多孔質メッシュを通過する液体を第２のポートから排出する工程、（ｃ）多孔質メッシュを通過しないマイクロキャリアまたはスフェロイドを処理して、そのマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を放出する工程、および（ｄ）その細胞を第２のポートから排出させる工程を有してなる。新たな細胞分離器具が使用される場合、マイクロキャリアまたはスフェロイドは、従来の細胞分離器具の水平の多孔質メッシュにおけるように、重力により垂直なまたは傾斜した多孔質メッシュ内の細孔の大半をもはや塞がないので、垂直なまたは傾斜した多孔質メッシュを通る液体の流れは、従来の細胞分離器具におけるようには、もはや容易には塞がれないという点で、本開示の細胞分離器具は、垂直なまたは傾斜した多孔質メッシュを有することにより、従来の細胞分離器具を上回って著しく改善されている。

本開示の実施の形態は、本開示の非限定的な実施の形態による様々な細胞分離器具およびその様々な細胞分離器具を使用する方法を図解する、図１〜８を参照して論じられる。以下の説明は、新たな細胞分離器具を実現するための説明を与えることを目的としており、その新たな細胞分離器具の様々な態様は、その非限定的な実施の形態に関して本開示全体に亘り詳しく具体的に述べられており、これらの実施の形態は、本開示の文脈において互いに交換できる。ここに記載された様々な細胞分離器具は、液体中のマイクロキャリアまたはスフェロイドからの細胞の分離に関して役立つが、（例えば）互いにくっついた細胞の染色などの他の用途に使用できることを認識すべきである。

図１Ａ〜１Ｂを参照すると、本開示の実施の形態による細胞分離器具１００の正面図および細胞分離器具１００内に配置される多孔質メッシュ１０２の側面図が、それぞれ示されている。図のように、細胞分離器具１００は、第１のポート１０６、第２のポート１０８、および空洞１１０を有する容器１０４を備えている。その細胞分離器具１００は、その空洞１１０を第１の区画１１２と第２の区画１１４に分割するように空洞１１０内に配置された多孔質メッシュ１０２をさらに備えている。その第１のポート１０６は空洞１１０の第１の区画１１２と連通している。さらに、その第１のポート１０６は多孔質メッシュ１０２の第一面１１６側に位置している。第２のポート１０８は空洞１１０の第２の区画１１４と連通している。さらに、その第２のポート１０８は多孔質メッシュ１０２の第二面１１８側に位置している。その上、第１のポート１０６は容器１０４の一方の端部１２０に位置しており、第２のポート１０８は容器１０４の反対の端部１２２に位置している。また、（１）第１のポート１０６が実質的に上向きに位置しており、第２のポート１０８が実質的に下向きに位置している場合（図１Ａに示されるように）、または（２）第１のポート１０６が実質的に下向きに位置し、第２のポート１０８が実質的に上向きに位置している場合、多孔質メッシュ１０２が空洞１１０内で実質的に垂直の向きを有するように、第１のポート１０６および第２のポート１０８は容器１０４上で互いからずれている。

この例において、細胞分離器具１００は、バイオリアクター、真空ポンプなどの外部装置に直接的に接続されていないので、開放系細胞分離器具１００であるように構成されている。この構成において、細胞分離器具１００は、第１のポート１０６に取り付けられる第１のキャップ１２４を有する（すなわち、第１のキャップ１２４は、第１のポート１０６に締め付けたり、第１のポート１０６から取り外したりすることができる）。さらに、細胞分離器具１００は、第２のポート１０８に取り付けられる第２のキャップ１２６を有する（すなわち、第２のキャップ１２６は、第２のポート１０８に締め付けたり、第２のポート１０８から取り外したりすることができる）。

図１Ｃに示されるように、液体（例えば、細胞培養培地、緩衝食塩水）中のマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を分離するときに、所望であれば、リング・スタンド１２８または類似の器具を使用して、細胞分離器具１００を保持し、多数の位置のいずれか１つに動かしても差し支えない。また、図１Ｄは、第１のポート１０６および第２のポート１０８を除いて細胞分離器具１００の大部分を取り囲む、所望であれば、使用できる筐体１３０を示す。筐体１３０は、細胞分離器具１００（可撓性容器１０４を有することがある）の回転を可能にし、一般に、細胞分離器具１００の取扱いに役立つ。

１つの例示の用途において、細胞分離器具１００を使用して、以下の工程を行うことによって、液体内のマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を得ることができる：
１）上向きの細胞分離器具１００の上部にある第１のポート１０６から第１のキャップ１２４を取り外す。
２）マイクロキャリアまたはスフェロイドを含む液体を、第１のポート１０６を通じて細胞分離器具１００中に注ぎ入れる。
３）細胞分離器具１００の上部にある第１のポート１０６に第１のキャップ１２４を戻す。次に、例えば、上述したリング・スタンド１２８を使用することにより、第１のキャップ１２４が今では下向きであり、第２のキャップ１２６が今では上向きであるように、細胞分離器具１００を反転させる。
４）細胞分離器具１００の第２のポート１０８から第２のキャップ１２６を取り外す。次に、細胞分離器具１００の第２のポート１０８から、多孔質メッシュ１０２を通過した液体を注ぎ出す。この注ぎ出し工程中、多孔質メッシュ１０２は、細胞分離器具１００の内部にマイクロキャリアまたはスフェロイドを保持していることに留意のこと。
５）細胞分離器具１００の第２のポート１０８に第２のキャップ１２６を配置する。次に、例えば、上述したリング・スタンド１２８を使用することにより、第１のキャップ１２４が今では上向きであり、第２のキャップ１２６が今では下向きであるように、細胞分離器具１００を反転させる。
６）細胞分離器具１００の第１のポート１０６から第１のキャップ１２４を取り外す。次に、洗浄液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））を、第１のポート１０６を通じて細胞分離器具１００中に注ぎ入れる。
７）細胞分離器具１００の第１のポート１０６に第１のキャップ１２４を戻す。細胞分離器具１００を動かす。次に、例えば、上述したリング・スタンド１２８を使用することにより、第１のキャップ１２４が今では下向きであり、第２のキャップ１２６が今では上向きであるように、細胞分離器具１００を反転させる。
８）細胞分離器具１００の第２のポート１０８から第２のキャップ１２６を取り外す。次に、細胞分離器具１００の第２のポート１０８から、多孔質メッシュ１０２を通過した液体を注ぎ出す。工程６、７および８は、多数回繰り返しても差し支えないことに留意のこと。あるいは、工程６、７および８を省略しても差し支えない。
９）細胞分離器具１００の第２のポート１０８に第２のキャップ１２６を配置する。次に、例えば、上述したリング・スタンド１２８を使用することにより、第１のキャップ１２４が今では上向きであり、第２のキャップ１２６が今では下向きであるように、細胞分離器具１００を反転させる。
１０）細胞分離器具１００の第１のポート１０６から第１のキャップ１２４を取り外す。次に、細胞解離試薬（例えば、トリプシン）を、第１のポート１０６を通じて細胞分離器具１００中に注ぎ入れる。
１１）細胞分離器具１００の第１のポート１０６に第１のキャップ１２４を配置する。細胞分離器具１００を水平位置に動かして、マイクロキャリアまたはスフェロイドを細胞解離試薬中でインキュベートさせる。細胞が解離した後、例えば、上述したリング・スタンド１２８を使用することにより、第１のキャップ１２４が今では下向きであり、第２のキャップ１２６が今では上向きであるように、細胞分離器具１００を反転させる。
１２）細胞分離器具１００の第２のポート１０８から第２のキャップ１２６を取り外す。次に、細胞分離器具１００の第２のポート１０８から、多孔質メッシュ１０２を通過した細胞解離試薬および細胞（マイクロキャリアから放出されたまたはスフェロイドから溶解した）を注ぎ出す。

図２Ａ〜２Ｂを参照すると、本開示の実施の形態による、細胞分離器具２００の正面図および細胞分離器具２００内に配置された多孔質メッシュ２０２の側面図が、それぞれ示されている。この実施の形態において、細胞分離器具２００は、第１のポート２０６、第２のポート２０８、および空洞２１０を有する容器２０４を備える。細胞分離器具２００は、空洞２１０を第１の区画２１２と第２の区画２１４に分割するために空洞２１０内に配置された多孔質メッシュ２０２をさらに備える。第１のポート２０６は空洞２１０の第１の区画２１２と連通している。さらに、その第１のポート２０６は多孔質メッシュ２０２の第一面２１６側に位置している。第２のポート２０８は空洞２１０の第２の区画２１４と連通している。さらに、その第２のポート２０８は多孔質メッシュ２０２の第二面２１８側に位置している。その上、第１のポート２０６は容器２０４の一方の端部２２０に位置しており、第２のポート２０８は容器２０４の反対の端部２２２に位置している。また、（１）第１のポート２０６が実質的に上向きに位置しており、第２のポート２０８が実質的に下向きに位置している場合（図２Ａに示されるように）、または（２）第１のポート２０６が実質的に下向きに位置し、第２のポート２０８が実質的に上向きに位置している場合、多孔質メッシュ２０２が空洞２１０内で傾斜した向きを有するように、第１のポート２０６および第２のポート２０８は容器２０４上で互いに一列に並んでいる。この例示の実施の形態において、細胞分離器具２００は、第１のポート２０６および第２のポート２０８を除いて、細胞分離器具２００の大部分を取り囲む筐体（図示せず）も有していて差し支えない（細胞分離器具２００に使用できるであろう例示の筐体１３０について、図１Ａを参照のこと）。使用される場合、その筐体は、細胞分離器具２００（可撓性容器２０４を有することがある）の回転を可能にし、一般に、細胞分離器具２００の取扱いに役立つ。

この例において、細胞分離器具２００は、図２Ｃ〜２Ｄに関して次により詳しく論じられるように、バイオリアクター、真空ポンプなどの外部装置に直接接続できるので、閉鎖系細胞分離器具２００であるように構成されている。この構成において、細胞分離器具２００は、第１のポート２０６に取り付けられた第１の流量制御システム２３２、および第２のポート２０８に取り付けられた第２の流量制御システム２３４を有する。この例において、第１の流量制御システム２３２は、管を通じて第１のポート２０６に接続された一方の端部およびＹ字管を通じて、（１）第１のクランプ２３８（またはバルブ）とベント・フィルタ２４０、および（２）多目的コネクタ２４４（または無菌コネクタ２４４）に接続された別の端部を有するバルブ２３６を有する。第２の流量制御システム２３４は、管を通じて第２のポート２０８に接続された一方の端部およびＹ字管を通じて、（１）第２のクランプ２４８（またはバルブ）とベント・フィルタ２５０、および（２）多目的コネクタ２５２（または無菌コネクタ２５２）に接続された別の端部を有するバルブ２４６を有する。ベント・フィルタ２４０および２５０は、空気が細胞分離器具２００から抜けられるように開くことができる。

外部装置との閉鎖系細胞分離器具２００（筐体なし）の例示の統合が、図２Ｃ〜２Ｄに示されている。図２Ｃにおいて、そのプロセスの開始時の細胞分離器具２００は、スフェロイド灌流バイオリアクター２６０の出力口と直列に接続されている。スフェロイド灌流バイオリアクター２６０は、酸素供給器２６２の出力口に接続された入力口を有する。酸素供給器２６２は、ポンプ２６４の出力口に接続された入力口を有する。ポンプ２６４は、新鮮な液体（例えば、新鮮な細胞培養培地）を受け入れる入力口を有する。制御装置２６５、およびスフェロイド灌流バイオリアクター２６０の出力口とポンプ２６４の入力口に接続された廃液送り管およびバルブの網目構造２６６もある。この例示の設定において、細胞分離器具２００は、スフェロイドがスフェロイド灌流バイオリアクター２６０から取り出され、細胞分離器具２００内に収集されるまで、スフェロイド灌流バイオリアクター２６０と直列のままである。スフェロイドが細胞分離器具２００内に収集された後、細胞分離器具２００は、スフェロイド灌流バイオリアクター２６０から外され、図２Ｄに示されるような、細胞解離試薬容器２７０、洗浄液容器２７２（例えば、ＰＢＳ容器２７２）、廃液容器２７４および細胞収集容器２７６に接続される。

この時点で、細胞分離器具２００を使用して、以下の例示の工程を行うことによって、中にあるスフェロイドから細胞を得ることができる：
１）多孔質メッシュ２０２がほぼ水平の向きにあるように細胞分離器具２００を配置する。図２に示されたクランプおよびバルブの全てが閉じられているものとする。
２）ＰＢＳ容器２７２から細胞分離器具２００へのクランプ２６７およびバルブ２３６を開く。それに加え、細胞分離器具２００に関連するクランプ２３８およびベント・フィルタ２４０を開く。ＰＢＳが重力によって細胞分離器具２００中に流入し、細胞分離器具２００中のどの空気も、ベント・フィルタ２４０を通って外に出る。
３）要求されるような多くのＰＢＳが細胞分離器具２００に入った後、ＰＢＳ管のクランプ２６７およびバルブ２３６を閉じる。
４）細胞分離器具２００を左右に傾けて、収集したＰＢＳ中でスフェロイドを洗浄する。
５）細胞分離器具２００から廃液容器２７４へのバルブ２４６およびクランプ２６９と２７１を開く。それに加え、廃液容器２７４のクランプ２７３（もしあれば）およびベント・フィルタ２７５（もしあれば）を開く。
６）多孔質メッシュ２０２が実質的に垂直向きになり、ＰＢＳが重力によって廃液容器２７４に流れ出るように、細胞分離器具２００を位置付ける。
７）廃液容器２７４へのクランプ２７１を閉じ。細胞分離器具２００に関連するバルブ２４６を閉じる。細胞解離試薬容器２７０から細胞分離器具２００への管路にあるクランプ２７７およびバルブ２３６を開く。細胞解離試薬が重力によって細胞分離器具２００中に流れ込む。
８）多孔質メッシュ２０２が水平であるような面に、細胞分離器具２００を位置付ける。細胞がスフェロイドから解離できるように、細胞分離器具２００を穏やかに揺り動かす。
９）細胞が一旦解離したら、多孔質メッシュ２０２が実質的に垂直向きになるように、細胞分離器具２００を垂直に向ける。
１０）細胞収集容器２７６へのバルブ２４６およびクランプ２６９と２７９を開く。それに加え、細胞収集容器２７６に取り付けられたベント・フィルタ２８３（もしあれば）へのクランプ２８１（もしあれば）を開く。解離した細胞は、重力により細胞収集容器２７６中に流れ込む。

廃液容器２７４および細胞収集容器２７６が袋である場合、ひいては、最初に使用する際に袋内には空気が存在しないので、ベント・フィルタ２７５および２８３は不要であることに留意のこと。対照的に、規定の形状を有する硬質側面の廃液容器２７４および硬質側面の細胞収集容器２７６には、ベント２７５および２８３が使用されるであろう。何故ならば、それらの容器２７４および２７６中に空気が存在し、流体が硬質側面の廃液容器２７４および硬質側面の細胞収集容器２７６中に流入するために、空気が抜ける必要があるからである。

第１の流量制御システム２３２および第２の流量制御システム２３４をキャップと交換する場合、細胞分離器具２００は、開放系の細胞分離器具２００であるように構成しても差し支えないことを認識すべきである。同様に、細胞分離器具１００は、キャップ１２４および１２６を第１の流量制御システムおよび第２の流量制御システムと交換すれば、閉鎖系の細胞分離器具１００であるように構成できるであろう。このことは、ここに記載された細胞分離器具の全てに当てはまる。

図３Ａを参照すると、本開示の実施の形態にしたがって構成された細胞分離器具３００の正面図がある。この実施の形態において、細胞分離器具３００は、第１のポート３０６、第２のポート３０８、および空洞３１０を有する容器３０４を備える。その細胞分離器具３００は、その空洞３１０を第１の区画３１２と第２の区画３１４に分割するために空洞３１０内に配置された多孔質メッシュ３０２をさらに備える。その第１のポート３０６は空洞３１０の第１の区画３１２と連通している。さらに、その第１のポート３０６は多孔質メッシュ３０２の第一面３１６側に位置している。第２のポート３０８は空洞３１０の第２の区画３１４と連通している。さらに、その第２のポート３０８は多孔質メッシュ３０２の第二面３１８側に位置している。その上、第１のポート３０６は容器３０４の一方の端部３２０に位置しており、第２のポート３０８は容器３０４の反対の端部３２２に位置している。また、（１）第１のポート３０６が実質的に上向きに位置しており、第２のポート３０８が実質的に下向きに位置している場合（図３Ａに示されるように）、または（２）第１のポート３０６が実質的に下向きに位置し、第２のポート３０８が実質的に上向きに位置している場合、多孔質メッシュ３０２が空洞３１０内で傾斜した向きを有するように、第１のポート３０６および第２のポート３０８は容器３０４上で互いに一列に並んでいる。この例示の実施の形態において、細胞分離器具３００は、第１のポート３０６および第２のポート３０８を除いて、細胞分離器具３００の大部分を取り囲む筐体（図示せず）も有していて差し支えない（細胞分離器具３００に使用できるであろう例示の筐体１３０について、図１Ａを参照のこと）。使用される場合、その筐体は、細胞分離器具３００（可撓性容器３０４を有することがある）の回転を可能にし、一般に、細胞分離器具３００の取扱いに役立つ。

この例において、細胞分離器具３００は、バイオリアクター、真空ポンプなどの外部装置に直接的に接続されていないので、開放系細胞分離器具３００であるように構成されている。この構成において、細胞分離器具３００は、第１のポート３０６に取り付けられる第１のキャップ３２４を有する（すなわち、第１のキャップ３２４は、第１のポート３０６に締め付けたり、第１のポート３０６から取り外したりすることができる）。さらに、細胞分離器具３００は、第２のポート３０８に取り付けられる第２のキャップ３２６を有する（すなわち、第２のキャップ３２６は、第２のポート３０８に締め付けたり、第２のポート３０８から取り外したりすることができる）。

以下は、細胞分離器具３００をどのように使用して、マイクロキャリアから細胞を得ることができるかについての説明である。この例示のプロセス中、細胞の汚染を避けるために、細胞分離器具３００は、安全キャビネット内に置き、その中で操作すべきである。マイクロキャリアから細胞を得るために細胞分離器具３００を配置する位置が２つある。位置１において、細胞分離器具３００は、キャップ３２４／第１のポート３０６を上向きにし、キャップ３２６／第２のポート３０８を下向きにして、垂直の向きにある（図３Ｂ参照）。位置２において、細胞分離器具３００は、キャップ３２４／第１のポート３０６を右向きにし、キャップ３２６／第２のポート３０８を左向きにして、水平の向きにある（図３Ｃ参照）。以下の工程を行うことができる：
１）細胞分離器具３００が位置１にある状態で、キャップ３２４および３２６を取り外す。
２）細胞分離器具３００の第２のポート３０８を含む下端を空の廃液収集容器中に入れる。
３）培養容器からの細胞で覆われたマイクロキャリアおよび培地を細胞分離器具３００の第１のポート３０６に注ぎ入れる。培地は細胞分離器具３００内の多孔質メッシュ３０２を通り第２のポート３０８から廃液収集容器中に流れ込むが、細胞で覆われたマイクロキャリアは、細胞分離器具３００内の多孔質メッシュ３０２により保持される（保持されたマイクロキャリアは、画像において斜線の三角形３０３により示されている）。
４）廃液収集容器から細胞分離器具３００を持ち上げ、細胞分離器具３００を位置２（水平の向き）に置く。
５）多量の洗浄液（例えば、ＰＢＳ）を加え、細胞分離器具３００をわずかに左右に揺り動かすことにより、細胞で覆われたマイクロキャリアを洗浄する。
６）廃液収集容器上に細胞分離器具３００を保持し、細胞分離器具３００を位置１に保持することによって、ＰＢＳ洗浄液をそこから出す。所望であれば、洗浄工程４〜６を繰り返す。
７）細胞分離器具３００を位置２に置き、細胞分離器具３００の第１のポート３０６中に細胞解離試薬を加える。細胞をマイクロキャリアから解離させるのに必要なインキュベーション期間中、細胞分離器具３００を時折左右に穏やかに揺り動かす。
８）細胞がマイクロキャリアから解離した後、細胞収集容器上で細胞分離器具３００を位置１に置くことにより、細胞および解離試薬（例えば、トリプシン）を収集する。
９）細胞分離器具３００を位置２に置く。多量の細胞収集溶液（例えば、新たな培地）を細胞分離器具３００に加え、細胞分離器具３００を左右に穏やかに揺り動かして、残留する細胞をマイクロキャリアから洗い落とす。
１０）細胞分離器具３００を位置１に置くことによって、細胞収集容器内の細胞に細胞収集溶液を加える。マイクロキャリアは細胞分離器具３００内に残され、細胞は細胞収集容器中にある。

以下は、細胞分離器具３００をどのように使用して、細胞−スフェロイドから細胞を得ることができるかについての説明である。この例示のプロセス中、細胞の汚染を避けるために、細胞分離器具３００は、安全キャビネット内に置き、その中で操作すべきである。細胞−スフェロイドから細胞を取り去るために細胞分離器具３００を配置する位置が２つある。位置１において、細胞分離器具３００は、キャップ３２４／第１のポート３０６を上向きにし、キャップ３２６／第２のポート３０８を下向きにして、垂直の向きにある（図３Ｂ参照）。位置２において、細胞分離器具３００は、キャップ３２４／第１のポート３０６を右向きにし、キャップ３２６／第２のポート３０８を左向きにして、水平の向きにある（図３Ｃ参照）。以下の工程を行うことができる：
１）細胞分離器具３００が位置１にある状態で、キャップ３２４および３２６を取り外す。
２）細胞分離器具３００の第２のポート３０８を含む下端を空の廃液収集容器中に入れる。
３）培養容器からの細胞−スフェロイドおよび培地を細胞分離器具３００の第１のポート３０６に注ぎ入れる。培地は細胞分離器具３００の多孔質メッシュ３０２を通り第２のポート３０８から廃液収集容器中に流れ込むが、細胞−スフェロイドは、細胞分離器具３００内に保持される（保持されたスフェロイドは、画像において斜線の三角形３０３により示されている）。
４）廃液収集容器から細胞分離器具３００を持ち上げ、細胞分離器具３００を位置２（水平の向き）に置く。
５）多量の洗浄液（例えば、ＰＢＳ）を加え、細胞分離器具３００をわずかに左右に揺り動かすことにより、細胞−スフェロイドを洗浄する。
６）廃液収集容器上で細胞分離器具３００を位置１に保持し、ＰＢＳ洗浄液を細胞分離器具３００から出す。所望であれば、洗浄工程４〜６を繰り返す。
７）細胞分離器具３００を位置２に置き、第１のポート３０６を通して細胞分離器具３００中に細胞解離試薬（例えば、トリプシン）を加える。単細胞をスフェロイドから解離させるのに必要なインキュベーション期間中、細胞分離器具３００を時折左右に穏やかに揺り動かす。細胞分離器具３００をインキュベーター内に入れて、細胞をスフェロイドから完全に解離させる必要があることがある。そうであれば、細胞分離器具３００を安全キャビネットから移す前に、細胞分離器具３００に再びキャップをする。
８）細胞が単細胞懸濁液を形成した後、細胞収集容器上で細胞分離器具３００を、特に第２のポート３０８を位置１に置くことにより、細胞および解離試薬を収集する。細胞分離器具３００は、この工程後に細胞を持っていないはずである。

図４Ａを参照すると、本開示の実施の形態により構成された、細胞分離器具４００の正面図が示されている。図のように、細胞分離器具４００は、第１のポート４０６、第２のポート４０８、および空洞４１０を有する容器４０４を備える。細胞分離器具４００は、空洞４１０を第１の区画４１２と第２の区画４１４に分割するように空洞４１０内に配置された多孔質メッシュ４０２をさらに備える。第１のポート４０６は空洞４１０の第１の区画４１２と連通している。さらに、その第１のポート４０６は多孔質メッシュ４０２の第一面４１６側に位置している。第２のポート４０８は空洞４１０の第２の区画４１４と連通している。さらに、その第２のポート４０８は多孔質メッシュ４０２の第二面４１８側に位置している。その上、第１のポート４０６は容器４０４の一方の端部４２０に位置しており、第２のポート４０８は容器４０４の反対の端部４２２に位置している。また、（１）第１のポート４０６が実質的に上向きに位置しており、第２のポート４０８が実質的に下向きに位置している場合（図４Ａに示されるように）、または（２）第１のポート４０６が実質的に下向きに位置し、第２のポート４０８が実質的に上向きに位置している場合、多孔質メッシュ４０２が空洞４１０内で実質的に垂直の向きを有するように、第１のポート４０６および第２のポート４０８は容器４０４上で互いからずれている。この例示の実施の形態において、細胞分離器具４００は、第１のポート４０６および第２のポート４０８を除いて、細胞分離器具４００の大部分を取り囲む筐体（図示せず）も有していて差し支えない（細胞分離器具４００に使用できるであろう例示の筐体１３０について、図１Ａを参照のこと）。使用される場合、その筐体は、細胞分離器具４００（可撓性容器４０４を有することがある）の回転を可能にし、一般に、細胞分離器具４００の取扱いに役立つ。

この例において、細胞分離器具４００は、バイオリアクター、真空ポンプなどの外部装置に直接的に接続されていないので、開放系細胞分離器具４００であるように構成されている。この構成において、細胞分離器具４００は、第１のポート４０６に取り付けられる第１のキャップ４２４を有する（すなわち、第１のキャップ４２４は、第１のポート４０６に締め付けたり、第１のポート４０６から取り外したりすることができる）。さらに、細胞分離器具４００は、第２のポート４０８に取り付けられる第２のキャップ４２６を有する（すなわち、第２のキャップ４２６は、第２のポート４０８に締め付けたり、第２のポート４０８から取り外したりすることができる）。

以下は、細胞分離器具４００をどのように使用して、マイクロキャリアから細胞を得ることができるかについての説明である。この例示のプロセス中、細胞の汚染を避けるために、細胞分離器具４００は、安全キャビネット内に置き、その中で操作すべきである。マイクロキャリアから細胞を取り去るために細胞分離器具４００を配置する位置が２つある。位置１において、細胞分離器具４００は、キャップ４２４／第１のポート４０６を上向きにし、キャップ４２６／第２のポート４０８を下向きにして、垂直の向きにある（図４Ｂ参照）。位置２において、細胞分離器具４００は、キャップ４２４／第１のポート４０６を右向きにし、キャップ４２６／第２のポート４０８を左向きにして、水平の向きにある（図４Ｃ参照）。以下の工程を行うことができる：
１）細胞分離器具４００が位置１にある状態で、キャップ４２４および４２６を取り外す。
２）細胞分離器具４００の第２のポート４０８を含む下端を空の廃液収集容器中に入れる。
３）培養容器からの細胞で覆われたマイクロキャリアおよび培地を細胞分離器具４００の第１のポート４０６に注ぎ入れる。培地は細胞分離器具４００内の多孔質メッシュ４０２を通り第２のポート４０８から廃液収集容器中に流れ込むが、細胞で覆われたマイクロキャリアは、細胞分離器具４００内の多孔質メッシュ４０２により保持される（保持されたマイクロキャリアは、画像において斜線の三角形４０３により示されている）。
４）廃液収集容器から細胞分離器具４００を持ち上げ、細胞分離器具４００を位置２（水平の向き）に置く。
５）多量の洗浄液（例えば、ＰＢＳ）を加え、細胞分離器具４００をわずかに左右に揺り動かすことにより、細胞で覆われたマイクロキャリアを洗浄する。
６）廃液収集容器上に細胞分離器具４００を保持し、細胞分離器具４００を位置１に保持することによって、ＰＢＳ洗浄液をそこから出す。所望であれば、洗浄工程４〜６を繰り返す。
７）細胞分離器具４００を位置２に置き、細胞分離器具４００の第１のポート４０６中に細胞解離試薬（例えば、トリプシン）を加える。細胞をマイクロキャリアから解離させるのに必要なインキュベーション期間中、細胞分離器具４００を時折左右に穏やかに揺り動かす。
８）細胞がマイクロキャリアから解離した後、無菌容器上で細胞分離器具４００を位置１に置くことにより、細胞および細胞解離試薬を収集する。
９）細胞分離器具４００を位置２に置く。多量の細胞収集溶液（例えば、新たな培地）を細胞分離器具４００に加え、細胞分離器具４００を左右に穏やかに揺り動かして、残留する細胞をマイクロキャリアから洗い落とす。
１０）細胞分離器具４００を位置１に置くことによって、細胞収集容器内の細胞に細胞収集溶液を加える。マイクロキャリアは細胞分離器具４００内に残され、細胞は細胞収集容器中にある。

以下は、細胞分離器具４００をどのように使用して、細胞−スフェロイドから細胞を得ることができるかについての説明である。この例示のプロセス中、細胞の汚染を避けるために、細胞分離器具４００は、安全キャビネット内に置き、その中で操作すべきである。細胞−スフェロイドから細胞を取り去るために細胞分離器具４００を配置する位置が２つある。位置１において、細胞分離器具４００は、キャップ４２４／第１のポート４０６を上向きにし、キャップ４２６／第２のポート４０８を下向きにして、垂直の向きにある（図４Ｂ参照）。位置２において、細胞分離器具４００は、キャップ４２４／第１のポート４０６を右向きにし、キャップ４２６／第２のポート４０８を左向きにして、水平の向きにある（図４Ｃ参照）。以下の工程を行うことができる：
１）細胞分離器具４００が位置１にある状態で、キャップ４２４および４２６を取り外す。
２）細胞分離器具４００の第２のポート４０８を含む下端を空の廃液収集容器中に入れる。
３）培養容器からの細胞−スフェロイドおよび培地を細胞分離器具４００の第１のポート４０６に注ぎ入れる。培地は細胞分離器具４００の多孔質メッシュ４０２を通り第２のポート４０８から廃液収集容器中に流れ込むが、細胞−スフェロイドは、細胞分離器具４００内に保持される（保持されたスフェロイドは、画像において斜線の三角形４０３により示されている）。
４）廃液収集容器から細胞分離器具４００を持ち上げ、細胞分離器具４００を位置２（水平の向き）に置く。
５）多量の洗浄液（例えば、ＰＢＳ）を加え、細胞分離器具４００をわずかに左右に揺り動かすことにより、細胞−スフェロイドを洗浄する。
６）廃液収集容器上で細胞分離器具４００を位置１に保持し、ＰＢＳ洗浄液を細胞分離器具４００から出す。所望であれば、洗浄工程４〜６を繰り返す。
７）細胞分離器具４００を位置２に置き、第１のポート４０６を通して細胞分離器具４００中に細胞解離試薬（例えば、トリプシン）を加える。単細胞をスフェロイドから解離させるのに必要なインキュベーション期間中、細胞分離器具４００を時折左右に穏やかに揺り動かす。細胞分離器具４００をインキュベーター内に入れて、細胞をスフェロイドから完全に解離させる必要があることがある。そうであれば、細胞分離器具４００を安全キャビネットから移す前に、細胞分離器具４００に再びキャップをする。
８）細胞が単細胞懸濁液を形成した後、無菌細胞収集容器上で細胞分離器具４００を、特に第２のポート４０８を位置１に置くことにより、細胞および細胞解離試薬を収集する。細胞分離器具４００は、この工程後に細胞を持っていないはずである。

図５Ａを参照すると、本開示の実施の形態により構成された、細胞分離器具５００の正面図が示されている。図のように、細胞分離器具５００は、第１のポート５０６、第２のポート５０８、および空洞５１０を有する容器５０４を備える。細胞分離器具５００は、空洞５１０を第１の区画５１２と第２の区画５１４に分割するように空洞５１０内に配置された多孔質メッシュ５０２をさらに備える。第１のポート５０６は空洞５１０の第１の区画５１２と連通している。さらに、その第１のポート５０６は多孔質メッシュ５０２の第一面５１６側に位置している。第２のポート５０８は空洞５１０の第２の区画５１４と連通している。さらに、その第２のポート５０８は多孔質メッシュ５０２の第二面５１８側に位置している。その上、（１）第１のポート５０６および第２のポート５０８が実質的に上向きに位置している場合（図５Ａに示されるように）、または（２）第１のポート５０６および第２のポート５０８が実質的に下向きに位置している場合（図示せず）、多孔質メッシュ５０２が空洞５１０内で実質的に垂直の向きを有するように、第１のポート５０６および第２のポート５０８の両方とも容器５０４の一方の側５２０に位置している。この例示の実施の形態において、細胞分離器具５００は、第１のポート５０６および第２のポート５０８を除いて、細胞分離器具５００の大部分を取り囲む筐体（図示せず）も有していて差し支えない。使用される場合、その筐体は、細胞分離器具５００（可撓性容器５０４を有することがある）の回転を可能にし、一般に、細胞分離器具５００の取扱いに役立つ。

この例において、細胞分離器具５００は、バイオリアクター、真空ポンプなどの外部装置に直接的に接続されていないので、開放系細胞分離器具５００であるように構成されている。この構成において、細胞分離器具５００は、第１のポート５０６に取り付けられる第１のキャップ５２４を有する（すなわち、第１のキャップ５２４は、第１のポート５０６に締め付けたり、第１のポート５０６から取り外したりすることができる）。さらに、細胞分離器具５００は、第２のポート５０８に取り付けられる第２のキャップ５２６を有する（すなわち、第２のキャップ５２６は、第２のポート５０８に締め付けたり、第２のポート５０８から取り外したりすることができる）。

以下は、細胞分離器具５００をどのように使用して、マイクロキャリアから細胞を得ることができるかについての説明である。この例示のプロセス中、細胞の汚染を避けるために、細胞分離器具５００は、安全キャビネット内に置き、その中で操作すべきである。マイクロキャリアから細胞を取り去るために細胞分離器具５００を配置する位置が３つある。位置１において、細胞分離器具５００は、キャップ５２４／第１のポート５０６が左手にあり、他方のキャップ５２６／第２のポート５０８が直立状態にあるように位置付けられている（図５Ｂ参照）。位置２において、細胞分離器具５００のキャップ５２４と５２６／ポート５０６と５０８は、角度が付けられて直立状態にある（図５Ｃ参照）。位置３において、キャップ５２６／第２のポート５０８が右手にあり、他方のキャップ５２４／第１のポート５０６が直立状態にある（図５Ｄ参照）。以下の工程を行うことができる：
１）細胞分離器具５００が位置２にある状態で、キャップ５２４および５２６を取り外す。
２）培養容器からの細胞で覆われたマイクロキャリアおよび培地を細胞分離器具５００の第１のポート５０６に注ぎ入れる。
３）右手に廃液収集容器を配置し、細胞分離器具５００を位置３に傾けて、細胞分離器具５００の第２のポート５０８から廃液培地を廃液収集容器中に取り出して空にする。培地は細胞分離器具５００の多孔質メッシュ５０２を通り第２のポート５０８を通じて廃液収集容器中に流れ込むが、細胞で覆われたマイクロキャリアは、細胞分離器具５００内に保持される（保持された細胞で覆われたマイクロキャリアは、画像において斜線の三角形５０３により示されている）。
４）再び細胞分離器具５００を位置２に傾け、第１のポート５０６中に多量の洗浄液（例えば、ＰＢＳ）を加える。
５）細胞分離器具５００をわずかに左右に揺り動かすことにより、細胞で覆われたマイクロキャリアを洗浄する。
６）廃液収集容器上で細胞分離器具５００を位置３に保持し、細胞分離器具５００の第２のポート５０８からＰＢＳ洗浄液を排出する。所望であれば、洗浄工程４〜６を繰り返す。
７）細胞分離器具５００を位置１に置き、第１のポート５０６を通して細胞分離器具５００中に細胞解離試薬（例えば、トリプシン）を加える。細胞をマイクロキャリアから解離させるのに必要なインキュベーション期間中、細胞分離器具５００を時折左右に傾ける。細胞分離器具５００をインキュベーター内に入れて、細胞を完全に解離させる必要があることがある。そうであれば、細胞分離器具５００を安全キャビネットから移す前に、細胞分離器具５００に再びキャップをし、インキュベーション中にそれを位置１に配置する。
８）全ての細胞がマイクロキャリアから解離した後、無菌細胞収集容器上で細胞分離器具５００の第２のポート５０８を位置３に置くことにより、細胞および細胞解離試薬を収集する。
９）細胞分離器具５００を位置２に置く。多量の細胞収集溶液（例えば、新たな培地）を細胞分離器具５００に加え、細胞分離器具５００を左右に穏やかに揺り動かして、残留する細胞をマイクロキャリアから洗い落とす。
１０）細胞分離器具５００を位置３に置くことによって、無菌細胞収集容器内の細胞に細胞収集溶液を加える。マイクロキャリアは細胞分離器具５００内に残され、細胞は無菌細胞収集容器中にある。

以下は、細胞分離器具５００をどのように使用して、細胞−スフェロイドから細胞を得ることができるかについての説明である。この例示のプロセス中、細胞の汚染を避けるために、細胞分離器具５００は、安全キャビネット内に置き、その中で操作すべきである。細胞−スフェロイドから細胞を取り去るために細胞分離器具５００を配置する位置が３つある。位置１において、細胞分離器具５００は、キャップ５２４／第１のポート５０６が左手にあり、他方のキャップ５２６／第２のポート５０８が直立状態にあるように位置付けられている（図５Ｂ参照）。位置２において、細胞分離器具５００のキャップ５２４と５２６（ポート５０６と５０８）は、角度が付けられて直立状態にある（図５Ｃ参照）。位置３において、キャップ５２６／第２のポート５０８が右手にあり、他方のキャップ５２４／第１のポート５０６が直立状態にある（図５Ｄ参照）。以下の工程を行うことができる：
１）細胞分離器具５００が位置２にある状態で、キャップ５２４および５２６を取り外す。
２）培養容器からの細胞−スフェロイドおよび培地を細胞分離器具５００の第１のポート５０６に注ぎ入れる。
３）右手に廃液収集容器を配置し、細胞分離器具５００を位置３に傾けて、細胞分離器具５００の多孔質メッシュ５０２および第２のポート５０８を通過した廃液培地を廃液収集容器中に取り出して空にする。培地は細胞分離器具５００を通り廃液収集容器中に流れ込むが、細胞−スフェロイドは、細胞分離器具５００内に保持される（保持されたスフェロイドは、画像において斜線の三角形５０３により示されている）。
４）再び細胞分離器具５００を位置２に傾け、第１のポート５０６中に多量の洗浄液（例えば、ＰＢＳ）を加える。
５）細胞分離器具５００をわずかに左右に揺り動かすことにより、細胞−スフェロイドを洗浄する。
６）廃液収集容器上で細胞分離器具５００を位置３に保持し、第２のポート５０８を通じて細胞分離器具５００からＰＢＳ洗浄液を排出する。所望であれば、洗浄工程４〜６を繰り返す。
７）細胞分離器具５００を位置１に置き、細胞分離器具５００の第１のポート５０６に細胞解離試薬（例えば、トリプシン）を加える。単細胞をスフェロイドから解離させるのに必要なインキュベーション期間中、細胞分離器具５００を時折左右に傾ける。細胞分離器具５００をインキュベーター内に入れて、細胞を完全に解離させる必要があることがある。そうであれば、細胞分離器具５００を安全キャビネットから移す前に、細胞分離器具５００に再びキャップをし、それを位置１に配置する。
８）細胞が単細胞懸濁液を形成した後、無菌細胞収集容器上で細胞分離器具５００の第２のポート５０８を位置３に置くことにより、細胞および細胞解離試薬を収集する。細胞分離器具５００は、この工程後に細胞を持っていないはずである。

図６Ａを参照すると、本開示の実施の形態により構成された細胞分離器具６００の正面図が示されている。この実施の形態において、細胞分離器具６００は、第１のポート６０６、第２のポート６０８、および空洞６１０を有する容器６０４を備える。細胞分離器具６００は、空洞６１０を第１の区画６１２と第２の区画６１４に分割するために空洞６１０内に配置された多孔質メッシュ６０２をさらに備える。第１のポート６０６は空洞６１０の第１の区画６１２と連通している。さらに、その第１のポート６０６は多孔質メッシュ６０２の第一面６１６側に位置している。第２のポート６０８は空洞６１０の第２の区画６１４と連通している。さらに、その第２のポート６０８は多孔質メッシュ６０２の第二面６１８側に位置している。その上、第１のポート６０６は容器６０４の一方の端部６２０に位置しており、第２のポート６０８は容器６０４の反対の端部６２２に位置している。また、（１）第１のポート６０６が実質的に上向きに位置しており、第２のポート６０８が実質的に下向きに位置している場合（図６Ａに示されるように）、または（２）第１のポート６０６が実質的に下向きに位置し、第２のポート６０８が実質的に上向きに位置している場合、多孔質メッシュ６０２が空洞６１０内で傾斜した向きを有するように、第１のポート６０６および第２のポート６０８は容器６０４上で互いに一列に並んでいる。細胞分離器具６００は、細胞分離器具６００の取扱いに役立つように容器６０４に形成された開口６１１ａおよび６１１ｂを有する。この例示の実施の形態において、細胞分離器具６００は、第１のポート６０６および第２のポート６０８を除いて、細胞分離器具６００の大部分を取り囲む筐体（図示せず）も有していて差し支えない（細胞分離器具６００に使用できるであろう例示の筐体１３０について、図１Ａを参照のこと）。使用される場合、その筐体は、細胞分離器具６００（可撓性容器６０４を有することがある）の回転を可能にし、一般に、細胞分離器具６００の取扱いに役立つ。

この例において、細胞分離器具６００は、図６Ｂに関して次により詳しく論じられるように、バイオリアクター、真空ポンプなどの外部装置に直接接続できるので、閉鎖系細胞分離器具６００であるように構成されている。図示された例示の構成において、細胞分離器具６００は、第１のポート６０６に取り付けられる第１のキャップ６２４を有する（すなわち、第１のキャップ６２４は、第１のポート６０６に締め付けたり、第１のポート６０６から取り外したりすることができる）。さらに、細胞分離器具６００は、第２のポート６０８に取り付けられる第２のキャップ６２６を有する（すなわち、第２のキャップ６２６は、第２のポート６０８に締め付けたり、第２のポート６０８から取り外したりすることができる）。図示された例において、第１のキャップ６２４は、（１）それに接続されたクランプ６３６および別の端部に取り付けられたベント・フィルタ６４０を有する第１の管６３１および（２）それに接続されたクランプ６３８および例えば、図６Ｂに示されるように、外部装置に接続された別の端部を有する第２の管６３３を受け入れるように構成されている。同様に、第２のキャップ６２６は、（１）それに接続されたクランプ６４４および例えば、図６Ｂに示されるように外部装置に接続された別の端部を有する第１の管６３５、および（２）それに接続されたクランプ６４６および例えば、図６Ｂに示されるように外部装置に接続された別の端部を有する第２の管６３７を受け入れるように構成されている。

外部装置との閉鎖系細胞分離器具６００（筐体なし）の例示の統合が、図６Ｂに示されている。図６Ｂに示されるように、細胞分離器具６００は、管およびクランプの網目構造を介して、細胞解離試薬容器６７０、洗浄液容器６７２（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）容器６７２）、廃液容器６７４、細胞収集容器６７６、スピナーフラスコ６７８（液体中の細胞で覆われたマイクロキャリアを収容する）、および加圧ポンプ６８０に接続されている。細胞分離器具６００は、以下の工程を行うことによって、マイクロキャリアから細胞を得るために使用することができる：
１）細胞をスピナーフラスコ６７８内のマイクロキャリア上で増殖させ、下記に述べられているように、そのマイクロキャリアから解離させ、収集する必要がある。
２）加圧ポンプ６８０にある管クランプ６０１、並びにスピナーフラスコ６７８から細胞分離器具６００を通して廃液容器６７４までの管クランプ６０３、６４４、および６３８を開く。他のクランプは全て、閉じたまま、すなわち閉じられている。
３）加圧ポンプ６８０を作動させる。細胞、マイクロキャリア、および培地は、浸漬管６３９を上昇させられ、スピナーフラスコ６７８から細胞分離器具６００へと流れ、そこで、培地が廃液容器６７４へと流れている間、細胞分離器具６００のメッシュが、細胞で覆われたマイクロキャリアを止める。廃液容器６７４は、この時には開いており、管を通じてベント・フィルタ６１３に接続されているクランプ６１１を有することがある。
４）加圧ポンプ６８０を停止させ、スピナーフラスコ６７８に付随するベント・フィルタ６１７へのクランプ６１５を開き、また、ＰＢＳ容器６７２からスピナーフラスコ６７８への流体管路に沿った管クランプ６０３および６１９を開く。他のクランプは閉じている。ＰＢＳは、管を通って重力によりスピナーフラスコ６７８に流れ込む。
５）スピナーフラスコ６７８を旋回させて、どのような残留する細胞で覆われたマイクロキャリアも再懸濁させる。
６）ベント・フィルタ６１３および６１７のクランプ６１１、６１５を閉じ、スピナーフラスコ６７８から細胞分離器具６００への管路のためにクランプ６０３および６３８を開く。他のクランプは閉じている。
７）クランプ６０１を開き、加圧ポンプ６８０を作動させて、スピナーフラスコ６７８から細胞分離器具６００への流れを開始させる。ＰＢＳおよび細胞で覆われたマイクロキャリアは、スピナーフラスコ６７８から細胞分離器具６００へと流れる。
８）加圧ポンプ６８０を停止させ、細胞分離器具６００上のベント・フィルタ６４０へのクランプ６３６を開く。キャップ６２４および６２６が水平であるように細胞分離器具６００を位置付け、細胞分離器具６００を左右に傾けて、収集されたＰＢＳ中のマイクロキャリアを洗浄する。
９）廃液容器６７４へのクランプ６４４を開き、キャップ６２４が上であり、キャップ６２６が下であるように細胞分離器具６００を垂直に位置付け、ＰＢＳを廃液容器６７４へと排出させる（重力により）。
１０）クランプ６０３、６４４、および６１９を閉じ、細胞解離試薬容器６７０から細胞分離器具６００への管路にあるクランプ６２１および６３８を開く。細胞解離試薬は、重力によって細胞分離器具６００に流れ込む。ベントクランプ６３６を閉じる。
１１）キャップ６２４および６２６が水平であるような面に細胞分離器具６００を位置付ける。細胞がマイクロキャリアから解離できるように、細胞分離器具６００を穏やかに揺り動かす。
１２）キャップ６２４が上であり、キャップ６２６が下であるように細胞分離器具６００を垂直に向ける。ベント・フィルタ６２５へのクランプ６２３および細胞収集容器６７６へのクランプ６４６を開く。解離した細胞は、重力によって、細胞収集容器６７６に流れ、マイクロキャリアを細胞分離器具６００中に残す。

図７Ａを参照すると、本開示の実施の形態により構成された細胞分離器具７００の正面図が示されている。この実施の形態において、細胞分離器具７００は、第１のポート７０６、第２のポート７０８、および空洞７１０を有する容器７０４を備える。細胞分離器具７００は、空洞７１０を第１の区画７１２と第２の区画７１４に分割するために空洞７１０内に配置された多孔質メッシュ７０２をさらに備える。第１のポート７０６は空洞７１０の第１の区画７１２と連通している。さらに、その第１のポート７０６は多孔質メッシュ７０２の第一面７１６側に位置している。第２のポート７０８は空洞７１０の第２の区画７１４と連通している。さらに、その第２のポート７０８は多孔質メッシュ７０２の第二面７１８側に位置している。その上、第１のポート７０６は容器７０４の一方の端部７２０に位置しており、第２のポート７０８は容器７０４の反対の端部７２２に位置している。また、（１）第１のポート７０６が実質的に上向きに位置しており、第２のポート７０８が実質的に下向きに位置している場合（図７Ａに示されるように）、または（２）第１のポート７０６が実質的に下向きに位置し、第２のポート７０８が実質的に上向きに位置している場合、多孔質メッシュ７０２が空洞７１０内で傾斜した向きを有するように、第１のポート７０６および第２のポート７０８は容器７０４上で互いに一列に並んでいる。細胞分離器具７００は、細胞分離器具７００の取扱いに役立つように容器７０４に形成された開口７１１ａおよび７１１ｂを有する。この例示の実施の形態において、細胞分離器具７００は、第１のポート７０６および第２のポート７０８を除いて、細胞分離器具７００の大部分を取り囲む筐体（図示せず）も有していて差し支えない（細胞分離器具７００に使用できるであろう例示の筐体１３０について、図１Ａを参照のこと）。使用される場合、その筐体は、細胞分離器具７００（可撓性容器７０４を有することがある）の回転を可能にし、一般に、細胞分離器具７００の取扱いに役立つ。

この例において、細胞分離器具７００は、図７Ｂに関して次により詳しく論じられるように、バイオリアクター、真空ポンプなどの外部装置に直接接続できるので、閉鎖系細胞分離器具７００であるように構成されている。図示された例示の構成において、細胞分離器具７００は、第１のポート７０６に取り付けられる第１のキャップ７２４を有する（すなわち、第１のキャップ７２４は、第１のポート７０６に締め付けたり、第１のポート７０６から取り外したりすることができる）。さらに、細胞分離器具７００は、第２のポート７０８に取り付けられる第２のキャップ７２６を有する（すなわち、第２のキャップ７２６は、第２のポート７０８に締め付けたり、第２のポート７０８から取り外したりすることができる）。図示された例において、第１のキャップ７２４は、（１）それに接続されたクランプ７３６および別の端部に取り付けられたベント・フィルタ７４０を有する第１の管７３１および（２）それに接続されたクランプ７３８および例えば、図７Ｂに示されるように、外部装置に接続された別の端部を有する第２の管７３３を受け入れるように構成されている。同様に、第２のキャップ７２６は、（１）それに接続されたクランプ７４４および例えば、図７Ｂに示されるように外部装置に接続された別の端部を有する第１の管７３５、および（２）それに接続されたクランプ７４６および例えば、図７Ｂに示されるように外部装置に接続された別の端部を有する第２の管７３７を受け入れるように構成されている。

外部装置との閉鎖系細胞分離器具７００（筐体なし）の例示の統合が、図７Ｂに示されている。図７Ｂに示されるように、細胞分離器具７００は、管およびクランプの網目構造を介して、細胞解離試薬容器７７０、洗浄液容器７７２（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）容器７７２）、廃液容器７７４、細胞収集容器７７６、スピナーフラスコ７７８（液体中のスフェロイドを収容する）、および真空ポンプ７８０に接続されている。細胞分離器具７００は、以下の工程を行うことによって、スフェロイドから細胞を得るために使用することができる：
１）スピナーフラスコ７７８から細胞分離器具７００を通して廃液容器７７４までの流体管路にある管クランプ７０３、７０５、７３８および７４４を開く。他のクランプは全て、閉じている、すなわち閉じたままである。
２）クランプ７４６を開き、真空ポンプ７８０を作動させる。スフェロイドおよび培地は、浸漬管７３９に吸い上げられ、スピナーフラスコ７７８から細胞分離器具７００へと流れ、そこで、培地が廃液容器７７４へと流れている間、多孔質メッシュ７０２がスフェロイドを止める。廃液容器７７４は、この時には開いており、管を通じてベント・フィルタ７１３に接続されているクランプ７１１を有することがある。
３）真空ポンプ７８０を停止させ、次に、スピナーフラスコ７７８に付随するベント・フィルタ７１７へのクランプ７１５を開き、また、ＰＢＳ容器７７２からスピナーフラスコ７７８への流体管路に沿った管クランプ７０３および７１９を開く。他のクランプは閉じている。ＰＢＳは、管を通って重力によりスピナーフラスコ７７８に流れ込む。
４）スピナーフラスコ７７８を旋回させて、どのような残留するスフェロイドも再懸濁させる。
５）ベント・フィルタ７１３および７１７のクランプ７１１、７１５を閉じ、スピナーフラスコ７７８から細胞分離器具７００への管路のためにクランプ７０３および７３８を開く。他のクランプは閉じている。
６）クランプ７４６を開き、真空ポンプ７８０を作動させて、スピナーフラスコ７７８から細胞分離器具７００への流れを開始させる。ＰＢＳおよびスフェロイドは、スピナーフラスコ７７８から細胞分離器具７００へと流れる。
７）真空ポンプ７８０を停止させ、細胞分離器具７００上のベント・フィルタ７４０へのクランプ７３６を開く。キャップ７２４および７２６が水平であるように細胞分離器具７００を位置付け、細胞分離器具７００を左右に傾けて、収集されたＰＢＳ中のマイクロキャリアを洗浄する。
８）廃液容器７７４へのクランプ７０５および７４４を開き、キャップ７２４が上であり、キャップ７２６が下であるように細胞分離器具７００を垂直に位置付け、ＰＢＳを廃液容器７７４へと排出させる（重力により）。
９）クランプ７０３、７０５、７１９および７４４を閉じ、細胞解離試薬容器７７０から細胞分離器具７００への管路にあるクランプ７２１および７３８を開く。細胞解離試薬は、重力によって細胞分離器具７００に流れ込む。ベントクランプ７３６を閉じる。
１０）キャップ７２４および７２６が水平であるような面に細胞分離器具７００を位置付ける。細胞がスフェロイドから解離できるように、細胞分離器具７００を穏やかに揺り動かす。
１１）キャップ７２４が上であり、キャップ７２６が下であるように細胞分離器具７００を垂直に向ける。ベント・フィルタ７２５へのクランプ７２３および細胞収集容器７７６へのクランプ７２７を開く。解離した細胞は、重力によって、細胞分離器具７００から細胞収集容器７７６に流れる。

図６Ａ〜６Ｂおよび７Ａ〜７Ｂに関する説明に鑑みて、細胞を培養するために使用される容器、およびその系全体で流体を動かすために加圧または真空が好ましい方法であるか否かに応じて、「閉鎖系」細胞分離器具６００および７００に使用できる方法がいくつかあることを認識すべきである。上述した細胞分離器具１００、２００、３００、４００、５００、６００および７００、またはその同等物のいずれも、液体中のマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を分離するために「開放」系（例えば、図３Ｂ〜３Ｃ、４Ｂ〜４Ｃおよび５Ｂ〜５Ｄを参照のこと）または「閉鎖」系（例えば、図２Ｃ〜２Ｄ、６Ｂおよび７Ｂを参照のこと）のいずれかに使用するために構成できることも認識すべきである。上述した細胞分離器具１００、２００、３００、４００、５００、６００および７００、またはその同等物のいずれも、図８に関して下記に述べられるように、液体から細胞を分離するために使用できることも認識すべきである。

図８を参照すると、細胞分離器具１００、２００、３００、４００、５００、６００および７００を使用して、液体（例えば、細胞培養培地、緩衝食塩水）中のマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を分離する方法８００が示されている。工程８０２で、細胞分離器具１００、２００、３００、４００、５００、６００および７００を提供する。工程８０４で、細胞分離器具１００、２００、３００、４００、５００、６００および７００の空洞１１０、２１０、３１０、４１０、５１０、６１０および７１０の第１の区画１１２、２１２、３１２、４１２、５１２、６１２および７１２中に第１のポート１０６、２０６、３０６、４０６、５０６、６０６および７０６を通じて液体（マイクロキャリアまたはスフェロイドを含む）を導入する。工程８０６で、細胞分離器具１００、２００、３００、４００、５００、６００および７００の第２のポート１０８、２０８、３０８、４０８、５０８、６０８および７０８から、傾斜したまたは垂直な多孔質メッシュ１０２、２０２、３０２、４０２、５０２、６０２および７０２を通過した液体を排出する。工程８０６の後、マイクロキャリアまたはスフェロイドは、垂直なまたは傾斜した多孔質メッシュ１０２、２０２、３０２、４０２、５０２、６０２および７０２のために、細胞分離器具１００、２００、３００、４００、５００、６００および７００内に残っている。工程８０８で、垂直なまたは傾斜した多孔質メッシュ１０２、２０２、３０２、４０２、５０２、６０２および７０２を通過して、第２のポート１０８、２０８、３０８、４０８、５０８、６０８および７０８から出なかったマイクロキャリアまたはスフェロイドを処理して（例えば、洗浄工程および細胞塊離工程）、マイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を放出させる。工程８１０で、細胞分離器具１００、２００、３００、４００、５００、６００および７００の第２のポート１０８、２０８、３０８、４０８、５０８、６０８および７０８から細胞を排出させる。新たな細胞分離器具１００、２００、３００、４００、５００、６００および７００が使用される場合、マイクロキャリアまたはスフェロイドは、従来の細胞分離器具の水平の多孔質メッシュにおけるように、重力により垂直なまたは傾斜した多孔質メッシュ１０２、２０２、３０２、４０２、５０２、６０２および７０２内の細孔の大半をもはや塞がないので、垂直なまたは傾斜した多孔質メッシュ１０２、２０２、３０２、４０２、５０２、６０２および７０２を通る液体の流れは、従来の細胞分離器具におけるようには、もはや容易には塞がれないという点で、細胞分離器具１００、２００、３００、４００、５００、６００および７００は、垂直なまたは傾斜した多孔質メッシュ１０２、２０２、３０２、４０２、５０２、６０２および７０２を有することによって、従来の細胞分離器具を上回って著しく改善されている。

以下は、試作の「開放系」細胞分離器具３００、４００および５００（図３Ａ、４Ａおよび５Ａ参照）および試作の「閉鎖系」細胞分離器具６００（図６Ａ〜６Ｂ参照）を使用して行った収穫実験についての議論である。以下の議論において、マイクロキャリアという用語はＭＣと省略され、ミリリットルはｍＬと省略され、遠心分離管はＣＴと省略されている。全ての実験は、安全キャビネット内で行った。細胞は、マイクロキャリアの全表面積の平方センチメートル当たり５０，０００細胞の初期密度で播種した。マイクロキャリアをＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｓｐｉｎｎｅｒ Ｆｌａｓｋ内で培養した。対照方法（細胞分離器具を使用しない）、および試作の「開放系」細胞分離器具３００、４００および５００の全てに関する収穫を評価するために１つのスピナーフラスコを使用した。培地中のマイクロキャリアをよく混合し、次いで、各細胞分離器具３００、４００および５００の各々に使用するために、個々の遠心分離管中に計り取った。試作の「閉鎖系」細胞分離器具６００に関する収穫を行うために、別のスピナーフラスコ培養を使用した。収穫する方法は、対照について、および試験した試作の細胞分離器具３００、４００、５００および６００の各々について、下記に記載されている。

対照：対照の収穫には、分離器具を使用しない標準方法を利用した。工程１）５０ｍＬの培地中のＭＣをＣＴに加え、５分間に亘り静置して、ＭＣを沈降させた。工程２）培地をＭＣから吸引して除いた。ＣＴに１０ｍＬのＰＢＳ（洗浄液）を加え、ＭＣを再懸濁させ、次いで、沈降させた。工程３）沈降したＭＣからＰＢＳを吸引して除き、次いで、工程２に述べたように、もう一度ＰＢＳ洗浄を行った。工程４）沈降したＭＣからＰＢＳを吸引して除き、５ｍＬのトリプシン（細胞解離試薬）を加え、ＭＣを再懸濁させ、次いで、５分間に亘りインキュベーションした。沈降したＭＣからトリプシン／細胞溶液を吸引して除き、無菌ＣＴ内に入れた。工程５）工程２に述べたように、各回で５ｍＬを使用して、さらに２回、ＰＢＳ洗浄を行ったが、先に吸引した細胞とトリプシンを収容するＣＴに、吸引したＰＢＳと細胞を加えた。工程６）トリプシンを不活性化させるために、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む培地を使用して、ＭＣの最後の洗浄を行った。これを細胞溶液試験管に加えて、２０ｍＬの総容積にした。ＭＣからの細胞分離を行うのに要した総時間は、約４０分であった。細胞を沈降させる代わりに、各操作後に、ＣＴを遠心分離しても差し支えないが、それにより、分離を行うための総時間は減少しなかったであろう。

試作の細胞分離器具３００：工程１）キャップ３２４および３２６を細胞分離器具３００から取り外し、第２のポート３０８（位置１−図３Ｂ）を空の遠心分離管（廃液ＣＴ）に入れた。ストリペット(stripette)を使用して、ＭＣ含有遠心分離管から２５ｍＬのＭＣおよび培地を吸引した。この体積を第１のポート３０６を通じて、傾斜した多孔質メッシュ３０２が側壁に接触する、細胞分離器具３００の角に分配した。培地は、細胞分離器具３００を通って、それが配置された廃液ＣＴ中に流れ込み、ＭＣを、それらが置かれた多孔質メッシュ３０２の隣の細胞分離器具３００の角に残した。工程２）細胞分離器具３００を廃液ＣＴから持ち上げ、ＭＣを収容する細胞分離器具３００がその面上で静止する（位置２−図３Ｃ）ように卓上に置いた。第１のポート３０６を通じて１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、ＭＣをＰＢＳ中に再懸濁させて、洗浄した。細胞分離器具３００を廃液ＣＴ上で直立状態に（位置１）保持し、ＰＢＳを、多孔質メッシュ３０２を通して廃液ＣＴ中に流し込ませ、ＭＣを残した。洗浄を繰り返した（工程２を繰り返す）。工程３）細胞分離器具３００を再び、卓上にその面で置いた（位置２）。５ｍＬのトリプシンを加え、ＭＣを再懸濁させた。ＭＣを有する細胞分離器具３００を放置して、ＭＣを再懸濁させるために定期的に撹拌しながら、５分間に亘りトリプシン中でインキュベーションさせた。５分間のインキュベーション後、第２のポート３０８を新たなＣＴ中に置き、細胞分離器具３００を直立（位置１）させることによって、トリプシンおよび細胞を多孔質メッシュ３０２に通して流した。工程４）その流体および細胞を細胞分離器具３００からＣＴ中に排出させた後、細胞分離器具３００を持ち上げ、ＭＣを有する側に置いた（位置２）。５ｍＬのＰＢＳを加え、ＭＣを洗浄した。細胞を含有するＣＴにＰＢＳを加えた。５ｍＬのＰＢＳを使用し、次いで、トリプシンを不活性化させるためにウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する５ｍＬの培地を使用して、洗浄を繰り返した。これらの体積を両方とも、細胞含有ＣＴに加えた（全細胞体積＝２０ｍＬ）。あるいは、トリプシンの代わりに、不活性化させる必要のない試薬（ＴｒｙｐＬＥ（商標）など）を使用して、ＭＣから細胞を取り去って、ＦＢＳ含有培地の必要性をなくしても差し支えない。分離を行うのに要した総時間は約１２分であった。

試作の細胞分離器具４００：工程１）キャップ４２４および４２６を細胞分離器具４００から取り外した。細胞分離器具４００をその面で卓上に置いた（位置２−図４Ｃ）。流体が２つの区画４１２と４１４の間に位置する多孔質メッシュ４０２を通って自由に移動するように、細胞分離器具４００を位置１（図４Ｂ）に傾けながら、ストリペットを使用して、２５ｍＬの培地中のＭＣを、第１のポート４０６を通じて細胞分離器具４００に入れた。培地を第２のポート４０８を通じて廃液容器へと吸引した。工程２）細胞分離器具４００を位置１にした状態で、第１のポート４０６を通じて１０ｍＬのＰＢＳを加え、細胞分離器具４００を左右に傾けて流体を動かして、ＭＣを洗浄し、次いで、位置２に傾けて、流体を多孔質メッシュ４０２に通して次の区画４１４に排出させた。流体を第２のポート４０８を通じて廃液容器へと吸引した。この洗浄を繰り返した。工程３）細胞分離器具４００を位置１にした状態で、第１のポート４０６を通じて５ｍＬのトリプシンを加え、ＭＣを再懸濁させた。ＭＣを再懸濁させるために定期的に撹拌しながら、ＭＣを５分間に亘りトリプシン中でインキュベーションするように放置した。５分間のインキュベーション後、細胞分離器具４００を傾け、トリプシンと細胞を、多孔質メッシュ４０２を通して次の区画４１４に流し込ませ、そこで、それらを、第２のポート４０８を通じた吸引により収集した。この細胞と流体を無菌ＣＴに入れた。工程４）５ｍＬのＰＢＳを、位置１にある細胞分離器具４００に加え、その器具を左右に傾けることによって、ＭＣを洗浄した。細胞分離器具４００を位置２に傾け、ＰＢＳと細胞を、多孔質メッシュを通して次の区画４１４に流れ込ませ、そこで、それらを、第２のポート４０８を通じた吸引により収集した。ＰＢＳと細胞を細胞含有ＣＴに加えた。５ｍＬのＰＢＳを使用し、次いで、トリプシンを不活性化させるためにウシ胎児血清を含有する５ｍＬの培地を使用して、先に述べたように洗浄を繰り返した。これらの体積を両方とも、細胞含有ＣＴに加えた（全細胞体積＝２０ｍＬ）。分離を行うのに要した総時間は約１２分であった。

試作の細胞分離器具５００：工程１）キャップ５２４および５２６を、位置２（図５Ｃ）にある細胞分離器具５００から取り外し、ストリペットを使用して、２５ｍＬの培地中のＭＣを、第１のポート５０６を通じて細胞分離器具５００に入れた。流体が多孔質メッシュ５０２を通り第２の区画５１４に移動するように、細胞分離器具５００を位置３（図５Ｄ）に傾け、そこで、吸引して第２のポート５０８を通して廃棄することができる。工程２）追加の２５ｍＬの培地中のＭＣを、細胞分離器具５００が位置２にある状態で、第１のポート５０６を通じて加え、次いで、流体を吸引して、第２のポート５０８を通して廃棄できるように、位置３に傾けた。工程３）細胞分離器具５００を位置２にした状態で、１０ｍＬのＰＢＳを、第１のポート５０６を通じて加え、細胞分離器具５００を左右に傾けて、流体を動かして、ＭＣを洗浄し、次いで、位置３に傾けて、流体を多孔質メッシュ５０２に通して、次の区画５１４へと吸引した。流体を第２のポート５０８を通じて、廃液容器へと吸引した。この洗浄を繰り返した。工程４）細胞分離器具５００が位置２にある状態で、５ｍＬのトリプシンを加えて、ＭＣを再懸濁させ、次いで、ＭＣを再懸濁させるために度々撹拌しながら、位置１において５分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞分離器具５００を位置３に傾け、細胞と流体を、第２のポート５０８から吸引し、無菌ＣＴに入れた。工程５）工程３に述べたように、３回のＭＣ洗浄を行った；２回は、５ｍＬのＰＢＳを使用し、次いで、ＦＢＳを含有する５ｍＬの培地で１回。全ての洗浄液と細胞を同じＣＴに収集した（全細胞体積＝２０ｍＬ）。分離を行うのに要した総時間は約１５分であった。

試作の細胞分離器具４００（この実験は、試作の細胞分離器具４００を使用した先の実験とは異なる）：工程１）キャップ４２４および４２６を細胞分離器具４００から取り外した。細胞分離器具４００をその面で卓上に置いた（位置２−図４Ｃ）。ストリペットを使用して、２５ｍＬの培地中のＭＣを、第１のポートを通じて細胞分離器具４００の上部区画４１２に入れた。注射器を第２のポート４０８に適用するときに真空が生じるように、これによりエアロックを作り出し、よって、流体は、２つの区画４１２と４１４の間に位置する多孔質メッシュ４０２を通り、下側区画４１４中に自由に移動した。培地を第２のポート４０８を通じて廃液容器へと吸引した。工程２）細胞分離器具４００を位置１（図４Ｂ）にした状態で、第１のポート４０６を通じて１０ｍＬのＰＢＳを加え、細胞分離器具４００を左右に傾けて流体を動かして、ＭＣを洗浄し、次いで、位置２に傾けて、流体を多孔質メッシュ４０２に通して次の区画４１４に排出させた。流体を第２のポート４０８を通じて廃液容器へと吸引した。この洗浄を繰り返した。工程３）細胞分離器具４００を位置１にした状態で、第１のポート４０６を通じて５ｍＬのトリプシンを加え、ＭＣを再懸濁させた。ＭＣを再懸濁させるために定期的に撹拌しながら、ＭＣを５分間に亘りトリプシン中でインキュベーションするように放置した。５分間のインキュベーション後、細胞分離器具４００を傾け、トリプシンと細胞を、多孔質メッシュ４０２を通して次の区画４１４に流し込ませ、そこで、それらを、第２のポート４０８を通じた吸引により収集した。この細胞と流体を無菌ＣＴに入れた。工程４）５ｍＬのＰＢＳを、位置１にある細胞分離器具４００に加え、細胞分離器具４００を左右に傾けることによって、ＭＣを洗浄した。細胞分離器具４００を位置２に傾け、ＰＢＳと細胞を、多孔質メッシュ４０２を通して次の区画４１４に流れ込ませ、そこで、それらを、第２のポート４０８を通じた吸引により収集した。ＰＢＳと細胞を細胞含有ＣＴに加えた。５ｍＬのＰＢＳを使用し、次いで、トリプシンを不活性化させるためにウシ胎児血清を含有する５ｍＬの培地を使用して、先に述べたように洗浄を繰り返した。これらの体積を両方とも、細胞含有ＣＴに加えた（全細胞体積＝２０ｍＬ）。分離を行うのに要した総時間は、形成したエアロックのために、約１３分であった。

試作の閉鎖系細胞分離器具６００：工程１）細胞分離器具６００を位置１（図６Ｂに示されるような直立）にした状態で、クランプを開いて、スピナーフラスコ６７８から細胞分離器具６００を通して廃液容器６７４へと流体を流した。他のクランプは閉じたままであった。ＭＣと培地を、加圧によって、浸漬管に上昇させて、その系を通して細胞分離器具６００の多孔質メッシュ６０２に流した。多孔質メッシュ６０２はＭＣを留まらせ、一方で、培地を廃液容器６７４へと流れた。工程２）ベントからクランプを外し、ＰＢＳ容器６７２からスピナーフラスコ６７８への流体管路も同様にした。他のクランプを閉じた。ＰＢＳは、浸漬管を通じて、重力によりスピナーフラスコ６７８中に流れた。スピナーフラスコ６７８を旋回させて、残留するＭＣを再懸濁させた。クランプは、ベントのものを閉じ、スピナーフラスコ６７８から細胞分離器具６００（今では、横向きの位置にある）への管路のものを開いた。再び加圧を開始して、ＰＢＳ／ＭＣをスピナーフラスコ６７８から細胞分離器具６００に押し出した。ＰＢＳとＭＣが細胞分離器具６００に進んだので、圧力をオフにした。ベントのクランプを開いた。細胞分離器具６００を左右に傾けて、収集したＰＢＳ中のＭＣを洗浄した。工程２を繰り返して、ＭＣの全てを捕捉し、濯いだ。細胞分離器具６００を位置１（図６Ｂに示されるような直立）に動かし、細胞分離器具６００から廃液容器６７４へのクランプを開いた。細胞分離器具６００中のＰＢＳは廃液容器６７４に送った。工程３）細胞分離器具６００を位置２（横向き）に置いた。ベントのクランプを開き、「ＴｒｙｐＬＥ」容器６７０から細胞分離器具６００への流体管路を同様に開いた。他のクランプは閉じた。「ＴｒｙｐＬＥ」は重力により細胞分離器具６００に流れ込んだ。細胞分離器具６００を左右に傾けて、「ＴｒｙｐＬＥ」中にＭＣを再懸濁させ、次いで、時折撹拌しながら、５分間に亘りインキュベーションするように放置した。細胞分離器具６００から細胞収集容器６７６への流体管路を開き、細胞分離器具６００を位置１（図６Ｂに示されるような直立）に置き、細胞と「ＴｒｙｐＬＥ」を細胞収集容器６７６中に流れ込ませた。工程４）細胞分離器具６００を位置２（横向き）に置いた。ベントのクランプは開いたままであり、ＰＢＳ容器６７２から細胞分離器具６００への流体管路を同様に開いたままにした。他のクランプは閉じた。ＰＢＳは重力により細胞分離器具６００に流れ込んだ。ＭＣをＰＢＳ中に再懸濁させ、洗浄した。細胞分離器具６００から細胞収集容器６７６への流体管路を開き、細胞分離器具６００を位置１に置き、細胞とＰＢＳを細胞収集容器６７６中に流れ込ませた。この工程を繰り返して、２００ｍＬの全細胞体積にした。分離を行うのに要した総時間は約２０分であった。

実験の結果：対照並びに試作の分離器具３００、４００、５００および６００の各々から得た０．２ｍＬの細胞懸濁液をＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）カセットに装填して、ｍＬ当たりの収集細胞数、細胞生存率、および塊（細胞の群）で残留する細胞％を決定した。対照並びに試作の分離器具３００、４００、５００および６００の各々からの結果が、下記の表１に与えられている。

注釈：これらの実験において、試作の細胞分離器具３００、４００、５００および６００の各々は、最初に培地からマイクロキャリアを分離し、次いで、マイクロキャリアから細胞を分離するために使用される手法において、わずかな変更が必要であった。スフェロイドはマイクロキャリアのサイズと同程度であるので、培地からスフェロイドを分離し、次いで、スフェロイドを単細胞に縮小させるための結果は、マイクロキャリアと同様の様式で行われるであろうことも想定される。

結論：全ての細胞生存率は非常に良好であった。開放系細胞分離器具３００および５００が、取扱いが最も容易であり、これらの分離器具で最多数の細胞が収穫されたので、流体貯留が最低であるようであった。細胞分離器具３００は実際に、対照よりも多い数の細胞を収穫した。対照プロトコル後の各吸引工程中にＭＣの損失があり得るので、このことが可能である。細胞を収穫するのに要する時間が、対照と、試験した分離器具３００、４００、５００および６００との間で最大の違いであった。閉鎖系細胞分離器具６００に関連する系を流体が自動的に流れるのを妨げるエアロックが時折あったが、これは、ベントを閉じ、瞬時に加圧を行うことによって克服した。閉鎖系細胞分離器具６００に関連する系は、加圧の代わりに流体を系に引き込むために真空を使用するように構成することもできる（図７Ｂ参照）。メッシュを中間に有する並んだ区画など、分離器具にとって有用であろう設計が、潜在的に他にもある。

先に鑑みて、容器内のマイクロキャリアまたはスフェロイドを捕捉するために垂直のまたは傾斜した多孔質メッシュであって、マイクロキャリアから細胞を取り出すか、またはスフェロイドを単細胞懸濁液に転化させるかのために、容易に洗浄し、処理できる多孔質メッシュを使用する細胞分離器具が開示されている。その器具は、開放系または閉鎖系として製造できる。その器具は、注ぐ、重力、灌流、真空または供給源容器の加圧によって、充填できる。その器具は、灌流式バイオリアクターシステムに容易に組み込まれるように構造化することができる。その器具内の多孔質メッシュの傾斜したまたは垂直な配置により、マイクロキャリアまたはスフェロイドが、メッシュの細孔を塞ぐのを防いで、流体の流れおよび細胞分離を向上させる。その器具の設計により、マイクロキャリアまたはスフェロイドがメッシュから離れ、それでも器具内に維持できるように、液体（例えば、細胞培養培地、緩衝食塩水）が傾斜したまたは垂直なメッシュを越えて流れることができる。その器具は、内蔵式であり、マイクロキャリアまたはスフェロイドを多孔質メッシュの片側に隔離した後、器具を逆にして、さらに別の操作が可能になる。細胞は、その器具内で洗浄され、マイクロキャリアから放出され、次いで、それらを器具から出るように灌流することによって収集することができる。その器具内のスフェロイドから単細胞懸濁液を作り出すことができ、次いで、その細胞を器具内に保持するか、そこから放出することができる。その器具は、内蔵式であり、潜在的に、投与の部位に治療のための細胞を輸送するために使用できる。その器具は、必要に応じて、多くの形状が可能であり、サイズを拡大・縮小することができる。その器具は、剛性容器であっても、可撓性容器であってもよい。その器具は、安定化のために外側筐体を有してもよく、または必要に応じて、外側筐体がなく製造することもできる。その器具は、プラスチック材料または他の種類の材料から器具を形成し、組み立てる従来の方法の全てを使用して製造できる。所望の属性を向上させるために、その器具に被覆しても、処理してもよい。多孔質メッシュまたは膜は、高分子、金属またはガラスもしくはその複合体から製造することができ、その細孔径は、例えば、約１２から２００マイクロメートルに及び得る。

本開示の態様（１）によれば、液体中のマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を分離するように構成された細胞分離器具が提供される。その細胞分離器具は、第１のポート、第２のポート、および空洞を有する容器；および、その空洞を第１の区画と第２の区画に分割するために空洞内に配置された多孔質メッシュを備え、その第１のポートは空洞の第１の区画と連通しており、その第１のポートは多孔質メッシュの第一面側に位置しており、第２のポートは空洞の第２の区画と連通しており、その第２のポートは多孔質メッシュの第二面側に位置しており、その多孔質メッシュは、多孔質メッシュを通る液体の流れに対して実質的に垂直な向きまたは傾斜した向きを有するように空洞内に配置されている。

本開示の別の態様（２）によれば、第１のポートが容器の一方の端部に位置し、第２のポートが容器の反対の端部に位置している、態様（１）の細胞分離器具が提供される。

本開示の別の態様（３）によれば、（１）第１のポートが実質的に上向きに位置しており、第２のポートが実質的に下向きに位置している場合、または（２）第１のポートが実質的に下向きに位置し、第２のポートが実質的に上向きに位置している場合、多孔質メッシュが空洞内で実質的に垂直の向きを有するように、第１のポートおよび第２のポートが容器上で互いからずれている、態様（２）の細胞分離器具が提供される。

本開示の別の態様（４）によれば、（１）第１のポートが実質的に上向きに位置しており、第２のポートが実質的に下向きに位置している場合、または（２）第１のポートが実質的に下向きに位置し、第２のポートが実質的に上向きに位置している場合、多孔質メッシュが空洞内で傾斜した向きを有するように、第１のポートおよび第２のポートが容器上で互いに一列に並んでいる、態様（２）の細胞分離器具が提供される。

本開示の別の態様（５）によれば、第１のポートおよび第２のポートの両方とも容器の片側に位置しており、（１）第１のポートおよび第２のポートが実質的に上向きに位置している場合、または（２）第１のポートおよび第２のポートが実質的に下向きに位置している場合、多孔質メッシュが容器内で実質的に垂直向きを有する、態様（１）の細胞分離器具が提供される。

本開示の別の態様（６）によれば、第１のポートに取り付けられる第１のキャップ、および第２のポートに取り付けられる第２のキャップをさらに備える、態様（１）〜（５）のいずれかの細胞分離器具が提供される。

本開示の別の態様（７）によれば、第１のポートと外部装置に取り付けられた第１の流量制御システム、および第２のポートと外部装置に取り付けられた第２の流量制御システムをさらに備える、態様（１）〜（６）のいずれかの細胞分離器具が提供される。

本開示の別の態様（８）によれば、多孔質メッシュが、約１２マイクロメートルから約２００マイクロメートルに及ぶサイズを有する細孔を中に有する、態様（１）〜（７）のいずれかの細胞分離器具が提供される。

本開示の別の態様（９）によれば、容器の少なくとも一部を取り囲む外側筐体をさらに備える、態様（１）〜（８）のいずれかの細胞分離器具が提供される。

本開示の別の態様（１０）によれば、容器に連結されたリング・スタンドであって、容器の動きと回転を容易にするように構成されたリング・スタンドをさらに備える、態様（１）〜（９）のいずれかの細胞分離器具が提供される。

本開示の別の態様（１１）によれば、液体中のマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を分離する方法が提供される。その方法は、細胞分離器具の容器の第１のポートを通じて液体を導入する工程であって、その容器は第２のポートおよび空洞をさらに有し、多孔質メッシュが、その多孔質メッシュを通る液体の流れに対して実質的に垂直なまたは傾斜した向きを有し、その空洞を第１の区画と第２の区画に分割するようにその空洞内に配置され、第１のポートが多孔質メッシュの第一面側に位置しており、第１のポートは空洞の第１の区画と連通しており、第２のポートは空洞の第２の区画と連通している工程；多孔質メッシュを通過する液体を第２のポートから排出する工程；多孔質メッシュを通過しないマイクロキャリアまたはスフェロイドを処理して、そのマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を放出する工程；およびその細胞を第２のポートから排出させる工程を有してなる。

本開示の別の態様（１２）によれば、マイクロキャリアまたはスフェロイドを処理する工程が、マイクロキャリアまたはスフェロイドを洗浄し、次いで、そのマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を解離させる各工程をさらに含む、態様（１１）の方法が提供される。

本開示の別の態様（１３）によれば、マイクロキャリアまたはスフェロイドを洗浄する工程が、洗浄液を空洞に加え、容器を動かし、洗浄液を第２のポートから排出する各工程を含む、態様（１２）の方法が提供される。

本開示の別の態様（１４）によれば、マイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を解離させる工程が、細胞解離試薬を空洞に加え、容器を動かす各工程を含み、細胞を第２のポートから排出する工程が、細胞解離試薬を第２のポートから排出する工程をさらに含む、態様（１２）の方法が提供される。

本開示の別の態様（１５）によれば、分離器具は、外部装置に直接的に接続されていない開放系細胞分離器具である、態様（１１）〜（１４）のいずれかの方法が提供される。

本開示の別の態様（１６）によれば、分離器具が、外部装置に直接接続された閉鎖系細胞分離器具である、態様（１１）〜（１４）のいずれかの方法が提供される。

本開示の別の態様（１７）によれば、第１のポートが容器の一方の端部に位置しており、第２のポートが容器の反対の端部に位置している、態様（１１）〜（１６）のいずれかの方法が提供される。

本開示の別の態様（１８）によれば、（１）第１のポートが実質的に上向きに位置しており、第２のポートが実質的に下向きに位置している場合、または（２）第１のポートが実質的に下向きに位置し、第２のポートが実質的に上向きに位置している場合、多孔質メッシュが空洞内で実質的に垂直の向きを有するように、第１のポートおよび第２のポートが容器上で互いからずれている、態様（１７）の方法が提供される。

本開示の別の態様（１９）によれば、（１）第１のポートが実質的に上向きに位置しており、第２のポートが実質的に下向きに位置している場合、または（２）第１のポートが実質的に下向きに位置し、第２のポートが実質的に上向きに位置している場合、多孔質メッシュが空洞内で傾斜した向きを有するように、第１のポートおよび第２のポートが容器上で互いに一列に並んでいる、態様（１７）の方法が提供される。

本開示の別の態様（２０）によれば、第１のポートおよび第２のポートの両方とも容器の片側に位置しており、（１）第１のポートおよび第２のポートが実質的に上向きに位置している場合、または（２）第１のポートおよび第２のポートが実質的に下向きに位置している場合、多孔質メッシュが容器内で実質的に垂直向きを有する、態様（１１）〜（１６）のいずれかの方法が提供される。

開示された様々な実施の形態は、その特定の実施の形態に関して記載された特定の特徴、要素または工程を含むことがあることが認識されよう。特定の特徴、要素または工程は、ある特定の実施の形態に関して記載されているが、説明されていない様々な組合せまたは順序で代わりの実施の形態と交換しても、組み合わせてもよいこと認識されよう。

ここに用いたように、名詞は、「少なくとも１つ」の対象を指し、特に明記のない限り、「ただ１つ」の対象に制限されるべきではないことも理解されよう。それゆえ、例えば、「開口」に対する言及は、特に明記のない限り、そのような「開口」を２つ以上有する例を含む。

範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで、としてここに表現することができる。そのような範囲が表現された場合、例は、その１つの特定の値から、および／または他方の特定の値まで、を含む。同様に、値が、先行詞「約」を用いて、近似として表現されている場合、特定の値は別の態様を形成することが理解されよう。複数の範囲の各々の端点は、他方の端点に関してと、他方の端点とは関係なくの両方で有意であることがさらに理解されよう。

ここに表現された全ての数値は、特に明記のない限り、そのように述べられていなくても、「約」を含むと解釈すべきである。しかしながら、列挙された各数値は、「約」その値と表現されているか否かにかかわらず、同様に正確に意図されることがさらに理解されよう。それゆえ、「１０ｍｍ未満の寸法」および「約１０ｍｍ未満の寸法」の両方とも、「約１０ｍｍ未満の寸法」並びに「１０ｍｍ未満の寸法」の実施の形態を含む。

特に明記のない限り、ここに述べられたどの方法も、その工程が特定の順序で行われることを必要とするものと解釈されることは決して意図されていない。したがって、方法の請求項が、その工程がしたがうべき順序を実際に列挙していない場合、またはその工程が特定の順序に制限されることが請求項または説明に他の様式で具体的に述べられていない場合、どの特定の順序も推測されることは決して意図されていない。

特定の実施の形態の様々な特徴、要素または工程が、移行句「含む」を使用して開示されることがあるが、移行句「からなる」または「から実質的になる」を使用して記載されることがある実施の形態を含む代わりの実施の形態が暗示されることを理解すべきである。それゆえ、例えば、Ａ＋Ｂ＋Ｃを含む方法に対して暗示される代わりの実施の形態は、方法がＡ＋Ｂ＋Ｃからなる実施の形態、および方法がＡ＋Ｂ＋Ｃから実質的になる実施の形態を含む。

本開示の多数の実施の形態が、添付図面に示され、先の発明を実施するための形態に記載されているが、付随の特許請求の範囲に述べられ、定義されたような開示から逸脱せずに、様々な再構成、改変および置換が可能であることを理解すべきである。

以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。

実施形態１
液体中のマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を分離するように構成された細胞分離器具であって、該細胞分離器具は、
第１のポート、第２のポート、および空洞を有する容器；および
前記空洞を第１の区画と第２の区画に分割するために該空洞内に配置された多孔質メッシュ、
を備え、
前記第１のポートは前記空洞の前記第１の区画と連通しており、該第１のポートは前記多孔質メッシュの第一面側に位置しており、
前記第２のポートは前記空洞の前記第２の区画と連通しており、該第２のポートは前記多孔質メッシュの第二面側に位置しており、
前記多孔質メッシュは、該多孔質メッシュを通る液体の流れに対して実質的に垂直な向きまたは傾斜した向きを有するように前記空洞内に配置されている、細胞分離器具。

実施形態２
前記第１のポートが前記容器の一方の端部に位置し、前記第２のポートが該容器の反対の端部に位置している、実施形態１に記載の細胞分離器具。

実施形態３
（１）前記第１のポートが実質的に上向きに位置しており、前記第２のポートが実質的に下向きに位置している場合、または（２）前記第１のポートが実質的に下向きに位置し、前記第２のポートが実質的に上向きに位置している場合、前記多孔質メッシュが前記空洞内で実質的に垂直の向きを有するように、該第１のポートおよび該第２のポートが前記容器上で互いからずれている、実施形態２に記載の細胞分離器具。

実施形態４
（１）前記第１のポートが実質的に上向きに位置しており、前記第２のポートが実質的に下向きに位置している場合、または（２）前記第１のポートが実質的に下向きに位置し、前記第２のポートが実質的に上向きに位置している場合、前記多孔質メッシュが前記空洞内で傾斜した向きを有するように、該第１のポートおよび該第２のポートが前記容器上で互いに一列に並んでいる、実施形態２に記載の細胞分離器具。

実施形態５
前記第１のポートおよび前記第２のポートの両方とも容器の片側に位置しており、（１）該第１のポートおよび該第２のポートが実質的に上向きに位置している場合、または（２）該第１のポートおよび該第２のポートが実質的に下向きに位置している場合、前記多孔質メッシュが前記容器内で実質的に垂直向きを有する、実施形態１に記載の細胞分離器具。

実施形態６
前記第１のポートに取り付けられる第１のキャップ、および
先記第２のポートに取り付けられる第２のキャップ、
をさらに備える、実施形態１から５いずれか１つに記載の細胞分離器具。

実施形態７
前記第１のポートと外部装置に取り付けられた第１の流量制御システム、および
前記第２のポートと外部装置に取り付けられた第２の流量制御システム、
をさらに備える、実施形態１から６いずれか１つに記載の細胞分離器具。

実施形態８
前記多孔質メッシュが、約１２マイクロメートルから約２００マイクロメートルに及ぶサイズを有する細孔を中に有する、実施形態１から７いずれか１つに記載の細胞分離器具。

実施形態９
前記容器の少なくとも一部を取り囲む外側筐体をさらに備える、実施形態１から８いずれか１つに記載の細胞分離器具。

実施形態１０
前記容器に連結されたリング・スタンドであって、該容器の動きと回転を容易にするように構成されたリング・スタンドをさらに備える、実施形態１から９いずれか１つに記載の細胞分離器具。

実施形態１１
液体中のマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を分離する方法において、
細胞分離器具の容器の第１のポートを通じて液体を導入する工程であって、該容器は第２のポートおよび空洞をさらに有し、
多孔質メッシュが、該多孔質メッシュを通る液体の流れに対して実質的に垂直なまたは傾斜した向きを有し、前記空洞を第１の区画と第２の区画に分割するように、該空洞内に配置され、
前記第１のポートが前記多孔質メッシュの第一面側に位置しており、
前記第１のポートは前記空洞の第１の区画と連通しており、前記第２のポートは該空洞の第２の区画と連通している工程；
前記多孔質メッシュを通過する液体を前記第２のポートから排出する工程；
前記多孔質メッシュを通過しない前記マイクロキャリアまたはスフェロイドを処理して、該マイクロキャリアまたはスフェロイドから前記細胞を放出する工程；および
前記細胞を前記第２のポートから排出させる工程；
を有してなる方法。

実施形態１２
前記マイクロキャリアまたはスフェロイドを処理する工程が、前記マイクロキャリアまたはスフェロイドを洗浄し、次いで、該マイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を解離させる各工程をさらに含む、実施形態１１に記載の方法。

実施形態１３
前記マイクロキャリアまたはスフェロイドを洗浄する工程が、
洗浄液を前記空洞に加え、
前記容器を動かし、
前記洗浄液を前記第２のポートから排出する、
各工程を含む、実施形態１２に記載の方法。

実施形態１４
前記マイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を解離させる工程が、
細胞解離試薬を前記空洞に加え、
前記容器を動かす、
各工程を含み、
前記細胞を第２のポートから排出する工程が、前記細胞解離試薬を前記第２のポートから排出する工程をさらに含む、実施形態１２に記載の方法。

実施形態１５
前記分離器具が、外部装置に直接的に接続されていない開放系細胞分離器具である、実施形態１１から１４いずれか１つに記載の方法。

実施形態１６
前記分離器具が、外部装置に直接接続された閉鎖系細胞分離器具である、実施形態１１から１４いずれか１つに記載の方法。

実施形態１７
前記第１のポートが前記容器の一方の端部に位置しており、前記第２のポートが該容器の反対の端部に位置している、実施形態１１から１６いずれか１つに記載の方法。

実施形態１８
（１）前記第１のポートが実質的に上向きに位置しており、前記第２のポートが実質的に下向きに位置している場合、または（２）前記第１のポートが実質的に下向きに位置し、前記第２のポートが実質的に上向きに位置している場合、前記多孔質メッシュが前記空洞内で実質的に垂直の向きを有するように、該第１のポートおよび該第２のポートが前記容器上で互いからずれている、実施形態１７に記載の方法。

実施形態１９
（１）前記第１のポートが実質的に上向きに位置しており、前記第２のポートが実質的に下向きに位置している場合、または（２）前記第１のポートが実質的に下向きに位置し、前記第２のポートが実質的に上向きに位置している場合、前記多孔質メッシュが前記空洞内で傾斜した向きを有するように、該第１のポートおよび該第２のポートが前記容器上で互いに一列に並んでいる、実施形態１７に記載の方法。

実施形態２０
前記第１のポートおよび前記第２のポートの両方とも容器の片側に位置しており、（１）該第１のポートおよび該第２のポートが実質的に上向きに位置している場合、または（２）該第１のポートおよび該第２のポートが実質的に下向きに位置している場合、前記多孔質メッシュが前記容器内で実質的に垂直向きを有する、実施形態１１から１６いずれか１つに記載の方法。

１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００ 細胞分離器具
１０２、２０２、３０２、４０２、５０２、６０２、７０２ 多孔質メッシュ
１０４、２０４、３０４、４０４、５０４、６０４、７０４ 容器
１０６、２０６、３０６、４０６、５０６、６０６、７０６ 第１のポート
１０８、２０８、３０８、４０８、５０８、６０８、７０８ 第２のポート
１１０、２１０、３１０、４１０、５１０、６１０、７１０ 空洞
１１２、２１２、３１２、４１２、５１２、６１２、７１２ 第１の区画
１１４、２１４、２１４、４１４、５１４、６１４、７１４ 第２の区画
１２４、３２４、４２４、５２４、６２４、７２４ 第１のキャップ
１２６、３２６、４２６、５２６、６２６、７２６ 第２のキャップ
１２８ リング・スタンド
１３０ 筐体
２３２ 第１の流量制御システム
２３４ 第２の流量制御システム
２３８、２４８、６３６、６３８、７３６、７３８ クランプ
２４０、２５０、６４０、７４０ ベント・フィルタ
２４４、２５２ 多目的コネクタまたは無菌コネクタ
３０３、４０３、５０３ 保持されたマイクロキャリアまたはスフェロイド
６１１ａ、６１１ｂ、７１１ａ、７１１ｂ 開口
６３３、６３７、７３１、７３３、７３５、７３７ 管

Claims (2)

1. 液体中のマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を分離するように構成された細胞分離器具であって、該細胞分離器具は、
   第１のポート、第２のポート、および空洞を有する容器；および
   前記空洞を第１の区画と第２の区画に分割するために該空洞内に配置された多孔質メッシュ、
   を備え、
   前記第１のポートは前記空洞の前記第１の区画と連通しており、該第１のポートは前記多孔質メッシュの第一面側に位置しており、
   前記第２のポートは前記空洞の前記第２の区画と連通しており、該第２のポートは前記多孔質メッシュの第二面側に位置しており、
   前記多孔質メッシュは、該多孔質メッシュを通る液体の流れに対して実質的に垂直な向きまたは傾斜した向きを有するように前記空洞内に配置されている、細胞分離器具。
2. 液体中のマイクロキャリアまたはスフェロイドから細胞を分離する方法において、
   細胞分離器具の容器の第１のポートを通じて液体を導入する工程であって、該容器は第２のポートおよび空洞をさらに有し、
   多孔質メッシュが、該多孔質メッシュを通る液体の流れに対して実質的に垂直なまたは傾斜した向きを有し、前記空洞を第１の区画と第２の区画に分割するように、該空洞内に配置され、
   前記第１のポートが前記多孔質メッシュの第一面側に位置しており、
   前記第１のポートは前記空洞の第１の区画と連通しており、前記第２のポートは該空洞の第２の区画と連通している工程；
   前記多孔質メッシュを通過する液体を前記第２のポートから排出する工程；
   前記多孔質メッシュを通過しない前記マイクロキャリアまたはスフェロイドを処理して、該マイクロキャリアまたはスフェロイドから前記細胞を放出する工程；および
   前記細胞を前記第２のポートから排出させる工程；
   を有してなる方法。

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