JPWO2012036246A1 - 中耳粘膜様細胞シート、その製造方法及びその利用方法 - Google Patents

Abstract

中耳骨表面に生着し、中耳腔内の肉芽組織の増生や骨増生、線維芽細胞の進展等を抑制する中耳腔粘膜の代替物を得ること。鼻粘膜上皮細胞等を０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で中耳粘膜様細胞を培養し、その後、培養液をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることでシート状に回収することで、表層に繊毛を保持した中耳粘膜様細胞シートを得ること。

Description

本発明は、医学、生物、創薬、薬学等の分野において有用な中耳粘膜様細胞シート、製造方法及びその利用方法に関するものである。本出願は、２０１０年９月１５日に提出された日本特許出願（特願２０１０−２２６０５５号）を基礎とする優先権主張出願である。

耳鼻科領域における真珠腫を含めた中耳炎の手術において、粘膜の保存が可能な症例では粘膜の生理的機能の回復が期待でき、術後の中耳腔・乳突腔に含気腔が確保される。しかし、真珠腫の多くの症例では乳突腔内の粘膜を保存することが困難である。特に骨面が広範囲に露出した例では、鼓室峡部の閉塞や削開乳突腔の術後変化により形成鼓膜が再陥凹し、再形成性真珠腫を生じる可能性が高い（非特許文献１、２参照）。またこのような病的な状態では術後粘膜の上皮化は遅延し、粘膜を介したガス交換能や線毛機能も大きく失われることが知られている。

従って、術後に広範囲に露出した骨面上に早期に粘膜が再生されれば、鼓膜の再癒着や再形成性真珠腫の予防が期待できる。実際に、これまで鼻粘膜や口腔粘膜の移植、或いははコラーゲンスポンジ等を使用し検討していたが、狭い中耳腔出の縫合は困難であり、また、露出した骨面が生着の足場としては不十分であることが分かった（非特許文献３、４参照）。また、その効果についてもいまだ不明な点が多かった。

このような背景のもと、特許文献１には、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃であるポリマーで基材表面を被覆した細胞培養支持体上にて、細胞を上限臨界溶解温度以下または下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下にすることにより酵素処理なくして培養細胞を剥離させる新規な細胞培養法が示されている。また、特許文献２には、この温度応答性細胞培養基材を利用して皮膚細胞を上限臨界溶解温度以下或いは下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上或いは下限臨界溶解温度以下にすることにより培養皮膚細胞を低損傷で剥離させることが記載されている。温度応答性細胞培養基材を利用することにより、従来の培養技術に対しさまざまな新規な展開をはかれるようになってきた。特許文献３では、その技術をさらに発展させ、肝組織内に存在する実質細胞を細胞シートとすることで、従来技術では困難であった肝組織細胞機能を長期にわたり維持させられることが分かってきた。しかしながら、特殊な形態を有する鼻粘膜細胞についてはこれまで何ら検討されていなかった。

中耳炎の手術において、術後の露出した骨面上に早期に粘膜が再生されれば、中耳真珠腫や癒着性中耳炎に対する手術方法が変わる可能性がある。即ち、もし術後に乳突腔の粘膜が期待通りに再生できれば、乳突腔は空洞性治癒となるため、乳突腔充填術が不要になるものと期待される。一方で、ヒトへの臨床応用を考える場合、いくつかの問題点が浮上する。患者側の病変が高度な場合は中耳粘膜組織の採取が困難なこと、中耳粘膜を採取するために先行した手術が必要であること、症例によっては健常側からの採取の必要性が生じることなどであり、倫理的問題も加わる。しかしながら、鼻粘膜は外来での採取が容易であり、患者の負担も少なく好ましい。

特開平０２−２１１８６５号公報 特開平０５−１９２１３８号公報 再表２００７−０８０９９０号公報

Ann. Otol. Rhinol. Laryngol., 104, 369 - 373 (1995) Laryngoscope, 108, 1840 - 1845 (1998) Acta. Oto-Laryngologica., 127, 1038 - 1044 (2007) Acta. Oto-Laryngologica., 126, 801 - 810 (2006)

本発明は、上述したような中耳炎等の術後に関する問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、従来技術と全く異なった発想からの新規な中耳粘膜様細胞シート、製造方法及びその利用方法を提供するものである。

本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、鼻粘膜組織の細胞を培養し、シート状に再構築することで得られる中耳粘膜様細胞シートであれば、中耳骨表面に生着し、中耳腔内の肉芽組織の増生や骨増生、線維芽細胞の進展等が抑制され、中耳炎等の手術により失った中耳腔粘膜の代替になることを見出した。そして、本発明の中耳粘膜様細胞シートは、鼻腔内、及び口腔内の粘膜損失時の代替粘膜として有用であることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。

すなわち、本発明は、表層に繊毛を保持した中耳粘膜様細胞シートを提供するものである。また、本発明は、この中耳粘膜様細胞シートを温度応答性ポリマーが被覆された基材表面で作製する方法を提供するものである。さらに、本発明は得られた中耳粘膜様細胞シートを利用する方法を提供するものである。本発明は、細胞シートという世界に類のない新規な発想による細胞構造物を使ってはじめて実現する極めて重要な発明と考えている。

本発明によれば、繊毛を保持した鼻粘膜上皮細胞を含む中耳粘膜様細胞シートであって、培養基材から剥離された中耳粘膜様細胞シートが提供される。なお、本発明の中耳粘膜様細胞シートは、限定されないが、好ましい態様として下記の態様を含む。

本発明の一態様では、本発明の中耳粘膜様細胞シートに使用される鼻粘膜上皮細胞は、鼻腔内、副鼻腔内、または乳突洞内粘膜由来である。好ましくは、鼻粘膜上皮細胞は、上甲介粘膜、中甲介粘膜、下甲介粘膜、または乳突洞粘膜由来である。より好ましくは、鼻粘膜上皮細胞は下甲介粘膜由来である。
本発明の一態様では、本発明の中耳粘膜様細胞シートは、換気機能、肉芽組織増生抑制機能及び／又はムチン分泌機能を有する。
本発明の一態様では、本発明の中耳粘膜様細胞シートに使用される細胞は、遺伝子導入されている。
本発明の一態様では、２以上の中耳粘膜様細胞シートが積層化されていてもよい。また、別の態様では、中耳粘膜様細胞シートに血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合した細胞シートが積層化されていてもよい。

また、本発明によれば、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で鼻粘膜上皮細胞を培養し、その後、培養液をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで培養した中耳粘膜様細胞をシート状で剥離させることを特徴とする中耳粘膜様細胞シートの製造方法が提供される。なお、本発明の中耳粘膜様細胞シートの製造方法は、限定されないが、好ましい態様として下記の態様を含む。
本発明の一態様では、細胞培養支持体の細胞培養面は多孔膜のセルインサートである。
本発明の一態様では、剥離した中耳粘膜様細胞シートをさらに別の中耳粘膜様細胞シート上に積層化し、或いはその操作を繰り返すことで中耳粘膜様細胞シートを積層化している。剥離方法は、蛋白質分解酵素による処理を施されることなく細胞培養支持体から剥離する方法である。また、剥離方法は、培養終了時に培養細胞上にキャリアを密着させ、キャリアと共に剥離する方法であってもよい。
本発明の一態様では、中耳粘膜様細胞は生体組織から採取されたものであってもよい。なお、培養時に播種する細胞数が３×１０⁴〜２×１０⁵個／ｃｍ²であり得る。
本発明の一態様では、本発明の中耳粘膜様細胞シートの製造方法に使用されるポリマーは、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーがポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である。

本発明によれば、得られた中耳粘膜様細胞シートを生体内の中耳腔、乳突洞腔に移植することを特徴とする、中耳粘膜様細胞シートの利用方法が提供される。
本発明の一態様では、移植部位があらかじめフィブリングルーを施した部位であってもよい。
本発明の一態様では、中耳真珠腫、癒着性中耳炎、術後性副鼻腔嚢胞、前頭嚢胞、口腔咽頭癌、副鼻腔癌、もしくは喉頭癌の治療、または中耳腔の再建を目的としてもよい。

本発明に示される中耳粘膜様細胞シートであれば、中耳骨表面に生着し、中耳腔内の肉芽組織の増生や骨増生、線維芽細胞の進展等を抑制し、中耳炎等の手術により失った中耳腔粘膜の代替になる。また、この中耳粘膜様細胞シートは鼻腔内、口腔内の粘膜損失時の有用な粘膜にもなる。

実施例１の鼻粘膜細胞シート作製時の概要を示す図である。 実施例１で得られた鼻粘膜細胞シートの状態を示す図である。 実施例１の鼻粘膜細胞シート移植時の概要を示す図である。 実施例１の中耳腔の粘膜を除去し、８週間後の骨増生の様子を示す図である。撮像には、Ｘ線ＣＴ（Ｌａｔｈｅｔａ ＬＣＴ−２００）（ＡＬＯＫＡ社）を使用した。ｅｘ：外耳道、ｂｕｌｌａ：中耳骨胞、ａｔ：上鼓室。(坂井：了解いたしました。) 実施例１の中耳腔の粘膜を除去後、本発明の鼻粘膜細胞シートをし、８週間後の骨増生の様子を示す図である。撮像には、Ｘ線ＣＴ（Ｌａｔｈｅｔａ ＬＣＴ−２００）（ＡＬＯＫＡ社）を使用した。ｅｘ：外耳道、ｂｕｌｌａ：中耳骨胞、ａｔ：上鼓室。 実施例１の中耳腔の粘膜を除去後、本発明の鼻粘膜細胞シートをし、８週間後の骨増生の様子を示す図である。撮像には、Ｘ線ＣＴ（Ｌａｔｈｅｔａ ＬＣＴ−２００）（ＡＬＯＫＡ社）を使用した。ｅｘ：外耳道、ｂｕｌｌａ：中耳骨胞、ａｔ：上鼓室。 実施例１の中耳腔の粘膜を除去後、本発明の鼻粘膜細胞シートをし、８週間後の骨増生の様子を示す図である。ａｔ：上鼓室、ｔｍ：鼓膜、ｅｘ：外耳道、ｂｕｌｌａ：中耳骨胞。 実施例１の中耳腔の粘膜を除去後、本発明の鼻粘膜細胞シートを移植し、８週間後の中耳骨表面の様子を示す図である。 実施例１の鼻粘膜細胞シート移植後の中耳腔の機能を示す図である。 実施例２の鼻粘膜細胞シート作製時の概要を示す図である。 実施例２の鼻粘膜細胞シート作製時の概要を示す図である。 実施例２の鼻粘膜細胞シート作製時の概要を示す図である。 実施例２のヒトの粘膜組織を比較した図である。 実施例２のヒトの粘膜組織と鼻粘膜細胞シートを比較した図である。 実施例２で得られたヒト鼻粘膜細胞シートの状態を示す図である。 実施例２で得られたヒト鼻粘膜細胞シートの状態を示す図である。 実施例３で得られたヒト鼻粘膜上皮組織層の状態を示す図である。 実施例３でヒト鼻粘膜上皮組織層を剥がしたその他の粘膜組織の状態を示す図である。 実施例３で得られたヒト鼻粘膜細胞シートの状態を示す図である。 実施例３で得られたヒト鼻粘膜細胞シートの状態を示す図である。

本発明の中耳粘膜様細胞シートに使用される細胞は、細胞表層に繊毛を保持した細胞が使われる。その繊毛を有する細胞は、本発明における中耳粘膜様細胞シートを構成する細胞数の５％以上が良く、好ましくは８％以上がよく、より好ましくは１０％以上が良く、さらに好ましくは１５％以上が良く、最も好ましくは２０％以上が良い。繊毛を有する細胞が５％より少ないと、移植された細胞シートは本発明の効果を十分に発揮できず好ましくない。その細胞の種類は特に限定されるものではないが、代表的なものとして鼻粘膜上皮細胞が挙げられる。その際、鼻粘膜上皮細胞の由来は鼻腔内、副鼻腔内、或いは乳突洞内の粘膜であれば特に問われないが、例えば、上甲介粘膜、中甲介粘膜、下甲介粘膜、乳突洞粘膜等が挙げられる。その中で、下甲介粘膜は採取が容易で特に好ましい。本発明において、使用する材料が鼻粘膜であれば、生体内に豊富に存在し、その採取は外来で済む程度に容易であり、患者の負担も少なく、患者への倫理面の問題も少なく、好ましい。また、本発明において鼻粘膜上皮細胞を利用すれば、その細胞の表面には繊毛が豊富に存在し好都合である。なお、本発明では、その粘膜細胞以外のものが含まれていてもよく、その種類については何ら制約されるものではないが、例えば、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、骨髄由来細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したものが挙げられる。また、それらの細胞のそれぞれの含有比率についても特に限定されるものではない。

本発明で用いられる細胞は、生体組織から直接採取した細胞、直接採取し培養系等で分化させた細胞、或いは細胞株が挙げられるが、その種類は何ら制約されるものではない。これらの細胞の由来は特に制約されるものではないが、例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物等が挙げられるが、本発明の中耳粘膜様細胞シートをヒトの治療に用いる場合はヒト、ブタ、サル、チンパンジー由来の細胞を用いる方が望ましい。本発明における細胞培養のための培地は、培養される細胞に対し通常用いられるものを用いれば特に制約されるものではない。

本発明では、鼻腔内、副鼻腔内、或いは乳突洞内の粘膜内の細胞を特定の処理により個々の状態とする必要がある。その際の処理方法については、組織をそのまま培養基材上に置くエクスプラント培養法、採取した組織から表層の鼻粘膜上皮組織層を物理的に剥ぎ、その後、鼻粘膜上皮組織層を培養基材上に置くエクスプラント培養法、採取した組織を酵素処理し個々の細胞にして培養する方法、或いはそれらを組み合わせる方法等の常法に従えばよく、何ら制約されるものではない。本発明においては、採取した鼻粘膜組織からあらかじめ腺組織を除くことができれば、最終的に得られる鼻粘膜上皮細胞シートに腺細胞が混入せず、従ってその腺細胞から分泌物が産生されることなく好都合である。発明者らは精力的な検討により、ヒト鼻粘膜上皮組織はヒト鼻粘膜組織より容易に剥がすことができ、本発明を実施するにあたり極めて好都合であることを見出している。その際に使用する培地としては、使用する細胞によって適宜、常法に従って実施すればよく、特に限定されるものではないが、例えば鼻粘膜上皮細胞の場合は、ＫＣＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ−１２培地、或いはこれらの混合物等が挙げられる。その際に、培地中に血清等の細胞培養において通常使われるような添加物を加えてもよい。また、使用する培養基材表面に細胞の付着性を上げるために必要に応じてコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル、及びそれらの混合物をあらかじめ被覆して使用してもよく、本発明ではこれらの条件で特に制限されることはない。本発明ではこうして得られた粘膜細胞を後述する本発明の特徴である温度応答性培養基材へ播種して細胞シートを作製するものである。その際、播種する細胞数は使用細胞の動物種によって異なるが、一般的に３．０×１０⁴〜２．０×１０⁵個／ｃｍ²が良く、好ましくは４．０×１０⁴〜１．５×１０⁵個／ｃｍ²が良く、さらに好ましくは５．０×１０⁴〜１．０×１０⁵個／ｃｍ²が良い。播種濃度が３．０×１０⁴個／ｃｍ²より少ない場合、粘膜細胞の増殖が悪く、得られる中耳粘膜様細胞シートの機能の発現程度が悪化し、本発明を実施する点において好ましくない。逆に、播種する細胞数が２．０×１０⁵個／ｃｍ²より多いと粘膜細胞の増殖性が悪くなり好ましくない。使用する培地としては、使用する細胞によって適宜、常法に従って実施すればよく特に限定されるものではないが、例えば鼻粘膜上皮細胞の場合は、ＫＣＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ−１２培地、或いはこれらの混合物等が挙げられる。その際に、培地中に血清等の細胞培養において通常使われるような添加物を加えてもよい。発明者らは、ヒト鼻粘膜上皮細胞を培養するとき、後述するような培養基材の形態にかかわらず、ヒト血清を添加すると培養したヒト鼻粘膜上皮細胞がよく増殖し、結果として物理的な強度を持ち、柔軟性に富んだヒト鼻粘膜上皮細胞シートが得られることが分かった。さらにそこで使用する血清は、鼻粘膜組織を採取した患者の自己血清とすることでより一層、物理的な強度を持ち、柔軟性に富んだ本発明として好適な状態の良いヒト鼻粘膜上皮細胞シートが得られることが分かった。ここで、使用する血清の培地中の濃度は、０．５〜３５％が良く、好ましくは１〜２０％、より好ましくは５〜１５％、最も好ましくは８〜１２％である。血清濃度が０．５％より低い場合、或いは３０％より高い場合は、培養している細胞の強度が弱まることがあり、本発明として好ましくない。また、使用する培養基材表面に細胞の付着性を上げるために必要に応じてコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル、及びそれらの混合物をあらかじめ被覆して使用してもよく、本発明ではこれらの条件で特に制限されることはない。

本発明においては、上記細胞を０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力の弱い温度域で培養される。その温度とは通常、細胞を培養する温度である３７℃が好ましい。本発明に用いる温度応答性高分子はホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このような高分子としては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。その際、培養、剥離されるものが細胞であることから、分離が５℃〜５０℃の範囲で行われるため、温度応答性ポリマーとしては、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）などが挙げられる。本発明に用いられる共重合のためのモノマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリアクリル酸及びその塩、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの含水ポリマーなどが挙げられるが、特に制約されるものではない。

本発明で用いられる、上述の各ポリマーの基材表面への被覆方法は、特に制限されないが、例えば、基材と上記モノマーまたはポリマーを、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応のいずれかにより、または塗布、混練等の物理的吸着等により行うことができる。培養基材表面への温度応答性ポリマーの被覆量は、１．１〜２．３μｇ／ｃｍ²の範囲が良く、好ましくは１．４〜１．９μｇ／ｃｍ²であり、さらに好ましくは１．５〜１．８μｇ／ｃｍ²である。１．１μｇ／ｃｍ²より少ない被覆量のとき、刺激を与えても当該ポリマー上の細胞は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。逆に２．３μｇ／ｃｍ²以上であると、その領域に細胞が付着し難く、細胞を十分に付着させることが困難となる。このような場合、温度応答性ポリマー被覆層の上にさらに細胞接着性タンパク質を被覆すれば、基材表面の温度応答性ポリマー被覆量は２．３μｇ／ｃｍ²以上であっても良く、その際の温度応答性ポリマーの被覆量は９．０μｇ／ｃｍ²以下が良く、好ましくは８．０μｇ／ｃｍ²以下が良く、７．０μｇ／ｃｍ²以下が好都合である。温度応答性ポリマーの被覆量が９．０μｇ／ｃｍ²以上であると温度応答性ポリマー被覆層の上にさらに細胞接着性タンパク質を被覆しても細胞が付着し難くなり好ましくない。そのような細胞接着性タンパク質の種類は何ら限定されるものではないが、例えば、コラーゲン、ラミニン、ラミニン５、フィブロネクチン、マトリゲル等の単独、もしくは２種以上の混合物が挙げられる。また、これらの細胞接着性タンパク質の被覆方法は常法に従えば良く、通常、細胞接着性タンパク質の水溶液を基材表面に塗布し、その後その水溶液を除去しリンスする方法がとられている。本発明は、温度応答性培養皿を利用した細胞シートそのものを利用しようとする技術である。従って、温度応答性ポリマー層上の細胞接着性タンパク質の被覆量が極度に多くなっては好ましくない。温度応答性ポリマーの被覆量、並びに細胞接着性タンパク質の被覆量の測定は常法に従えばよく、例えばＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲを用いて細胞付着部を直接測る方法、あらかじめラベル化したポリマーを同様な方法で固定化し細胞付着部に固定化されたラベル化ポリマー量より推測する方法などが挙げられるがいずれの方法を用いてもよい。

本発明の方法において、培養した細胞シートを温度応答性基材から剥離回収するには、培養された細胞の付着した培養基材の温度を培養基材上の被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって剥離させることができる。その際、培養液中において行うことも、その他の等張液中において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。細胞をより早く、より高効率に剥離、回収する目的で、基材を軽くたたいたり、ゆらしたりする方法、更にはピペットを用いて培地を撹拌する方法等を単独で、あるいは併用して用いてもよい。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。

以上のことを温度応答性ポリマーとしてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を例にとり説明する。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３１℃に下限臨界溶解温度を有するポリマーとして知られ、遊離状態であれば、水中で３１℃以上の温度で脱水和を起こしポリマー鎖が凝集し、白濁する。逆に３１℃以下の温度ではポリマー鎖は水和し、水に溶解した状態となる。本発明では、このポリマーがシャーレなどの基材表面に被覆、固定されたものである。したがって、３１℃以上の温度であれば、基材表面のポリマーも同じように脱水和するが、ポリマー鎖が基材表面に被覆、固定されているため、基材表面が疎水性を示すようになる。逆に、３１℃以下の温度では、基材表面のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が基材表面に被覆、固定されているため、基材表面が親水性を示すようになる。このときの疎水的な表面は細胞が付着、増殖できる適度な表面であり、また、親水的な表面は細胞が付着できないほどの表面となり、培養中の細胞、もしくは細胞シートも冷却するだけで剥離させられることになる。

被覆を施される基材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外のポリマー化合物、セラミックス類など全て用いることができる。

本発明における培養基材の形状は特に制約されるものではないが、例えばディッシュ、マルチプレート、フラスコ、多孔膜、さらにはその多孔膜上で培養するセルインサートのような形態のもの、或いは平膜状のものなどが挙げられる。その中で、多孔膜上やその多孔膜をセルインサートのような形状の培養基材を利用して細胞を培養した場合、細胞は多孔膜上で培養され、従って、培養中、常に培地が多孔膜を介しても供給されることとなり、結果として、本発明で用いられる繊毛を有する細胞はその繊毛化が促進され、また得られた本発明の細胞シートは物理的に強い細胞シートとなり、柔軟性に富むものとなり好都合である。その際、本発明で用いられる細胞が上皮細胞であれば、細胞シートは良好に重層化していることも判明し、得られた細胞シートは物理的により一層強い細胞シートとなり、柔軟性に富むものとなり好都合であった。

本発明における中耳粘膜様細胞シートは培養時にディスパーゼ、トリプシン等で代表される蛋白質分解酵素による損傷を受けていないものである。そのため、基材から剥離された中耳粘膜様細胞シートは接着性蛋白質を有し、粘膜細胞をシート状に剥離させた際には細胞−細胞間のデスモソーム構造がある程度保持されたものとなる。このことにより、移植時において患部組織と良好に接着することができ、効率良い移植を実施することができるようになる。一般に蛋白質分解酵素であるディスパーゼに関しては、細胞−細胞間のデスモソーム構造については１０〜４０％保持した状態で剥離させることができることで知られているが、細胞−基材間の基底膜様蛋白質等を殆ど破壊してしまうため、得られる細胞シートは強度の弱いものとなる。これに対して、本発明の中耳粘膜様細胞シートは、デスモソーム構造、基底膜様蛋白質共に６０％以上残存された状態のものであり、上述したような種々の効果を得ることができるものである。

また、本発明の方法においては、中耳粘膜様細胞シートを培養基材から剥離し、回収する場合、必要に応じて、培養終了時に培養細胞上にキャリアを密着させ、中耳粘膜様細胞シートをキャリアと共に回収してもよい。典型的には、培養した中耳粘膜様細胞シートを温度応答性基材から剥離回収する場合には、培養終了時に培養細胞上にキャリアを密着させた後、培養基材の被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって、中耳粘膜様細胞シートをキャリアと共に剥離することができる。必要に応じて使用されるキャリアは、例えば、親水化処理が施されたポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリプロピレン、ポリエチレン、セルロース及びその誘導体、キチン、キトサン、コラーゲン、和紙等の紙類、ウレタン、スパンデックス等のネット状、ストッキネット状高分子材料等であってもよい。ここで、ネット状またはストッキネット状高分子材料であれば、中耳粘膜様細胞シートの自由度が増し、中耳粘膜様細胞シートが移植される中耳腔及び乳突洞腔の部位に適した形状を有する中耳粘膜様細胞シートして提供することができる。

本発明における中耳粘膜様細胞シートは繊毛を保持した細胞から作製されたものである。そのため、本発明の細胞シートは、その繊毛による換気機能、ガス交換機能等幾つかの特徴的な機能を有したものである。すなわち、本発明の細胞シートを中耳腔内、鼻腔内、口腔内に移植すると、細胞シート表層に存在する繊毛によって腔内が換気されることになる。本発明においては、このような機能を有する細胞シートを作製し、生体内へ移植することで生体機能を再生することを目的としている。一方で、繊毛を有する細胞を培養すると、その培養工程中に細胞表面の繊毛が失われていくことが知られている。本発明では、最終的に得られる細胞シート中に繊毛が存在すれば特に限定されるものではないが、本発明の最終的な目的を考えると、細胞シートを構成する総細胞数に対し５％以上、好ましくは８％以上、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上、最も好ましいものは２０％以上の細胞に繊毛が存在することが望ましい。一般に、中耳腔内粘膜組織表層の繊毛を有する細胞の比率は約１０％とされ、本発明でも生体組織本来の状態に近くなる方が好ましい。本発明においては、換気機能、ガス交換機能は同義として扱われ、その機能はいずれも細胞表層の繊毛による機能として考えてよい。また、本発明で得られる中耳粘膜様細胞シートは、ムチン、ヒアルロン酸、多糖類等の粘膜特有の物質を分泌するものでもよく、その種類、分泌量については特に限定されるものではない。さらに、本発明で用いられる細胞シートは、細胞シートの機能を高める目的で遺伝子を導入させたものでもよく、その導入方法は常法に従えばよい。

本発明では、２以上の中耳粘膜様細胞シートが積層化されたものであってもよい。その積層化枚数は特に限定されるものではないが、積層回数は１０回以下が良く、好ましくは５回以下、さらに好ましくは２回以下が良い。中耳粘膜様細胞シートを積層化するとシート単面積当たりの細胞密度が向上し、中耳粘膜様細胞シートとしての機能も向上し好ましい。また、本発明の中耳粘膜様細胞シートでは、上述したような本発明の細胞シートの機能が損なわれない範囲において、粘膜細胞以外に血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合したものでもよく、またそれらの細胞シートが中耳粘膜様細胞シートに対して積層化されたものでもよい。

本発明における細胞シートの積層体を作製する方法についても特に限定されるものではないが、例えば、培養細胞をシート状で剥離させ、必要に応じ培養細胞移動治具を用いて培養細胞シート同士を積層化させることで得られる。その際、培地の温度は、培養基材表面に被覆された前記ポリマーが上限臨界溶解温度を有する場合はその温度以下、また前記ポリマーが下限臨界溶解温度を有する場合はその温度以上であれば特に制限されない。しかし、培養細胞が増殖しないような低温域、あるいは培養細胞が死滅するような高温域における培養が不適切であることは言うまでもない。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。また、必要に応じ、細胞シートを移動させるための治具を利用してもよい。そのような治具としては、剥離した細胞シートを捕捉できるものであれば材質、形状共に何ら限定されるものではないが、それらの材質としては、通常、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコン、ポリビニルアルコール、ウレタン、セルロース及びその誘導体、キチン、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、フィブリングルー等の材料を膜状、多孔膜状、不織布状、織布状として中耳粘膜様細胞シートに接触させて使用される。

本発明で得られた中耳粘膜様細胞シートを生体内の所定部位に移植することができる。その移植部位としては、中耳腔内、乳突洞内、鼻腔内、口腔内の粘膜欠損部等が挙げられる。その中で、特に中耳腔内の粘膜欠損への移植が本発明の効果を最も期待でき好ましい。その移植部位へはあらかじめ血管誘導を施されていてもよく、フィブリングルー、コラーゲン等の細胞間接着性成分が塗布されていても、特に限定されるものではない。ここで、血管誘導を施す方法も特に限定されるものではないが、例えば、血管増殖因子であるＦＧＦをミクロスフィアに包埋し、このミクロスフィアの組成、大きさ、注入範囲を変えながら生体に８〜１０日間作用させる方法、ポリエチレンテレフタレートメッシュを任意の大きさに切り、袋状のものを作製し、そのバッグの内側に、高濃度アガロース溶液に溶解させたＦＧＦを入れ、８〜１０日間後、そのバッグを除去することにより、血管誘導された空間を作製する方法などが挙げられる。

本発明において移植される中耳粘膜様細胞シートは、基底膜様蛋白質を保持しており、生着性が極めて良好である。移植する際には目的に応じて細胞数を変えれば良く、移植する細胞がシート状の時には、その大きさや形状を変えることで細胞シートが持つ機能の総活性度を変えることができる。また、本発明の中耳粘膜様細胞シートを移植することで、移植部位の肉芽組織増生、骨増生、さらには線維芽細胞の進展等を抑制させられる。そのメカニズムについては現在、解析中であるが、結果として、本発明の中耳粘膜様細胞シートを移植することで腔内の空間体積を保持させられ、空間の狭小化を抑制することができるようになる。

ヒトに対し、本発明で示すところの中耳粘膜様細胞シートを利用することで、中耳真珠腫、癒着性中耳炎、術後性副鼻腔嚢胞、前頭嚢胞、口腔咽頭癌、副鼻腔癌、喉頭癌の治療、もしくは中耳腔の再建治療を行えるようになるが、その目的はそれらに特に限定されるものではない。

以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。

Ｉ型コラーゲンをコートした培養皿に無菌的に採取したウサギ鼻粘膜組織片をエクスプラントし、ＫＣＭ培地（Keratinocyte culture medium）にて初代培養を行った。その結果、組織片の周囲から鼻粘膜上皮細胞がはい出し、急速に増殖してきた。培養数日後には一部線維芽細胞様の形態を示す細胞の混入が観察された。約８０％コンフルエントになるまで培養を行った後、鼻粘膜上皮細胞を培養皿から回収し、組織用コラーゲン（CELLGEN）をコートした温度応答性培養皿（ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、被覆量２．０μｇ／ｃｍ²）上へ、５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の細胞密度となるように播種した。その際、温度応答性培養皿は、ファルコン３００２ペトリディッシュ（直径６ｃｍ）上に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドモノマーを３５％になるようにイソプロピルアルコールに溶解させたものを０．３５ｍｌ塗布した後、そのままの状態で０．２５ＭＧｙの強度の電子線を照射し、培養皿表面全体にＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマー（ＰＩＰＡＡｍ）を被覆させることで得た。６日間培養の後、２０℃のＣＯ₂インキュベーターへ移し、２０分低温処理を行うことで、鼻粘膜細胞シートとして回収に成功した。その作業工程を図１に示す。

作製された鼻粘膜細胞シートをＨＥ染色にて組織学的に検討すると、上皮細胞様の細胞が表層に１層配列し、その下層には数層の線維芽細胞様の細胞からなる３次元構造を有していることが明らかとなった。免疫染色の結果から、この表層に単層に配列した細胞はＰａｎ−ＣＫ陽性上皮細胞であり、その下層はＶｉｍｅｎｔｉｎ陽性線維芽細胞で構成されている事から、単層粘膜上皮と下層の結合組織からなる正常中耳粘膜組織に非常に近似していることが分かった。継代培養の過程で、上皮細胞と線維芽細胞がそれぞれ増殖しながら住み分けていき、生体組織と同様の構造を有したことは非常に興味深い。さらに、電子顕微鏡を用いて細胞シートの超微形態学的な観察を行った。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による鼻粘膜細胞シート表層の観察から、細胞表面に無数のマイクロビライを有する細胞や繊毛様の構造を有した細胞等のヘテロな細胞が混在することが明らかとなった。また、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による観察の結果から、タイトジャンクションやデスモゾームといった細胞接着装置の構造、上皮層と線維芽細胞層の境界に基底膜様の構造、さらには細胞シートの生着に重要である細胞シート下面のＥＣＭの沈着が確認された（図２）。

得られた鼻粘膜細胞シートを、あらかじめ中耳腔粘膜を除去したウサギへ移植して、本発明である中耳粘膜様細胞シートの効果を確認した。その際の作業工程を図３に示す。その結果、中耳腔粘膜を除去しそのまま何も移植しなかった群においては中耳腔内の狭小化が進み、明らかな骨増生を認めたが（図４）、本発明である中耳粘膜様細胞シートを移植した群においては中耳腔内の狭小化は進行せず、骨増生も認められなかった（図５）。この結果は、冠状断ＣＴ（図６）、或いは中耳腔の組織を採取し脱灰切片化して染色（図７）を行っても認められた。さらに、移植部位の脱灰切片の解析から、生着した鼻粘膜様細胞シートが残っていることも確認できた（図８）。

本発明の中耳粘膜様細胞シートを移植した中耳腔の機能を評価するために、図９に示すように、ウサギの中耳腔を耳管部に栓をすることで閉鎖し、外耳道側から中耳腔内ガス交換器を挿入し、微小圧センサーによってその機能を計測した。その結果、本発明の中耳粘膜様細胞シートを移植した群は、優位に中耳粘膜を除去した群より良好な結果となり、その数値はほぼ正常値に近いものであった。鼓膜内外の気圧が正常組織とほぼ等しい状態に保たれ、内耳への最適な伝音機能を保つことができるものと考えられる。以上より、本発明の中耳粘膜様細胞シートは、中耳粘膜を代替できるものと確認できた。

実施例１と同様な手法によって、Ｉ型コラーゲンをコートした培養皿に無菌的に採取したヒト鼻腔内下甲介粘膜組織（図１２左上写真）片をエクスプラントし、ＫＣＭ培地（Keratinocyte culture medium）にて初代培養を行った（図１２左下写真）。得られた鼻粘膜細胞を図１０に示すように、実施例１と同様な手法で多孔膜部分へポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を１．５μｇ／ｃｍ²量を被覆したセルインサートへヒト鼻粘膜細胞を播種し、培養面が空気に触れるようにして培養を行った。６日間培養の後、２０℃のＣＯ₂インキュベーターへ移し、２０分低温処理を行うことで、ヒト鼻粘膜細胞シートとして回収に成功した（図１２右下写真）。その作業工程を図１１に示す。また、各工程の様子を図１２に示した。一般に、中耳粘膜は気管上皮や鼻粘膜上皮と同様に呼吸上皮の一部であり、中耳腔内の部位において、粘膜上皮の形態が異なることが知られている（図１３左列：ヒト正常中耳粘膜、図１３右列：ヒト正常鼻粘膜）。耳管開口部付近は、排泄機能を担う繊毛細胞を豊富に含む多列円柱上皮に覆われているが、鼓膜付近の中耳腔後方へ移行するにつれて、大部分が無繊毛細胞の扁平上皮の形態を呈する。今回、ヒトの中耳粘膜と鼻粘膜の形態学的な検証を行った結果では鼻粘膜には上皮下に腺組織を豊富に有する。しかし、上皮細胞におけるサイトケラチンおよびカドヘリン、カテニン等のタンパクの発現形式は酷似していることが判明した（図１４）。よって鼻粘膜の上皮細胞を回収することにより中耳粘膜類似細胞シートを作成することが十分可能であると考えられる。さらに、電子顕微鏡を用いてヒト鼻粘膜細胞シートの超微形態学的な観察を行った。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による鼻粘膜細胞シート表層の観察から、細胞表面に無数のマイクロビライを有する細胞や繊毛様の構造を有した細胞等ヘテロな細胞が混在することが明らかとなった（図１５）。また、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による観察の結果から、タイトジャンクションやデスモゾームといった細胞接着装置の構造、上皮層と線維芽細胞層の境界に基底膜様の構造、さらには細胞シートの生着に重要である細胞シート下面のＥＣＭの沈着が確認された（図１６）。

以上より、温度応答性培養基材を用いて本発明である中耳粘膜様細胞シートを得た。得られた細胞シートをウサギへ移植し、その効果を検討した。シート移植群に於いて明らかに骨増生および中耳腔内の狭小化を抑制することが確認できた。そこで今回は臨床応用に向け、ヒト細胞を用いた細胞シートを検討した。そして、動物モデル同様にヒト鼻腔内下甲介粘膜から細胞シートを製作することができた（１０例実施）。その結果、ヒト鼻腔内下甲介粘膜より採取した粘膜組織片から継代・培養し増殖させた細胞から、生体の中耳粘膜組織に非常に近似した３次元構造を有する中耳粘膜様細胞シートの作成に成功した。粘膜採取から細胞シート回収までは約３週間を要した。今回の検討により鼻粘膜細胞を用いた細胞シートが中耳炎手術後の粘膜再生において有用な移植材料であると考えられた。

無菌的に採取したヒト鼻腔内下甲介粘膜組織から鼻粘膜上皮組織部分を剥ぎ、その鼻粘膜上皮組織を市販培養皿上でエクスプラントし、ＫＣＭ培地にて初代培養を行った。得られた鼻粘膜上皮組織を図１７、鼻粘膜上皮組織が剥がされた残りの部分を図１８に示す。実施例１と同様な手法で多孔膜部分へポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を１．２μｇ／ｃｍ²量を被覆したセルインサートへヒト鼻粘膜細胞を播種し、培養面が空気に触れるようにして培養を行った。その際、培地としてはヒト血清を１０％含んだＫＣＭ培地を利用した。７日間培養の後、２０℃のＣＯ₂インキュベーターへ移し、２０分低温処理を行うことで、ヒト鼻粘膜細胞シートとして回収に成功した。電子顕微鏡を用いてヒト鼻粘膜細胞シートの超微形態学的な観察を行った。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による鼻粘膜細胞シート表層の観察から、本実施例のようにセルインサート上でヒト血清を含む培地で培養した鼻粘膜上皮細胞は細胞表層の繊毛化が促進され、細胞表面にマイクロビライが豊富に有することが明らかとなった（図１９、図２０）。

実施例３で得られたヒト鼻粘膜細胞シートを実施例１と同様な手法であらかじめ中耳腔粘膜を除去したウサギへ移植した。その結果、本発明である中耳粘膜様細胞シートを移植した群においては中耳腔内の狭小化は進行せず、骨増生も認められなかった。今回の検討により鼻粘膜細胞を用いた細胞シートが中耳炎手術後の粘膜再生において有用な移植材料であると考えられ、中耳真珠腫や癒着性中耳炎に対する手術方法を大きく変える術後の新たな治療法として今後の臨床応用が期待される。

温度応答性培養基材上で作製された中耳粘膜様細胞シートは、中耳骨表面に生着し、中耳腔内の肉芽組織の増生や骨増生、線維芽細胞の進展等を抑制し、中耳炎等の手術により失った中耳腔粘膜の代替になる。また、この中耳粘膜様細胞シートは鼻腔内、口腔内の粘膜損失時の有用な粘膜にもなる。

Claims (21)

1. 繊毛を保持した鼻粘膜上皮細胞を含む中耳粘膜様細胞シートであって、培養基材から剥離された中耳粘膜様細胞シート。
2. 鼻粘膜上皮細胞が、鼻腔内、副鼻腔内、または乳突洞内粘膜由来である、請求項１記載の中耳粘膜様細胞シート。
3. 鼻粘膜上皮細胞が、上甲介粘膜、中甲介粘膜、下甲介粘膜、または乳突洞粘膜由来である、請求項１記載の中耳粘膜様細胞シート。
4. 鼻粘膜上皮細胞が下甲介粘膜由来である、請求項３記載の中耳粘膜様細胞シート。
5. 換気機能を有する、請求項１〜４のいずれか１項記載の中耳粘膜様細胞シート。
6. 肉芽組織増生抑制機能を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の中耳粘膜様細胞シート。
7. ムチン分泌機能を有する、請求項１〜６のいずれか１項記載の中耳粘膜様細胞シート。
8. 遺伝子導入された、請求項１〜７のいずれか１項記載の中耳粘膜様細胞シート。
9. ２以上の中耳粘膜様細胞シートが積層化されたものである、請求項１〜８のいずれか１項記載の中耳粘膜様細胞シート。
10. 中耳粘膜様細胞シートに血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、脂肪由来細胞、間葉系幹細胞のいずれか１種、もしくは２種以上の細胞が混合した細胞シートが積層化された、請求項１〜９のいずれか１項記載の中耳粘膜様細胞シート。
11. ０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で鼻粘膜上皮細胞を培養し、その後、培養液をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで培養した中耳粘膜様細胞をシート状で剥離させることを特徴とする中耳粘膜様細胞シートの製造方法。
12. 細胞培養支持体の細胞培養面が多孔膜のセルインサートである、請求項１１記載の中耳粘膜様細胞シートの製造方法。
13. 剥離した中耳粘膜様細胞シートをさらに別の中耳粘膜様細胞シート上に積層化し、或いはその操作を繰り返すことで中耳粘膜様細胞シートを積層化する、請求項１１または１２記載の中耳粘膜様細胞シートの製造方法。
14. 剥離方法が蛋白質分解酵素による処理を施されることなく細胞培養支持体から剥離されたものである、請求項１１〜１３のいずれか１項記載の中耳粘膜様細胞シートの製造方法。
15. 剥離方法が培養終了時に培養細胞上にキャリアを密着させ、キャリアと共に剥離する方法である、請求項１１〜１４のいずれか１項記載の中耳粘膜様細胞シートの製造方法。
16. 中耳粘膜様細胞が生体組織から採取されたものである、請求項１１〜１５の中耳粘膜様細胞シートの製造方法。
17. 培養時に播種する細胞数が３×１０⁴〜２×１０⁵個／ｃｍ²である、請求項１１〜１６のいずれか１項記載の中耳粘膜様細胞シートの製造方法。
18. ０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーがポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である、請求項１１〜１７のいずれか１項記載の中耳粘膜様細胞シートの製造方法。
19. 請求項１〜１０のいずれか１項記載の中耳粘膜様細胞シートを生体内の中耳腔、乳突洞腔に移植することを特徴とする、中耳粘膜様細胞シートの利用方法。
20. 移植部位があらかじめフィブリングルーを施した部位である、請求項１９記載の中耳粘膜様細胞シートの利用方法。
21. 中耳真珠腫、癒着性中耳炎、術後性副鼻腔嚢胞、前頭嚢胞、口腔咽頭癌、副鼻腔癌、又は喉頭癌の治療、もしくは中耳腔の再建を目的とすることを特徴とする、請求項１９または２０のいずれか１項記載の中耳粘膜様細胞シートの利用方法。