JPWO2012023291A1 - 経大腸吸収用医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)少なくとも以下の(a)及び(b)を含有することを特徴とする、経大腸吸収用医薬組成物;
(a)細胞内に作用部位を有し、且つ、リポタンパク質導入物質が結合した生理活性物質;
(b)前記生理活性物質の大腸粘膜上皮透過性亢進作用を有する化合物;や、
(2)大腸粘膜上皮透過性亢進作用を有する化合物として、界面活性剤を更に含有することを特徴とする上記(1)に記載の医薬組成物や、
(3)リポタンパク質導入物質が、カイロミクロン又はカイロミクロンレムナントへの導入物質であることを特徴とする、上記(1)又は(2)に記載の医薬組成物や、
(4)リポタンパク質導入物質が、脂溶性ビタミン又はコレステロールであることを特徴とする、上記(3)に記載の医薬組成物や、
(5)脂溶性ビタミンがビタミンE又はその誘導体であることを特徴とする、上記(4)に記載の医薬組成物や、
(6)生理活性物質を肝臓細胞へ特異的に送達することができることを特徴とする、上記(1)又は(2)に記載の医薬組成物や、
(7)リポタンパク質導入物質と結合させた生理活性物質の分子量が、1000〜150000ダルトンの範囲内であることを特徴とする、上記(1)又は(2)に記載の医薬組成物や、
(8)生理活性物質が、標的遺伝子の発現を抑制する核酸であることを特徴とする、上記(1)又は(2)に記載の医薬組成物や、
(9)核酸が、siRNA、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴmir、核酸アプタマー、リボザイム及びデコイからなる群から選択される1種又は2種以上の核酸であることを特徴とする、上記(8)に記載の医薬組成物や、
(10)大腸粘膜上皮透過性亢進作用を有する化合物が、以下の(c)又は(d)のいずれか1つ以上を含む、上記(1)又は(2)に記載の医薬組成物;
(c)中鎖脂肪酸又は長鎖不飽和脂肪酸;
(d)前記(c)記載の脂肪酸(多価不飽和脂肪酸の場合は共役型も含まれる)の、塩、エステル体又はエーテル体;や、
(11)大腸粘膜上皮透過性亢進作用を有する化合物が、リノール酸、オレイン酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、カプリン酸又はラウリン酸、或いは、それらの塩、エステル体又はエーテル体であることを特徴とする、上記(10)に記載の医薬組成物や、
(12)界面活性剤が、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート、ポリエチレングリコール、ポロキサマー、モノアシルグリセリン、モノアシルソルビタン又は脂肪酸ショ糖エステル類であることを特徴とする、上記(2)に記載の医薬組成物や、
(13)大腸投与剤、経口腸溶剤又は経口薬物送達システムである、上記(1)又は(2)に記載の医薬組成物に関する。
(a)細胞内に作用部位を有し、且つ、リポタンパク質導入物質が結合した生理活性物質(以下、単に「本発明における生理活性物質」とも表示する。);
(b)前記生理活性物質の大腸粘膜上皮透過性亢進作用を有する化合物(以下、単に「本発明における上皮透過性亢進化合物」とも表示する。);
本発明における生理活性物質の1例として、マウスapoB遺伝子を標的遺伝子とするsiRNAを作製した。具体的には、配列番号1(GUCAUCACACUGAAUACCAAUGCUGGA)からなるセンス鎖(27mer)と、配列番号2(UCCAGCAUUGGUAUUCAGUGUGAUGACAC)からなるアンチセンス鎖(29mer)からなるsiRNAを合成し、適当な化学修飾を施した。このsiRNAのアンチセンス鎖5’末端に、リポタンパク質導入物質として、ビタミンEの天然型アイソマーの一つであるα−トコフェロール(Toc)をリン酸結合で共有結合させて、VE−siRNAを得た(図2)。
本発明により、生理活性物質を効率的に肝組織へ送達することが可能かどうかを調べるために、以下のような試験を行った。
透過性亢進剤として、リノール酸(LA)(和光純薬工業株式会社製)を用意し、界面活性剤として、HCO−60(日光ケミカルズ株式会社製)を用意した。LAの最終投与濃度が10mMとなるように、HCO−60(3.0w/w%)及びRNAse freeのリン酸緩衝液(PBS)を用いて調節後、ソニケーターによりソニケーションを行い、用時混合ミセルとして調製した。なお、この用時混合ミセルは、0.1N NaOHでpHを7.4に調節した。用事調製した混合ミセルと、蛍光(Cy3)標識VE−siRNA(0.3mg/head)とをピペッティングでよく混合し、送達試験用の実施例製剤(HCO−60/LA/VE−siRNA)(製剤E)を調製した。
前述の実施例2(1)で調製した製剤を投与する対象動物として、マウス(ICR、9週齢)を用意した。このマウスを一夜絶食させた後、乳脂肪5%ミルクを0.4mlずつ30分おきに三回経口投与することにより、カイロミクロン形成を促進させた。最後のミルク投与から30分後に、ネンブタールでマウスに麻酔をかけ、腸管を洗浄した後、前述のいずれかの製剤(約200μL)を注腸剤として肛門部より投与(直腸投与)し、次いで、肛門部を結紮した。製剤を単回投与してから2時間毎に腸内残留薬剤を除去後、新たに同用量の製剤を追加投与して、合計3回の投与を行った。また、実施例製剤(製剤E)については、この他にも、絶食後にミルクの前投与を行わずに、同様に製剤Eを直腸投与すること(Milk(−) HCO−60/LA/VE−siRNA)や、絶食後にミルクの前投与を同様に行い、製剤Eを直腸投与する30分間前に、生理食塩水で希釈したTriton−X100(Sigma社製)の溶液(20mg/kg)を尾静脈より投与すること(Triton−X pre i.V. HCO−60/LA/VE−siRNA)も行った。
前述の実施例2(2)において、最後に製剤を投与してから2時間後に、麻酔下で4℃の生理食塩水にてマウスを還流し、次いで、肝臓を摘出した。摘出した肝臓を4%パラホルムアルデヒド(和光純薬工業株式会社製)で一晩固定後、30%スクロース(和光純薬工業株式会社製)で一晩固定し、次いで、O.C.T.Compound(Sakura Finetek社製)で包埋し、常法により凍結切片を作製した。凍結切片はTO−PRO(登録商標)−3(Molecular Probe社製)、Fluorescein(FITC)−ファロイジン(Invitrogen社製)を用いて、各々細胞核、細胞線維の染色を行った。これらの凍結切片を共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を図3に示す。図3Aは製剤Aを投与した場合の結果を示し、図3Bは製剤Bを投与した場合の結果を示し、図3Cは製剤Cを投与した場合の結果を示し、図3Dは製剤Dを投与した場合の結果を示し、図3Eは製剤Eを投与した場合の結果を示し、図3Fは絶食後にミルクの前投与を行わずに、製剤Eを投与した場合の結果を示し、図3GはTriton−X100溶液を投与してから製剤Eを投与した場合の結果を示す。また、図3A〜Gの各パネルはそれぞれ4分割されているが、それぞれ左上はTO−PRO(登録商標)−3の青色蛍光の検出結果を示し、右上はFITC−ファロイジンの緑色蛍光の検出結果を示し、左下はCy3の赤色蛍光の検出結果を示し、右下は左上と右上と左下の蛍光の検出結果を重ね合わせた結果を示す。
本発明における生理活性物質の肝組織への送達機構を調べるために、以下のような試験を行った。
マウス(ICR、9週齢)を用意した。このマウスを16時間絶食させた後、乳脂肪5%ミルクを0.4mlずつ30分おきに三回経口投与することにより、カイロミクロン形成を促進させた。最後のミルク投与から30分後に、ネンブタールでマウスに麻酔をかけ、腸管を洗浄した後、腸管の遠位側または肛門を結紮して腸管ループを作りループの肛門部から、前述の実施例2における製剤E(HCO−60/LA/VE−siRNA)を、10mg/kg投与した。
最終投与の2時間後に、マウスの腸管リンパ管からリンパ液を採取した。Cy3標識された分子の拡散時間を、蛍光相関分析法(FCS)を用いて求めた。また無処置のマウスから採取したリンパ液を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)でリポタンパク分画に分離したものを、同様に拡散時間を求めてこれと比較した。その結果を図5に示す。
本発明における生理活性物質の肝組織への送達機構を調べるために、引き続き、以下のようなノザンブロット解析を行った。
本発明における生理活性物質が肝組織へ送達され、細胞内で実際に機能を発揮しているかどうかを調べるために、以下のような定量的RT−PCRを行った。
本発明における生理活性物質が肝組織へ送達され、細胞内で実際に機能を発揮しているかどうかを調べるために、以下のようなウエスタンブロット解析を行った。
本発明における生理活性物質が肝組織へ送達され、細胞内で実際に機能を発揮しているかどうかを調べるために、引き続き、以下のような解析を行った。
HCO−60/LA以外の上皮透過性亢進化合物を用いた場合であっても、生理活性物質を効率的に肝組織へ送達することが可能かどうかを調べるために、以下のような試験を行った。
VE−siRNAのマウスにおける副作用を調べるために以下のような血液試験を行った。
VE−siRNAの送達が、肝細胞特異的なものであるかどうかを確認するために、以下のような、肝細胞以外の臓器への送達試験を行った。
VE−siRNAの直腸投与剤形として、液状製剤である注腸剤に変えて、固形製剤又は半固形製剤である坐剤への製剤化を試みた。まずは、液状又は固形製剤を充填することのできる中空坐剤を用いて評価した。
油脂性坐剤基剤(SUPPOCIRE AM PASTILLES,GATTEFOSSE社製)10gを加温融解し、ダイズ油1〜10gを添加・混和し、坐剤用基剤を調製した。なお、ダイズ油10gを添加した基剤の溶融点は約32℃であった。約50℃にて融解させた坐剤基剤を、予め−20℃に冷却した坐剤鋳型に流し込み、基剤と型との接触部分が固化した時点で、中心軸付近の固化していない部分の基剤を抜き取る方法により中空坐剤を調製した。
実施例2の製剤E(HCO−60/LA/VE−siRNA)で、LAの最終濃度を100mMとし、これに粘膜保護剤としてタウリン(最終濃度100mM)を添加し、冷却下、短時間ソニケーションを行うことにより混合ミセル液を調製した。アニーリング後凍結乾燥したCy3標識VE−siRNA(1mg)を本混合ミセル液で溶解し、上記実施例12(1)の中空型坐剤に注入した後、同坐剤基剤で密封することで、Cy3標識VE−siRNAを含有する中空坐剤を調製した。なお、Cy3標識VE−siRNA(1mg)の混合ミセル液に、PBSを添加して全量200μLとした注腸剤をポジティブの対照製剤とした。
ラット(Wistar、オス、7週齢、体重180g)を一夜絶食させ、薬剤投与2時間前より、濃縮ミルク(乳脂肪分20%)を1.2mLずつ30分おきに3回投与した。最終のミルク投与から30分後、ネンブタール麻酔し、各製剤を肛門部より投与後、肛門部を結紮した。投与4時間後、実施例2記載の方法に従い、肝臓と大腸を摘出し、共焦点顕微鏡によるsiRNAの分布を観察した。図11に肝臓組織を観察した結果を示す。図11aは注腸剤を投与した場合の結果を示し、図11bは中空坐剤を投与した場合の結果を示し、図11cは図11bの枠内の拡大図を示す。また、図11a〜cの各パネルは4分割されているが、それぞれ左上はTO−PRO(登録商標)−3の青色蛍光の検出結果を示し、右上はFITC−ファロイジンの緑色蛍光の検出結果を示し、左下はCy3の赤色蛍光の検出結果を示し、右下は左上と右上と左下の蛍光の検出結果を重ね合わせた結果を示す。
中空坐剤は製造工程がやや複雑であり、また、中空坐剤内部に液状製剤を充填した場合は、坐剤投与して液状製剤が腸内に放出された後は、注腸剤と同様に、腸管腔内での希釈や酵素分解などが課題となる。一方、中空坐剤内部に固形製剤を充填した通常の坐剤を調製する方法としては、VE−siRNA混合ミセル液を凍結乾燥して坐剤基剤に均質添加する方法が考えられるが、VE−siRNA混合ミセル液の凍結乾燥製剤の品質制御には課題が多い。そこで、発明者らは、多くの中空部を有する多孔性微粒子を用いることで、VE−siRNAの混合ミセル液を簡便に粉末固形化し、汎用される油脂性坐剤基剤中に均質に混合分散して坐剤を調製する方法を考案した。この製剤によれば、製造工程が簡便であるという利点や、多孔性微粒子内に保持されたVE−siRNAが腸管腔内での酵素による分解や希釈から保護されるという利点が得られる。
エチルセルロース(日新化成社製、STD 7cps)2gをアセトン16gに溶解した(A液)。また、グリセリン7gと5%ポリビニルアルコール(クラレ社製、クラレポバール220C)水溶液1gを混和した(B液)。A液中にB液を、乳化機(ヒスコトロン(登録商標)、マイクロテック・ニチオン社製)を用いて1分間処理し乳化した(油相)。一方、グリセリン45gと5%ポリビニルアルコール(クラレ社製、クラレポバール220C)水溶液5gを混和した液を調製し、スリーワンモーターにて600rpmで撹拌下、油相を注入し、1分間撹拌した。得られた乳化液を、直ちに500mLの精製水中に注ぎ、撹拌して、油相を固化させた後、目開き20μmのふるいを用いてp−MSを減圧濾過した。濾取したp−MSは、100mLの精製水で2回洗浄した後、少量の精製水にて再懸濁させ、凍結乾燥した。得られた多孔性マイクロスフェアを走査型電子顕微鏡で観察した結果を図12に示す。
Cy3標識VE−siRNA(10mg/mL)/50mM LA/HCO−60の混合ミセル40μLをp−MS 9mgに含浸させた後、JAPOCIRE(登録商標)NA 15 PASTILLES:ダイズ油=9:1の混合基剤500μL中に均質に混和・分散させて、Cy3標識VE−siRNA/p−MS含有坐剤を作製した(図13)。また、対照製剤として、上記の高濃度混合ミセル/Cy3標識VE−siRNA含有p−MSを生理食塩水500μLに分散した溶液を注腸剤として調製した。なお、上記の「JAPOCIRE(登録商標)NA 15 PASTILLES」とは、Gattefosse社製の坐剤用基剤の1種であり、具体的には、炭素数12〜18の飽和脂肪酸の半合成トリグリセリド基剤(水酸基価10;融点34.5±1.0)である。日本では、かかる製品を例えばCBC株式会社から購入することができる。
実施例12に従い、一夜絶食したラット(Wistar、オス、4週齢、体重80g)に、濃縮ミルク(乳脂肪分20%)を0.5mlずつ30分おきに3回投与した後、最後のミルク投与から30分後にネンブタール麻酔をかけ、腸管洗浄後、各製剤を肛門部より投与した。投与後肛門部を結紮し、ボールマンケージ内にラットを保持した。投与6時間後、実施例2記載の方法にしたがい、肝臓、大腸、腎臓、心臓、筋肉、小腸を摘出し、共焦点顕微鏡法により、各製剤投与後のsiRNAの分布を観察した。図14は、コントロール用p−MS注腸剤(図14a)、または、p−MS坐剤製剤(図14b)投与後の肝臓の組織像を示す。図14a及びbの各パネルは縦に4分割されているが、それぞれ一番上はTO−PRO(登録商標)−3の青色蛍光の検出結果を示し、上から2番目はFITC−ファロイジンの緑色蛍光の検出結果を示し、上から3番目はCy3の赤色蛍光の検出結果を示し、一番下は上の3つの蛍光の検出結果を重ね合わせた結果を示す。
図14a、bのいずれの場合も、一部の領域でCy3の蛍光に基づくVE−siRNAの移行が観察された。特にp−MS坐剤製剤の投与で、蛍光の強度自体は低いものの、多くの肝細胞内でCy3の蛍光が検出された。
マウスapoB遺伝子を標的遺伝子とするsiRNA以外の、本発明における生理活性物質として、トランスサイレチン(TTR)遺伝子を標的遺伝子とするsiRNAを用いた試験を試みた。かかるsiRNAとして、配列番号3(5’-GUAACCAAGAGUAUUCCAUUUUUACUA-3’)からなるセンス鎖(27mer)と、配列番号4(5’-UAGUAAAAAUGGAAUACUCUUGGUUACAC-3’)からなるアンチセンス鎖(29mer)からなるsiRNAを合成して用いた。
TTR遺伝子に対する上記siRNAのアンチセンス鎖5’末端に、リポタンパク質導入物質として、ビタミンEの天然型アイソマーの一つであるα−トコフェロール(Toc)をリン酸結合で共有結合させて、VE−siRNAを作製した。
上記実施例2(1)で用いたVE−siRNAに代えて、上記実施例14(1)で得たVE−siRNAを用いたこと以外は、上記実施例2(1)記載の方法にしたがって、注腸剤(HCO−60/LA/VE−siRNA)を調製した。また、コントロールとして、VE−siRNAに代えて、PBSを混合ミセル液と混合して、コントロール注腸剤(HCO−60/LA/PBS)を調製した。
ヒトトランスサイレチン(hTTR)遺伝子を持つトランスジェニックマウスである、hTTR V30M Tgマウス(メス、6月齢、体重30g、一群5匹)をネンブタール麻酔し、肛門部付近に残存する糞を軽微な下腹部マッサージにより排出させた後、上記(2)にて調製した各注腸剤をそれぞれ肛門部より投与した(一回投与量:10mg/kg)。投与後、肛門部をクリップで止めた状態で、20分間マウスを静置した後、クリップをはずし、マウスを通常の飼育ケージに戻した。この投与方法を4時間毎に、一日3回、連続5日間行った。投与前、また投与開始後6日目、9日目、12日目の時点で採血を行い、全血を遠心分離して血清を採取した。各血清中のhTTRの濃度(mg/dL)を測定した。投与前の血清、及び、投与開始12日目の血清中のhTTRの濃度(mg/dL)を図16に示す。図16から分かるように、TTRに対するVE−siRNAと、本混合ミセルとからなる注腸剤を投与することにより、血清におけるTTR分泌タンパク質を抑制し得ることが実証された。
Claims (13)
- 少なくとも以下の(a)及び(b)を含有することを特徴とする、経大腸吸収用医薬組成物;
(a)細胞内に作用部位を有し、且つ、リポタンパク質導入物質が結合した生理活性物質;
(b)前記生理活性物質の大腸粘膜上皮透過性亢進作用を有する化合物。 - 大腸粘膜上皮透過性亢進作用を有する化合物として、界面活性剤を更に含有することを特徴とする請求項1に記載の医薬組成物。
- リポタンパク質導入物質が、カイロミクロン又はカイロミクロンレムナントへの導入物質であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
- リポタンパク質導入物質が、脂溶性ビタミン又はコレステロールであることを特徴とする、請求項3に記載の医薬組成物。
- 脂溶性ビタミンがビタミンE又はその誘導体であることを特徴とする、請求項4に記載の医薬組成物。
- 生理活性物質を肝臓細胞へ特異的に送達することができることを特徴とする、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
- リポタンパク質導入物質と結合させた生理活性物質の分子量が、1000〜150000ダルトンの範囲内であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
- 生理活性物質が、標的遺伝子の発現を抑制する核酸であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
- 核酸が、siRNA、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴmir、核酸アプタマー、リボザイム及びデコイからなる群から選択される1種又は2種以上の核酸であることを特徴とする、請求項8に記載の医薬組成物。
- 大腸粘膜上皮透過性亢進作用を有する化合物が、以下の(c)又は(d)のいずれか1つ以上を含む、請求項1又は2に記載の医薬組成物;
(c)中鎖脂肪酸又は長鎖不飽和脂肪酸;
(d)前記(c)記載の脂肪酸の、塩、エステル体又はエーテル体。 - 大腸粘膜上皮透過性亢進作用を有する化合物が、リノール酸、オレイン酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、カプリン酸又はラウリン酸、或いは、それらの塩、エステル体又はエーテル体であることを特徴とする、請求項10に記載の医薬組成物。
- 界面活性剤が、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート、ポリエチレングリコール、ポロキサマー、モノアシルグリセリン、モノアシルソルビタン又は脂肪酸ショ糖エステル類であることを特徴とする、請求項2に記載の医薬組成物。
- 大腸投与剤、経口腸溶剤又は経口薬物送達システムである、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
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