JPWO2011040613A1 - 腫瘍治療剤 - Google Patents
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Abstract
Description
また、本発明者らは、がん細胞にmiR27bを導入することによりRPN2の発現が抑制されることを新たに見出した。RPN2については、RPN2発現を抑制すればがん転移が抑制されることが知られている(Nat. Med. 2008 Sep; 14(9): 939-48)。
さらに、がん幹細胞は、一般的な抗腫瘍剤に抵抗性があり、腫瘍の再発や転移に深く関与しているといわれているが、このがん幹細胞においてmiR27bの発現量が低下していることが判明し、乳がん幹細胞にpre-miR27bを導入するとCD44発現細胞が抑制され、がん幹細胞の割合が減少することを新たに見出した。
本発明者らは、これらの知見により、(1)miR27bは薬剤耐性がんの治療に有用である、(2)miR27bはRPN2の発現を抑制することによりがん転移を抑制することができる、(3)miR27bはがん幹細胞分化療法に有用である、(4)miR27bの発現を指標に薬剤耐性がんやがん幹細胞を判定することができる、ことを見出して本発明を完成させた。
[1]miR27bまたは配列番号1で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を含む、腫瘍の治療剤。
[2]核酸が一本鎖または二本鎖である、[1]に記載の治療剤。
[3]miR27bが配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチドである、[1]に記載の治療剤。
[4]核酸が配列番号1で表されるヌクレオチド配列またはその部分配列からなるRNA、或いはその修飾体である、[1]に記載の治療剤。
[5]核酸が配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるRNAまたはその修飾体である、[1]に記載の治療剤。
[6]miR27bを含む核酸が、miR27bおよびその前駆体からなる群から選ばれる少なくとも一種の核酸である、[1]に記載の治療剤。
[7]前駆体が、miR27bのpri-miRNAまたはpre-miRNAである、[6]に記載の治療剤。
[8]腫瘍が薬剤耐性がんである、[1]に記載の治療剤。
[9]腫瘍が薬剤耐性乳がんまたは薬剤耐性肺がんである、[8]に記載の治療剤。
[10]腫瘍の転移を抑制または予防するための、[1]に記載の治療剤。
[11]がん再発を抑制または予防するための、[1]に記載の治療剤。
[12]がんが乳がんまたは肺がんである、[11]に記載の治療剤。
[13](A) miR27bまたは配列番号1で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸と、
(B) 抗腫瘍剤
とを併用してなる腫瘍の治療剤。
[14]腫瘍が薬剤耐性がんである、[13]に記載の治療剤。
[15]腫瘍が薬剤耐性乳がんまたは薬剤耐性肺がんである、[13]に記載の治療剤。
[16]腫瘍におけるmiR27bの発現レベルもしくは濃度を測定すること、および該発現レベルもしくは該濃度と薬剤耐性との間の負の相関に基づき、薬剤耐性がんを判定する方法。
[17]腫瘍におけるmiR27bの発現レベルを測定することにより、がん幹細胞を判定する方法。
[18]がん幹細胞が乳がん幹細胞または肺がん幹細胞である、[17]記載の方法。
[19]腫瘍におけるmiR27bの発現レベルもしくは濃度を測定し、がん幹細胞の有無を判定することにより、がん治療の予後を判定する方法。
[20]がん幹細胞が乳がん幹細胞または肺がん幹細胞である、[19]記載の方法。
[21]miR27bを特異的に検出し得る核酸プローブを含む、薬剤耐性がんを判定するための剤。
[22]miR27bを特異的に検出し得る核酸プローブを含む、がん幹細胞を判定するための剤。
[23]がん幹細胞が乳がん幹細胞または肺がん幹細胞である、[22]記載の剤。
[24]以下の工程を含む、薬剤耐性がんの増殖を抑制し得る物質を探索する方法:
(1)被検物質とmiR27bの発現を測定可能な細胞とを接触させること;
(2)被検物質を接触させた細胞におけるmiR27bの発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞におけるmiR27bの発現量と比較すること;並びに
(3)上記(2)の比較結果に基づいて、miR27bの発現量を上昇制御する被検物質を、薬剤耐性がんの増殖を阻害し得る物質として選択すること。
[25]以下の工程を含む、腫瘍の転移または腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質を探索する方法:
(1)被検物質とmiR27bの発現を測定可能な細胞とを接触させること;
(2)被検物質を接触させた細胞におけるmiR27bの発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞におけるmiR27bの発現量と比較すること;並びに
(3)上記(2)の比較結果に基づいて、miR27bの発現量を上昇制御する被検物質を、腫瘍の転移または腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質として選択すること。
[26]哺乳動物に対して、有効量のmiR27bまたは配列番号1で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍を治療する方法。
[27]腫瘍が薬剤耐性がんである、[26]に記載の方法。
[28]腫瘍が薬剤耐性乳がんまたは薬剤耐性肺がんである、[26]に記載の方法。
[29]哺乳動物に対して、有効量のmiR27bまたは配列番号1で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍の転移を抑制または予防する方法。
[30]哺乳動物に対して、有効量のmiR27bまたは配列番号1で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を投与することを含む、該哺乳動物におけるがん再発を抑制または予防する方法。
[31]がんが乳がんまたは肺がんである、[30]に記載の方法。
[32]哺乳動物に対して、有効量の
(A) miR27bまたは配列番号1で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸と、
(B) 抗腫瘍剤
を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍の治療方法。
[33]腫瘍が薬剤耐性がんである、[32]に記載の方法。
[34]腫瘍が薬剤耐性乳がんまたは薬剤耐性肺がんである、[32]に記載の方法。
[35]哺乳動物に対して、有効量の
(A) miR27bまたは配列番号1で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸と、
(B) 抗腫瘍剤
を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍の転移を抑制または予防する方法。
[36]哺乳動物に対して、有効量の
(A) miR27bまたは配列番号1で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸と、
(B) 抗腫瘍剤
を投与することを含む、該哺乳動物におけるがん再発を抑制または予防する方法。
[37]がんが乳がんまたは肺がんである、[36]に記載の方法。
また本発明により、薬剤耐性がんを判定する方法、がん幹細胞を判定する方法、がん治療の予後を判定する方法、薬剤耐性がんまたはがん幹細胞を判定するための剤、薬剤耐性がんの増殖を抑制する作用を有する物質のスクリーニング方法、および腫瘍の転移を阻害する作用を有する物質のスクリーニング方法等も提供することができる。
本発明者らは、今回このmiR27bが、(1)薬剤耐性がん細胞の増殖を抑制する機能を有すること(実施例参照、後述)、(2)RPN2発現抑制活性を有するので(実施例参照、後述)、がん細胞の転移を抑制する機能を有すること、(3)がん幹細胞分化療法に有効であるので(実施例参照、後述)、がん再発を抑制または予防する機能を有すること、を見出し、miR27bが腫瘍治療剤の有効成分として利用可能であることを見出した。
即ち、本発明は、miR27bまたは配列番号1で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を含む剤を提供するものである。
すなわち、本発明の剤は、薬剤耐性がんの治療剤乃至細胞増殖抑制剤、腫瘍の転移の抑制または予防剤、およびがん再発を抑制または予防する剤として有用である。
即ち、転移能を有するヒト骨肉腫細胞株である143B細胞を1x106細胞/6cm dishで終夜培養後、DharmaFECT transfection(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)によって核酸を30nM導入する。48時間後の細胞を用いてCytoSelectTM 96-Well Cell Invasion Assay kit(Cell Biolab社製)により、細胞浸潤アッセイを行い、20時間後の浸潤細胞数を計測する。
また、核酸自体を修飾してもよい。また、例えば、miR27bと同一の領域と、その配列と60%〜100%未満相補的である相補領域とを含む合成核酸であってもよい。WO 2006/627171に記載のような合成RNA分子としてもよい。
miR27bのpri-miRNAやpre-miRNAは公知の分子であり、例えばサンガー研究所が作成しているmiRBaseデータベース:http://microrna.sanger.ac.uk/等に開示されている。miR27bの好適なpre-miRNAとしては、下記の配列番号2(MI0000440)で表されるヌクレオチド配列からなる1本鎖RNAを挙げることが出来る。
非経口的な投与に好適な別の製剤としては、噴霧剤等を挙げることが出来る。
また、本発明の核酸は、RPN2発現抑制活性を有するので、本発明の剤を、腫瘍の患者や、腫瘍の転移リスクを有する腫瘍の治療後の患者等に対して投与することにより、腫瘍の転移を抑制し、腫瘍の転移に起因する疾患を治療または予防することが出来る。
さらに、本発明の核酸は、実施例に記載のように、がん幹細胞を非がん幹細胞に変える活性を有する。がん幹細胞は、一般的な抗腫瘍剤に抵抗性があり、腫瘍の再発や転移に深く関与しているといわれているため(瀬戸口啓夫ら 蛋白質核酸酵素 Vol.50 No.15 1999(2005)、家田敬輔ら がん分子標的治療 Vol.5 No.3 187(2007))、本発明の剤を腫瘍の患者に対して投与すれば、腫瘍におけるがん幹細胞数を減少させることができ、がん再発や転移を抑制または予防することが出来る。
従って、本発明の剤は、腫瘍の治療剤として極めて有用である。
「転移抑制」とは、腫瘍細胞が原発巣から異なる部位へ到達し、該部位において腫瘍を二次的に生じることを抑制することを意味する。
「がん幹細胞」とは、自己複製能とがん形成能を併せもつ細胞で、抗がん剤・放射線療法に耐性でがん再発の原因細胞を意味する。
薬剤耐性がんとしては、例えば、上述の腫瘍で且つ薬剤耐性のがんが例示でき、好ましくは薬剤耐性乳がんや薬剤耐性肺がん、より好ましくは薬剤耐性乳腺がん(乳管がん)が挙げられる。
また、腫瘍の転移に起因する疾患としては、例えば、転移性がん、腫瘍の増大やがん性胸膜炎による呼吸不全等が挙げられる。
本発明の剤は、腫瘍組織においてmiR27b発現量が減少している患者に投与するのが望ましい。
本発明の核酸と抗腫瘍剤とを併用することによって、腫瘍そのものの増殖を抑制するとともに、薬剤耐性がんの増殖抑制、腫瘍の転移抑制、およびがん幹細胞数が減少する効果が得られるため、根治的に腫瘍を治療することができる。従って、本発明は、上述の本発明の核酸と抗腫瘍剤とを併用してなる腫瘍治療剤を提供するものである。
投与対象としては、好ましくは薬剤耐性がん患者、転移性がん患者、がん再発患者、がん再発リスクのある患者を挙げることができる。
本発明の剤は腫瘍組織においてmiR27b発現量が減少している患者に投与することが望ましい。
本発明の併用剤は、上記(1.本発明の剤)の項において「本発明の剤が適用できる腫瘍」として詳述されている腫瘍に適用することができる。本発明の併用剤は、具体的には、薬剤耐性がん、転移性がん、がん再発のリスクがあるがんに適用するのが好ましい。
本発明は、腫瘍におけるmiR27bの発現レベルを測定すること、および該発現レベルと薬剤耐性との間の負の相関に基づき、薬剤耐性がんであるかどうかについて判定することを含む、薬剤耐性がんを判定する方法を提供するものである。
また、核酸プローブは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素(例:125I、131I、3H、14C等)、酵素(例:β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等)、蛍光物質(例:フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等)、発光物質(例:ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等)などで標識されていてもよい。あるいは、蛍光物質(例:FAM、VIC等)の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー(消光物質)がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
そして、miR27bの発現レベルの比較結果より、測定対象のmiR27bの発現レベルが相対的に低い場合には、腫瘍が薬剤耐性がんである可能性が相対的に高いと判定することができる。逆に、測定対象のmiR27bの発現レベルが相対的に高い場合には、腫瘍が薬剤耐性がんである可能性が相対的に低いと判定することができる。
本発明は、腫瘍細胞におけるmiR27bの発現レベルを測定すること、および該発現レベルとがん幹細胞との間の負の相関に基づき、がん幹細胞であるかどうかについて判定することを含む、がん幹細胞を判定する方法を提供するものである。
また、核酸プローブは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素(例:125I、131I、3H、14C等)、酵素(例:β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等)、蛍光物質(例:フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等)、発光物質(例:ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等)などで標識されていてもよい。あるいは、蛍光物質(例:FAM、VIC等)の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー(消光物質)がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
本発明はまた、被検物質がmiR27bの発現を増強するか否かを評価することを含む、薬剤耐性がんの増殖を抑制する物質を探索する方法、腫瘍の転移または腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質を探索する方法、がん幹細胞を非がん幹細胞に変える物質を探索する方法、並びに当該方法により得られうる物質を提供する。本発明の探索方法においては、miR27bの発現を上方制御する物質が、薬剤耐性がんの増殖を抑制しえる物質、腫瘍の転移または腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質、またはがん幹細胞機能抑制剤として選択される。
(1)被検物質とmiR27bの発現を測定可能な細胞とを接触させること;
(2)被検物質を接触させた細胞におけるmiR27bの発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞におけるmiR27bの発現量と比較すること;並びに
(3)上記(2)の比較結果に基づいて、miR27bの発現量を上昇制御する被検物質を、腫瘍の転移または腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質として選択すること。
MCF7細胞およびMCF7-ADR細胞をDMEM培地にウシ胎児血清(FBS)を10%添加した培地を用いて培養し、両細胞株からマイクロRNAをmirVana RNA Isolation kit (Life Technologies社製) を用いてキット添付のプロトコールに従って抽出した。次に、得られたマイクロRNAを鋳型としてTaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit (Life Technologies社製) およびmiR27b TaqMan MicroRNA Assay、U6 TaqMan MicroRNA Assay (Life Technologies社製) を用いて逆転写反応を行った。即ち、マイクロRNA 5 μL、100 mM dNTPs (with dTTP) 0.15 μL、MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U/μL) 1 μL、10×Reverse Transcription Buffer 1.5 μL、RNase Inhibitor (20 U/μL) 0.19 μL、Nuclease-free water 4.16 μL、TaqMan MicroRNA Assay (5×) 3 μLを混合し、16℃ 30分間、42℃ 30分間、85℃ 5分間の保温を行った。続いて、当該反応液の15倍希釈液 1.33 μL、TaqMan MicroRNA Assay (20×) 1 μL、TaqMan 2×Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNGa (Life Technologies社製) 10 μL、Nuclease-free water 7.67 μLを混合し、95℃ 10分間の保温後、95℃ 15秒間、60℃ 1分間の保温サイクルを40回繰り返すPCR反応を7300 Real Time PCR System (Life Technologies社製) を用いて行うことにより、MCF7、MCF7-ADR細胞におけるmiR27b、U6の発現量を定量した。その結果、図1に示される通り、MCF7細胞と比較してMCF7-ADR細胞におけるmiR27bの発現量が減少していることが分かった。
(1)FLuc-hRPN2-3’UTRの構築
ヒト乳がんcDNAライブラリー溶液 2 μL、配列番号3で示された塩基配列からなるプライマー 100 pmol、配列番号4で示される塩基配列からなるプライマー 100 pmol、Taqポリメラーゼ(Life Technologies社製)0.1 μL、Taqポリメラーゼ添付のバッファー 2 μLおよびTaqポリメラーゼ添付のdNTP mixture 2 μLを含む20 μLの反応液を調製した。PCRは、まず95℃で9分間処理し、次いで95℃で30秒間、62℃で30秒間、更に72℃で1分間からなる保温サイクルを25回繰り返し、最後に72℃で5分間保温する条件にて行われた。PCR後、アガロース電気泳動で約281 bpを示すPCR産物を回収した。次いで回収されたPCR産物をpGL-3 vector (Promega社製) のXbaIサイトにサブクローニングした後、当該プラスミドでE. coli DH5α株コンピテントセル(TOYOBO社製)を形質転換した。形質転換された細胞を50 μg/mL カナマイシン含有LB培地 100 mLで培養することにより得られる培養菌体から、QIAGEN Plasmid Maxi kit (QIAGEN社製) を用いて分離・精製することにより、ヒト由来RPN2遺伝子の3’UTR領域をFirefly luciferase遺伝子の3’側に連結したプラスミドFLuc-hRPN2-3’UTRを得た。得られたプラスミドを鋳型として、BigDye(登録商標)Terminator v3.1 Cycle Sequencing キット(Life Technologies社製)およびABI PRISM(登録商標)3100 Genetic Analyzer配列読み取り装置(Life Technologies社製)を用いて配列番号5で示される塩基配列からなるヒト由来RPN2遺伝子の3’UTR領域の塩基配列を決定した。
つぎにmiR27bのRPN2発現抑制活性を上記(1)記載の方法で得られたFLuc-hRPN2-3’UTRを用いて評価した。50000 cells/mlに調製したMCF7-ADR細胞を96-wellプレート上にそれぞれ100 μl撒き、37℃で一晩インキュベートした。翌日、FLuc-hRPN2-3’UTR 300 ng、Renilla luciferase expression vector 50 ng、および2 μMのPre-miRTM miRNA27b Precursor Molecule (Life Technologies社製) もしくはPre-miRTM miRNA Precursor Molecules-Negative Control (NC1) (Life Technologies社製) 1 μlをLipofectamine 2000試薬 (Invitrogen社製) を用いて上述した細胞にトランスフェクションした。次いで、当該細胞を5% CO2存在下、37℃で1日間培養した後、Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega社製)を用いてホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの発現量をEnvision 2101 Multilabel Reader(パーキンエルマー社製)で測定した。その結果、Pre-miRTM miRNA27b Precursor Molecule (Life Technologies社製) を導入した細胞のルシフェラーゼ活性はコントロールであるPre-miRTM miRNA Precursor Molecules-Negative Control (NC1) (Life Technologies社製) を導入した細胞と比較して減少していることが分かった (図2)。即ち、miR27bによりRPN2発現が抑制されることが示された。
(1)FLuc-hMDR1-3’UTRの構築
MCF7-ADR細胞由来のcDNAライブラリー溶液 2 μL、配列番号6で示された塩基配列からなるプライマー 100 pmol、配列番号7で示される塩基配列からなるプライマー 100 pmol、Taqポリメラーゼ(Life Technologies社製)0.1 μL、Taqポリメラーゼ添付のバッファー 2 μLおよびTaqポリメラーゼ添付のdNTP mixture 2 μLを含む20 μLの反応液を調製した。PCRは、まず95℃で9分間処理し、次いで95℃で30秒間、62℃で30秒間、更に72℃で1分間からなる保温サイクルを25回繰り返し、最後に72℃で5分間保温する条件にて行われた。PCR後、アガロース電気泳動で約575 bpを示すPCR産物を回収した。次いで回収されたPCR産物をpGL3 vector (Promega社製) のXbaIサイトにサブクローニングした後、当該プラスミドでE. coli DH5α株コンピテントセル(TOYOBO社製製)を形質転換した。形質転換された細胞を50 μg/mL カナマイシン含有LB培地 100 mLで培養することにより得られる培養菌体から、QIAGEN Plasmid Maxi kit (QIAGEN社製) を用いて分離・精製することにより、ヒト由来RPN2遺伝子の3’UTR領域をFirefly luciferase遺伝子の3’側に連結したプラスミドFLuc-hMDR1-3’UTRを得た。得られたプラスミドを鋳型として、BigDye(登録商標)Terminator v3.1 Cycle Sequencing キット(Life Technologies社製)およびABI PRISM(登録商標)3100 Genetic Analyzer配列読み取り装置(Life Technologies社製)を用いて配列番号8で示される塩基配列からなるヒト由来MDR1遺伝子の3’UTR領域の塩基配列を決定した。
つぎにmiR27bのMDR1発現抑制活性を上記(1)記載の方法で得られたFLuc-hMDR1-3’UTRを用いて評価した。50000 cells/mlに調製したMCF7-ADR細胞を96-wellプレート上にそれぞれ100 μl撒き、37℃で一晩インキュベートした。翌日、FLuc-hRPN2-3’UTR 300 ng、Renilla luciferase expression vector 50 ng、および2 μMのPre-miRTM miRNA27b Precursor Molecule (Life Technologies社製) もしくはPre-miRTM miRNA Precursor Molecules-Negative Control (NC1) (Life Technologies社製) 1 μlをLipofectamine 2000試薬 (Invitrogen社製) を用いて上述した細胞にトランスフェクションした。次いで、当該細胞を5% CO2存在下、37℃で1日間培養した後、Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega社製)を用いてホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの発現量をEnvision 2101 Multilabel Reader(パーキンエルマー社製)で測定した。その結果、Pre-miRTM miRNA27b Precursor Molecule (Life Technologies社製) を導入した細胞のルシフェラーゼ活性は、コントロールであるPre-miRTM miRNA Precursor Molecules-Negative Control (NC1) (Life Technologies社製) を導入した細胞と比較して減少していた (図3)。即ち、miR27bによりMDR1発現が抑制されることが示された。
1×106個のMCF7細胞と10 μLのCD24-PE抗体(BDバイオサイエンス社製)を4℃、30分間インキュベートした。PBSを用いて細胞を2度洗浄した後、5 μLの0.1 mg/mL Propidium iodideを含む500 μLのPBSに細胞を懸濁した。得られた細胞懸濁液をCell sorter (ベイバイオサイエンス社製) に供し、CD24陽性細胞群(がん細胞群)とCD24陰性細胞群 (がん幹細胞群) に分画した。両細胞画分からmirVana miRNA isolation kit(Life Technologies社製)を用いてRNAを調製し、参考例1記載の方法でmiR27bの発現量を定量した。その結果、CD24陰性細胞群 (がん幹細胞群) においてmiR27bの発現量が低下していることが分かった (図4)。
(1)FLuc-hCD44-3’UTRの構築
MCF7-ADR細胞由来のcDNAライブラリー溶液 2 μL、配列番号9で示された塩基配列からなるプライマー 100 pmol、配列番号10で示される塩基配列からなるプライマー 100 pmol、Taqポリメラーゼ(Life Technologies社製)0.1 μL、Taqポリメラーゼ添付のバッファー 2 μLおよびTaqポリメラーゼ添付のdNTP mixture 2 μLを含む20 μLの反応液を調製した。PCRは、まず95℃で9分間処理し、次いで95℃で30秒間、62℃で30秒間、更に72℃で1分間からなる保温サイクルを25回繰り返し、最後に72℃で5分間保温する条件にて行われた。PCR後、アガロース電気泳動で約840 bpを示すPCR産物を回収した。次いで回収されたPCR産物をpGL-3 vector (Promega社製) のXbaIサイトにサブクローニングした後、当該プラスミドでE. coli DH5α株コンピテントセル(TOYOBO社製)を形質転換した。形質転換された細胞を50 μg/mL カナマイシン含有LB培地100 mLで培養することにより得られる培養菌体から、QIAGEN Plasmid Maxi kit (QIAGEN社製) を用いて分離・精製することにより、ヒト由来RPN2遺伝子の3’UTR領域をFirefly luciferase遺伝子の3’側に連結したプラスミドFLuc-hCD44-3’UTRを得た。得られたプラスミドを鋳型として、BigDye(登録商標)Terminator v3.1 Cycle Sequencing キット(Life Technologies社製)およびABI PRISM(登録商標)3100 Genetic Analyzer配列読み取り装置(Life Technologies社製)を用いて配列番号11で示される塩基配列からなるヒト由来CD44遺伝子の3’UTR領域の塩基配列を決定した。
つぎにmiR27bのCD44発現抑制活性を上記(1)記載の方法で得られたFLuc-hCD44-3’UTRを用いて評価した。50000 cells/mlに調製したMCF7-ADR細胞を96-wellプレート上にそれぞれ100 μl撒き、37℃で一晩インキュベートした。翌日、FLuc-hRPN2-3’UTR 300 ng、Renilla luciferase expression vector 50 ng、および2 μMのpre-miR27bもしくはNC1 (Life Technologies社製) 1 μlをLipofectamine 2000試薬 (Invitrogen社製) を用いて上述した細胞にトランスフェクションした。次いで、当該細胞を5% CO2存在下、37℃で1日間培養した後、Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega社製)を用いてホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの発現量をEnvision 2101 Multilabel Reader(パーキンエルマー社製)で測定した。その結果、Pre-miRTM miRNA27b Precursor Molecule (Life Technologies社製) を導入した細胞のルシフェラーゼ活性はコントロールであるPre-miRTM miRNA Precursor Molecules-Negative Control (NC1) (Life Technologies社製) を導入した細胞と比較して減少していた (図5)。即ち、miR27bによりCD44発現が抑制されることが示された。
(1)miR27b発現ベクターの作製
配列番号12で示される塩基配列からなる10 nMの合成miR27b 4 μlとpcDNA6.2-GW/EmGFP-miR (Invitrogen社製) 10 ngを混合した後、ligationキット(Invitrogen社製)を用いて室温で5分間ライゲーション反応した。反応後、当該ライゲーション反応液 2 μLおよびE. coli TOP10株コンピテントセル(Invitrogen社製)を用いて、E. coli TOP10形質転換細胞を得た。形質転換された細胞を50 μg/mLスペクチノマイシン含有LB培地100 mLで培養することにより得られる培養菌体から、QIAGEN Plasmid Maxi kitを用いて分離・精製することにより、miR27b発現ベクターであるところのpcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-miR27bを得た。
MCF7-ADR-luc細胞に上述した方法で作製されたpcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-miR27bをLipofectamine 2000試薬を用いて導入した。該細胞を2 μg/mLのBlastcidinを含む培地にて14日間培養を継続した後、生き残った細胞を単離し、miR27b恒常発現細胞を得た。一方、これと同様の方法でpcDNA6.2-GW/EmGFP-miRを導入した細胞を作製し、以降の実験のコントロール細胞に使用した。
10,000 cells/mlに調製したmiR27b恒常発現MCF7-ADR-luc細胞とコントロール細胞を96穴プレートに播き込み、4日間、細胞増殖活性をTetracolor one for cell proliferation assay (生化学工業製) を用いて測定した。その結果、miR27b恒常発現細胞の細胞増殖速度がコントロール細胞と比較して遅いことが分かった (図6)。
1×106個のmiR27b恒常発現MCF7-ADR-luc細胞とコントロール細胞をそれぞれ10 μLのCD24-PE抗体(BDバイオサイエンス社製)と4℃、30分間インキュベートした。PBSを用いて細胞を2度洗浄した後、5 μLの0.1 mg/mL Propidium iodideを含む500 μLのPBSに細胞を懸濁した。得られた細胞懸濁液をCell sorter (ベイバイオサイエンス社製) に供し、GFP、CD24共に陽性の細胞群(がん細胞群)とGFP陽性、CD24陰性の細胞群 (がん幹細胞群) の細胞数を計測したところ、miR27b恒常発現MCF7-ADR-luc細胞のがん幹細胞群の割合がコントロール細胞に比べて減少しているのに対して非がん幹細胞群の割合が増加していることが分かった (図7)。
肺がん細胞株であるPC14細胞および薬剤耐性肺がん細胞株PC14-CDDP細胞をDMEM培地にウシ胎児血清(FBS)を10%添加した培地を用いて培養し、両細胞株からマイクロRNAをmirVana RNA Isolation kit (Life Technologies社製) を用いてキット添付のプロトコールに従って抽出した。次に、得られたマイクロRNA を鋳型としてTaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit (Life Technologies社製) およびmiR27b TaqMan MicroRNA Assay、U6 TaqMan MicroRNA Assay (Life Technologies社製) を用いて逆転写反応を行った。即ち、マイクロRNA 5 μL、100 mM dNTPs (with dTTP) 0.15 μL、MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U/μL) 1 μL、10×Reverse Transcription Buffer 1.5 μL、RNase Inhibitor (20 U/μL) 0.19 μL、Nuclease-free water 4.16 μL、TaqMan MicroRNA Assay (5×) 3 μLを混合し、16℃ 30分間、42℃ 30分間、85℃ 5分間の保温を行った。続いて、当該反応液の15倍希釈液 1.33 μL、TaqMan MicroRNA Assay (20×) 1 μL、TaqMan 2×Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNGa (Life Technologies社製) 10 μL、Nuclease-free water 7.67 μLを混合し、95℃ 10分間の保温後、95℃ 15秒間、60℃ 1分間の保温サイクルを40回繰り返すPCR反応を7300 Real Time PCR System (Life Technologies社製) を用いて行うことにより、MCF7、MCF7-ADR細胞におけるmiR27b、U6の発現量を定量した。その結果、図8に示される通り、PC14細胞と比較してPC14-CDDP細胞におけるmiR27bの発現量が減少していることが分かった。
同じ細胞数のmiR27b恒常発現MCF7-ADR-luc細胞とコントロール細胞をヌードマウスの乳腺付近にそれぞれ移植する。移植後毎日、生体イメージングによりルシフェラーゼ発光量を計測すると、同じ細胞数移植したにも関わらず、miR27b恒常発現MCF7-ADR-luc細胞の発光量はコントロール細胞に比べて減少していることが示される。すなわち、miR27bを強制発現させることで、腫瘍形成能が落ちることが分かる。
Claims (25)
- miR27bまたは配列番号1で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を含む、腫瘍の治療剤。
- 核酸が一本鎖または二本鎖である、請求項1に記載の治療剤。
- miR27bが配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチドである、請求項1に記載の治療剤。
- 核酸が配列番号1で表されるヌクレオチド配列またはその部分配列からなるRNA、或いはその修飾体である、請求項1に記載の治療剤。
- 核酸が配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるRNAまたはその修飾体である、請求項1に記載の治療剤。
- miR27bを含む核酸が、miR27bおよびその前駆体からなる群から選ばれる少なくとも一種の核酸である、請求項1に記載の治療剤。
- 前駆体が、miR27bのpri-miRNAまたはpre-miRNAである、請求項6に記載の治療剤。
- 腫瘍が薬剤耐性がんである、請求項1に記載の治療剤。
- 腫瘍が薬剤耐性乳がんまたは薬剤耐性肺がんである、請求項8に記載の治療剤。
- 腫瘍の転移を抑制または予防するための、請求項1に記載の治療剤。
- がん再発を抑制または予防するための、請求項1に記載の治療剤。
- がんが乳がんまたは肺がんである、請求項11に記載の治療剤。
- (A) miR27bまたは配列番号1で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸と、
(B) 抗腫瘍剤
とを併用してなる腫瘍の治療剤。 - 腫瘍が薬剤耐性がんである、請求項13に記載の治療剤。
- 腫瘍が薬剤耐性乳がんまたは薬剤耐性肺がんである、請求項13に記載の治療剤。
- 腫瘍におけるmiR27bの発現レベルもしくは濃度を測定すること、および該発現レベルもしくは該濃度と薬剤耐性との間の負の相関に基づき、薬剤耐性がんを判定する方法。
- 腫瘍におけるmiR27bの発現レベルを測定することにより、がん幹細胞を判定する方法。
- がん幹細胞が乳がん幹細胞または肺がん幹細胞である、請求項17記載の方法。
- 腫瘍におけるmiR27bの発現レベルもしくは濃度を測定し、がん幹細胞の有無を判定することにより、がん治療の予後を判定する方法。
- がん幹細胞が乳がん幹細胞または肺がん幹細胞である、請求項19記載の方法。
- miR27bを特異的に検出し得る核酸プローブを含む、薬剤耐性がんを判定するための剤。
- miR27bを特異的に検出し得る核酸プローブを含む、がん幹細胞を判定するための剤。
- がん幹細胞が乳がん幹細胞または肺がん幹細胞である、請求項22記載の剤。
- 以下の工程を含む、薬剤耐性がんの増殖を抑制し得る物質を探索する方法:
(1)被検物質とmiR27bの発現を測定可能な細胞とを接触させること;
(2)被検物質を接触させた細胞におけるmiR27bの発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞におけるmiR27bの発現量と比較すること;並びに
(3)上記(2)の比較結果に基づいて、miR27bの発現量を上昇制御する被検物質を、薬剤耐性がんの増殖を阻害し得る物質として選択すること。 - 以下の工程を含む、腫瘍の転移または腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質を探索する方法:
(1)被検物質とmiR27bの発現を測定可能な細胞とを接触させること;
(2)被検物質を接触させた細胞におけるmiR27bの発現量を測定し、該発現量を被検物質
を接触させない対照細胞におけるmiR27bの発現量と比較すること;並びに
(3)上記(2)の比較結果に基づいて、miR27bの発現量を上昇制御する被検物質を、腫瘍の転移または腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質として選択すること。
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