JPWO2011013806A1 - シュワン前駆細胞の製造方法及び増殖方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明に係るシュワン前駆細胞の製造方法及び増殖方法は、末梢神経損傷が生じてから24時間から6週間後に単離された、当該末梢神経由来の細胞を、接着培養せず、且つ浮遊培養する工程を含むことを特徴とする。ここで、浮遊培養とは、目的の細胞や細胞塊を培養器の底面に接着させずに培養することを意味し、接着培養とは、目的の細胞や細胞塊を培養器の底面に接着させて培養することを意味する。なお、培養中、細胞や細胞塊が培養器の底面に接着するとは、細胞や細胞塊が、ECMなどに含まれる細胞−基質接着分子を通じて、培養器底面と接着している状態を意味し、培養液を軽く揺らしても細胞や細胞塊が培養液中に浮かんでこない状態を言う。一方、培養中、細胞や細胞塊が培養器の底面に接着しないとは、細胞や細胞塊が、ECMなどに含まれる細胞−基質接着分子を通じて培養器底面と接着していない状態を意味し、たとえ底面に触れていても培養液を軽く揺らすと細胞や細胞塊が培養液中に浮かんでくるような状態を言う。
本発明に係るシュワン前駆細胞は、上記いずれかのシュワン前駆細胞製造方法によって製造されたことを特徴とする。
本発明に係る移植組成物は、末梢神経損傷が生じてから24時間から6週間後に単離された、当該末梢神経由来の細胞を、接着培養せず、且つ浮遊培養して得られるシュワン前駆細胞を含有することを特徴とする。
本出願は、2009年7月30日付で出願した日本国特許出願2009−178340に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
シュワン前駆細胞は、動物個体において、末梢神経損傷が生じてから所定期間後に、損傷した末梢神経由来の細胞を単離し、接着培養せず、且つ浮遊培養することによって製造する。接着培養しないことにより、シュワン前駆細胞を未分化のままで増殖させることが可能になる。
本発明に係るシュワン前駆細胞は、上述したいずれかの製造方法によって製造される。
本発明に係る移植組成物は、末梢神経損傷してから所定時間後、当該末梢神経由来の細胞を、接着培養せず、且つ浮遊培養することによって得られるシュワン前駆細胞を含有する。
本実施例では、損傷させた坐骨神経の遠位から単離した細胞を浮遊培養することにより細胞塊(スフェア)が形成されること、および、その細胞塊が新しく分裂した細胞の集合体であることを示す。
成体マウス(ICRマウス、C57/BL6マウス、メス)をケタミン(100mg/kg)およびキシラジン(10mg/kg)で麻酔してうつ伏せに固定し、背面尾部付近を切開して坐骨神経を露出させた。鉗子を用い、この坐骨神経に5分間一定に圧力をかけることにより、坐骨神経を損傷させた。マウスの傷口を縫合し、6時間、24時間、3日、7日、10日、2週間、3週間、あるいは6週間飼育を続けた(n=6)。その後、中枢神経に対して損傷部位より遠位の坐骨神経を摘出し、0.25%コラゲナーゼで30分間37℃、次いで0.25%トリプシン−EDTAで30分間37℃で消化した後、ピペッティングを行った。これを、さらにナイロンメッシュでろ過することにより不要な軟部組織を除去した。ここで得られたろ液を遠心し、細胞を回収した。DMEM無血清培地に、インスリン(25μg/ml)、トランスフェリン(100μg/ml)、プロゲステロン(20nM)、セレン酸ナトリウム(30nM)、プトレッシン(60nM)、EGF(100ng/ml)、FGF(100ng/ml)、B27(20ng/ml)、10%FBSを添加し(シュワン前駆細胞用培地)、ここに上記のようにして得た細胞を1×105細胞/mlの密度で播種し、5%CO2存在下、37℃で、浮遊培養した。なお、対照群では、坐骨神経を露出させた後損傷させずに縫合し、7日後に上記と同様にして細胞を単離し、培養した。
次に、上記細胞塊を形成する細胞が分裂により新たに出現した細胞であることを確認した。神経損傷後7日目のマウス坐骨神経から単離した細胞を、0.8%メチルセルロース添加シュワン前駆細胞用培地で浮遊培養した。ここで得られた一次細胞塊を顕微鏡下でピペットを用いて回収し、0.25%トリプシンで37℃、30分間処理した。その後、細胞が解離するまでピペッティングを行った。この単細胞を、0.8%メチルセルロース添加シュワン前駆細胞用培地に播種して5%CO2、37℃で7日間浮遊培養した。同様にして、3代継代培養を行った。なお、メチルセルロースは、細胞同士の結合を妨げるため、メチルセルロース存在下で形成された細胞塊は単細胞の細胞分裂によって生じた細胞である。各継代ごとに、細胞塊が形成された。図3〜5に、継代培養された細胞が形成した細胞塊の顕微鏡写真を示す。
本実施例では、実施例1で製造された細胞がシュワン前駆細胞であることを示す。
実施例1で得られた細胞塊を各種マーカーにより標識し、細胞塊に含まれる細胞の分化段階を検討した。
本実施例では、製造されたシュワン前駆細胞がシュワン細胞への分化能を有することを示す。
本実施例では、実施例1で形成された細胞塊と神経細胞を共培養すると、シュワン前駆細胞がシュワン細胞に分化し、神経突起が伸長することを示す。
本実施例では、霊長類においても、損傷させた坐骨神経の遠位から単離した細胞を浮遊培養することにより細胞塊(スフェア)が形成されること、および、その細胞塊が新しく分裂した細胞の集合体であることを示す。
成体マーモセット(n=1)をイソフルレンで吸入麻酔してうつ伏せに固定し(図11A)、背面尾部付近を切開して坐骨神経を露出させた。鉗子を用い、この坐骨神経に5分間一定に圧力をかけることにより、坐骨神経を損傷させた(図11B)。マーモセットの傷口を縫合し、1週間飼育を続けた。その後、中枢神経に対して損傷部位より遠位の坐骨神経を摘出し、0.25%コラゲナーゼで30分間37℃、次いで0.25%トリプシン−EDTAで30分間37℃で消化した後、ピペッティングを行って細胞を解離し、さらにナイロンメッシュでろ過することにより不要な軟部組織を除去した。ここで得られたろ液を遠心し、細胞を回収した。このようにして得た細胞を0.8%メチルセルロース添加シュワン前駆細胞様培地(実施例1参照)に1×105細胞/mlの密度で播種し、5%CO2存在下、37℃で、浮遊培養した(損傷群)。なお、対照群では、坐骨神経を露出させた後損傷させずに縫合し、1週間後に上記と同様にして細胞を単離し、浮遊培養した。
Claims (21)
- シュワン前駆細胞を増殖させる増殖方法であって、
末梢神経損傷が生じてから24時間から6週間後に単離された、当該末梢神経由来の細胞を、浮遊培養する工程を含むことを特徴とする、増殖方法。 - 請求項1に記載の増殖方法であって、
前記細胞が、前記末梢神経損傷部位よりも遠位の末梢神経に由来することを特徴とする、増殖方法。 - 請求項1または2に記載の増殖方法であって、
18時間以上浮遊培養することを特徴とする、増殖方法。 - 請求項3に記載の増殖方法であって、
48時間以上浮遊培養することを特徴とする、増殖方法。 - 請求項1〜4のいずれかに記載の増殖方法であって、
前記単離された細胞を、血清を含む培地において培養することを特徴とする、増殖方法。 - 請求項1〜5のいずれかに記載の増殖方法であって、
前記単離された細胞を、細胞増殖因子を含む培地において培養することを特徴とする、増殖方法。 - 請求項6に記載の増殖方法であって、
細胞増殖因子がEGF及び/またはFGFであることを特徴とする、増殖方法。 - 請求項1〜7のいずれかに記載の増殖方法であって、
前記単離された細胞を、化学物質でコートされていないプラスティック培養皿を用いて浮遊培養することを特徴とする、増殖方法。 - シュワン前駆細胞の製造方法であって、
末梢神経損傷が生じてから24時間から6週間後に単離された、当該末梢神経由来の細胞を、浮遊培養する工程を含むことを特徴とする、製造方法。 - 請求項9に記載の製造方法によって製造されたことを特徴とする、浮遊培養されたシュワン前駆細胞。
- シュワン前駆細胞を含有することを特徴とする、移植組成物。
- 請求項11に記載の移植組成物であって、
前記シュワン前駆細胞が、末梢神経損傷が生じてから24時間から6週間後に単離された、当該末梢神経由来の細胞を、接着培養せず、且つ浮遊培養することによって得られることを特徴とする、移植組成物。 - 請求項11または12に記載の移植組成物であって、
前記単離された細胞が、前記末梢神経損傷部位よりも遠位の末梢神経に由来することを特徴とする、移植組成物。 - 請求項12〜13のいずれかに記載の移植組成物であって、
前記単離された細胞を18時間以上浮遊培養することを特徴とする、移植組成物。 - 請求項14に記載の移植組成物であって、
前記単離された細胞を48時間以上浮遊培養することを特徴とする、移植組成物。 - 請求項12〜15のいずれかに記載の移植組成物であって、
前記単離された細胞を、血清を含む培地において浮遊培養することを特徴とする、移植組成物。 - 請求項12〜16のいずれかに記載の移植組成物であって、
前記単離された細胞を、細胞増殖因子を含む培地において浮遊培養することを特徴とする、移植組成物。 - 請求項17に記載の移植組成物であって、
細胞増殖因子がEGF及び/またはFGFであることを特徴とする、移植組成物。 - 請求項12〜18のいずれかに記載の移植組成物であって、
前記単離された細胞を、化学物質でコートされていないプラスティック培養皿を用いて浮遊培養することを特徴とする、移植組成物。 - 請求項11〜19のいずれかに記載の移植組成物であって、
神経損傷や神経障害に起因する疾患に罹患した患者に移植されることを特徴とする、移植組成物。 - 請求項20に記載の移植組成物であって、
前記神経損傷や神経障害に起因する疾患が脊髄障害、末梢神経障害、脳血管障害、脱髄性・炎症性疾患、錐体外路症状疾患、及び、感染性疾患による神経障害からなる群から選ばれることを特徴とする、移植組成物。
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