JP5794694B2

JP5794694B2 - シュワン前駆細胞の製造方法及び増殖方法

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Publication number: JP5794694B2
Application number: JP2011524857A
Authority: JP
Inventors: 岡野　栄之; 栄之岡野; 戸山　芳昭; 芳昭戸山; 中村　雅也; 雅也中村; 賢石井; 岳彦高木
Original assignee: Keio University
Current assignee: Keio University
Priority date: 2009-07-30
Filing date: 2010-07-30
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2030-07-30
Also published as: JPWO2011013806A1; WO2011013806A1

Description

本発明は、シュワン前駆細胞の製造方法及び増殖方法に関する。

シュワン細胞は、末梢神経の軸索を取り囲む細胞である。末梢神経に損傷が生じた場合には、損傷部から遠位でシュワン細胞の脱分化が起こり、シュワン細胞管を既存の基底膜内で形成する。この未分化シュワン細胞が軸索再生を促進する物質を産生し、軸索再生を誘導する（例えば、Jassen R. K. and Richardson D. W. 編集、「Glial Cell Development, 2nd Ed.」Oxford University Press, 2001参照）。

そこで、損傷や障害により機能が失われた神経細胞の神経再生において、有効な治療手段と考えられるのが未分化なシュワン細胞の損傷や障害部位への移植である。移植するシュワン細胞として、拒絶反応の軽減や、倫理的問題を考慮すると移植が必要とされる患者本人の自家組織から調製した未分化なシュワン細胞であることが好ましいが、現在のところ、胎児では末梢神経から神経堤幹細胞が回収されたことが報告されているものの（例えば、Morrison S. J. et al., Cell 96(5): 737-749, 1999参照）、未分化なシュワン細胞の前駆細胞が単離された報告がない（例えば、Toma J. G. et al., Nat. Cell Biol. 3(9): 778-784, 2001; Wong C. E. et al., J. Cell Biol. 175(6): 1005-1015, 2006参照）。

本発明は、シュワン前駆細胞の製造方法及び増殖方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、以下の実施例に示すように、末梢神経の損傷が生じてから２４時間から６週間後に単離された当該末梢神経由来の細胞を、接着培養せずに浮遊培養することにより増殖能力の高いシュワン前駆細胞を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。

（１）シュワン前駆細胞の製造方法及び増殖方法
本発明に係るシュワン前駆細胞の製造方法及び増殖方法は、末梢神経損傷が生じてから２４時間から６週間後に単離された、当該末梢神経由来の細胞を、接着培養せず、且つ浮遊培養する工程を含むことを特徴とする。ここで、浮遊培養とは、目的の細胞や細胞塊を培養器の底面に接着させずに培養することを意味し、接着培養とは、目的の細胞や細胞塊を培養器の底面に接着させて培養することを意味する。なお、培養中、細胞や細胞塊が培養器の底面に接着するとは、細胞や細胞塊が、ＥＣＭなどに含まれる細胞−基質接着分子を通じて、培養器底面と接着している状態を意味し、培養液を軽く揺らしても細胞や細胞塊が培養液中に浮かんでこない状態を言う。一方、培養中、細胞や細胞塊が培養器の底面に接着しないとは、細胞や細胞塊が、ＥＣＭなどに含まれる細胞−基質接着分子を通じて培養器底面と接着していない状態を意味し、たとえ底面に触れていても培養液を軽く揺らすと細胞や細胞塊が培養液中に浮かんでくるような状態を言う。

単離された細胞は、前記末梢神経損傷部位よりも遠位の末梢神経に由来することが好ましい。

単離された細胞は、１８時間以上、あるいは、２４時間以上、好ましくは４８時間以上、さらに好ましくは７２時間以上浮遊培養する。また、血清を含む培地において浮遊培養することが好ましい。また、血清及び／または細胞増殖因子を含む培地において浮遊培養することが好ましい。細胞増殖因子はＥＧＦ及び／またはＦＧＦであってもよい。

（２）シュワン前駆細胞
本発明に係るシュワン前駆細胞は、上記いずれかのシュワン前駆細胞製造方法によって製造されたことを特徴とする。

（３）移植組成物
本発明に係る移植組成物は、末梢神経損傷が生じてから２４時間から６週間後に単離された、当該末梢神経由来の細胞を、接着培養せず、且つ浮遊培養して得られるシュワン前駆細胞を含有することを特徴とする。

移植組成物は、神経損傷や神経障害に起因する疾患に罹患した患者あるいは患獣に移植することが好ましく、その疾患が、（１）脊髄障害（脊髄損傷、脊髄梗塞などの脊髄血管障害、脊椎変性疾患に伴う脊髄・末梢神経障害、脊髄空洞症、脊髄腫瘍、脊髄炎、その他）、（２）末梢神経障害（末梢神経損傷、糖尿病性末梢神経障害、ギランバレー症候群、Fisher症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、多巣性運動ニューロパチー、Charcot-Marie-Tooth病、家族性アミロイドポリニューロパチー、血管炎性ニューロパチー、中毒性ニューロパチー、特発性顔面神経麻痺、critical illness polyneuropathy (CIP)、神経痛性筋萎縮症（neuralgic amyotrophy）、その他）、（３）脳血管障害など（脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、もやもや病、脳静脈洞血栓症、側頭動脈炎、抗リン脂質抗体症候群、アルツハイマー病、水頭症など）、（４）脱髄性・炎症性疾患（多発性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、神経ベーチェット病、神経Sweet病）、（５）錐体外路症状疾患（パーキンソン病、進行性核上性麻痺、ハンチントン病、脊髄小脳変性症、ジストニア・ジスキネジア、アテトーゼ、ヒョレア、バリズム、ミオクローヌスなど）、（６）感染性疾患による神経障害であることがさらに好ましい。

＝＝クロスリファレンス＝＝
本出願は、２００９年７月３０日付で出願した日本国特許出願２００９−１７８３４０に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。

本発明の一実施例において、坐骨神経を損傷させてから６時間、２４時間、３日、７日、１０日、２週間、３週間、６週間後に単離された細胞を1週間浮遊培養することにより得られた細胞塊を示す顕微鏡写真である。本発明の一実施例において、坐骨神経を損傷させてから６時間、２４時間、３日、７日、１０日、２週間、３週間、６週間後に単離された細胞を１週間浮遊培養することにより得られた細胞塊数を示すグラフである。本発明の一実施例において、坐骨神経を損傷させてから７日後に単離された細胞の初代浮遊培養においてメチルセルロース添加、あるいは無添加で行った結果を示す顕微鏡写真である。本発明の一実施例において、坐骨神経を損傷させてから７日後に単離された細胞の１回継代後の浮遊培養を、メチルセルロース添加、あるいは無添加で行った結果を示す顕微鏡写真である。本発明の一実施例において、坐骨神経を損傷させてから７日後に単離された細胞の２回継代後の浮遊培養を、メチルセルロース添加、あるいは無添加で行った結果を示す顕微鏡写真である。本発明の一実施例において、坐骨神経を損傷させてから７日後に単離された細胞を浮遊培養することによって形成された細胞塊の、各種抗体を用いた免疫組織化学的染色の結果を示した顕微鏡写真である。本発明の一実施例において、本発明に係る製造方法で製造されたシュワン前駆細胞を分化培地にて７日間培養した後、および、損傷を受けていない坐骨神経から単離されたシュワン細胞（インタクト）のｐ７５およびＰ０の免疫組織化学的染色結果を示す顕微鏡写真である。本発明の一実施例において、坐骨神経を損傷させてから７日後に単離された細胞を浮遊培養することにより得られた細胞塊由来の細胞、または、対照の成熟シュワン細胞と、神経細胞との共培養後に得られたＭＢＰ陽性成熟シュワン細胞、Ｔｕｊ−１陽性細胞を免疫組織化学的に検出した顕微鏡写真である。本発明の一実施例において、坐骨神経を損傷させてから７日後に単離された細胞を浮遊培養することにより形成された細胞塊由来のシュワン前駆細胞を神経細胞と共培養した後の、全細胞数、ＭＢＰ陽性成熟シュワン細胞数、神経突起長を示したグラフである。本発明の一実施例において、坐骨神経に損傷させてから７日後に単離された細胞を浮遊培養することにより形成された細胞塊由来のシュワン前駆細胞を神経細胞と共培養した後の、全細胞におけるＭＢＰ陽性成熟シュワン細胞の割合を示したグラフである。本発明の一実施例において、吸入麻酔し、うつ伏せに固定したマーモセット（Ａ）、坐骨神経の損傷（Ｂ）、神経損傷１週間後の坐骨神経（矢印）の摘出（Ｃ）を示す写真である。本発明の一実施例において、マーモセットの坐骨神経を損傷させてから１週間後に単離した細胞を1週間浮遊培養することにより形成された細胞塊（Ａ、Ｂ）を示す顕微鏡写真である。本発明の一実施例において、マーモセットの坐骨神経を損傷させてから１週間後に単離した細胞を1週間浮遊培養して得られた細胞塊を、１回継代し、さらに１週間浮遊培養して得られた細胞塊（２代目細胞塊、Ａ、Ｂ）および、Ａ、Ｂの細胞塊をさらに継代し、１週間浮遊培養して得られた細胞塊（３代目細胞塊、Ｃ）を示す顕微鏡写真である。

以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。

なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

＝＝シュワン前駆細胞の製造方法及び増殖方法＝＝
シュワン前駆細胞は、動物個体において、末梢神経損傷が生じてから所定期間後に、損傷した末梢神経由来の細胞を単離し、接着培養せず、且つ浮遊培養することによって製造する。接着培養しないことにより、シュワン前駆細胞を未分化のままで増殖させることが可能になる。

ここで、末梢神経とは、神経系において、その中枢部である中枢神経系に対して周辺部の神経を意味し、本発明においては、シュワン細胞を付随している限り、動物の体のいずれの部位に位置している末梢神経も用いることができる。

シュワン前駆細胞を単離する動物は、神経系を有する、ヒト又はヒト以外の動物であれば制限されないが、マウスなどの哺乳動物であることが好ましく、マーモセットなどの霊長類であることがより好ましく、ヒトであることがさらに好ましい。特に、製造されたシュワン前駆細胞を移植に用いる場合、自家移植であることが好ましいので、末梢神経由来の細胞は、レシピエントから得ることが好ましい。

末梢神経の損傷は、種類や原因に制限がなく、例えば、打撲、外傷、低温、高熱、電気ショック、切断、圧迫、放射線等により生じる損傷であってもよい。また、これらの末梢神経の損傷が、事故によって生じたものであっても、人為的に引き起こされたものであってもよい。人為的な損傷として、手術用ハサミやメスによる切断、あるいは、鉗子やピンセット等を用いた圧迫等が例示できる。

このような末梢神経損傷から約２４時間から約６週間後、好ましくは約２４時間から約３週間後、より好ましくは約３日から約３週間後、もっとも好ましくは約３日から約１０日後に末梢神経由来の細胞を単離する。その細胞は、損傷を受けた末梢神経において、損傷部位よりも遠位から単離することが好ましい。

以上のような、単離された末梢神経由来の細胞を浮遊培養する際の条件に関し、使用する培地として、ＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）培地、ＭＥＭ／ハムＦ−１２培地が例示できるが、シュワン前駆細胞の製造が可能な範囲で制限されず、当業者に周知の培地から適宜選択できる。培地には、血清及び／または細胞増殖因子が添加されていることが好ましい。血清は、ウシ胎仔血清、ウシ新生児血清、ウシ血清アルブミン、ヤギ血清、ウサギ血清、マウス血清、サル血清、ヒト血清等が例示できるが、シュワン前駆細胞の製造が可能な範囲で制限されず、周知の血清から当業者が適宜選択できる。また、細胞増殖因子として、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＣＮＴＦ等が例示できるが、シュワン前駆細胞の製造が可能な範囲で制限されず、周知の細胞増殖因子から当業者が適宜選択できる。

さらに、培養細胞を維持するために一般的に用いられるその他の周知物質、サイトカイン等の末梢神経再生促進物質、または抗生物質、あるいはその組み合わせが添加されていてもよい。その他の周知物質として、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、セレン酸ナトリウム、プトレッシン、Ｂ２７サプリメント（商品名、インビトロジェン社）等が例示できるがこれらに制限されない。また、抗生物質として、ジェネティシン、ハイグロマイシン、ゼオシン(商品名)、ピューロマイシン、ブラストシジン等が例示できるが、これらに制限されない。なお、以上のいずれの添加物の濃度も、当業者が適宜決定することができる。

シュワン前駆細胞の浮遊培養は、５％ＣＯ_２条件下、３５〜４０℃で行うのが好ましく、３７℃であることがより好ましい。培養時間は、シュワン前駆細胞が増殖する範囲内で制限されないが、１８時間以上あるいは２４時間以上が好ましく、４８時間以上がより好ましく、７２時間以上がさらに好ましい。４８時間以上浮遊培養することで、シュワン前駆細胞が塊状になって、細胞塊（スフェア）としてシュワン前駆細胞を得ることができるからである。

初代培養においてスフェアが１つでも形成されれば、いつでも継代し浮遊培養を繰り返すことができる。継代方法は特に制限されず、トリプシンやＥＤＴＡなどをもちいた常法を用いれば良い。シュワン前駆細胞を接着培養するとシュワン細胞に分化する傾向にあるので、継代している間は、細胞をディッシュ底面に接着させないことが望ましい。そのために、化学物質（ラミニン等）でコートしていないディッシュ（例えば、細菌用培養皿など）を用いるのが好ましい。

＝＝シュワン前駆細胞＝＝
本発明に係るシュワン前駆細胞は、上述したいずれかの製造方法によって製造される。

このシュワン前駆細胞は、未分化細胞マーカーであるＮｅｓｔｉｎ陽性、および未分化シュワン細胞マーカーであるＳｏｘ−１０、ＮＣＡＭ（neural cell adhesion molecule）、ｐ７５陽性である。同時に、このシュワン前駆細胞は、成熟シュワン細胞マーカーであるＰ０、およびＳ１００のいずれも陰性である。そして、このシュワン前駆細胞は、成熟シュワン細胞への分化能を有している。例えば、接着培養することによって、シュワン細胞に分化させることができる。

本発明に係るシュワン前駆細胞の用途に関して、特に制限されず、例えば、シュワン前駆細胞やシュワン細胞に関連する研究に用いても、あるいは、下記のような移植用組成物の製造に用いてもよい。

＝＝移植組成物及びその使用方法＝＝
本発明に係る移植組成物は、末梢神経損傷してから所定時間後、当該末梢神経由来の細胞を、接着培養せず、且つ浮遊培養することによって得られるシュワン前駆細胞を含有する。

本発明に係る移植組成物は、上記シュワン前駆細胞以外に、薬学的に許容される担体を含んでもよく、この担体としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液、血清、および体液等が挙げられるが、シュワン前駆細胞を正常に維持できる範囲内でこれらに限定されない。また、細胞の足場となる固体またはゲル状の支持体等と組み合わせてもよい。

本発明の移植組成物は、細胞外基質（extracellular matrix）成分を含んでいてもよい。細胞外基質成分とは、細胞間に蓄積する不溶性の網状または繊維状構成物に含まれるタンパク質またはムコ多糖の成分であり、生物から分離されたものであっても、あるいは人工的に再構成したものであってもよい。

本移植組成物の構造は特に制限されず、液状、あるいはゲル状またはペースト状の網構造、繊維状構造、平板（ディスク）状構造、ハニカム状構造、スポンジ様構造等が例示できる。本移植組成物の液状化やゲル化は、当業者に周知の方法に従って行うことができる。

本移植組成物を神経損傷や神経障害に起因する疾患に罹患したヒトまたはヒト以外の動物の患部に移植することができる。移植部位では、このシュワン前駆細胞により、損傷・障害部位の神経線維の再生が促され、神経機能の再生が促進される。

本発明に係る移植組成物は、例えば、シュワン前駆細胞の移植に関する研究用試薬の製造に用いても、あるいは、前記神経損傷や神経障害に起因する疾患の治療用医薬剤の製造に用いてもよく、特に制限されない。治療用医薬剤製造の際には、薬学的に許容される担体や安定剤、腑形剤などを含んで剤形化される。

ここで、神経損傷や神経障害に起因する疾患は、シュワン前駆細胞の移植によって神経線維の再生が生じ、治癒あるいは病状の改善が期待される疾患であれば特に制限されず、例えば、その疾患が、（１）脊髄障害（脊髄損傷、脊髄梗塞などの脊髄血管障害、脊椎変性疾患に伴う脊髄・末梢神経障害、脊髄空洞症、脊髄腫瘍、脊髄炎、その他）、（２）末梢神経障害（末梢神経損傷、糖尿病性末梢神経障害、ギランバレー症候群、Fisher症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、多巣性運動ニューロパチー、Charcot-Marie-Tooth病、家族性アミロイドポリニューロパチー、血管炎性ニューロパチー、中毒性ニューロパチー、特発性顔面神経麻痺、critical illness polyneuropathy (CIP)、神経痛性筋萎縮症（neuralgic amyotrophy）、その他）、（３）脳血管障害など（脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、もやもや病、脳静脈洞血栓症、側頭動脈炎、抗リン脂質抗体症候群、アルツハイマー病、水頭症など）、（４）脱髄性・炎症性疾患（多発性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、神経ベーチェット病、神経Sweet病）、（５）錐体外路症状疾患（パーキンソン病、進行性核上性麻痺、ハンチントン病、脊髄小脳変性症、ジストニア・ジスキネジア、アテトーゼ、ヒョレア、バリズム、ミオクローヌスなど）、（６）感染性疾患による神経障害であることが挙げられる。なお、損傷した神経は、末梢神経でも中枢神経でも構わない。

本移植組成物の移植対象となる動物は、神経系を有する、ヒトまたはヒト以外の動物であれば制限がないが、例えば、哺乳動物であることが好ましく、霊長類であることがより好ましく、ヒトであることがさらに好ましい。

［実施例１］
本実施例では、損傷させた坐骨神経の遠位から単離した細胞を浮遊培養することにより細胞塊（スフェア）が形成されること、および、その細胞塊が新しく分裂した細胞の集合体であることを示す。

＝＝細胞の調製・培養方法＝＝
成体マウス（ＩＣＲマウス、Ｃ５７／ＢＬ６マウス、メス）をケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔してうつ伏せに固定し、背面尾部付近を切開して坐骨神経を露出させた。鉗子を用い、この坐骨神経に５分間一定に圧力をかけることにより、坐骨神経を損傷させた。マウスの傷口を縫合し、６時間、２４時間、３日、７日、１０日、２週間、３週間、あるいは６週間飼育を続けた（ｎ＝６）。その後、中枢神経に対して損傷部位より遠位の坐骨神経を摘出し、０．２５％コラゲナーゼで３０分間３７℃、次いで０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで３０分間３７℃で消化した後、ピペッティングを行った。これを、さらにナイロンメッシュでろ過することにより不要な軟部組織を除去した。ここで得られたろ液を遠心し、細胞を回収した。ＤＭＥＭ無血清培地に、インスリン（２５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１００μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（２０ｎＭ）、セレン酸ナトリウム（３０ｎＭ）、プトレッシン（６０ｎＭ）、ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｂ２７（商品名、２０ｎｇ／ｍｌ）、１０％ＦＢＳを添加し（シュワン前駆細胞用培地）、ここに上記のようにして得た細胞を１×１０^５細胞／ｍｌの密度で播種し、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で、浮遊培養した。なお、対照群では、坐骨神経を露出させた後損傷させずに縫合し、７日後に上記と同様にして細胞を単離し、培養した。

培養開始７日目に単位容積の培地あたりの細胞塊の写真を撮影し、培地単位容積辺りの細胞塊を計測した。図１および図２に示すように、神経損傷後２４時間以上経てから細胞を単離した群で、細胞塊が形成された。なお、細胞塊が形成された群では、２日目から細胞塊が観察でき、図１および２では、３日目から細胞塊が観察されている。

＝＝細胞分裂による新規細胞の確認＝＝
次に、上記細胞塊を形成する細胞が分裂により新たに出現した細胞であることを確認した。神経損傷後７日目のマウス坐骨神経から単離した細胞を、０．８％メチルセルロース添加シュワン前駆細胞用培地で浮遊培養した。ここで得られた一次細胞塊を顕微鏡下でピペットを用いて回収し、０．２５％トリプシンで３７℃、３０分間処理した。その後、細胞が解離するまでピペッティングを行った。この単細胞を、０．８％メチルセルロース添加シュワン前駆細胞用培地に播種して５％ＣＯ_２、３７℃で７日間浮遊培養した。同様にして、３代継代培養を行った。なお、メチルセルロースは、細胞同士の結合を妨げるため、メチルセルロース存在下で形成された細胞塊は単細胞の細胞分裂によって生じた細胞である。各継代ごとに、細胞塊が形成された。図３〜５に、継代培養された細胞が形成した細胞塊の顕微鏡写真を示す。

これらの結果は、本実施例に記載の方法によって形成された細胞塊が、浮遊培養中の増殖によって生じたことを示す。このように、本実施例の方法によりシュワン前駆細胞を増殖させることができる。

［実施例２］
本実施例では、実施例１で製造された細胞がシュワン前駆細胞であることを示す。

＝＝免疫組織化学的染色＝＝
実施例１で得られた細胞塊を各種マーカーにより標識し、細胞塊に含まれる細胞の分化段階を検討した。

上記実施例１において損傷作製後７日のマウス坐骨神経から単離した細胞から得られた細胞塊を、顕微鏡下でピペットを用いて回収し、４％ＰＦＡで固定した。続いて、１０％スクロース、３０％スクロースにそれぞれ２４時間ずつ浸した後、ＯＣＴコンパウンドに包埋し、ＭＡＳコーティングスライドグラス（松浪硝子工業株式会社）に張り付けた。この試料に対し、５％ＦＢＳ／０．３％ＴｒｉｔｏｎＸでブロッキングを行った。ここに、抗Ｎｅｓｔｉｎマウスモノクローナル抗体（３ＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、１：２００）、抗Ｋｉ６７ウサギポリクローナル抗体（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ社、１：５００）、抗ＰＣＮＡウサギポリクローナル抗体（ＯｎｃｏｇｅｎｅＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ社、１：５００）、抗Ｓｏｘ−１０ヤギモノクローナル抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社、１：２００）、抗ＮＣＡＭ（neural cell adhesion molecule）ラットモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ社、１：２００）、抗ｐ７５ウサギポリクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、１：２００）、抗Ｐ０ニワトリモノクローナル抗体（Ａｖｅｓ社、１：２００）、あるいは抗Ｓ１００ウサギポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ社、１：５００）を滴下し、湿潤環境において４℃で一晩、インキュベートした。二次抗体として、Ａｌｅｘａ４８８あるいはＡｌｅｘａ５６８（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社、１：１０００）を滴下し、湿潤環境において室温で３０分インキュベートし、蛍光標識を行った。対比染色としてＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ社、１：１０００）を用いた。なお、抗体希釈液としてブロッキング液を用いた。その後、共焦点レーザースキャン鏡下で観察を行った。

図６に示すように、細胞塊は未分化細胞のマーカーであるＮｅｓｔｉｎ陽性であった。これは、細胞塊に含まれる細胞群に、高い割合で未分化段階の細胞が含まれることを示している。また、細胞増殖マーカーであるＫｉ６７およびＰＣＮＡ陽性であった。これは、細胞塊に含まれる細胞が増殖していることを示している。さらに、未分化シュワン細胞マーカーであるｐ７５、Ｓｏｘ−１０、ＮＣＡＭが陽性である一方で、成熟シュワン細胞マーカーであるＰ０、Ｓ１００はほぼ陰性であった。これは、細胞塊に含まれる細胞の多くが、成熟シュワン細胞に分化する以前の、未分化段階のシュワン前駆細胞であることを示している。

このように、実施例１の方法によって形成された細胞塊には、高い割合で、未分化で増殖しているシュワン前駆細胞が含まれている。

［実施例３］
本実施例では、製造されたシュワン前駆細胞がシュワン細胞への分化能を有することを示す。

上記実施例１において損傷作製後７日のマウス坐骨神経から単離した細胞から得られた細胞塊を顕微鏡下でピペットを用いて回収し、ラミニンでコーティングした８ウェルのチャンバースライドグラスに播種し、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ（分化培地）において、５％ＣＯ_２、３７℃で７日間培養し、シュワン細胞への分化を誘導した。

細胞の分化段階の検出のため、培養前の細胞塊、および、培養後の細胞を抗ｐ７５ウサギポリクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、１：２００）、抗Ｐ０ニワトリモノクローナル抗体（Ａｖｅｓ社、１：２００）を用いて、実施例２に記載の方法に従って免疫組織化学的染色を行った。

また、対照として、損傷を作製しないマウスの坐骨神経から単離されたシュワン細胞を分化培地で同様に培養した。

図７に示すように、細胞塊はｐ７５陽性、Ｐ０陰性であり（図７Ａ〜Ｄ）、未分化なシュワン前駆細胞からなることが確認された。一方で、７日間接着培養することによって、細胞におけるｐ７５およびＰ０の標識パターン（図７Ｅ〜Ｈ）は、単離した対照のシュワン細胞の標識パターン（図７Ｉ〜Ｋ）と同様のパターンを示した。すなわち、成熟シュワン細胞のマーカーであるＰ０の標識が、細胞塊（Ｂ）と比較し顕著に増加した。これは、７日間の接着培養によって未分化なシュワン前駆細胞が成熟シュワン細胞に分化誘導されたことを示している。

このように、実施例１で製造されたシュワン前駆細胞は、接着培養によって、成熟シュワン細胞に分化誘導される。

［実施例４］
本実施例では、実施例１で形成された細胞塊と神経細胞を共培養すると、シュワン前駆細胞がシュワン細胞に分化し、神経突起が伸長することを示す。

神経損傷後７日目のマウス坐骨神経から単離した細胞から得られた細胞塊を顕微鏡下でピペットを用いて回収し、０．２５％トリプシンで３７℃、３０分間処理した。その後、細胞塊が単一細胞に分散するまでピペッティングを行った。このようにして得られた細胞を、２％Ｂ２７、１％Ｌ−グルタミン酸、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したneurobasal medium (Ｇｉｂｃｏ社)に１×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で播種した。この際、成体マウス（ＩＣＲマウス、Ｃ５７／ＢＬ６マウス、メス）の後根神経節から単離した神経細胞８×１０^５細胞／ｍｌを共に播種し、５％ＣＯ_２、３７℃で７日間接着共培養を行った。成体マウスからの神経細胞単離は、上記実施例１に記載の細胞の調製・培養方法に従い行った。なお、対照群では、坐骨神経を露出させた後損傷作製を行わずに縫合し、７日後に単離した成熟シュワン細胞を同様に播種し、後根神経節由来の神経細胞と同様にして共培養を行った。

培養後、細胞を４％ＰＦＡで固定の後、ＰＢＳで洗浄し、５％ＦＢＳ／０．３％ＴｒｉｔｏｎＸでブロッキングを行った。抗ＭＢＰラットモノクローナル抗体（Ａｖｅｓ社、１：１０００）および抗Ｔｕｊ−１マウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社、１：５００）を滴下し、湿潤環境において４℃で一晩インキュベートした。二次抗体として、Ａｌｅｘａ４８８あるいはＡｌｅｘａ５６８（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社、１：１０００）を滴下し、湿潤環境において室温で３０分インキュベートし、蛍光標識を行った。対比染色としてＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ社、１：１０００）を用いた。共焦点レーザースキャン顕微鏡下で観察し、ＭＢＰ陽性成熟シュワン細胞数、全細胞数（全細胞数はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２において染色された核の数）を計数した（計数の際、１００倍視野で撮影される６６０μｍ×８８４μｍの視野の細胞を計数した）。計測にはＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐＣＳ４Ｅｘｔｅｎｄｅｄを用いた。なお、Ｔｕｊ−１は神経細胞のマーカーとして一般に使用される。抗体希釈液にはブロッキング液を用いた。

１つの神経細胞から出る突起のうち最も長いものを選択し神経突起の長さを測定した。計測にはＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐＣＳ４Ｅｘｔｅｎｄｅｄを用いた。

図８および９は、細胞塊由来シュワン前駆細胞またはシュワン細胞と神経細胞の共培養の結果である。細胞塊由来シュワン前駆細胞と神経細胞を共培養した場合には、全細胞数およびＭＢＰ陽性成熟シュワン細胞数は、対照群に比較して有意に多かった（ステューデントのｔ検定）。また、神経突起の長さも、細胞塊由来シュワン前駆細胞と神経細胞と共培養した場合に、対照群と比較して有意に長かった（ステューデントのｔ検定）。さらに図１０に示すように、全細胞あたりのＭＢＰ陽性成熟シュワン細胞率も、細胞塊由来シュワン前駆細胞において高かった。

このように、細胞塊由来シュワン前駆細胞は、成熟シュワン細胞に比べ、神経細胞の髄鞘化と突起伸長の促進効果が高い。従って、本発明によって作製された細胞塊由来シュワン前駆細胞は、神経損傷や神経障害等に起因する疾患に対し、治療効果の高い移植物として使用できる。

［実施例５］
本実施例では、霊長類においても、損傷させた坐骨神経の遠位から単離した細胞を浮遊培養することにより細胞塊（スフェア）が形成されること、および、その細胞塊が新しく分裂した細胞の集合体であることを示す。

＝＝細胞の調製・培養方法＝＝
成体マーモセット（ｎ＝１）をイソフルレンで吸入麻酔してうつ伏せに固定し（図１１Ａ）、背面尾部付近を切開して坐骨神経を露出させた。鉗子を用い、この坐骨神経に５分間一定に圧力をかけることにより、坐骨神経を損傷させた（図１１Ｂ）。マーモセットの傷口を縫合し、１週間飼育を続けた。その後、中枢神経に対して損傷部位より遠位の坐骨神経を摘出し、０．２５％コラゲナーゼで３０分間３７℃、次いで０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで３０分間３７℃で消化した後、ピペッティングを行って細胞を解離し、さらにナイロンメッシュでろ過することにより不要な軟部組織を除去した。ここで得られたろ液を遠心し、細胞を回収した。このようにして得た細胞を０．８％メチルセルロース添加シュワン前駆細胞様培地（実施例１参照）に１×１０^５細胞／ｍｌの密度で播種し、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で、浮遊培養した（損傷群）。なお、対照群では、坐骨神経を露出させた後損傷させずに縫合し、１週間後に上記と同様にして細胞を単離し、浮遊培養した。

図１２Ａ、Ｂは、浮遊培養開始から１週間後の損傷群の細胞の様子を示す。損傷群では細胞塊が形成されたが、対照群では細胞塊は形成されなかった。

損傷群の細胞塊を、浮遊培養開始から１週間目に継代し、さらに１週間後に２回目の継代を行った。培地に添加されたメチルセルロースが細胞同士の結合を妨げるため、メチルセルロース存在下で形成された細胞塊は単細胞の細胞分裂によって生じた細胞からなる。

図１３Ａ、Ｂに１回継代後の細胞が1週間後に形成した細胞塊、図１３Ｃに２回継代後の細胞が１週間後に形成した細胞塊の顕微鏡写真を示す。各継代毎に細胞塊が形成された。

以上の結果は、実施例１と同様の方法によって、霊長類の坐骨神経から単離した細胞から細胞塊が形成されること、さらに、この細胞塊が、浮遊培養中の増殖によって形成されたことを示す。このように、霊長類においても、本実施例の方法により、シュワン前駆細胞を増殖させることができる。

本発明によって、シュワン前駆細胞の製造方法及び増殖方法、その製造方法によって製造されたシュワン前駆細胞、シュワン前駆細胞を含有する移植組成物を提供することができる。

Claims

シュワン前駆細胞を増殖させる増殖方法であって、
末梢神経損傷が生じてから２４時間から６週間後に単離された、当該末梢神経由来の細胞を、１８時間以上浮遊培養する工程を含むことを特徴とする、増殖方法。
シュワン前駆細胞を増殖させる増殖方法であって、
末梢神経損傷が生じてから２４時間から６週間後に単離された、当該末梢神経由来の細胞を、４８時間以上浮遊培養する工程を含むことを特徴とする、増殖方法。
シュワン前駆細胞を増殖させる増殖方法であって、
末梢神経損傷が生じてから２４時間から６週間後に単離された、当該末梢神経由来の細胞を、化学物質でコートされていないプラスティック培養皿を用いて浮遊培養する工程を含むことを特徴とする、増殖方法。
前記化学物質がラミニンである、請求項３に記載の増殖方法。
シュワン前駆細胞を増殖させる増殖方法であって、
末梢神経損傷が生じてから２４時間から６週間後に単離された、当該末梢神経由来の細胞を、細胞塊が形成されるまで浮遊培養する工程を含むことを特徴とする、増殖方法。
前記細胞が、前記末梢神経損傷部位よりも遠位の末梢神経に由来することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の増殖方法。
前記単離された細胞は、血清を含む培地において浮遊培養されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の増殖方法。
前記単離された細胞は、ＥＧＦ及び／またはＦＧＦを含む培地において浮遊培養されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の増殖方法。
シュワン前駆細胞の製造方法であって、
末梢神経損傷が生じてから２４時間から６週間後に単離された、当該末梢神経由来の細胞を、１８時間以上浮遊培養する工程を含むことを特徴とする、製造方法。
シュワン前駆細胞の製造方法であって、
末梢神経損傷が生じてから２４時間から６週間後に単離された、当該末梢神経由来の細胞を、２４時間以上浮遊培養する工程を含むことを特徴とする、製造方法。
シュワン前駆細胞の製造方法であって、
末梢神経損傷が生じてから２４時間から６週間後に単離された、当該末梢神経由来の細胞を、化学物質でコートされていないプラスティック培養皿を用いて浮遊培養する工程を含むことを特徴とする、製造方法。
前記化学物質がラミニンである、請求項１１に記載の製造方法。
シュワン前駆細胞の製造方法であって、
末梢神経損傷が生じてから２４時間から６週間後に単離された、当該末梢神経由来の細胞を、細胞塊が形成されるまで浮遊培養する工程を含むことを特徴とする、製造方法。
請求項８〜１３のいずれか１項に記載の製造方法によって製造された、シュワン前駆細胞を含有する細胞塊。
請求項１４に記載の細胞塊に含有されるシュワン前駆細胞。
請求項１５に記載のシュワン前駆細胞を含有することを特徴とする、移植組成物。
請求項１６に記載の移植組成物であって、
前記単離された細胞が、前記末梢神経損傷部位よりも遠位の末梢神経に由来することを特徴とする、移植組成物。
請求項１６または１７に記載の移植組成物であって、
前記単離された細胞は、血清を含む培地において浮遊培養されることを特徴とする、移植組成物。
請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の移植組成物であって、
前記単離された細胞は、ＥＧＦ及び／またはＦＧＦを含む培地において浮遊培養されることを特徴とする、移植組成物。
請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の移植組成物であって、
神経損傷や神経障害に起因する疾患に罹患した患者に移植されることを特徴とする、移植組成物。
請求項２０に記載の移植組成物であって、
前記神経損傷や神経障害に起因する疾患が脊髄障害、末梢神経障害、脳血管障害、脱髄性・炎症性疾患、錐体外路症状疾患、及び、感染性疾患による神経障害からなる群から選ばれることを特徴とする、移植組成物。