JPWO2009084232A1 - 糖鎖関連遺伝子、およびその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
糖において、これらの化学修飾を受ける部位は複数存在する。例えば、GlcNAcにおいては、1位〜6位の炭素の全てが化学修飾を受けることが知られている。その他の糖においても、種々の部位において化学修飾を受けることが報告されている。
上述のように、糖鎖を構成する糖には複数の種類が知られており、糖は複数の部位において種々の化学修飾を受けることによって、生体内において重要な生理作用を担うものと考えられている。
上述のように、糖鎖を構成する糖の種類、糖を標的とする化学修飾の種類およびその化学修飾される部位は多数存在することから、糖鎖は無数のバリエーションからなるものと考えられる。従って、ある役割を担う糖鎖の構造を特定することは非常に困難であり、また、ある疾患に起因する病態と、糖鎖の具体的な作用との関連性を見出すことは極めて困難を伴うことである。
〔1〕 N−アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸化インヒビターを成分とする、組織線維形成抑制剤、
〔2〕 生体組織の線維形成に対して抑制効果を有することを特徴とする、〔1〕に記載の薬剤、
〔3〕 前記インヒビターがN−アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素の機能を阻害する活性を有する、〔1〕または〔2〕に記載の薬剤、
〔4〕 前記インヒビターが、N−アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素遺伝子の発現を抑えるsiRNAである、〔3〕に記載の薬剤、
〔5〕 前記インヒビターがN−アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基の脱硫酸化酵素である、〔1〕または〔2〕に記載の薬剤、
〔6〕 線維形成性疾患の治療用または予防用の、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の薬剤、
〔7〕 糖鎖を構成するN−アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸化を阻害する化合物を選択する工程を含む、組織線維形成抑制剤のスクリーニング方法、
〔8〕 以下の工程(a)〜(c)を含む、組織線維形成抑制剤のスクリーニング方法、
(a)N−アセチルガラクトサミンまたはN−アセチルガラクトサミンを含有する糖鎖と、被検化合物を接触させる工程
(b)N−アセチルガラクトサミンの4位または6位について硫酸化の程度を測定する工程
(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、硫酸化の程度を低下させる化合物を選択する工程
〔9〕 以下の工程(a)〜(c)を含む、組織線維形成抑制剤のスクリーニング方法、
(a)N−アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記酵素の硫酸基転移活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、前記活性を低下させる化合物を選択する工程
〔10〕 以下の工程(a)〜(c)を含む、組織線維形成抑制剤のスクリーニング方法、
(a)N−アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)前記細胞における遺伝子の発現量を測定する工程
(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、前記遺伝子の発現量を低下させる化合物を選択する工程
〔11〕 以下の工程(a)〜(c)を含む、組織線維形成抑制剤のスクリーニング方法、
(a)N−アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程
(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、前記レポーター遺伝子の発現量を低下させる化合物を選択する工程
〔12〕 以下の工程(a)および(b)を含む、線維形成性疾患の治療または予防のための医薬組成物の製造方法、
(a)被検試料から、〔7〕〜〔11〕のいずれかに記載の方法により、組織線維形成抑制剤を選択する工程
(b)前記薬剤と医薬的に許容される担体とを混合する工程
を、提供するものである。
さらに本発明は以下に関する。
〔13〕N−アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸化インヒビターを個体へ投与する工程を含む、組織線維形成を抑制する方法。
〔14〕N−アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸化インヒビターの、組織線維形成抑制剤の製造における使用。
〔15〕組織線維形成抑制における使用のためのN−アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸化インヒビター。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、糖鎖を構成する糖の中の一つであるN-アセチルガラクトサミンにおいて、その4位または6位の部位の硫酸化を阻害することを機序とする、組織線維形成抑制剤に関する。
即ち本発明は、N-アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸化インヒビター(本明細書において、「本発明のインヒビター」あるいは単に「インヒビター」と記載する場合あり)を成分とする、組織線維形成抑制剤を提供する。
また、N-アセチルガラクトサミンは、1〜6位の部位が化学修飾を受けることが知られている。
本発明は、N-アセチルガラクトサミンの4位または6位の部位の硫酸化を阻害することを特徴とする。
本発明のインヒビターによって阻害される部位は、具体的には下記のGalNAcの化学式において矢印で表される部位である。
本発明におけるインヒビターの好ましい態様としては、例えば、N-アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素の機能を阻害する活性を有する物質を挙げることができる。
(a)N-アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b)N-アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
(c)N-アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸(硫酸基転移酵素遺伝子の発現を抑えるsiRNA)
(a)N-アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素と結合する抗体
(b)N-アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素変異体
(c)N-アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素と結合する低分子化合物
N-アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基の「脱硫酸化」とは、N-アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基が除去されることを指す。
脱硫酸化酵素としては、例えば、Chondroitin-4-sulfatase(C4-サルファターゼ)、Chondroitin-6-sulfatase等が挙げられる。
1)GalNAc4ST-1: N-acetylgalactosamine 4-sulfotransferase-1
別名CHST8:Carbohydrate (N-acetylgalactosamine 4-O) sulfotransferase 8
2)GalNAc4ST-2
別名CHST9:Carbohydrate (N-acetylgalactosamine 4-O) sulfotransferase 9
3)C4ST-1: chondroitin-4-O-sulfotransferase-1
別名CHST11:Carbohydrate (chondroitin 4) sulfotransferase 11
4)C4ST-2
別名CHST12
5)C4ST-3
別名CHST13
6)C6ST-1: chondroitin-6-O-sulfotransferase-1
別名CHST3: Carbohydrate (chondroitin 6) sulfotransferase 3
7)GalNAc4S-6ST: N-acetylgalactosamine 4-sulfate 6-0 sulfotransferase
8)D4ST-1:dermatan 4 sulfotransferase 1
9)C6ST-2: chondroitin-6-O-sulfotransferase-2
別名CHST7: Carbohydrate (chondroitin 6) sulfotransferase 7
GalNAc4ST-1(アクセッション番号NM_175140、塩基配列の配列番号:2、アミノ酸配列の配列番号:3)
GalNAc4ST-2(アクセッション番号NM_199055、塩基配列の配列番号:4、アミノ酸配列の配列番号:5)
C4ST-1(アクセッション番号NM_021439、塩基配列の配列番号:6、アミノ酸配列の配列番号:7)
C4ST-2(アクセッション番号NM_021528、塩基配列の配列番号:8、アミノ酸配列の配列番号:9)
C4ST-3(アクセッション番号XM_355798、塩基配列の配列番号:10、アミノ酸配列の配列番号:11)
D4ST(アクセッション番号NM_028117、塩基配列の配列番号:12、アミノ酸配列の配列番号:13)
C6ST-1(アクセッション番号NM_016803、塩基配列の配列番号:14、アミノ酸配列の配列番号:15)
C6ST-2(アクセッション番号AB046929、塩基配列の配列番号:16、アミノ酸配列の配列番号:17)
GalNAc4S-6ST(アクセッション番号NM_015892、塩基配列の配列番号:18、アミノ酸配列の配列番号:19)
RNAiは1998年にFireらによって発見された現象(Fire A, Nature (1998) 391, :806-811)で、二本鎖RNA(double strand RNA)が相同な標的遺伝子の発現を強力に抑制するというものである。従来のベクター等を用いる遺伝子導入法に比べ簡便であり、標的に対する特異性が高く、遺伝子治療への応用が可能であるということで最近注目されている。また哺乳類細胞においては、短鎖dsRNA(siRNA)を用いることにより、RNAiを誘導する事が可能で、RNAiは、ノックアウトマウスと比較して、効果が安定、実験が容易、費用が安価であるなど、多くの利点を有している。
ここで「治療または予防」とは、組織線維形成を呈する臓器、組織に対して、必ずしも完全な治療効果または予防効果を有する必要はなく、部分的な効果を有する場合であってよい。
また本発明の「組織線維形成性疾患治療剤」は、「組織線維形成性疾患改善剤」、「抗組織線維形成剤」等と表現することも可能である。また、本発明における薬剤は、「医薬品」、「医薬組成物」、「治療用医薬」等と表現することもできる。
なお、本発明における「治療」には、線維形成の発生を予め抑制し得る予防的な効果も含まれる。また、線維形成性の臓器(組織)に対して、必ずしも、完全な治療効果を有する場合に限定されず、部分的な効果を有する場合であってもよい。
本発明の薬剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール等を用いることができる。
また、siRNAまたはshRNAを目的の組織または器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット(例えばアデノエクスプレス:クローンテック社)を用いることもできる。
本発明の方法の好ましい態様としては、糖鎖を構成するN-アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸化を阻害する化合物を選択する工程を含む方法である。
本発明のスクリーニング方法によって、組織線維形成抑制剤もしくは線維形成性疾患治療もしくは予防剤のための候補化合物を効率的に取得することができる。
(a)N-アセチルガラクトサミンまたはN-アセチルガラクトサミンを含有する糖鎖と、被検化合物を接触させる工程
(b)N-アセチルガラクトサミンの4位または6位について硫酸化の程度を測定する工程
(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、硫酸化の程度を低下させる化合物を選択する工程
(1) 標識色素(1-9-ジメチルメチレンブルー)を用いた定量的色素結合による方法(Nature. 1998 Feb 26;391(6670):908-11)
(2) (32P) 3',5'-ABPによる光親和性標識による方法 (Mandon, E.C., Milla, M.E., Kempner, E., and Hirschberg, C.B. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 10707-10711)
(3) 3'-(32P)-βmethyleneb PAPSによる光親和性標識による方法 (Ozeran, J.D., Wesley, J., and Schwarz, N.B. (1996) Biochemistry, 35, 3695-3703)
(4) 陰イオン交換樹脂(硫酸化糖蛋白質の分離法)による方法 (Vol.16, No.2(19860430) pp. 69-72、北里大学 ISSN:03855449)
(5) Alcian blue によるsGAG比色染色 (Anal Biochem. 1998 Feb 15; 256(2): 229-37)
本発明の上記方法は、例えば以下の工程からなる。
(a)N-アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記酵素の硫酸基転移活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、前記活性を低下させる化合物を選択する工程
被検化合物が上記硫酸基転移活性を有しているか否かについて評価(測定)可能な方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。
(a)N-アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)前記細胞における遺伝子の発現量を測定する工程
(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、前記遺伝子の発現量を低下させる化合物を選択する工程
(a)N-アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記レポーター遺伝子の発現量(レベル)を測定する工程
(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、前記レポーター遺伝子の発現量(レベル)を低下させる化合物を選択する工程
(a)被検試料から、上記組織線維形成抑制剤のスクリーニング方法により、組織線維形成抑制剤を選択する工程
(b)前記薬剤と医薬的に許容される担体とを混合する工程
本方法においては次いで、上記選択された薬剤と、医薬的に許容される担体とを混合する。医薬的に許容される担体としては、例えば上述の担体を用いることができる。
本発明のキットは、例えば本発明の上述の各種試薬の中から、実施するスクリーニング方法にあわせて適宜選択することができる。例えば本発明のキットは、本発明のN-アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素を構成要素とすることができる。本発明のキットには、さらに、本発明の方法において使用される各種試薬、容器等を含めることができる。例えば、抗体、プローブ、各種反応試薬、細胞、培養液、対照サンプル、緩衝液、使用方法を記載した指示書等を適宜含めることができる。
本発明の予防もしくは治療方法の対象となる個体は、線維形成性疾患を発症し得る生物であれば特に制限されないが、好ましくはヒトである。
個体への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者(医師、獣医師、薬剤師等)であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
なお、本明細書においてsiRNAの構造(配列)を、ターゲットとなる遺伝子のDNA領域を記載することによって表現する場合がある。当業者であれば、ターゲット配列として記載されたDNA配列の情報に基づいて、当該DNA配列に対応する二本鎖RNAからなるsiRNAの構造を認識することは容易である。
実施例1:マウス心筋症モデルにおける標的糖鎖遺伝子のsiRNAノックダウン効果の検討と、遺伝子レベルにおける抗線維形成効果の検討
この実施例及び以下の実施例では、マウス心筋症モデルとして標準化されている、塩酸ドキシルビシン(DOX:協和発酵社製)腹腔内投与モデルを使用した。このマウスモデルは古典的であるが再現性にすぐれ、簡便であることより心筋症モデルとして病態解明や、新規治療実験などに幅広く使用されている(Longhu Li, Circulation. 2006;113:535-543、Xiaoming Yi, Am J Physiol Heart Circ Physiol 290: H1098-H1102, 2006、Kang YJ, J Biol Chem. 2000 May 5; 275(18):13690-8、Nozaki N, Circulation. 2004;110:2869-2874、Fisher PW, Circulation. 2005;111:1601-1610)。
[human GalNac4-6STsiRNA](Gene Bank accession number NM_015892)
(北海道システムサイエンス社製)
5’-ggagcagagcaagaugaauacaauc-ag -3’(配列番号:25)
3’-ua-ccucgucucguucuacuuauguuag -5’(配列番号:26)
[定量PCR Primer配列]
*mouse GalNac4S-6ST(タカラバイオ社製)
forward : 5’-GTGAGTTCTGCTGCGGTCCA-3’(配列番号:27)
reverse : 5’-AGTCCATGCTGATGCCCAGAG-3’(配列番号:28)
*mouse procollagen Type 1 alpha 2(タカラバイオ社製)
forward : 5’-ACCCGATGGCAACAATGGA-3’(配列番号:29)
reverse : 5’-ACCAGCAGGGCCTTGTTCAC-3’(配列番号:30)
*mouse α-SMA(タカラバイオ社製)
forward : 5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’(配列番号:31)
reverse : 5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’(配列番号:32)
*mouse rリボゾーム18S(タカラバイオ社製)
forward : 5’- TTCTGGCCAACGGTCTAGACAAC-3’(配列番号:33)
reverse : 5’- CCAGTGGTCTTGGTGTGCTGA-3’(配列番号:34)
本発明の薬剤は、例えば、心筋線維形成抑制剤として有用である。
この実施例では心筋症モデルマウスの心重量(mg)と体重(g)を測定し、心肥大の指標となる心重量・体重比を算出し、GalNAc4S-6ST (GalNac) si RNA心肥大抑制効果について比較検討を行った。心肥大は組織の線維性変化を示す指標でもある。
図1は、siRNA治療群(n=4)及び未治療群(n=4)の心重量(mg)・体重(g)比について算出した結果について示している。この結果、未治療群での比の値は、6.376±0.484で、siRNA治療群の値は5.442±0.203であった。この結果、未治療群に比べてsiRNA治療群では、有意に値の減少が見られた(p<0.05:t検定)。これは、GalNac 4S-6ST siRNAが病的な心肥大を抑制する効果を持つこと示した結果である。
本発明の薬剤は、例えば、心肥大抑制剤(心肥大治療剤)として有用である。
この実施例では、心筋症モデルマウスの心臓サンプルを使用してGalNac 4S-6ST siRNAのI型コラーゲン沈着(線維形成の指標)の抑制効果について比較検討を行った。実施例1と同じマウスより採取された心臓の組織サンプルを、凍結用包埋剤OCTコンパウンド(Miles社製)に包埋し、クライオスタット(カールツァイス社製)により薄切し、得られた切片をアセトン(シグマアルドリッチジャパン社製)で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、さらに一次抗体として抗I型コラーゲンウサギ抗血清(ウサギポリクローナル抗体、1:2000希釈;LSL社製)を添加し、室温で一時間反応させた。続いて、二次抗体であるペルオキシダーゼ標識ヤギ由来抗ウサギIgG(1:200希釈;cappel社製)を添加し、室温で30分反応させた。反応後のサンプルにDAB基質(ニチレイ社製)を添加した。この標本を光学顕微鏡(ライカ社製)用いて観察した。
組織所見を図3に示した。未治療群においては、心筋線維間に非常に強いI型コラーゲンの陽性シグナルが確認出来た。これに対して、siRNA治療群では、I型コラーゲンの陽性シグナルは未治療群に比べて遥かに弱かった。以上のI型コラーゲンの免疫染色の結果を考察すると、GalNac 4S-6ST siRNAが、心筋組織におけるI型コラーゲンの過剰沈着に対して抑制効果をもつことが明らかとなった。この結果は、実施例1に示した定量PCRの結果と相関するものであった。
本発明の薬剤は、例えば、心筋組織におけるI型コラーゲン沈着抑制剤として有用である。
この実施例では、心筋症モデルマウスの心臓サンプルを使用してGalNac 4S-6ST siRNAのIII型コラーゲン沈着(線維形成の活動性の指標)の抑制効果について比較検討を行った。実施例3と同様の方法で得られた組織切片を、アセトン(シグマアルドリッチジャパン社製)で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、さらに一次抗体として抗III型コラーゲンウサギ抗血清(ウサギポリクローナル抗体、1:2000希釈;LSL社製)を添加し、室温で一時間反応させた。続いて、二次抗体であるペルオキシダーゼ標識ヤギ由来抗ウサギIgG(1:200希釈;cappel社製)を添加し、室温で30分反応させた。反応後のサンプルにDAB基質(ニチレイ社製)を添加した。この標本を光学顕微鏡(ライカ社製)用いて観察した。
組織所見を図4に示した。未治療群においては、心筋線維間にやや強めのIII型コラーゲンの陽性シグナルが確認出来た。これに対して、siRNA治療群では、III型コラーゲンの陽性シグナルは対照群と同程度であった。以上のIII型コラーゲンの免疫染色の結果を考察すると、GalNac 4S-6ST siRNAが、心筋組織におけるIII型コラーゲンの沈着を抑制する効果、つまり活動的なコラーゲンの沈着に対しても有効的な抑制効果もつことが明らかとなった。
本発明の薬剤は、例えば、心筋組織におけるIII型コラーゲン沈着抑制剤として有用である。
この実施例では、DOX投与により、心筋症モデルマウスの心筋組織内に浸潤してくる線維芽細胞の動態に対するGalNAc 4S-6ST siRNAの薬理効果について検討した。実施例3と同様の方法で得られた組織切片を、アセトン(シグマアルドリッチジャパン社製)で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、さらに一次抗体として抗マウス線維芽細胞抗体(ER-TR7:ラットモノクローナル抗体、1:400希釈;BMAバイオメディカルズ社製)を添加し、室温で一時間反応させた。続いて、二次抗体であるペルオキシダーゼ標識ヤギ由来抗ラット免疫グロブリン抗体(1:200希釈;バイオソース社製)を添加し、室温で30分反応させた。反応後のサンプルにDAB基質(ニチレイ社製)を添加した。この標本を光学顕微鏡(ライカ社製)用いて観察した。
組織所見を図5に示した。写真は心室隔壁部分フォーカスしたものである。未治療群においては、対照群に比べて多数の線維芽細胞の浸潤を認めた。これに対して、siRNA治療群では、未治療群に比べて、線維芽細胞の浸潤の程度を少なかった。この結果は、GalNac 4S-6ST siRNAが心筋組織における線維芽細胞の浸潤を抑制する薬理効果をもち、この効果が抗線維形成作用の一端である事を示すものであった。
本発明の薬剤は、例えば、心筋組織における線維芽細胞浸潤抑制剤として有用である。
実施例6:マウス腸管線維形成モデルにおけるGalNAc4S-6STの臨床的線維形成抑制効果
C57BL/6Jマウス(♀、6週齢、日本クレア社製)にデキストラン硫酸ナトリウム(DSS; 和光社製)を3%含有する高塩素水を8日間自由飲水させることにより大腸炎モデルを作成した。本DSS誘導性大腸炎モデルは再現性に優れており、マウス潰瘍性大腸炎やクローン病という炎症性腸疾患の標準的実験モデルとして広く用いられている他、腸管狭窄の組織学的特徴である全層性の炎症・線維性変化ならびに筋層の肥厚を呈するモデルでもある(Sasaki N, J Inflamm. 2005 2: 13、総説:Pucilowska JB et al. Am J Physiol Gastroenterol Liver Physiol. 279:G653-G659, 2000)。したがって、炎症性腸疾患に加え、組織上の腸管狭窄を呈する病態、すなわち、腸管ベーチェット(単純性潰瘍)、過敏性腸症候群、虚血性腸炎、薬剤性腸炎、放射線性腸炎、食道アカラシア、強皮症に伴う食道狭窄、SLE(全身性エリテマトーデス:systemic lupus erythematosus)に伴う腸管狭窄、ヒルス・シュプリング病、腸管摘出後の狭窄(術後狭窄)、消化管系の癌(舌癌、上咽頭癌、喉頭癌、食道癌、胃癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌)に対する内視鏡的粘膜切除術後の腸管狭窄、腸閉塞、という疾病に幅広く共通する組織学的所見である。
さらに、5日目にマウス屠殺後に大腸長を測定したところ、GalNAc4S-6ST siRNA投与群で有意(p<0.005、t検定)に大腸の短縮が抑制されていた(図6)。大腸長は、腸管線維形成あるいは狭窄を反映する決定的な指標である。したがって、GalNAc4S-6ST siRNA投与群では、臨床的にも腸管線維性変化を強く抑制することが明らかになった。
本発明の薬剤は、例えば、腸管線維性変化抑制剤として有用である。
この実施例では、GalNAc4S-6ST siRNA投与による大腸局所の線維形成関連遺伝子発現をリアルタイム定量PCR法により検討した。
実施例6と同様の方法で腸管線維形成モデルを作成し、7日目にマウスを屠殺した。採取した大腸の一部を1.5 mlチューブにとりわけ、液体窒素で凍結した。実施例1と同様の方法でcDNA合成を行ない、定量的PCRを行なった。プライマーの配列、PCRサイクルも同様である。
結果を図7に示す。本モデルではGalNAc4S-6ST遺伝子の発現が増強してくるが、GalNAc4S-6ST siRNA治療によって有意(p<0.001、t検定)にノックダウンされていることが確認できた。また、線維形成の指標であるtype I collagenならびにα-SMAの発現増強も、GalNAc4S-6ST siRNAにより有意(ともにp<0.001、t検定)に抑制した。本結果は、GalNAc4S-6ST の発現を抑制することにより、大腸の線維性変化の増強を効果的に抑制できることを示している。
本発明の薬剤は、例えば、大腸における線維性変化抑制剤として有用である。
実施例6と同様の方法で腸管線維形成モデルを作成し、7日目にマウスを屠殺した。採取した大腸を実施例3と同様の方法で凍結ブロックならびに、組織切片を作成した。大腸組織切片のマッソン染色像を図8に示す。マッソン染色はコラーゲン繊維を視覚化する、組織の線維性変化を評価するための指標である。GalNAc4S-6ST siRNA投与群においては、対照群に比較し、全層性(粘膜固有層、粘膜下層、筋層)のコラーゲン繊維の沈着が明確に抑制されていた。
本発明の薬剤は、例えば、全層性(粘膜固有層、粘膜下層、筋層)のコラーゲン繊維沈着抑制剤として有用である。
実施例6と同様の方法で腸管線維形成モデルを作成し、7日目にマウスを屠殺した。採取した大腸を実施例3と同様の方法で凍結ブロックならびに、組織切片を作成した。得られた切片をアセトン(和光社製)で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体として抗ER-TR7抗体(ラットモノクローナル抗体、1μg/ml、BMA社製)を添加し、室温で1時間反応させた。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗ラットIgG(1:200希釈)を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質(ニチレイバイオサイエンス社製)を添加し発色させた。その後リリー・マイヤーヘマトキシリン(武藤化学社製)により核染色を行い、光学顕微鏡(ライカ社製)下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
その結果、GalNAc4S-6ST siRNA治療群では対照群に比し、線維芽細胞の全層性の浸潤が明確に抑制されていた(図9)。したがって、GalNAc4S-6ST遺伝子発現抑制により、組織病変局所の線維芽細胞の浸潤及び定着を抑制することで、線維性変化の増強を軽減していることが判明した。
本発明の薬剤は、例えば、線維芽細胞浸潤抑制剤もしくは線維芽細胞定着抑制剤として有用である。
実施例6と同様の方法で腸管線維形成モデルを作成し、7日目にマウスを屠殺した。採取した大腸を実施例3と同様の方法で凍結ブロックならびに、組織切片を作成した。得られた切片をアセトン(和光社製)で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体として抗F4/80抗体(クローンA3-1、ラットモノクローナル抗体、2μg/ml:CALTAG LABORATORIES社製)を添加し、室温で1時間反応させた。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗ラットIgG(1:200希釈)を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質(ニチレイバイオサイエンス社製)を添加し発色させた。その後リリー・マイヤーヘマトキシリン(武藤化学社製)により核染色を行い、光学顕微鏡(ライカ社製)下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
その結果、GalNAc4S-6ST siRNA治療群では対照群に比し、マクロファージの全層性の浸潤が明確に抑制されていた(図10)。したがって、GalNAc4S-6ST遺伝子発現抑制によって、マクロファージと線維芽細胞という線維性変化を持続・増強させる責任細胞群の浸潤を抑制し、総合的に組織の線維性変化を抑制していることが判明した。
本発明の薬剤は、例えば、マクロファージもしくは線維芽細胞の浸潤抑制剤として有用である。
GalNAc4S-6STは4位が硫酸化されたNアセチルガラクトサミンの6位に硫酸基を転移する酵素である。本実施例では、4位硫酸転移酵素であるGalNAc-4ST1、GalNAc-4ST2というファミリーの役割に検討を加えた。実施例6と同様の方法で腸管線維形成モデルを作成した。7日目にマウスを屠殺した。本実施例では、GalNAc 4S-6ST siRNAのみならず、GalNAc 4ST-1とGalNAc 4ST-2(Gene World社製)を混合してマウス1匹あたり1μgを、媒体である1%アテノコラーゲン(高研社製)200μLを混合したものを腹腔内投与した。本siRNA投与群をGalNAc ST siRNA投与群と表現する。対照群は実施例6と同様である。本実施例に用いたGalNAc 4S-6ST siRNA、GalNAc 4ST-1、GalNAc 4ST-2の塩基配列について以下に示す。配列は必ずしも本例のみに限定されない。
[GalNAc4ST-1 siRNAカクテル配列](GenBank accession number NM_175140)
(Gene world社製)
5’-ACCCCCAACTCGGAACGATGCGGCT-3’(配列番号:35)
5’-TGCATGTTCTCGTCCATCCTGCTG-3’(配列番号:36)
5’-CGCCACCGTGTACTGTACTGTGAAGT-3’(配列番号:37)
5’-AGGCT GCTCCAACTG GAAGAGGGTG-3’(配列番号:38)
[GalNAc4ST-2 siRNAカクテル配列](GenBank accession number NM_199055)
(Gene world社製)
5’-ATATAGTATCTAGGATATATGTAG-3’(配列番号:39)
5’-GAAGTACCAAAAGCTGGCTGCTCTA-3’(配列番号:40)
5’-TTCTATCACTTGGACTATTTGATGTT-3’(配列番号:41)
5’-TACACAACTCCACATTTGTAATTTG-3’(配列番号:42)
[GALNAC4S-6ST siRNAカクテル配列](GenBank accession number NM_029935)
(Gene world社製)
5’-CCAGAAGCCAAGCTCATTGTTATG-3’(配列番号:43)
5’-CTGTGGAGAGGTTGTACTCAGACTA-3’(配列番号:44)
5’-ATTTGCCTGGAAGACAACGTGAGAGC-3’(配列番号:45)
5’-GTCCCTTCTGCAGAAGCTGGGCCCACT-3’(配列番号:46)
マウス腸管線維形成モデルにおいては実施例6から10で詳細に検討した如く、組織の線維性変化が大腸長に集約されるため、本実施例においては7日目における大腸長を決定的な評価ポイントとして示す。GalNAc ST siRNA投与群においては、対照群に比較し有意(p<0.01、t検定)に大腸の短縮を抑制した(図11)。したがって、GalNAc 4ST-1、GalNAc 4ST-2遺伝子の発現を抑制することで、腸管線維形成が抑制されることが判明した。
本発明の薬剤は、例えば、腸管線維形成抑制剤として有用である。
実施例12:マウス肺気腫モデルにおけるC6ST-1 siRNAの肺胞間質における効果
この実施例では、基本的な肺気腫マウスモデルであるブタ膵臓由来エラスターゼ(PPE)気管内投与モデルを使用した。このマウスモデルは古典的ではあるが再現性にすぐれ、簡便であることより肺気腫モデルとして広く使用されている。組織学的には肺胞間質への炎症細胞浸潤が認められるため、肺気腫や慢性気管支炎等の慢性閉塞肺疾患(COPD:chronic obstructive pulmonary disease)に加えて、特発性間質性肺炎(IIPs:idiopathic interstitial pneumonias)、塵肺、肺結核後遺症など、慢性呼吸不全に至る疾患の組織所見に共通する(Karlinsky JB et al Am Rev Respir Dis 1978;117:1109-1133.、Otto-Verberne CJ et al Protective effect of pulmonary surfactant on elastase-induced emphysema in mice. Eur Respir J 1992;5:1223-1230.、Janoff A et al Prevention of elastase-induced experimental emphysema by oral administration of a synthetic elastase inhibitor. Am Rev Respir Dis 1980;121:1025-1029.、Christensen TG, et al. Irreversible bronchial goblet cell metaplasia in hamsters with elastase-induced panacinar emphysema. J Clin Invest 1977;59:397-404.、Lucey EC, et al. Remodeling of alveolar walls after elastase treatment of hamsters: results of elastin and collagen mRNA in situ hybridization. Am J Respir Crit Care Med 1998;158:555-564.、Snider GL, Lucey EC, Stone PJ. Animal models of emphysema. Am Rev Respir Dis 1986;133:149-169.)。
最初にマウスモデルの作製についてであるが、C57BL6/J マウス(メス、5〜6週齢、日本クレア社製)に、PPE(4単位;Calbiochem-Novabiochem社製)を気管内投与する。投与後3週間飼育し肺組織を採取した。対照群は同様のマウスでPPE未投与のものを用いた。
C6ST-1 siRNAの投与については実施例1と同様に行なった。PPE投与後より1週間ごとにC6ST-1 siRNA 1μg(ambion社製)とsiRNAの媒体である1%アテノコラーゲン(高研社製)を混合したもの腹腔内投与した。投与量は200μL/ mouseで行った。
*[C6ST-1 siRNAカクテル配列]
(GenBank accession number NM_016803)
5’-gcgccccctctccccatggagaaag-3’(配列番号:47)
5’-gctttgcctcaggatttccgggacc-3’(配列番号:48)
5’-ggttcagccttggtctaccgtgatgtc-3’(配列番号:49)
5’-gcagttgttgctatgcgacctgtat-3’(配列番号:50)
採取した右肺組織を凍結用包埋剤OCTコンパウンド(Miles社製)に包埋し、液体窒素を用いて凍結ブロックを作製した。その凍結ブロックからクライオスタット(Microm社製)を用いて厚さ6μmの切片を作製した。
得られた切片を1%グルタールアルデヒド(ナカライテスク社製)で10分間固定後、さらにホルモールカルシウム液で10分間固定した。リン酸緩衝液で洗浄後、リリマイヤーヘマトキシリン液(シグマアルドリッチジャパン社製)で室温、5分間染色し脱色液(0.5% HCL含有70%エタノール、いずれもナカライテスク社製試薬を用いて作製)にて軽く洗浄した。その後10分間水洗いを行った。エオジンアルコールで室温、5分間染色し10分間水洗いを行った。100%エタノールで軽く洗浄後、3分間静置した。さらにキシレン(ナカライテスク社製)軽く洗浄後、10分間静置した。この標本を光学顕微鏡(ライカ社製)用いて観察し組織の様子を確認した。
得られた組織図を図12に示した。対照群(PPE未投与マウス)の所見では蜂の巣様の肺胞隔壁が特徴的な正常な肺実質の組織所見が確認出来る。しかしながら、中央の写真が示す未治療群(PPE投与、C6ST-1 siRNA未投与)では、肺気腫に特徴的な所見である肺胞隔壁の破壊消失と気腔の拡大に伴う気腫性病変が観察出来る。これに対して酵素治療群(PPE投与、C6ST-1 siRNA投与)では若干の肺胞隔壁の消失と気腫性病変が見られるものの、その程度は大幅に改善されていることが観察出来る所見であった。
この実施例では、C6ST-1 siRNA投与による肺胞間質の線維化関連遺伝子発現をリアルタイム定量PCR法により検討した。
実施例12と同様の方法でCOPDモデルを作成した。採取した肺組織の一部を1.5 mlチューブにとりわけ、液体窒素で凍結した。実施例1と同様の方法でcDNA合成を行ない、定量的PCRを行なった。I型コラーゲンとα-SMAのプライマーの配列、PCRサイクルは同様である。C6ST-1のプライマーの配列を以下に示す。
[定量PCR Primer配列]
*mouse C6ST-1(タカラバイオ社製)
forward : 5’-TGTTCCTGGCATTTGTGGTCATA -3’(配列番号:51)
reverse : 5’-CCAACTC GCTCAGGGACAAGA-3’(配列番号:52)
結果を図13に示す。本モデルではC6ST-1遺伝子の発現が増強してくるが、C6ST-1 siRNA治療によって有意(p<0.01、t検定)にノックダウンされていることが確認できた。また、線維化の指標であるtype I collagenならびにα-SMAの発現増強も、C6ST-1 siRNAにより有意(ともにp<0.01、t検定)に抑制した。本結果は、C6ST-1 の発現を抑制することにより、肺間質の線維性変化の増強を効果的に抑制できることを示している。
本発明の薬剤は、例えば、肺間質の線維性変化抑制剤として有用である。
実施例12と同様の方法で腸管線維形成モデルを作成した。採取した肺組織を実施例3と同様の方法で凍結ブロックならびに、組織切片を作成した。得られた切片をアセトン(和光社製)で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体として抗ER-TR7抗体(ラットモノクローナル抗体、1μg/ml、BMA社製)を添加し、室温で1時間反応させた。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗ラットIgG(1:200希釈)を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質(ニチレイバイオサイエンス社製)を添加し発色させた。その後リリー・マイヤーヘマトキシリン(武藤化学社製)により核染色を行い、光学顕微鏡(ライカ社製)下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
その結果、対照群では肺胞隔壁の破壊した間質に線維芽細胞の強い集積を認めた(図14、対照群の図左)。また、肺胞隔壁が破壊されつつある部位の間質においても多数の集積を認めた(図14、対照群の図右)ことから、COPDのような病態において、線維芽細胞の過剰集積から肺胞壁の破壊過程に至るという予想外の結果を得た。一方、C6ST-1 siRNA治療群では、線維芽細胞の肺胞組織間質への浸潤が明確に抑制されていた(図14)。したがって、C6ST-1 遺伝子発現抑制により、肺胞組織間質の線維芽細胞の浸潤及び定着を抑制することで、線維性変化の増強を軽減していることが判明した。
本発明の薬剤は、例えば、肺胞組織間質の線維芽細胞浸潤もしくは定着抑制剤として有用である。
実施例12と同様の方法でCOPDモデルを作成した。採取した肺組織を実施例3と同様の方法で凍結ブロックならびに、組織切片を作成した。得られた切片をアセトン(和光社製)で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体として抗F4/80抗体(クローンA3-1、ラットモノクローナル抗体、2μg/ml:CALTAG LABORATORIES社製)を添加し、室温で1時間反応させた。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗ラットIgG(1:200希釈)を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質(ニチレイバイオサイエンス社製)を添加し発色させた。その後リリー・マイヤーヘマトキシリン(武藤化学社製)により核染色を行い、光学顕微鏡(ライカ社製)下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
その結果、C6ST-1 siRNA治療群では対照群に比し、マクロファージの肺胞間質への浸潤が明確に抑制されていた(図15)。したがって、C6ST-1遺伝子発現抑制によって、マクロファージと線維芽細胞という線維性変化を持続・増強させる責任細胞群の浸潤を抑制し、総合的に組織の線維性変化を抑制していることが判明した。
本発明の薬剤は、例えば、肺胞間質へのマクロファージ浸潤抑制剤として有用である。
本実施例では、C6ST-1 siRNAの肺気腫モデルマウスにおける臨床効果を検討するために静肺コンプライアンス(statistic compliance: Cst)を指標として呼吸機能に与える影響について評価した。Cstは肺組織の伸びやすさを表しているが、肺胞域の組織破壊を伴う疾患である肺気腫はCstが上昇する。
実施例12で示してきた方法と同様の手順で肺気腫モデルマウスを作製し、C6ST-1 siRNAで治療を行った。それらのマウスの自発呼吸を麻酔薬にて停止させたのちFlexiVent(SCIREQ社製)呼吸機能解析装置のP-V roop modeを用いてCstを測定した。マウスとFlexiVentとの接続はマウスの自発呼吸停止後に正中切開を行い、気管内に専用カニューレを挿管し気管支周囲を結紮する方法にて行った。
本実施例の結果について図16に示した。対照群では42.62±2.25μL/cmH2Oであったが、未治療群で51.22±5.2μL/cmH2O(vs対照群P=0.03 t検定)と統計学的に有意な増加を認めた。また、C6ST-1 siRNA投与群におけるCstは、42.92±1.82μL/cmH2O(vs未治療群P=0.03 t検定)と、未治療群に対して有意に低下していた。
したがって、C6ST-1 siRNA投与群では、PPEの気管内投与により誘導される肺気腫に伴うCstの増加を有意に抑制することが明らかになった。また、本実施例に示された結果は、C6ST-1 の遺伝子発現を抑制することにより、肺組織の間質線維性変化に伴う肺胞破壊を抑制するだけでなく実際の臨床症状(呼吸状態)を改善する効果を有することを示唆するものであった。
本発明の薬剤は、例えば、肺胞破壊抑制剤として有用である。
肺胞の気腔拡大を特徴的な病理像として示す肺気腫では、気腫性病変の進行に従い肺容量が増加する。本実施例ではC6ST-1 siRNAの治療効果が、細胞レベルでの破壊を抑制するだけでなく臓器の形態維持・保存の効果にまで及ぶものであることを立証することを目的として行われた。
本実施例で使用した肺組織は、実施例12で使用した肺組織の右肺を使用して行っている。マウスより摘出した肺組織をリン酸緩衝液で軽く洗浄後、同じくガラス容器に満たしたリン酸緩衝液につけた。リン酸緩衝液を満たしたガラス容器の重量を予め測定しておき、肺組織を容器に加えた後に増加した重量を液量に換算し肺容量とした。
本実施例の結果について図17に示した。対照群における肺容量は277.5±61.85μLであったが、未治療群で413.33±77.67μL(vs対照群P=0.024 t検定)と統計学的に有意な肺容量の増加を認めた。また、C6ST-1 siRNA治療群における肺容量は、292.5±51.23μL(vs未治療群P=0.027 t検定)と未治療群に対して有意に肺容量の低下を認めた。
これらの結果をまとめると、C6ST-1の遺伝子発現を抑制することにより、PPEの気管内投与により誘導される肺気腫に伴う肺容量の増加を効果的に抑制することが明らかになった。したがって、細胞レベルでの破壊を抑制するだけでなく、臓器の形態維持・保存の効果、もしくは破壊された組織の修復効果を持ち合わせていることを示すものであった。
本発明の薬剤は、例えば、肺気腫に伴う肺容量増加抑制剤として有用である。
4位および6位硫酸化が重要であることをもう一つの実施例で示す。本実施例では、実施例11と同様の方法で、GalNAcST siRNA投与による肺胞間質の線維化関連遺伝子発現をリアルタイム定量PCR法により検討した。siRNAの配列は実施例11と同様である。
実施例12と同様の方法で肺気腫モデルを作成した。採取した肺組織の一部を1.5 mlチューブにとりわけ、液体窒素で凍結した。実施例1と同様の方法でcDNA合成を行ない、定量的PCRを行なった。プライマーの配列、PCRサイクルは実施例1ならびに13と同様である。TGF-βの配列は以下に示す。
[定量PCR Primer配列]
*mouse TGF-β(タカラバイオ社製)
forward : 5’-GTGTGGAGCAACATGTGGAACTCTA -3’(配列番号:53)
reverse : 5’-TTGGTTCAGCCACTGCCGTA -3’(配列番号:54)
結果を図18に示す。本実施例においても、線維化の指標であるtype I collagen、α-SMA、ならびにTGF-βの発現増強が、GalNAcST siRNAにより有意(ともにp<0.01、t検定)に抑制した。本結果は、GAlNAc4ST-1、GAlNAc4ST-2ならびにGAlNAc4S-6STの発現を抑制することにより、肺間質の線維性変化の増強を効果的に抑制できることを示している。
本発明の薬剤は、例えば、肺間質の線維性変化抑制剤として有用である。
本実施例では、GAlNAcST siRNAの肺気腫モデルマウスにおける臨床効果を検討するために静肺コンプライアンス(statistic compliance: Cst)を指標として呼吸機能に与える影響について評価した。
実施例12で示してきた方法と同様の手順で肺気腫モデルマウスを作製し、GAlNAcST siRNAで治療を行った。それらのマウスの自発呼吸を麻酔薬にて停止させたのちFlexiVent(SCIREQ社製)呼吸機能解析装置のP-V roop modeを用いてCstを測定した。マウスとFlexiVentとの接続はマウスの自発呼吸停止後に正中切開を行い、気管内に専用カニューレを挿管し気管支周囲を結紮する方法にて行った。
本実施例の結果について図18に示した。対照群では42.62±2.25μL/cmH2Oであったが、未治療群で51.22±5.2μL/cmH2O(vs対照群P=0.03 t検定)と統計学的に有意な増加を認めた。また、C6ST-1 siRNA投与群におけるCstは、44.15±2.29μL/cmH2O(vs未治療群P=0.0018 t検定)と、未治療群に対して有意に低下していた。
したがって、GalNAcST siRNA投与群では、PPEの気管内投与により誘導される肺気腫に伴うCstの増加を有意に抑制することが明らかになった。また、本実施例に示された結果は、GAlNAc4ST-1、GAlNAc4ST-2ならびにGAlNAc4S-6STの遺伝子発現を抑制することにより、肺組織の間質線維性変化に伴う肺胞破壊を抑制するだけでなく実際の臨床症状(呼吸状態)を改善する効果を有することを示唆するものであった。
本発明の薬剤は、例えば、肺胞破壊抑制剤もしくは呼吸状態改善剤として有用である。
本実施例ではGalNAcST siRNAの治療効果が、細胞レベルでの破壊を抑制するだけでなく臓器の形態維持・保存の効果にまで及ぶものであることを立証することを目的として行われた。
本実施例で使用した肺組織は、実施例12で使用した肺組織の右肺を使用して行っている。マウスより摘出した肺組織をリン酸緩衝液で軽く洗浄後、同じくガラス容器に満たしたリン酸緩衝液につけた。リン酸緩衝液を満たしたガラス容器の重量を予め測定しておき、肺組織を容器に加えた後に増加した重量を液量に換算し肺容量とした。
本実施例の結果について図20に示した。対照群における肺容量は277.5±61.85μLであったが、未治療群で413.33±77.67μL(vs対照群P=0.024 t検定)と統計学的に有意な肺容量の増加を認めた。また、GalNAcST siRNA治療群における肺容量は、315±51.96μL(vs未治療群P=0.049 t検定)と未治療群に対して有意に肺容量の低下を認めた。
これらの結果をまとめると、GAlNAc4ST-1、GAlNAc4ST-2ならびにGAlNAc4S-6STの遺伝子発現を抑制することにより、PPEの気管内投与により誘導される肺気腫に伴う肺容量の増加を効果的に抑制することが明らかになった。したがって、細胞レベルでの破壊を抑制するだけでなく、臓器の形態維持・保存の効果、もしくは破壊された組織の修復効果を持ち合わせていることを示すものであった。
本発明の薬剤は、例えば、肺の形態維持剤、もしくは肺の形態保存剤として有用である。
以下の実施例では生後2日目C57BL/6JcLマウス(雌、日本クレア社製)のStreptozotocin投与により2型糖尿病モデルを作製し、C4ST-1(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1)siRNA、C4ST-2(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 2)siRNA、C4ST-3(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 3)siRNA処置による体重変動、血糖値変動、遺伝子発現や膵臓組織における線維性変化を検討した。各siRNAの投与法については、実施例1と同様の方法で行なった。配列を以下に示す。
*[C4ST-1 siRNAカクテル配列]
C4ST1(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1)
(GenBank accession number NM_021439)
5’-ACAAAGCCATGAAGCCGGCGCTGCTGGAAGTGATGAGGATGAACAGAATT-3’(配列番号:55)
5’-CAACCTGAAGACCCTTAACCAGTACA-3’(配列番号:56)
5’-GCATCCCAGAGATCAACCACCGCTTG-3’(配列番号:57)
*[C4ST-2 siRNAカクテル配列]
C4ST2(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 2)
(GenBank accession number NM_021528)
5’-GCCAGGAGTGGGCCCAGCCCAGGGC -3’(配列番号:58)
5’-ATGACCAAGCCGCGGCTCTTCCGGCTG -3’(配列番号:59)
5’-AGAGCCTGCTGGACCGGGGCAGCCCCTA -3’(配列番号:60)
5’-GAGACCCCCTGGACATCCCCCGGGAACA-3’(配列番号:61)
*[C4ST-3 siRNAカクテル配列]
C4ST3(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 3)
(GenBank accession number XM_355798)
5’-ATGACTGTCGCCTGCCACGCGTGCCA -3’(配列番号:62)
5’-CAGCATGGGAAGACGCTCCTGTTGCA -3’(配列番号:63)
5’-TCCAAGCGCAATCCCTGCGCACGAGGCG -3’(配列番号:64)
5’-GCCTGGCCTGCTGCCCTCGCTGGCC -3’(配列番号:65)
まず、サンプル調製するため以下の様に行った。
実施例21:Streptozocin誘発性 C57BL/6JcL 2型糖尿病モデルマウスによるC4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA処置における抗肥満効果の検討
妊娠14日目 C57BL/6JcLマウス(日本クレア社製)を飼育、出産させ、出生後2日令 C57BL/6JcLマウス雌、各々にStreptozocin 10 mg/mL(SIGMA社製)20μL/headに皮下注射し、4週令までCE-2(日本クレア社製)の飼料、滅菌水を与え飼育し、4週令よりHigh Fat Diet食(日本クレア社製)、滅菌水を与え、2週間飼育させた。2週間目にsiRNA C4ST-1(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1)、C4ST-2(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 2)、C4ST-3(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 3)1μg(GeneWorld社製)をsiRNA媒体である1% Atelocollagen(高研社製)と混合させたものを1回/1週間 200μL 腹腔内投与(1回/1週間)の2回(2週間)処置を行った。実験14日目にBrdU 5 mg/mL(ZyMED Laboratory.Inc社製)100μLを尾静脈内投与処置し、1時間後、解剖し、肝臓、膵臓、腎臓、精巣、卵巣、筋肉を摘出し、免疫染色用サンプル、遺伝子発現解析用サンプルを得た。体重変動に関しては、実施例期間中、14日間、経時的に測定を行った。
図21に結果を示した。縦軸に体重(g)を横軸に測定日数(days)を示した。図21よりControl群と比較してC4ST-1 siRNA処置群、C4ST-2 siRNA処置群、C4ST-3 siRNA処置群において処置10日目以降、体重増加が抑えられる傾向を示した。C4ST-2 siRNA処置群、C4ST-3 siRNA処置群においては、処置18日目に有意に(ともにp<0.05)体重増加が抑制させた。本結果はC4ST-1、C4ST-2、C4ST-3の発現を抑制することにより、2型糖尿病に付随する肥満を抑制できることを示している。
本発明の薬剤は、例えば、体重増加抑制剤、もしくは2型糖尿病に付随する肥満抑制剤として有用である。
解剖前日にインスリン抵抗性テスト(Insulin-tolerance test)としてHuman crystalline insulin(0.75 U/kg)を腹腔内投与処置し、0分後、15分後、60分後の血糖値をグルテストエース血糖値測定器(ボンビックス薬品社製)を用い測定を行い評価を実施した。siRNA処置後、0分後、15分後、60分後の血糖値の変動を図22に示した。縦軸に血糖値(mg/dL)、横軸にInsulin-tolerance test後、0分後、15分後、60分後を示した。
図22よりControl群と比較してC4ST-1 siRNA処置群、C4ST-2 siRNA処置群、C4ST-3 siRNA処置群において処置後、0分後、15分後においては有意な血糖値の減少は認められなかったが、60分後においてC4ST-1 siRNA処置群、C4ST-2 siRNA処置群、C4ST-3 siRNA処置群各々で有意な血糖値の減少が認められた。本結果は、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3の発現抑制により、2型糖尿病の本質的な機能障害であるインスリン抵抗性を効果的に改善できることを示している。
本発明は、例えば、2型糖尿病のインスリン抵抗性改善剤として有用である。
Streptozocin誘発性C57BL/6JcLマウス、雌より摘出した臓器(膵臓)50 mg当たりに対し、実施例1と同様にcDNAを調整し、以下の組成でPCR反応を行った。
PCR Buffer 2μL [組成:166 mM (NH4)2SO4(Sigma Aldrich Japan社製)、670 mM Tris pH8.8(Invitrogen社製)、67 mM MgCl2・6H2O(Sigma Aldrich Japan製)、100 mM 2-mercaptoethanol](WAKO社製)]、25 mM dNTP mix 0.8μL(Invitrogen社製)、DMSO 0.6μL(Sigma Aldrich Japan社製)、Primer Forward 0.2μL(GeneWorld社製)、Primer Reverse 0.2μL(GeneWorld社製)、大塚蒸留水 15.7μL(大塚製薬社製)、Taq polymerase 0.1μL(Perkin Elmer社製)、上記より得られたcDNA 1μLを混合させAuthorized Thermal Cycler(eppendorf社製)により94℃ 45second、56℃ 45second、72℃ 60second 35cycle反応させた。反応終了後、得られたPCR産物に2μL Loading Dye(Invitrogen社製)を加え、1.5% UltraPure Agarose(Invitrogen社製)ゲルを作製し、Mupid-2 plus(ADVANCE社製)により100 V、20分間 電気泳動を行った。泳動後、1×LoTE[組成:3 mM Tris-HCl(pH7.5)(Invitrogen社製)、0.2 mM EDTA(pH7.5)(Sigma Aldrich Japan社製)]にて10000倍希釈Ethydium Bromide(Invitrogen社製)染色液中で20分間〜30分間振とうさせた後、I-Scope WD(ADVANCE製)に設置したEXILIM(CASIO社製)にてゲル撮影し遺伝子発現の確認を行った。
今回、用いたPrimer(Forward、Reverse)(GeneWorld社製)を以下に列記する。
[Primer配列]
*GAPDH
Forward : 5’-CTGCCAAGTATGACATCA -3’(配列番号:66)
Reverse : 5’-TACTCCTTGGAGGCCATGTAG -3’(配列番号:67)
*C4ST1(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1)
Forward : 5’-gtggatgaggaccacgaact-3’(配列番号:68)
Reverse : 5’-cttttcaagcggtggttgat-3’(配列番号:69)
*C4ST2(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 2)
Forward : 5’-acctcctagacccacacacg-3’(配列番号:70)
Reverse : 5’-ggatgttggcaaaccagtct-3’(配列番号:71)
*C4ST3(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 3)
Forward : 5’-atgagcccttcaacgaacac-3’(配列番号:72)
Reverse : 5’-tggtagaaggggctgatgtc-3’(配列番号:73)
本実施例では、2型糖尿病モデルマウスの膵臓組織サンプルを使用して、C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNAのアミロイド前駆タンパク質(APP:Amyloid precursor protein)沈着抑制効果について比較検討を行った。β細胞の存在するisletにおけるAPP、アミロイド線維の沈着は、2型糖尿病の重要な病理組織所見であることは古くから知られているが、近年ではアルツハイマー病との関わりも判明している(Johnson KH et al. N Eng J Med 321:513, 1989.、Rhodes CJ. Science 307:380, 2005.、Haan MN. Nat Clin Pract Neurol 3:159, 2006.、Prentki M et al. J Clin Invest 116:1802, 2006.)。
得られた組織サンプル切片を、実施例3と同様の方法で抗アミロイド前駆体タンパクヤギ抗体(calbiochem社)を用いて染色を行い、組織レベルの発現を評価、検討した。図24に正常マウス(Normal)群、Control群、C4ST-2 siRNA処置群の組織画像を示した。2型糖尿病モデルマウスのisletにおいてはAPPの沈着が増強してくるが、Control群と比較してC4ST-2 siRNA処置群では明確に抑えられていることが確認された。
本発明の薬剤は、例えば、アミロイド線維沈着抑制剤として有用である。
採取した膵臓組織を実施例3と同様の方法で凍結ブロックならびに、組織切片を作成した。得られた切片をアセトン(和光社製)で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体として抗ER-TR7抗体(ラットモノクローナル抗体、1μg/ml:BMA社製)を添加し、室温で1時間反応させた。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗ラットIgG(1:200希釈)を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質(ニチレイバイオサイエンス社製)を添加し発色させた。その後リリー・マイヤーヘマトキシリン(武藤化学社製)により核染色を行い、光学顕微鏡(ライカ社製)下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
その結果、C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA各治療群では対照群に比し、線維芽細胞の膵臓isletへの浸潤が明確に抑制されていた(図25)。したがって、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3遺伝子発現抑制によって、β細胞の局在するisletへの線維芽細胞浸潤と定着を抑制することで、組織の線維性変化の増強を軽減していることが判明した。
本発明の薬剤は、例えば、isletへの線維芽細胞浸潤抑制剤として有用である。
採取した膵臓組織を実施例3と同様の方法で凍結ブロックならびに、組織切片を作成した。得られた切片をアセトン(和光社製)で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体として抗F4/80抗体(クローンA3-1、ラットモノクローナル抗体、2μg/ml:CALTAG LABORATORIES社製)を添加し、室温で1時間反応させた。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗ラットIgG(1:200希釈)を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質(ニチレイバイオサイエンス社製)を添加し発色させた。その後リリー・マイヤーヘマトキシリン(武藤化学社製)により核染色を行い、光学顕微鏡(ライカ社製)下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
その結果、C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA各治療群では対照群に比し、マクロファージの肺胞間質への浸潤が明確に抑制されていた(図26)。したがって、C6ST-1遺伝子発現抑制によって、マクロファージと線維芽細胞という線維性変化を持続・増強させる責任細胞群の浸潤を抑制し、総合的に組織の線維性変化を抑制していることが判明した。
本発明の薬剤は、例えば、肺胞間質へのマクロファージ浸潤抑制剤として有用である。
4位および6位硫酸化が重要であることを示すためのもう一つの実施例を示す。本実施例では、実施例11、実施例18と同様の方法でGalNAcST siRNA投与によるインスリン抵抗性の改善を検討した。実施例21と同様の方法で2型糖尿病モデルを作成し、実施例22と同様の方法でインスリン抵抗性を検査した。結果を図27に示す。
GalNAcST siRNA投与によりインスリン負荷後の良好な血糖降下作用が認められた。本結果は、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GalNAc4S-6STの発現を抑制することにより、膵臓組織isletの線維性変化に伴うインスリン抵抗性を効果的に改善できることを示している。
本発明の薬剤は、例えば、血糖降下剤、もしくは膵臓組織のインスリン抵抗性改善剤として有用である。
腎臓組織の線維性変化は、あらゆる腎疾患のエンドポイントと考えられている。古典的には1)間質性腎疾患(tubulointerstitial disease)が腎線維形成の代表的疾患とされてきた。これには薬剤性、感染性、放射線性、重金属性間質性腎障害の他に、シェーグレン症候群や移植拒絶反応(chronic allograft nephropathyなど)、移植片対宿主反応(Graft-versus-host diseaseなど)なども含まれる。次に、2)血管性腎疾患が挙げられる。いわゆる高血圧に伴う腎硬化症の他、近年では動脈硬化症、メタボリック症候群に伴う線維形成も含まれる。さらには、糸球体原発疾患でも、蛋白尿などの結果、間質の線維形成を来たし慢性腎不全につながることから、3)原発性糸球体疾患、ならびに4)続発性糸球体疾患における腎線維性変化がある。3)にはIgA腎症、微小変化型ネフローゼ症候群、膜性腎症、膜性増殖性腎炎、巣状糸球体硬化症(FGFS:focal segmental glomerulosclerosis)が、4)には糖尿病性腎症、SLE(systemic lupus erythematosus)に伴うループス腎炎、慢性関節リウマチに伴う腎症、アミロイド腎症、B型肝炎やC型肝炎に伴う腎症などが含まれる。最後に、5)尿路閉塞に伴う間質性腎疾患が挙げられ、尿路結石、腫瘍、神経因性膀胱などが含まれる。
近年、腎機能の程度により分類・診断される臨床的な疾患概念として、これらの疾患群を慢性腎疾患(CKD:chronic kidney disease)と総称するようになった。CKDは間質の線維性変化により徐々に進行し、慢性腎不全、ESRD(end-stage renal disease)に至る。従来、ESRDに対しては人工透析しか決定的な治療法がなかった。アンギオテンシン系の降圧剤の使用によりESRDへの進行を遅らせる可能性も示唆されているが、腎線維形成そのものを標的とした治療法は確立されていない。CKDに対する新規治療が切に望まれるが、その病態進行プロセスから、線維性変化を治療標的とすることが、原発疾患の種類に関わらず共通した治療戦略として決定的な意義を持つ。CKDは全世界で5億人の患者が存在すると報告されていること、生活習慣の変化に伴い今後も一層患者数の増加が予測されること、更には、人工透析に至るまでに心血管障害で死亡するリスクが極めて高いことが大規模試験で明らかになったこと、から、CKDを21世紀型疾患として捉え、積極的な治療を行なうことが医療界の重大な課題となっている(Sergio A et al. Hypertension 38:635, 2001.、Weiner DE et al. JASN 15:1307, 2004.、Anavekar NS et al. N Eng J Med 351:1285, 2004.、Remuzzi G et al. J Clin Invest 116:288, 2006.、Tonelli M et al. BMJ 332:1426, 2006.、Khwaja A et al. Kidney International doi:10.1038/sj.ki.5002489)。
本実施例では、腎間質の組織学的な線維性変化に対する、4位及び6位硫酸基を修飾する糖鎖遺伝子阻害による変化を検討した。
実施例28と同様の方法で2型糖尿病モデルを作成した。妊娠14日目 C57BL/6JcLマウス(日本クレア社製)を飼育、出産させ、出生後2日齢C57BL/6JcLマウスにstreptozotocin(STZ:シグマ社製)を投与し、STZ誘発糖尿病モデルを作成した。マウスにSTZ(10 mg/ml)20μlを皮下に注射し、これを2日間で計3回行い、合計60μl投与した。これを4週齢まで親マウスと共に通常餌で飼育し、満4週齢で離乳させた後よりhigh fat diet(日本クレア社製)を給餌し、2週間飼育させた。2週間目にC4ST-1(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1)siRNA 1μg(GeneWorld社製)をsiRNA媒体である0.1% Atelocollagen(高研社製)と混合させたものを1回/1週間200μL腹腔内投与(1shot/1週間)の2回(2週間)処置を行った。実験14日目に解剖し、腎臓を摘出し、免疫染色用サンプルを得た。遺伝子発現や体重、インスリン抵抗性に関する効果は、実施例21、22、23に記載の通りである。
得られた腎臓組織サンプル切片をアセトン(和光社製)で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体として抗ER-TR7抗体(ラットモノクローナル抗体、1μg/ml、BMA社製)を添加し、室温で1時間反応させた。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗ラットIgG(1:200希釈)を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質(ニチレイバイオサイエンス社製)を添加し発色させた。その後リリー・マイヤーヘマトキシリン(武藤化学社製)により核染色を行い、光学顕微鏡(ライカ社製)下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
その結果、C4ST-1 siRNA治療群では対照群に比べて腎皮質及び髄質における線維芽細胞(ER-TR7陽性細胞)の浸潤が少なかった(図28、原図はカラー)。また炎症性細胞の線維形成を定量化するため、ER-TR7陽性細胞をカウントした。それぞれの標本を顕微鏡下で400倍にて10視野観察し、陽性細胞数をカウントし対照群とC4ST-1 siRNA投与群とを比較した。その結果、対照群と比較しC4ST-1 siRNA治療群ではER-TR7の陽性率が有意に低下した(p<0.001)。
得られた腎臓組織サンプル切片をアセトン(和光社製)で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体として抗ER-TR7抗体(ラットモノクローナル抗体、1μg/ml、BMA社製)を添加し、室温で1時間反応させた。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗ラットIgG(1:200希釈)を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質(ニチレイバイオサイエンス社製)を添加し発色させた。その後リリー・マイヤーヘマトキシリン(武藤化学社製)により核染色を行い、光学顕微鏡(ライカ社製)下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
その結果、C4ST-1 siRNA治療群では対照群に比べて腎皮質及び髄質におけるマクロファージ(F4/80陽性細胞)の浸潤が少なかった(図29、原図はカラー)。また、実施例29と同様に組織病変を定量化すると、対照群と比較し、C4ST-1 siRNA治療群ではマクロファージの陽性率が有意に低下していた(p<0.001)。
腎臓組織サンプル切片をアセトン(和光社製)で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体として抗ヒト平滑筋線維アクチン抗体(αSMA : マウスモノクローナル抗体、1:100、DACO社製)を添加し、室温で1時間反応させた。続いて、ヒストファインマウスステインキット(ニチレイバイオサイエンス社製)を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質(ニチレイバイオサイエンス社製)を添加し発色させた。その後リリー・マイヤーヘマトキシリン(武藤化学社製)により核染色を行い、光学顕微鏡(ライカ社製)下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
その結果、C4ST-1 siRNA治療群では対照群に比べて傍糸球体及び間質におけるαSMA陽性細胞の定着が明確に減少していた(図30、原図はカラー)。αSMAは線維芽細胞活性化の機能的なマーカーであり、本結果は、C4ST-1の遺伝子発現を抑制することで組織に浸潤している線維芽細胞の活性化が抑制していることを示している。
本発明の薬剤は、例えば、線維芽細胞活性化抑制剤として有用である。
実施例28と同様の方法で糖尿病性腎症モデルを作成し、GalNAc4S-6ST siRNAの効果を検討した。本実施例では経過をより長期に渡って観察した。GalNAc4S-6ST siRNAの配列は実施例1と同様であり、8週齢ならびに9週齢の時点で各1回腹腔内投与を施した。さらに、比較対象としてアンギオテンシンII受容体阻害剤(ARB)であるValsartanを30 mg/kgの容量で経口投与を、同一スケジュールで行なった。10週齢で免疫組織学的検査と遺伝子発現検査のための腎臓組織を採取した。実施例1と同様の方法で腎臓組織の定量的PCRを行い、遺伝子発現を検討した。本実施例では内部コントロールとして36B4を使用しており、その配列を以下に示す。
[定量PCR Primer配列]
*mouse 36B4(タカラバイオ社製)
forward : 5’-TTCCAGGCTTTGGGCATCA -3’(配列番号:74)
reverse : 5’-ATGTTCAGCATGTTCAGCAGTGTG -3’(配列番号:75)
結果を図31に示す(なお、GalNAc4S-6STは図中ではG#1と表記する)。糖尿病性腎症モデルにおいては、腎臓組織のGalNAc4S-6STの発現が増強するが、GalNAc4S-6ST siRNAの投与により、腎臓組織でのGalNAc4S-6ST遺伝子発現が有意に抑制されていた。さらに、線維化のマーカーであるαSMAとTGFβの発現増強が有意に抑制されていた。ARBと治療効果を比較検討すると、TGFβに関しては両群とも抑制効果を示し、有意差は出なかったが、αSMAに関してはGalNAc4S-6ST siRNA投与群がARB投与群に比較し有意な抑制効果を示した。本結果は、GalNAc4S-6STの遺伝子発現を抑制することにより、腎臓組織における線維性変化を示すマーカーが抑制できたことを示している。更には、線維芽細胞の活性化(αSMAの増強)に関しては、GalNAc4S-6ST siRNAの効果が際立って優れていることも示された。
線維芽細胞の腎組織内浸潤の程度は、実施例28と同様の方法で免疫組織学的検討を加え、定量的評価を行った。結果を図32に示す。GalNAc4S-6ST siRNA投与により、線維芽細胞の腎間質内浸潤は有意に抑制された。間質全体的な定量的検索ではARBとの有意差を認めなかったが、傍糸球体領域に浸潤する線維芽細胞に限定した検討では、GalNAc4S-6ST siRNA投与群が図の如く明確な抑制効果を示した。
本発明の薬剤は、例えば、線維芽細胞の腎間質内浸潤抑制剤として有用である。
線維芽細胞の腎組織内浸潤の程度は、実施例29と同様の方法で免疫組織学的検討を加え、定量的評価を行った。結果を図33に示す。GalNAc4S-6ST siRNA投与により、マクロファージの腎間質内浸潤は有意に抑制された。間質全体的な定量的検索ではARBとの有意差を認めなかったが、傍糸球体領域に浸潤するマクロファージに限定した検討では、GalNAc4S-6ST siRNA投与群が図の如く明確な抑制効果を示した。
本発明の薬剤は、例えば、マクロファージの腎間質内浸潤抑制剤として有用である。
実施例32、33と同様の方法で、タイプIVコラーゲンの免疫染色を行った。一次抗体として抗マウスIV型コラーゲンウサギ抗血清(エル・エス・エル社製)を添加し、室温で1時間反応させた。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗ラビットIgG(1:200希釈)を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質(ニチレイバイオサイエンス社製)を添加し発色させた。その後リリー・マイヤーヘマトキシリン(武藤化学社製)により核染色を行い、光学顕微鏡(ライカ社製)下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
IVコラーゲンの蓄積を定量化するため、糸球体周囲に茶色のシグナルで可視化されたコラーゲンの厚みを測定した。それぞれの標本を糸球体15〜20個において糸球体周囲で最も肥厚している部分の厚みをモニター上でノギスを用いて計測した。その結果、コントロール群に比較し、GalNAc4S-6ST siRNA投与群で有意に糸球体基底膜(GBM)の肥厚が抑制されていた(図34)。ARBと比較した場合、GalNAc4S-6ST siRNA投与群で肥厚をより優勢に抑制する傾向を示した。
本発明の薬剤は、例えば、糸球体基底膜肥厚抑制剤として有用である。
糖尿病性腎症の線維形成においてはアンギオテンシンIIの関与が報告されている。本実施例では腎臓組織の定量的PCRでアンギオテンシン経路の検討を行った。本モデルにおいてはアンギオテンシノーゲン及びアンギオテンシン変換酵素(ACE)の発現に増強が認められ(図35)、これが腎局所のアンギオテンシンIIを増強させる要因と考えられた。GalNAc4S-6ST siRNA投与群においてはアンギオテンシノーゲンとACEの抑制効果を認めた(図35)。本結果により、GalNAc4S-6STの遺伝子抑制によって線維芽細胞の浸潤・活性を抑制することにより、アンギオテンシン経路においても改善効果を示すことが判明した。
本発明の薬剤は、例えば、アンギオテンシノーゲン発現抑制剤、もしくはアンギオテンシン変換酵素抑制剤として有用である。
糖尿病性腎症からESRDに至る過程で、腎機能の低下に伴い血清クレアチニン濃度が上昇するため、臨床的に最も汎用される腎機能マーカーである。しかしながら、血清クレアチニンが上昇した時点では既に機能的ネフロンの50%の機能低下を来している事が明らかになっており、如何にクレアチニン上昇前に腎機能を保護するかが臨床的には大きい課題である。
本モデルにおいても既に組織学的線維形成が進行した18週齢においてようやく血清クレアチニン濃度の上昇を認めた(図36)。コントロール群に比較して、GalNAc4S-6ST siRNA投与群においては、血清クレアチニンの上昇を抑制した(図36)。本結果は、GalNAc4S-6STの遺伝子抑制により、腎組織の線維性変化を抑制する事で、血清クレアチニンの上昇すなわち腎機能の低下を抑制するという、極めて有効な腎保護作用を呈する事を示している。
本発明の薬剤は、例えば、腎機能低下抑制剤、もしくは腎保護剤として有用である。
4位及び6位硫酸化が重要である事をもう一つの実施例で示す。実施例11と同様の方法で、GalNAcST siRNA投与による腎間質の線維性変化を検討した。GalNAcST siRNAの投与スケジュールは実施例28と同様である。実施例31と同様の方法で、腎臓組織を用いた定量的PCRを行った。本実施例では内部コントロールにβアクチンを使用しており、その配列を以下に示す。
[定量PCR Primer配列]
*mouse βアクチン(タカラバイオ社製)
forward : 5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC -3’ (配列番号:76)
reverse : 5’-ATGGAGCCACCGATCCACA -3’ (配列番号:77)
図37に示す通り、糖尿病性腎症モデルの腎組織においては、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GalNAc4S-6STの発現増強を認めたが、GalNAcST siRNA投与により、全ての遺伝子発現が有意に抑制された。
GalNAcST siRNA投与群においては、対照群と比較して、腎組織における線維形成のマーカーであるαSMA、TGFβ、CTGFの発現増強も有意に抑制された(図38)。更には、ACEの発現増強も有意に抑制された。本結果は、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GalNAc4S-6STの発現を抑制する事によって、腎組織の線維形成を抑制し、腎保護に働く事を示している。実施例35の結果と併せると、いずれの遺伝子を抑制してもACEの低下が顕著である事から、血圧低下作用を有する事もまた明らかである。
本発明の薬剤は、例えば、降圧剤として有用である。
本実施例では、典型的な薬剤性間質性腎炎におけるGalNAc4S-6ST siRNAの効果を検討した。最初に、マウスモデルの作製についてであるが、C57BL6/Jマウス(オス、8週齢、日本クレア社製)に、アドリアマイシン(15 mg/kg;協和発酵社製)を腹腔内投与する。投与後1週間飼育し、腎臓組織を採取した。対照群は、同様のマウスでアドリアマイシンを投与せず、同時期に購入・飼育したものを用いた。
GalNac 4S-6ST siRNAは、実施例1と同様の方法で、アドリアマイシン投与の24時間前に、マウス1匹あたり、GalNac 4S-6ST siRNA 1μg(北海道システムサイエンス社製)と、媒体である1%アテノコラーゲン(高研社製)200μLを混合したもの腹腔内投与した。本実施例における典型的な薬剤性間質性腎炎のモデルにおいても、腎臓組織におけるGalNac 4S-6STの発現増強を認め(図39)、GalNac 4S-6ST siRNA投与によりその発現は有意に抑制された。
本実施例では、実施例34と同様の方法でタイプIコラーゲンの免疫染色を行った。一次抗体として抗ラットI型コラーゲンウサギ抗血清(エル・エス・エル社製)を添加し、室温で1時間反応させた。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗ラビットIgG(1:200希釈)を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質(ニチレイバイオサイエンス社製)を添加し発色させた。その後リリー・マイヤーヘマトキシリン(武藤化学社製)により核染色を行い、光学顕微鏡(ライカ社製)下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
結果を図40に示す。コントロール群では傍糸球体から間質にかけて広くタイプIコラーゲンの沈着を認めるのに対し、GalNac 4S-6ST投与群では顕著に沈着が抑制されていた。本結果は、薬剤性間質性腎炎においても、GalNac 4S-6STの発現を抑制する事で、腎組織の線維性変化を抑制できる事を示している。
本発明の薬剤は、例えば、腎組織の線維性変化抑制剤として有用である。
まず、マウス腎線維化モデルの作成に関してであるが、C57BL/6JcLマウス(♀、8週齢、日本クレア社製)に片側尿管結紮術(UUO)を行い、腎線維化モデルを作成した。この腎線維症モデルマウスは再現性に優れており、マウスの腎線維症の実験系で広く用いられている(American journal of pathology 2003 163;4 1261-1273)。マウスをケタラール/キシラジン麻酔下で開腹し、尿管を露出させ、右尿管を4-0号手術用糸で2カ所結紮し、1-0号手術用糸にて腹膜、皮膚を縫合した。
腎線維化モデルマウスの典型例として片側尿管結紮術(UUO)による腎線維化モデルマウスを用いてC6ST siRNA投与によるC6ST発現の抑制効果をPCR法により確認した。C57BL/6JcLマウス(♀、8週齢、日本クレア社製)にUUOを施術し腎線維化モデルを作成した。また、UUOを施術する直前に、マウスにはC6ST-1 siRNA、C6ST-2 siRNA混合物(1μg/匹、ジーンワールド社製)、またはPBSをsiRNA媒体である0.1% Atelocollagen(高研社製)に混合し200μlを腹腔内に注射した。この処置を行ったマウス群をC6ST siRNA群、対照群と名付けた。実験8日目に解剖し、UUO施術腎を摘出し、免疫染色用サンプル、遺伝子発現解析用サンプルを得た。実施例1と同様の方法で定量的PCRを行なった。
今回、用いたC6ST-1 siRNA、C6ST-2 Primer(Forward、Reverse)(GeneWorld社製)を以下に示す。
*C6ST1(Chondroitin 6-sulfotransferase-1)
Forward : 5’-tgtgtggacacacctcccta-3’(配列番号:78)
Reverse : 5’-cttcaaaggtccccttcctc-3’(配列番号:79)
*C6ST2(Chondroitin 6-sulfotransferase-2)
Forward : 5’-cagcttgagccatttcaaca-3’(配列番号:80)
Reverse : 5’-gggtgaggcctttaggaaac-3’(配列番号:81)
[C6ST-1カクテル配列](Gene Bank accession number NM_016803)
(Gene world社製)
5’-gcgccccctctccccatggagaaag-3’(配列番号:82)
5’-gctttgcctcaggatttccgggacc-3’(配列番号:83)
5’-ggttcagccttggtctaccgtgatgtc-3’(配列番号:84)
5’-gcagttgttgctatgcgacctgtat-3’(配列番号:85)
[C6ST-2カクテル配列](Gene Bank accession number NM_021715)
(Gene world社製)
5’-tggggagagtgaggattcggtgaa-3’(配列番号:86)
5’-cggacgtgggactcgtcgaggacaaag-3’(配列番号:87)
5’-cgaaagtacctgcccgcccgtttcgc-3’(配列番号:88)
その結果、腎臓におけるC6ST-2(G#10)の発現増強が認められた(図41、C6ST-2をG#10と表記した)。C6ST siRNA治療群では発現減少が認められ、Atellocollagen媒体C6ST siRNA投与によりC6ST-2遺伝子のノックダウンが確認された(図41)。また、TGFβ、αSMA、タイプIコラーゲン、CTGFといった線維形成マーカーの発現増強も、C6ST siRNA投与により有意に抑制された。
摘出した組織を凍結用包埋剤OCTコンパウンド(サクラ社製)にて包埋し、液体窒素で凍結ブロックを作成し、クリオスタット(マイクロエッジ社製)を用いて厚さ6μmの切片を作成した。得られた切片を、実施例28と同様の方法で抗ER-TR7抗体を用いて免疫染色を行なった。光学顕微鏡(ライカ社製)下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察し、定量化を行った。
その結果、UUO施術腎において、C6ST siRNA治療群では対照群に比べて腎間質における線維芽細胞の集積が有意に抑制されていた(図42)。
本発明の薬剤は、例えば、腎間質における線維芽細胞集積抑制剤として有用である。
実施例42と同様に、抗F4/80抗体で免疫染色、定量化を行った。その結果、UUO施術腎において、C6ST siRNA治療群では対照群に比べて腎間質におけるマクロファージの集積が有意に抑制されていた(図43)。
本発明の薬剤は、例えば、腎間質におけるマクロファージ集積抑制剤として有用である。
実施例42と同様に、抗タイプIVコラーゲン抗体で免疫染色を行い、実施例34と同様に定量化を行った。その結果、UUO施術腎において、C6ST siRNA治療群では対照群に比べて糸球体基底膜の線維性肥厚が有意に抑制されていた(図44)。このことから、C6ST-2の遺伝子発現を抑制する事により、炎症性細胞の浸潤、線維形成を抑制しうる事が認められた。
本発明の薬剤は、例えば、炎症性細胞浸潤抑制剤として有用である。
実施例30と同様に抗αSMA抗体で免疫染色を行った。その結果、UUO施術腎において、C6ST siRNA治療群では対照群に比べて、間質とりわけ傍糸球体領域におけるαSMA陽性細胞の明らかな減少を認めた(図45)。本結果は、C6ST-1ならびにC6ST-2の遺伝子発現を抑制する事により、腎間質に集積している線維芽細胞の活性化が抑制される事を示している。
本発明の薬剤は、例えば、腎間質における線維芽細胞活性化抑制剤として有用である。
同様に、抗ヒトACEウサギ抗体(サンタクルーズ社製)を用いて免疫染色を行なった。その結果、UUO施術腎において、C6ST siRNA治療群では対照群に比べて、間質とりわけ傍糸球体領域におけるACE陽性細胞の明らかな減少を認めた(図46)。本結果は、C6ST-2の遺伝子発現を抑制する事により、腎間質に集積している線維芽細胞の活性化が抑制され、それに伴ってACEの発現も抑制される事を示している。ACE抑制は血圧低下作用を有するため、本結果においても血圧降下あるいは動脈硬化抑制作用を有するものと強く考えられた。
本発明の薬剤は、例えば、動脈硬化抑制剤として有用である。
〔眼組織〕
眼組織においても他臓器と同様に、種々の原因による侵襲に対し、線維性変化が生じ、視力の低下・損失を招く。主要な疾患として、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、網膜色素変性症などが挙げられるが、角膜の炎症に伴って生じる線維形成、緑内障に伴う線維形成、白内障に伴う線維形成も含まれる(総説:Fiedlander M. J Clin Invest 117:576-586, 2007、Harada T et al. Genes and Dev. 21:367-378, 2007)。病理組織学的には線維形成に伴う視細胞の損傷・減少が視力低下の大きな要因となるため、眼組織の線維形成を抑制する事は、あらゆる眼疾患の視力低下を防ぐための新たな治療戦略として期待されている。
本実施例では糖尿病性網膜症のモデルにおける、網膜の線維形成とそれに伴う視細胞の損失を中心に検討を加えた。
実施例47:マウス糖尿病性網膜症モデルにおけるGalNAc4S-6ST (G#1) siRNAのコラーゲン集積における検討:
妊娠14日目 C57BL6J/JcLマウス(日本クレア社製)を飼育、出産させ、出生後2日令 C57BL6J/JcLマウス雌(日本クレア社製)、各々にStreptozocin 10 mg/mL(SIGMA社製) 20μL/head に皮下注射し、4週令までCE-2(日本クレア社製)の飼料、滅菌水を与え飼育し、4週令よりHigh Fat Diet食(日本クレア社製)、滅菌水を与え、2週間飼育させた。8週間目と9週間目に実施例11と同様の方法で、GalNac4S-6ST (G#1)siRNA(北海道システムサイエンス社製)をマウス1匹あたり1μgを、媒体である1%アテノコラーゲン(高研社製)200μLを混合したもの腹腔内投与した。18週間目にGalNac4S-6ST (G#1)siRNAの効果を検討するため、両群マウスの眼球を摘出し、免疫組織学的検討を加えた。
摘出眼で凍結ブロック・切片を作成した。切片をアセトン(シグマアルドリッチジャパン社製)で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、さらに一次抗体としてウサギ由来抗IV型コラーゲン抗血清(1:2000希釈;LSL社製)を添加し、室温で一時間反応させた。続いて、二次抗体であるペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG(1: 25希釈;Cappel社製)を添加し、室温で30分反応させた後、DAB基質を(ニチレイ社製)添加し酵素色素反応を行った。この標本を光学顕微鏡(ライカ社製)用いて観察した。
得られた網膜の組織像を図47に示した。対照群では視力に重要な視神経節細胞層(GCL:ganglion cell layer)から内顆粒層(INL:inner nuclear layer)にかけてタイプIVコラーゲンの沈着が増加していたのに比較し、GalNac4S-6ST (G#1)siRNA投与群では、とりわけGCLにおけるコラーゲン増生が顕著に抑制されていた。
本発明の薬剤は、例えば、視神経節細胞層におけるコラーゲン増生抑制剤として有用である。
実施例47と同様の方法で網膜の免疫組織学的検討を行った。一次抗体として抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)抗体(クローンCS56、マウスモノクローナル抗体、1:100;生化学工業社製)を添加し、室温で一時間反応させた。続いて、ヒストファインマウスステインキット(ニチレイ社製;マウスモノクローナル抗体に対して使用)を用いて二次抗体反応を行った。
図48に示すように、対照群においては、網膜のGCLならびに外顆粒層(ONL: outer nuclear layer)から網膜色素上皮細胞層にかけてのセグメントにCS56陽性所見の著しい増強を認めた。これに対して、GalNac4S-6ST (G#1)siRNA投与群ではCS56強度が顕著に減弱していた。それに伴って、GCL層における神経節細胞ならびに網膜色素上皮細胞の形態が極めて良好に維持されていた。
以上より、本モデルマウスにおいて誘導される網膜組織におけるCSPGの沈着は、GalNac4S-6ST (G#1)siRNAの生体内投与により顕著に抑制されることが明らかになった。CSPGはコラーゲンとともに線維形成病変形成に重要であると考えられる他、神経節細胞が軸索を伸張する過程を阻害すると報告されている(Brittis PA et al. Science 255:733, 1992)。既報ではin vitroの実験結果ならびに発生過程の報告しかなく、生体内病変での役割は全く未知であったが、本結果により初めて病変組織における役割が示唆された。
網膜損傷時における生体防御機構の一環として、視神経の再生が報告されてきたが、そのような傷害後再生に関わる視神経前駆細胞はグリア細胞である事が報告されている(Fischer AJ et al. Nature neuroscience 4:247, 2001、Ooto S et al. PNAS 101:13645, 2004)。本実施例ではグリア細胞のマーカーとして抗GFAPヤギ抗体(サンタクルーズ社製)を用い、実施例47と同様の方法で免疫染色を行なった。
結果を図49に示す。正常群、対照群ではGFAP陽性グリア細胞数に変化はなかったが、GalNac4S-6ST (G#1)siRNA投与群では、INLからGCLにかけて顕著な細胞数の増加を認めた。視神経の再生はINLからGCLに向かって起こると報告されている事から、本結果は、GalNac4S-6ST (G#1)siRNAにより、視神経の再生が活発に行なわれている過程を示すと考えられる。
本発明の薬剤は、例えば、視神経再生剤として有用である。
実施例47に作製したサンプルを用いて、神経節細胞の数を定量化した。その結果、糖尿病性網膜症モデルにおいてもGCLにおける神経節細胞の減少が認められたが、GalNac4S-6ST (G#1)siRNA投与によりこのような損失が有意に回復する事が明らかになった(図50)。
実施例1と同様の方法で眼組織のRNAを抽出し、定量的PCRを行なった。ミューラー細胞のマーカーであるglutamate synthetase(GS)の発現の変化を解析する事により、視神経再生能力に検討を加えた。PCRプライマー配列を以下に記す。
[定量PCR Primer配列]
*mouse GS(タカラバイオ社製)
forward : 5’-CTGTGAGCCCAAGTGTGTGGA -3’(配列番号:89)
reverse : 5’-GTCTCGAAACATGGCAACAGGA -3’(配列番号:90)
結果を図51に示す。GalNac4S-6ST (G#1)siRNA投与により、眼組織のGalNAc4S-6STの発現増強が有意に抑制できた。これに伴い、GalNac4S-6ST (G#1)siRNA投与群では、眼組織におけるGSの発現が有意に上昇していた。本結果は、GalNac4S-6ST (G#1)siRNA投与によりミューラー細胞の再生すなわち視神経の回復を導く事を示している。
本実施例により、GalNAc4S-6STの遺伝子発現を抑制する事で、網膜組織の線維性変化を抑制でき、結果として神経節細胞の再生に基づく視細胞損失の回避につながる事が判明した。このような組織学的所見は緑内障や糖尿病性網膜症を始め、幅広い眼線維化病変に共通する所見である。
本発明の薬剤は、例えば、ミューラー細胞再生剤、もしくは、神経節細胞再生剤として有用である。
肝臓における組織の線維性変化はあらゆる肝疾患の進行像あるいは終末像である。ウイルス性肝炎(A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、G型肝炎ウイルス)由来の肝線維形成のみならず、アルコール性肝障害、非アルコール性脂肪性肝障害(NAFLD及びNASH)、代謝性肝障害、薬剤性肝障害、特発性門脈圧亢進症、バッド・キアリ症候群、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、胆道系疾患(胆道閉鎖症や胆道拡張症を含む)、腫瘍等の膵疾患による胆道閉鎖、移植片対宿主反応、慢性拒絶反応など、多岐にわたる(Bataller R et al. J Clin Invest 115:209, 2005. Iredale JP. J Clin Invest 117:539, 2007)。本実施例では、肝臓組織レベルの線維性変化の検討を行った。
妊娠14日目 C57BL/6JcLマウス(日本クレア社製)を飼育、出産させ、出生後2日齢C57BL/6JcLマウスにstreptozotocin(STZ:シグマ社製)を投与した。マウスにSTZ(10 mg/ml)20μlを皮下に注射し、これを2日間で計3回行い、合計60μl投与した。これを4週齢まで親マウスと共に通常餌で飼育し、満4週齢で離乳させた後よりhigh fat diet(日本クレア社製)を給餌し、2週間飼育させた。2週間目に、実施例11に記載のGalNAcST siRNAを1回/1週間200μL腹腔内投与(1 shot/1週間)の2回(2週間)処置を行った。実験14日目に解剖し、肝臓を摘出し、遺伝子発現解析ならびに免疫染色用サンプルを得た。
本実施例では、実施例1と同様の方法で、肝臓組織の定量的PCRを行なった。結果を図52に示す。本モデルの肝臓組織ではGalNAc4S-6STの発現が増強するが、GalNAcST siRNA投与により有意に抑制された。
実施例52と同様の方法で、肝臓組織の線維形成マーカーの発現を検討した。本モデルにおいては、タイプIコラーゲンならびにαSMAの発現が有意に上昇した(図53)。したがって、肝臓組織における線維性変化が増強している事が示された。これに対し、GalNAcST siRNA投与により、これらの線維形成マーカーの増強が有意に抑制された。
次に、実施例3と同様の方法で肝臓組織の免疫染色を行なった。一次抗体としてラット抗マウス線維芽細胞抗体(クローンER-TR7;1:500希釈;BMA社製)を添加し、室温で1時間反応させた。続いて、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラットIgG(1:200希釈;バイオソース社製)を添加して、室温で30分更に反応させた後、DAB基質(ニチレイ社製)を添加した。光学顕微鏡(ライカ社製)下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を確認した。
得られた肝組織の免疫染色像の例を図53に示す。対照群では線維芽細胞の集積が明確であり、ブリッジングを形成している組織像を認めた。これに比較し、GalNAcST siRNA投与群では線維芽細胞の集積をほとんど認めなかった。
実施例54で行った免疫組織学的染色に基づき、各試料の肝線維形成の程度を既報(Dai K, et al. World J Gactroenterol. 31:4822-4826, 2005、Hillebrandt S, et al. Nature Genetics 37:835-843, 2005)に従って、線維形成度数で評価した。線維形成度数の評価基準は以下の通りである。0度:正常、1度:中心静脈からの少量のコラーゲン伸長が認められる、2度:中心静脈からの明白なコラーゲン伸長が認められるが、肝臓全体を取り囲まない程度である、3度:中心静脈からの明白なコラーゲン伸長が認められ、肝臓全体を取り囲む程度である、4度:肝臓全体の瀰漫性コラーゲン伸長が認められ、偽小葉を形成している。
結果を図55にグラフで示す。各バーは、各群における線維形成度数の平均値±標準偏差を示している。対照群と比較すると、GalNAcST siRNA投与群(p<0.01、t検定)で統計学的に有意に線維形成が軽減されていた。以上より、GalNAcST siRNAの投与は、臨床的にも優れた肝線維形成抑制効果を発揮することが示された。
次に、実施例54と同様の方法で肝臓組織の免疫染色を行なった。一次抗体としてラット抗マウスF4/80抗体(クローンA3-1;2μg/ml;CALTAG LABORATORIES社製)を添加し、室温で1時間反応させた。続いて、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラットIgG(1:200希釈;バイオソース社製)を添加して、室温で30分更に反応させた後、DAB基質(ニチレイ社製)を添加した。光学顕微鏡(ライカ社製)下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を確認した。
得られた肝組織の免疫染色像の例を図56に示す。対照群ではマクロファージの集積が明確であり、炎症集簇層を形成している組織像を認めた。これに比較し、GalNAcST siRNA投与群ではマクロファージの過剰集積を認めなかった。
実施例52と同様の方法で肝臓の脂質代謝関連遺伝子の発現を検討した。ChREBP(carbohydrate response element-binding protein)ならびにACC2(Acetyl-CoA carxylase-2)の発現が増強していたが、GalNAcST siRNA投与群で有意に抑制された(図57)。本結果は、GAlNAc4ST-1、GalNAc4ST-2ならびにGalNAc4S-6STの遺伝子発現を抑制する事によって、肝臓組織の線維性変化が抑制でき、結果として糖脂質代謝が改善出来る事を示している。
本発明の薬剤は、例えば、糖脂質代謝改善剤として有用である。
実施例52と同様の方法で脂肪性肝障害モデルを作成し、同様の投与プロトコールで、実施例21に記載のC4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNAを投与し、肝臓組織を採取した。
次に、実施例3と同様の方法で肝臓組織の免疫染色を行なった。一次抗体としてラット抗マウス線維芽細胞抗体(クローンER-TR7;1:500希釈;BMA社製)を添加し、室温で1時間反応させた。続いて、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラットIgG(1:200希釈;バイオソース社製)を添加して、室温で30分更に反応させた後、DAB基質(ニチレイ社製)を添加した。光学顕微鏡(ライカ社製)下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を確認した。
得られた肝組織の免疫染色像の例を図58に示す。対照群では線維芽細胞の集積が明確であり、ブリッジングを形成している組織像を認めた。これに比較し、C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA投与群では全ての群において線維芽細胞の集積を認めなかった。
実施例58で行った免疫組織学的染色に基づき、各試料の肝線維形成の程度を線維形成度数で評価した。結果を図59に示す。各バーは、各群における線維形成度数の平均値±標準偏差を示している。対照群と比較すると、C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA投与群(p<0.001、t検定)で全てに統計学的に有意に線維形成が軽減されていた。以上より、C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNAの投与は、臨床的にも優れた肝線維形成抑制効果を発揮することが示された。
実施例58のプロトコールでマウス屠殺時に採血を施し、血清中ALT(アラニントランスフェラーゼ)値をSRL社に委託し、測定した。結果を図60に示す。血清ALT値は肝細胞の破壊を示す臨床的に最も汎用される指標である。対照群では血清ALT値の上昇を認めたのに比較し、C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA投与群では平均値で50%以下の低下を認めた(図60)。本結果は、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3の遺伝子発現を抑制する事により、肝臓組織の線維性変化を抑制でき、結果として肝細胞障害を軽減し得る事を示している。
本発明の薬剤は、例えば、肝細胞障害軽減剤として有用である。
本実施例では、実験的に最も汎用されるマウス四塩化炭素誘導肝硬変モデルを用いて実験を行なった。まずマウスモデルの作成であるが、C57BL6/Jマウス(雌、5〜6週齢、日本クレア社製)に、四塩化炭素(25μL/100 g体重;Sigma-Aldrich社製)を、週2回ずつ4週間にわたり(8回)、腹腔内に注射し、肝線維症を惹起した。さらに四塩化炭素を週2回ずつ2週間にわたって追加投与し(総計12回)、肝硬変を誘導した。肝硬変が誘導されたマウスを屠殺し、その肝臓を採取した(硬変肝)。一方、対照実験では、四塩化炭素の投与を行っていない同週齢のC57BL6/Jマウス(雌、日本クレア社製)から肝臓を採取した(正常肝)。
四塩化炭素の追加投与(9回目から12回目までの合計4回)と同様に、合計4回、実施例41と同一のC6ST siRNAとそのコントロールを腹腔内投与した。追加投与終了後、両群のマウスを屠殺し、肝臓組織切片を作成、免疫組織学的検討を行った。一次抗体としてラット抗マウス線維芽細胞抗体(クローンER-TR7;1:500希釈;BMA社製)を添加し、室温で1時間反応させた。続いて、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラットIgG(1:200希釈;バイオソース社製)を添加して、室温で30分更に反応させた後、DAB基質(ニチレイ社製)を添加した。光学顕微鏡(ライカ社製)下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を確認した。
得られた肝組織の免疫染色像の例を図61に示す。対照群では線維芽細胞の集積が明確であり、ブリッジングを形成している組織像を認めた。これに比較し、C6ST siRNA投与群では全ての群において線維芽細胞の集積を認めなかった。
実施例61で行った免疫組織学的染色に基づき、各試料の肝線維形成の程度を線維形成度数で評価した。結果を図62に示す。各バーは、各群における線維形成度数の平均値±標準偏差を示している。対照群と比較すると、C6ST siRNA投与群(p<0.05、t検定)で全てに統計学的に有意に線維形成が軽減されていた。以上より、C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNAの投与は、臨床的にも優れた肝線維形成抑制効果を発揮することが示された。
実施例1と同様の方法で肝臓組織よりRNAを抽出し、定量的PCRを行なった。結果を図63に示す。対照群では線維形成マーカーであるαSMA、タイプIコラーゲン、CTGF、TGFβの発現増強を認めたが、C6ST siRNA投与群においては、有意に抑制されていた。本結果は、C6ST-1、C6ST-2の遺伝子発現抑制により、肝臓組織の線維性変化が抑制できる事を示している。
〔脳神経組織〕
本実施例ではパーキンソン病マウスモデルとして基本的な、MPTP誘導パーキンソン病モデルを使用した。このモデルは古典的であるが再現性にすぐれ、簡便であることよりパーキンソン病モデルとして汎用されている。組織学的には脳実質組織内への炎症細胞の浸潤と、ドーパミン産生ニューロンの減少を特徴とする。このような病変におけるニューロンの減少の原因として、古典的には神経原線維性変化が考えられている。
したがって、神経が障害される病態、すなわち、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、アルツハイマー病、ポリグルタミン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、脊髄性進行性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、多発性硬化症などの代表的な神経変性疾患のみならず、多系統萎縮症(線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、シャイ・ドレーガー症候群)、副腎白質ジストロフィー、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、フィッシャー症候群、慢性炎症性脱随性多発神経炎、ルイス・サムナー症候群、クロウ・フカセ症候群、正常圧水頭症、脊髄空洞症、プリオン病(クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、致死性家族性不眠症)、亜急性硬化性全脳炎(SSPE)、進行性多巣性白質脳症(PML)、脊髄小脳変性症などを含む。更には、脳外傷後遺症、脳血管障害(脳梗塞、脳出血)後遺症、ウイルス性脳炎後遺症、細菌性髄膜炎後遺症、脊髄損傷後遺症や、脊髄神経、末梢神経、聴神経、視神経などにおける神経原線維性変化も含まれる。とりわけ上記の後遺症は抑うつ状態などの精神疾患の基盤となるものとの考えが古くからあるため、神経原線維性変化は精神症状の原因としても重要である。
本実施例では1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6 tetrahydropyridine(MPTP)によりドーパミンニューロンを選択的に変性させたパーキンソン病のマウスモデルを作成(Amende et al. (2005)Journal of NeuroEngineering and Rehabilitation 2(20) 1-13)してGalNAc4S-6ST siRNAを投与し、治療後における遺伝子発現と組織の様子を比較検討した。
妊娠14日目 C57BL/6JcLマウス(日本クレア社製)を飼育、出産させ、8週令 C57BL/6JcLマウス雌(日本クレア社製)、各々に実施例1と同一のGalNAc4S-6ST siRNA 1μg(GeneWorld社製)をsiRNA媒体である1% Atelocollagen(高研社製)と混合させたもの200μL腹腔内投与した。その後、二日、三日そして四日後の三度にわたりドーパミンニューロンのみを選択的に破壊するMPTP(Sigma Aldrich Japan社製)を30 mg/kgで体内へ投与したものを飼育した。実験8日目にBrdU 5 mg/mL(ZyMED Laboratory.Inc社製)100μlを尾静脈内投与処置し、1時間後、解剖し、脳を摘出し、免疫染色用サンプル、遺伝子発現解析用サンプルを得た。
遺伝子発現は実施例1と同様の方法で、定量的に検討を行った。結果を図64に示す。本パーキンソン病モデルにおいては、脳組織のGalNAc4S-6ST ならびに線維形成マーカーであるTGFβ、タイプIコラーゲン、αSMAの発現が増強するが、GalNAc4S-6ST siRNA投与により、これらの発現が有意に抑制された。したがって、GalNAc4S-6STの発現を抑制する事により、脳組織における線維性変化を抑制できる事が明らかになった。
本発明の薬剤は、例えば、脳組織における線維性変化抑制剤として有用である。
実施例3と同様に脳組織のサンプルを用いて、脳内の神経細胞における線維形成に対してGalNAc4S-6ST生体内投与により得られる組織所見を比較した。得られた切片を4%PFAリン酸緩衝液(ナカライテスク社製)で10分間固定後、脱イオン水で洗浄し、一次抗体として線維芽細胞抗体(ER-TR7; 1:100希釈;BMA社製)を添加し、4℃で一晩反応させた。次に二次抗体であるAlexa488標識抗ラットIgGヤギ抗体(1:200希釈;Invitrogen社)を添加し、室温で30分反応させた。
以上の手法にて得られた組織像を図65に示した。未治療群での強い陽性シグナルは脳梁膨大後部顆粒皮質付近にて対照群より脳内における線維芽細胞の浸潤を示している結果であった。さらに、GalNAc4S-6ST siRNA治療群においては、線維芽細胞の陽性所見は激減していた。以上の結果より、パーキンソン病マウスモデルの誘導される脳組織におけるER-TR7の陽性シグナルの所見は、GalNAc4S-6ST siRNA生体内投与により顕著に抑制されることが明らかになった。
次に、上記の線維形成が神経細胞の減少に伴っているかを調べるために、実施例64と同様の方法で、神経再生関連遺伝子の脳組織における発現を定量化した。ドーパミン神経の生存と分化を制御し、再生を促進する因子GDNF、ならびにドーパミン神経を形成する因子であるNurr1の発現が、GalNAc4S-6ST siRNA投与により増強していた(図66)。本結果は、GalNAc4S-6STの発現を抑制する事により、脳組織におけるドーパミン神経の再生を促進できる事を示している。
本発明の薬剤は、例えば、脳組織におけるドーパミン神経再生促進剤として有用である。
以上の実施例で示された結果を最終的に明らかにするために得られた組織サンプル切片をドーパミンニューロンのマーカーとする抗チロシンハイドロキシラーゼ抗体にてドーパミンニューロンを染め、組織所見を比較検討した。このチロシンハイドロキシラーゼ(TH: thyrosine hydroxylase)はドーパミン前駆体をドーパミンへ転換する酵素である。実施例64と同様の方法で得られた切片を4%PFAリン酸緩衝液(ナカライテスク社製)で10分間固定後、脱イオン水で洗浄し、一次抗体としてラビットポリクローナル抗チロシンハイドロキシラーゼ抗体(1:50希釈;Calbiochem社)を添加し、室温で1時間反応させた。次に二次抗体であるAlexa488標識抗ラビット-ロバ抗体(1:200希釈;Invitrogen社)を添加し、室温で30分反応させた。
図67に対照群、未治療群、GalNAc4S-6ST siRNA、処置群各々の組織画像を示した(原図はカラーである)。中脳上丘付近において、対照群では正常にチロシンハイドロキシラーゼが発現していることが確認できるが未治療群においては陰性のシグナルとして現れた。これは、MPTPにより選択的にドーパミンニューロンが破壊されたことが示唆される所見である。一方、GalNAc4S-6ST siRNA処置を行った群におけるシグナルは未治療群に比べて強く現れていることが確認できた。つまり、GalNAc4S-6ST siRNAの生体内投与によって線維性変化の抑制に伴い、ドーパミンニューロンの機能回復が期待できる結論が得られた。
本発明の薬剤は、例えば、ドーパミンニューロン機能回復剤として有用である。
実施例64と同様に、妊娠14日目C57BL/6JcLマウス(日本クレア社製)を飼育、出産させ、8週令C57BL/6JcLマウス雌(日本クレア社製)、各々にGalNAcST(GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2とGALNAC4S-6STのカクテル配列を混合したもの)siRNA 1μg(GeneWorld社製)をsiRNA媒体である1% Atelocollagen(高研社製)と混合させたもの200μL腹腔内投与した。その後、二日、三日そして四日後の三度にわたりドーパミンニューロンのみを選択的に破壊するMPTP(Sigma Aldrich Japan社製)を30 mg/kgで体内へ投与したものを飼育した。実験8日目にBrdU 5 mg/mL(ZyMED Laboratory.Inc社製)100μlを尾静脈内投与処置し、1時間後、解剖し、脳を摘出し、免疫染色用サンプル、遺伝子発現解析用サンプルを得た。
実施例67と同様に、得られた切片を抗TH抗体で免疫染色を行なった。結果を図68に示す。GalNAcST siRNA処置を行った群においては、TH陽性ドーパミン神経細胞の減少が抑制されていることが確認できた。つまり、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GalNAc4S-6STの発現抑制によって、実施例67と同様に、神経原線維性変化を抑制し、ドーパミンニューロンの機能回復が期待できる結論が得られた。
本発明の薬剤は、例えば、神経原線維性変化抑制剤として有用である。
妊娠14日目 C57BL/6JcLマウス(日本クレア社製)を飼育、出産させ、出生後2日令 C57BL/6JcLマウス 雌(日本クレア社製)、各々にStreptozocin 10mg/mL(SIGMA社製) 20μL/head に皮下注射し、4週令までCE-2(日本クレア社製)の飼料、滅菌水を与え飼育し、4週令よりHigh Fat Diet食(日本クレア社製)、滅菌水を与え、2週間飼育させた。2週間目にコンドロ−4−脱硫酸化酵素(C4-サルファターゼ)(20単位/ml;生化学工業社製)を4単位/ a headで、ならびに溶媒(リン酸緩衝液)を2回/1週間、腹腔内投与(1shot/1週間)の4回(2週間)処置を行った。14日目にC4-サルファターゼの効果を検討するため、両群マウスの眼球を摘出し、免疫組織学的検討を加えた。
摘出眼で凍結ブロック・切片を作成した。切片をアセトン(シグマアルドリッチジャパン社製)で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、さらに一次抗体として抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)抗体(クローンCS56、マウスモノクローナル抗体、10μg/mL;生化学工業社製)を添加し、室温で一時間反応させた。続いて、ヒストファインマウスステインキット(ニチレイ社製;マウスモノクローナル抗体に対して使用)を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質を(ニチレイ社製)添加し酵素色素反応を行った。この標本を光学顕微鏡(ライカ社製)用いて観察した。
得られた組織像を図69に示した(原図はカラーである)。未治療群では網膜の硝子体側に新規にCS56陽性所見を認めてくる。これに対して酵素治療群ではCS56強度が減弱している。CS56は、硫酸基を認識する抗体であり、この減弱は4位硫酸基の減弱を反映しているものと示唆される。以上より、本モデルマウスにおいて誘導される網膜組織におけるCSPGの沈着は、C4-サルファターゼの生体内投与により修飾を受け抑制されることが明らかになった。
C4-サルファターゼは、GalNAcの4位の硫酸基を脱硫酸化する酵素である。従って、GalNAcの4位の硫酸化を阻害することによって、生体レベルにおいて組織の線維形成を抑制できることが示された。即ち、GalNAcの4位の硫酸基の脱硫酸化酵素は、組織線維形成抑制剤として有用である。
実施例69と同様の方法で得られた切片をアセトン(シグマアルドリッチジャパン社製)で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体としてラット由来抗血管内皮細胞抗体(CD31;1:200希釈;ファーミンジェン社製)を添加し、室温で1時間反応させた。次に二次抗体であるペルオキシダーゼ標識ロバ由来抗ラットIgG(1:200希釈;バイオソース社製)を添加し、室温で30分反応させた。反応後のサンプルにDAB基質(ニチレイ社製)を添加した。この標本を光学顕微鏡(ライカ社製)用いて観察した。得られた組織像を図70に示した(原図はカラーである)。未治療群では網膜硝子体側におけるCD31陽性細胞の数が増加しており、一部硝子体に突出している像も認めた。これは、本モデルが糖尿病性網膜症の前増殖網膜症の段階を反映していると考えられ、モデルの有効性を示すものである。これに対して酵素治療群では、同部位のCD31陽性細胞の数が明らかに減少していた。以上の結果から、2型糖尿病モデルにおいては網膜硝子体側の血管内皮細胞数が増加してくるが、C4-サルファターゼ投与により、そのような血管増生が抑制させることが示唆された。
即ち、GalNAcの4位の硫酸基の脱硫酸化酵素は、血管増生抑制剤として有用である。
実施例69と同様の方法で得られた切片をアセトン(シグマアルドリッチジャパン社製)で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体としてウサギ由来抗IV型コラーゲン抗体(1:250希釈;Sigma社製)を添加し、室温で1時間反応させた。次に二次抗体であるペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG(1:200希釈;Jackson ImmunoResearch社製)を添加し、室温で30分反応させた。反応後のサンプルにDAB基質(ニチレイ社製)を添加した。この標本を光学顕微鏡(ライカ社製)用いて観察した。
得られた組織像を図71に示した(原図はカラーである)。未治療群では網膜硝子体側におけるIV型コラーゲン陽性所見の増加とともに、網膜内境界膜に平行して連なる所見を認めた。これは、静脈形態の異常と共に、コラーゲンの増生、すなわち線維化変化を示唆するものである。これに対して酵素治療群では、同部位のIV型コラーゲンの増生が顕著に抑制されていた。以上の結果から、2型糖尿病モデルにおいては網膜コラーゲン増生を認めるが、C4-サルファターゼ投与により抑制させることが明らかになった。
即ち、GalNAcの4位の硫酸基の脱硫酸化酵素は、2型糖尿病性網膜症の治療剤として有用である。
実施例72〜74では、前述の(実施例69〜71)2型糖尿病モデルマウスより採取した肝臓を用いて、C4-サルファターゼの肝臓における、抗線維化効果(線維芽細胞の組織浸潤を指標)について比較・検討した。凍結ブロックの作製、免疫染色の手法などは、全て前述の方法で行った。図72に示すように、未治療群においては、多数の線維芽細胞の浸潤を認めた。これに対して、C4-サルファターゼ治療群では、未治療群に比べて、線維芽細胞の浸潤の程度は少なかった。この結果は、C4-サルファターゼが線維芽細胞の浸潤を抑制する薬理作用をもち、この効果が抗線維化作用の一端である事を示すものであった。
即ち、GalNAcの4位の硫酸基の脱硫酸化酵素は、線維芽細胞浸潤抑制剤として有用である。
実施例73では、前述の(実施例69〜71)2型糖尿病モデルマウスより採取した肝臓を用いてC4-サルファターゼの肝臓における、抗炎症効果(マクロファージの組織浸潤を指標)について比較・検討した。凍結ブロックの作製、免疫染色の手法などは、全て前述の方法で行った。図73に示すように、未治療群においては、スポットの形成を伴う、多数のマクロファージの浸潤を認めた。これに対して、C4-サルファターゼ治療群では、未治療群に比べて、マクロファージの浸潤の程度は少なかった。この結果は、C4-サルファターゼがマクロファージの浸潤を抑制する薬理作用をもち、この効果が抗炎症作用の一端である事を示すものであった。
即ち、GalNAcの4位の硫酸基の脱硫酸化酵素は、マクロファージ浸潤抑制剤、あるいは抗炎症剤として有用である。
実施例74は、実施例72と実施例73の結果を補足する目的で解析を行った。本実施例では、前述の(実施例69〜71)2型糖尿病モデルマウスより採取した血清を用いて、肝機能の指標であるアスパラギン酸アミノ基転移酵素(AST)、アラニンアミノ基転移酵素(ALT)、脂質代謝の指標であるトリアシルグリセロール(TG)を測定した。図74には、その結果を示している。生化学検査は、検査受託業者に測定を依頼した。未治療群(unt)では、対照群(nor)に比べて、AST、ALT、TGのいずれの値も上昇傾向であった。一方、C4-サルファターゼ治療群(C4sul)では、AST、ALT、TGの検査値の上昇は、未治療群(unt)に比べて抑制される傾向にあった。これらの結果は、実施例72と実施例73の結果を支持するものであり、C4-サルファターゼの抗線維化効果と、抗炎症効果によって肝機能が保たれていることを示している。
即ち、GalNAcの4位の硫酸基の脱硫酸化酵素は、肝機能疾患に対する治療剤として有用である。
本実施例では1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6 tetrahydropyridine(MPTP)の代謝産物であるMPDPを用いてモデルを作成した、本実験を遂行した。
8週令 C57BL/6JcLマウス雌(日本クレア社製)、各々にC4-サルファターゼ(生化学工業社製)4 U/ml 100μl a headで、day 0、day 2にて腹腔内投与し、siRNA については、GALNAC4S-6ST siRNA(北海道システムサイエンス社製) 1μg/ 1% Atelocollagen/ 200μlをday 0で前投与した。day 2、day 3、day 4にて、MPDP (Sigma Aldrich Japan社製)を(30mg/ kg)で連日投与を行った。
本実施例に用いたmouse GalNac 4S-6ST siRNA薬の塩基配列について以下に示す。配列は必ずしも本例のみに限定されない。
[mouse GalNac4-6STsiRNA](Gene Bank accession number NM_029935)
(北海道システムサイエンス社製)
5’- gcagcccagcaagaugaauaagauc-ag -3’(配列番号:91)
3’-ua-cgucgggucguucuacuuauucuag -5’ (配列番号:92)
次に、RT reaction(cDNA合成)を行うため以下の手技を行った。算出して得られたRNAサンプルを500 ng/20μlの濃度に調整し、68℃、3分間、BLOCK INCUBATOR(ASTEC製)にて加温し、10分間、氷冷した。氷冷後、予め調製していたRT Pre Mix 液(組成:25 mM MgCl2 18.64μl(Invitrogen社製)、5×Buffer 20μl(Invitrogen社製)、0.1 M DTT 6.6μl(Invitrogen社製)、10 mM dNTP mix 10μl(Invitrogen社製)、RNase Inhibitor 2μl(Invitrogen社製)、MMLV Reverse transcriptase 1.2μl(Invitrogen社製)、Random primer 2μl(Invitrogen社製)、滅菌蒸留水19.56μl(大塚蒸留水:大塚製薬社製)を80μl加えBLOCK INCUBATOR(ASTEC社製)にて42℃、1時間、加温反応させ、1時間後、BLOCK INCUBATOR(ASTEC社製)にて99℃、5分間、加熱した後、氷冷し求めるcDNA 100μlを作製し、合成して得られたcDNAを用いて、以下の組成でPCR反応を行った。
MPDP誘導性パーキンソンモデルにおけるCSPG発現について、CS-56抗体(抗CSPG抗体:生化学工業社製 1: 100希釈)を用いた免疫染色にて検討した結果について図75に示す。図75に示したように、未治療群では、CSPG陽性のシグナルが強く発現している。これに対して、C4-サルファターゼ治療群、遺伝子治療群では陽性のシグナルの発現は低下していた。
C4-サルファターゼと、GalNAc4S-6ST siRNAのドーパミン作動性神経に対する薬理効果を明らかにする目的で、MPDP誘導性パーキンソンモデルにおけるドーパミン作動性神経の局在を、抗チロシン水酸化酵素(tyrosine hydroxylase, TH 1: 20希釈)抗体、二次抗体はAlexa-488標識抗ウサギIgG抗体(Invitrogen社製1: 200希釈)を用いた蛍光免疫染色を用いて解析を行った。図76に示すように、脳組織にドーパン作動性神経の局在は、未治療群では他の群に比べて、陽性のシグナルが弱く発現している。これに対して、C4-サルファターゼ治療群、遺伝子治療群では陽性のシグナルの発現は、対照群と大きな差異は見られなかった。C4-サルファターゼ投与、siRNA投与によるドーパミン作動性神経の保護作用、もしくは再生・修復促進作用が示される結果となった。
即ち、GalNAcの4位もしくは6位のインヒビター(GalNAcの4位の硫酸基の脱硫酸化酵素、およびGalNAc4S-6ST siRNA)はドーパミン作動性神経保護剤、もしくは再生・修復促進剤として有用である。
C4-サルファターゼと、GalNAc siRNAの抗炎症効果を比較する目的で、実施例75、実施例76で使用した組織切片と同様のサンプルから前述の方法で抽出したtotal RNAを用いてTNF-αの発現について定量PCR法で解析した。定量PCRについては、SYBR premix kit(タカラバイオ社製)とReal-time PCR thermal cycler DICE(タカラバイオ社製)を用いて行った。PCR反応の条件は、95℃を10秒、95℃を5秒と60℃を30秒の40サイクルとし、最後に融解曲線分析を行った。用いたプライマーの塩基配列について以下に示す。
mouse βアクチン(タカラバイオ社製)
forward : 5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC -3’(配列番号:93)
reverse : 5’-ATGGAGCCACCGATCCACA -3’ (配列番号:94)
Tumor Necrosis Factor (TNF-α):(タカラバイオ社製)
forward : 5’-CAGGAGGGAGAACAGAAACTCCA-3(配列番号:95)
reverse: 5’-CCTGGTTGGCTGCTTGCTT-3’ (配列番号:96)
図77に示すように、未治療群と比較し、C4-サルファターゼ治療群ではTNF-αの発現が抑制されていた。遺伝子治療群では、発現抑制の傾向を示すに留まった。これらの結果より、C4-サルファターゼが、炎症を抑制する作用を持つ事が示された。
即ち、GalNAcの4位の硫酸基の脱硫酸化酵素は抗炎症剤として有用である。
この実施例では、実施例73の結果を補足する目的で、ドーパミン作動性神経の発現に関与する遺伝子であるNurr1をマーカーとして検討を行った。C4-サルファターゼとGalNAc4S-6STが及ぼす影響について、前述の定量PCR法を用いて検討した結果について示す。用いたプライマーの塩基配列について以下に示す。
Nuclea receptor subfamily 4 GroupA member2 (Nurr1) :(タカラバイオ社製)
forward : 5’-CTGCCCTGGCTATGGTCACA-3’ (配列番号:97)
reverse : 5’-AGACAGGTAGTTGGGTCGGTTCA-3’ (配列番号:98)
図78に示すように、C4-サルファターゼ治療群、遺伝子治療群では、未治療群に比べてNurr1の遺伝子発現が有意(P <0.001)に増加していた。この結果は、実施例76の結果を支持するものであり、C4-サルファターゼ投与、siRNA投与によるドーパミン作動性神経の保護作用、もしくは再生・修復促進作用が示される結果となった。
即ち、GalNAcの4位もしくは6位のインヒビター(GalNAcの4位の硫酸基の脱硫酸化酵素、およびGalNAc4S-6ST siRNA)はドーパミン作動性神経保護剤、もしくは再生・修復促進剤として有用である。
慢性の組織線維形成(線維形成性組織変化)は全身臓器に起こり得るものであり、臓器機能不全により個体を死に至らしめる疾患群の総称である(総説:Wynn TA, J. Clin. Invest. 117:524-529, 2007)。
線維形成性疾患は慢性炎症の終末像と考えられ、全身の臓器に起こり当該臓器の機能不全さらには個体を死に至らしめる疾患の総称である。心血管疾患、脳血管疾患など従来死亡率の高かった疾患の本質は、組織レベルでの線維形成とそれに伴う機能不全であるという認識がなされつつあり、欧米死因の45%は線維形成に起因するとの見解がある。この新しい見解によれば、個体の病的な死亡は、癌、感染症、線維形成、という3つに集約される事になる。従来の概念である肝硬変、肺線維症、腎硬化症のみに留まらず、癌・感染症以外の極めて多彩な、主には慢性疾患が「線維形成性疾患」と定義され得る。とりわけ近年の生活習慣の変化(俗にいう欧米化)に伴い、NASH(非アルコール性脂肪性肝炎)やCKD(慢性腎疾患)という生命を脅かす新しい疾患(疾患概念)が急増しており、これらが組織の線維形成に起因するという知見は、「線維形成性疾患」治療剤確立の緊急性を示している。しかしながら、現在、移植や人工臓器しか対応がなく、根本的な治療方法が無いという決定的な課題を抱えていた。
臨床的にも難治性機能不全を呈する線維形成性疾患は死亡の決定的要因になるばかりでなく、日常のQOL(quality of life)を著しく阻害する疾患でもある。組織線維形成抑制剤の確立はそれゆえ極めて重要であるが、現在市場に出ている薬剤はない。実験的にもTGF-β阻害剤を中心に、アンギオテンシン阻害剤、炎症性サイトカイン阻害剤、TLR阻害剤、MMP阻害剤など精力的に研究が進められているが、未だ有効性が確立した方法とは言えない(総説:Wynn TA, J. Clin. Invest. 117:524-529, 2007)。
線維形成性疾患の確認は、決定的には病理像(線維芽細胞やコラーゲンの免疫染色、マッソン染色を含む)で行った。治療効果(線維形成阻害効果)は病理像の他、臨床症状、各臓器におけるコラーゲン発現量で決定した。
技術的手法としては、糖鎖遺伝子に対する核酸医薬(siRNA)で直接的な遺伝子ノックダウン法により治療効果を証明した。
Claims (12)
- N−アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸化インヒビターを成分とする、組織線維形成抑制剤。
- 生体組織の線維形成に対して抑制効果を有することを特徴とする、請求項1に記載の薬剤。
- 前記インヒビターがN−アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素の機能を阻害する活性を有する、請求項1または2に記載の薬剤。
- 前記インヒビターが、N−アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素遺伝子の発現を抑えるsiRNAである、請求項3に記載の薬剤。
- 前記インヒビターがN−アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基の脱硫酸化酵素である、請求項1または2に記載の薬剤。
- 線維形成性疾患の治療用または予防用の、請求項1〜5のいずれかに記載の薬剤。
- 糖鎖を構成するN−アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸化を阻害する化合物を選択する工程を含む、組織線維形成抑制剤のスクリーニング方法。
- 以下の工程(a)〜(c)を含む、組織線維形成抑制剤のスクリーニング方法。
(a)N−アセチルガラクトサミンまたはN−アセチルガラクトサミンを含有する糖鎖と、被検化合物を接触させる工程
(b)N−アセチルガラクトサミンの4位または6位について硫酸化の程度を測定する工程
(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、硫酸化の程度を低下させる化合物を選択する工程 - 以下の工程(a)〜(c)を含む、組織線維形成抑制剤のスクリーニング方法。
(a)N−アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記酵素の硫酸基転移活性を測定する工程
(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、前記活性を低下させる化合物を選択する工程 - 以下の工程(a)〜(c)を含む、組織線維形成抑制剤のスクリーニング方法。
(a)N−アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)前記細胞における遺伝子の発現量を測定する工程
(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、前記遺伝子の発現量を低下させる化合物を選択する工程 - 以下の工程(a)〜(c)を含む、組織線維形成抑制剤のスクリーニング方法。
(a)N−アセチルガラクトサミンの4位または6位の硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程
(c)被検化合物を接触させない場合と比較して、前記レポーター遺伝子の発現量を低下させる化合物を選択する工程 - 以下の工程(a)および(b)を含む、線維形成性疾患の治療または予防のための医薬組成物の製造方法。
(a)被検試料から、請求項7〜11のいずれかに記載の方法により、組織線維形成抑制剤を選択する工程
(b)前記薬剤と医薬的に許容される担体とを混合する工程
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