CN101965196A - 糖链相关基因及其利用 - Google Patents

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米山博之
小山纯
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Stelic Institute Of Regenerative Medicine Stelicinstitute & Co
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Abstract

本发明人深入研究的结果成功地首次发现通过阻碍作为构成糖链的糖之一的GalNAc的4位或6位的硫酸化，可以在生物水平上抑制组织的纤维形成。而且，本发明人通过利用各种疾病模型动物的研究，成功地证实了GalNAc的4位或6位的硫酸化抑制剂对组织的纤维形成所引起的疾病(组织纤维形成性疾病)具有治疗效果。

Description

糖链相关基因及其利用
技术领域
本发明涉及通过阻碍糖链相关基因来抑制生物组织水平的纤维形成的抑制剂。
背景技术
一直以来，对于核酸和蛋白质进行了深入细致的研究，已经清楚了很多情况。但是相反地，这些研究也说明了人类的基因只不过仅有2万2千个左右，蛋白质的翻译后修饰在生物体内是重要的，其还说明了以往的研究方式是有限的。近年来，在后基因组、后蛋白质组学的潮流中再次认识到了糖链的重要性(Nature誌446号：2007年4月26日发行(非专利文献1～7)中也大量编入了糖链特辑)。对于糖链而言，由于结构解析困难等理由，一直以来未被过多解析，虽然认为其有可能与癌症、炎症、免疫、病毒感染等有关，但在现阶段，其作用等不清楚的部分还有很多，有待进一步阐明。
作为构成糖链的糖(单糖)，目前已知有各种糖。例如已知葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、艾杜糖醛酸(IdoA)、岩藻糖(Fuc)、葡萄糖胺(GlcN)、N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、木糖(Xyl)、唾液酸(SA)等。
另外，有报道指出构成糖链的糖受到了各种化学修饰。例如已知甲基化、乙酰基化、甲酰化、肉豆蔻酰化、酰胺化、泛素化、酰化、磷酸化、差向异构化、硫酸化等。另外还可以举出唾液酸化、去唾液酸化、岩藻糖基化、糖基化、半乳糖基化、乳糖化、甘露糖基化等化学修饰。
糖中存在多个接受这些化学修饰的部位。例如已知在GlcNAc中1位～6位的碳全部受到化学修饰。其它的糖中也报道了在各种部位上受到了化学修饰。
非专利文献1：Danica P.Galonic and David Y.Gin，Nature 446：1000-1007(2007)
非专利文献2：Christopher J.Thibodeaux et.Al.，Nature 446：1008-1016(2007)
非专利文献3：Gerald W.Hart et.Al.，Nature 446：1017-1022(2007)
非专利文献4：Ajit Varki，Nature 446：1023-1029(2007)
非专利文献5：Joseph R.Bishop et.Al.，Nature 446：1030-1037(2007)
非专利文献6：Christopher N.et.Al.，Nature 446：1038-1045(2007)
非专利文献7：Peter H.Seeberger and Daniel B.Werz，Nature 446：1046-1051(2007)
发明内容
本发明基于通过对糖链相关基因的研究而新发现的事实。本发明的目的在于提供糖链相关基因的新用途。具体地说，其目的在于提供通过阻碍糖链相关基因的功能来抑制生物组织水平的纤维形成的药剂以及该药剂的筛选方法。
虽然已知糖链在生物体内的作用非常重要，但对于糖链在生物体内的功能仍有很多不清楚的部分。
如上所述，构成糖链的糖已知有多个种类，认为糖通过在多个部位受到各种化学修饰而在生物体内承担重要的生理作用。
如上所述，存在大量构成糖链的糖的种类、以糖为靶标的化学修饰的种类以及其被化学修饰的部位，因此认为糖链是由无数个变量构成的。因而，确定承担某作用的糖链的结构是非常困难的，而且也极难发现某种疾病所引起的病态与糖链的具体作用之间的关联性。
本发明人深入研究的结果是首次成功地发现了通过阻碍构成糖链的糖之一的GalNAc的4位或6位的硫酸化，可以抑制生物水平上的组织的纤维形成。进而，本发明人通过利用各种疾病模型动物的研究，证实了GalNAc的4位或6位的硫酸化抑制剂对组织的纤维形成所引起的疾病(组织纤维形成性疾病)具有治疗效果。
本发明涉及通过阻碍糖链相关基因的功能来抑制生物组织水平的纤维形成的药剂以及该药剂的筛选方法，更具体地说，本发明提供：
(1)一种组织纤维形成抑制剂，其以N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化抑制剂为成分。
(2)上述(1)所述的药剂，其特征在于，对生物组织的纤维形成具有抑制效果。
(3)上述(1)或(2)所述的药剂，其中，上述抑制剂具有阻碍N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的功能的活性。
(4)上述(3)所述的药剂，其中，上述抑制剂是抑制N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶基因的表达的siRNA。
(5)上述(1)或(2)所述的药剂，其中，上述抑制剂是N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基的脱硫酸化酶。
(6)上述(1)～(5)任一项所述的药剂，其为纤维形成性疾病的治疗用或预防用的药剂。
(7)一种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含选择阻碍构成糖链的N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化的化合物的工序。
(8)一种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含以下的工序(a)～(c)：
(a)使N-乙酰基半乳糖胺或含有N-乙酰基半乳糖胺的糖链与受试化合物接触的工序；
(b)测定N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化程度的工序；
(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使硫酸化程度降低的化合物的工序。
(9)一种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含以下的工序(a)～(c)：
(a)使N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶与受试化合物接触的工序；
(b)测定上述酶的硫酸基转移活性的工序；
(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使上述活性降低的化合物的工序。
(10)一种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含以下的工序(a)～(c)：
(a)使受试化合物与表达编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的细胞接触的工序；
(b)测定上述细胞中基因的表达量的工序；
(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使上述基因的表达量降低的化合物的工序。
(11)一种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含以下的工序(a)～(c)：
(a)使受试化合物与含有下述DNA的细胞或细胞提取液接触的工序，所述DNA具有编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域与报告基因功能性结合而成的结构；
(b)测定上述报告基因的表达量的工序；
(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使上述报告基因的表达量降低的化合物的工序。
(12)用于纤维形成性疾病的治疗或预防的药品组合物的制造方法，其包含以下的工序(a)和(b)：
(a)利用上述(7)～(11)任一项所述的方法从受试试样中选择组织纤维形成抑制剂的工序；
(b)将上述药剂和药学上可允许的载体混合的工序。
另外，本发明还涉及：
(13)一种抑制组织纤维形成的方法，其包含向个体投予N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化抑制剂的工序。
(14)N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化抑制剂在制造组织纤维形成抑制剂中的用途。
(15)用于组织纤维形成抑制用途的N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化抑制剂。
附图说明
图1是表示使用定量逆转录PCR法对通过DOX气管内投予所诱发的心肌病模型小鼠的基因表达进行研究的结果的图。研究项目是作为siRNA的靶基因的GalNAc4S-6ST、作为纤维形成标记物的α-SMA和I型胶原。图中表示了目标基因与看家基因(核糖体18S)的相对比值。*P＜0.001(t-检验)
图2是表示对通过盐酸多柔比星(DOX：协和发酵公司制)腹腔内投予所诱发的心肌病模型小鼠的心脏重量/体重比进行解析的结果的图。*P＜0.05(t-检验)
图3是表示显示通过DOX气管内投予所诱发的心肌病模型小鼠的siRNA治疗组的I型胶原沉积的抑制效果的组织所见的照片。倍率为100倍。
图4是表示显示通过DOX气管内投予所诱发的心肌病模型小鼠的siRNA治疗组的III型胶原沉积的抑制效果的组织所见的照片。倍率为100倍。
图5是表示通过DOX气管内投予所诱发的心肌病模型小鼠siRNA治疗组的纤维芽细胞(fibroblast，也称为成纤维细胞)的聚集抑制效果的照片。倍率为50倍。
图6是表示通过DSS所诱发的小鼠肠道纤维形成模型的临床图像的图。通过GalNAc 4S-6ST siRNA投予，临床评分(左)、大肠长度的短缩(右)均被显著抑制。
图7是表示小鼠肠道纤维形成模型的纤维形成相关基因的表达的图。研究了大肠组织中的GalNAc 4S-6ST以及作为纤维形成标记物的α-SMA和I型胶原。图中表示了目标基因与看家基因(核糖体18S)的相对比值。通过GalNAc 4S-6ST siRNA的沉默效应(上)，I型胶原(下左)、α-SMA(下右)的表达增强被显著抑制。
图8是表示小鼠肠道纤维形成模型的胶原组织沉积的照片。大肠组织的马松染色图像(蓝色)。×100。GalNAc 4S-6ST siRNA减轻了胶原的组织沉积。
图9是表示小鼠肠道纤维形成模型的纤维芽细胞浸润的照片。大肠组织的纤维芽细胞染色图像(茶色)。×100。GalNAc 4S-6ST siRNA抑制了纤维芽细胞的全层性的浸润。
图10是表示小鼠肠道纤维形成模型的巨噬细胞浸润图像的照片。大肠组织的巨噬细胞染色图像(茶色)。×100。GalNAc 4S-6ST siRNA抑制了巨噬细胞的全层性的浸润。
图11是表示小鼠肠道纤维形成模型的大肠长度的图。GalNAc 4STsiRNA显著地抑制了大肠的短缩。
图12是表示通过PPE所诱发的小鼠肺气肿模型的临床图像的照片。C6ST-1 siRNA投予显著地抑制了组织学上的肺泡壁破坏。×100。
图13是表示小鼠肺气肿模型的纤维形成相关基因的表达的图。研究了肺组织中的C6ST-1以及作为纤维形成标记物的α-SMA和I型胶原。图中表示了目标基因与看家基因(核糖体18S)的相对比值。通过C6ST-1 siRNA的沉默效应(左)，显著地抑制I型胶原(中央)、α-SMA(右)的表达增强。
图14是表示小鼠肺气肿模型的纤维芽细胞浸润的照片。肺组织的纤维芽细胞染色图像(茶色)。×200。通过C6ST-1 siRNA抑制了纤维芽细胞在肺泡间质中的浸润。
图15是表示小鼠肺气肿模型的巨噬细胞浸润图像的照片。肺组织的巨噬细胞染色图像(茶色)。×200。C6ST-1 siRNA抑制了巨噬细胞在肺泡间质中的浸润。
图16是表示小鼠肺气肿模型的静态肺顺应性(Cst)的图。通过C6ST-1siRNA，Cst显著降低。
图17是表示小鼠肺气肿模型的右肺容量(μl)的图。通过C6ST-1siRNA，肺容量显著降低。
图18是表示小鼠肺气肿模型的纤维形成相关基因的表达的图。研究了肺组织中的作为纤维形成标记物的α-SMA、I型胶原以及TGF-β。图中表示了目标基因与看家基因(核糖体18S)的相对比值。通过GalNACST siRNA的沉默，显著地抑制了各纤维形成标记物的表达增强。
图19是表示小鼠肺气肿模型的静态肺顺应性(Cst)的图。通过GalNAcST siRNA，Cst显著降低。
图20是表示小鼠肺气肿模型的右肺容量(μl)的图。通过GalNAcST siRNA，肺容量显著降低。
图21是表示小鼠2型糖尿病模型的肥胖变化的图。C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA显示出肥胖抑制倾向。C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA显示出显著的抗肥胖效果。
图22是表示小鼠2型糖尿病模型的胰岛素抵抗性的图。通过C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA，胰岛素抵抗性显著地改善。
图23是表示小鼠2型糖尿病模型的胰腺组织的基因表达的照片。通过C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA，抑制了胰腺组织的C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3基因表达。
图24是表示小鼠2型糖尿病模型中APP向胰腺胰岛沉积的照片。通过C4ST-2 siRNA，抑制了胰岛的APP(绿色)沉积。细胞核(红色)、×400。
图25是表示小鼠2型糖尿病模型中纤维芽细胞向胰腺胰岛浸润的照片。通过C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA，抑制了纤维芽细胞(茶色)向胰岛的浸润。×200。
图26是表示小鼠2型糖尿病模型中巨噬细胞向胰腺胰岛浸润的照片。通过C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA，抑制了巨噬细胞(茶色)向胰岛的浸润。×200。
图27是表示小鼠2型糖尿病模型的胰岛素抵抗性的图。通过GalNAcST siRNA投予，胰岛素负荷后的血糖下降良好地进行，即胰岛素抵抗性有所改善。
图28是表示小鼠糖尿病性肾病模型的纤维芽细胞的肾组织间质聚集的图及照片。通过C4ST-1 siRNA，显著地抑制了纤维芽细胞(茶色)的聚集。×200。
图29是表示小鼠糖尿病性肾病模型的巨噬细胞的肾组织间质聚集的图及照片。通过C4ST-1 siRNA，显著地抑制了巨噬细胞(茶色)的聚集。×200。
图30是表示小鼠糖尿病性肾病模型的αSMA阳性细胞的肾组织间质聚集的照片。通过C4ST-1 siRNA，显著地抑制了αSMA阳性细胞(茶色)的聚集。×200。
图31是表示小鼠糖尿病性肾病模型的抗纤维形成效果的图。通过GalNAc4S-6ST(G#1)siRNA的投予，显著地抑制了肾组织中的GalNAc4S-6ST(G#1)、αSMA、TGFβ的表达增强。ARB：血管紧张素受体拮抗剂(缬沙坦)。
图32是表示小鼠糖尿病性肾病模型的纤维芽细胞的肾组织间质聚集的照片及图。通过GalNAc4S-6ST(G#1)siRNA，显著地抑制了纤维芽细胞(茶色)的聚集。×200。
图33是表示小鼠糖尿病性肾病模型的巨噬细胞的肾组织间质聚集的照片及图。通过GalNAc4S-6ST(G#1)siRNA，显著地抑制了巨噬细胞(茶色)的聚集。×200。
图34是表示小鼠糖尿病性肾病模型的IV型胶原的蓄积的照片及图。通过GalNAc4S-6ST(G#1)siRNA，显著地抑制了可通过IV型胶原(茶色)阳性确认的肾小球基底膜的肥厚。×400。
图35是表示小鼠糖尿病性肾病模型的肾保护作用的图。通过GalNAc4S-6ST(G#1)siRNA，显著地抑制了肾组织的血管紧张素原以及ACE的表达增强。
图36是表示小鼠糖尿病性肾病模型的肾功能保护作用的图。通过GalNAc4S-6ST(G#1)siRNA，抑制了血清肌酸酐的增加、即抑制了肾功能下降。
图37是表示小鼠糖尿病性肾病模型的基因表达的图。通过GalNAcST siRNA，显著地抑制了肾组织中的GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GalNAc4S-6ST的表达增强。
图38是表示小鼠糖尿病性肾病模型的抗纤维形成效果的图。通过GalNAcST siRNA，显著地抑制了肾组织中的CTGF、αSMA、I型胶原、ACE的表达增强。
图39是表示小鼠药源性间质性肾炎的基因表达的图。通过GalNAc4S-6ST(G#1)siRNA，显著地抑制了肾组织的GalNAc4S-6ST(G#1)的表达增强。
图40是表示小鼠药源性间质性肾炎的胶原沉积的照片。通过GalNAc4S-6ST(G#1)siRNA，I型胶原(茶色)向肾间质的沉积明显减少。×200。
图41是表示小鼠UUO纤维形成模型的抗纤维形成效果的图。通过C6ST siRNA，显著地抑制了肾组织中的C6ST-2(G#10)、TGFβ、αSMA、I型胶原、CTGF的表达增强。
图42是表示小鼠UUO纤维形成模型的纤维芽细胞的间质聚集的图及照片。通过C6ST siRNA，显著地抑制了纤维芽细胞(茶色)从近肾小球向间质的聚集。×200。
图43是表示小鼠UUO纤维形成模型中巨噬细胞的间质聚集的图及照片。通过C6ST siRNA，显著地抑制了巨噬细胞(茶色)从近肾小球向间质的聚集。×200。
图44是表示小鼠UUO纤维形成模型中胶原沉积的图及照片。通过C6ST siRNA，显著地抑制了可以通过IV型胶原(茶色)确认的肾小球基底膜的肥厚。×400。
图45是表示小鼠UUO纤维形成模型中组织聚集纤维芽细胞的活化的照片。通过C6ST siRNA，显著地抑制了αSMA阳性细胞(茶色)从近肾小球向间质的聚集。×400。
图46是表示小鼠UUO纤维形成模型中ACE产生细胞的间质聚集的照片。通过C6ST siRNA，显著地抑制了ACE产生细胞(茶色)从近肾小球向间质的聚集。×400。
图47是表示小鼠糖尿病性视网膜病变模型的IV型胶原的组织蓄积的照片。通过GalNac4S-6ST(G#1)siRNA，抑制了IV型胶原(茶色)的聚集。×200。GCL：神经节细胞层、INL：内颗粒层、ONL：外颗粒层。
图48是表示小鼠糖尿病性视网膜病变模型中CSPG的组织蓄积的照片。通过GalNac4S-6ST(G#1)siRNA，抑制了CSPG(茶色)的聚集。特别是从GCL、ONL向色素上皮细胞层的抑制效果明显。×200。
图49是表示小鼠糖尿病性视网膜病变模型中GFAP阳性细胞的照片。通过GalNac4S-6ST(G#1)siRNA，GFAP阳性细胞(茶色)从INL向GCL显著增加。×200。
图50是表示小鼠糖尿病性视网膜病变模型中神经节细胞数的图。GGL中神经节细胞数的计数。通过GalNac4S-6ST(G#1)siRNA，可显著抑制神经节细胞数的减少。
图51是表示小鼠糖尿病性视网膜病变模型中视神经再生效果的图。通过GalNac4S-6ST(G#1)siRNA，眼组织的GS表达显著上升。
图52是表示小鼠脂肪性肝损伤模型中基因表达的图。表示了GalNAc4S-6ST在肝脏组织的表达增强和GalNAcST siRNA带来的显著抑制。
图53是表示小鼠脂肪性肝损伤模型中纤维形成相关基因表达的图。表示了I型胶原、αSAM在肝脏组织的表达增强和GalNAcST siRNA带来的显著抑制。
图54是表示小鼠脂肪性肝损伤模型中纤维形成细胞浸润的照片。通过GalNAcST siRNA，抑制了纤维芽细胞(茶色)在肝脏组织的桥样聚集。×100。
图55是表示小鼠脂肪性肝损伤模型中临床纤维形成评分的图。通过GalNAcST siRNA，显著地抑制了肝脏组织的纤维形成评分的上升。
图56是表示小鼠脂肪性肝损伤模型中巨噬细胞浸润的照片。通过GalNAcST siRNA，抑制了巨噬细胞(茶色)在肝脏组织的聚集。×100。
图57是表示小鼠脂肪性肝损伤模型中脂质代谢相关基因表达的图。通过GalNAcST siRNA，显著地抑制了肝脏组织中的ChREBP、ACC2的表达上升。
图58是表示小鼠脂肪性肝损伤模型中纤维形成细胞浸润的照片。通过C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA，抑制了纤维芽细胞(茶色)在肝脏组织的桥样聚集。×100。
图59是表示小鼠脂肪性肝损伤模型中临床纤维形成评分的图。通过C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA，显著地抑制了肝脏组织的纤维形成评分的上升。
图60是表示小鼠脂肪性肝损伤模型中临床的肝功能障碍的图。通过C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA，抑制了作为肝细胞功能障碍指标的ALT的上升。
图61是表示小鼠肝纤维症模型中纤维芽细胞浸润的照片。通过C6STsiRNA，抑制了纤维芽细胞(茶色)在肝脏组织的聚集。×50。
图62是表示小鼠肝纤维症模型中临床纤维形成评分的图。通过C6STsiRNA，显著地抑制了肝脏组织的纤维形成评分的上升。
图63是表示小鼠肝纤维症模型中抗纤维形成效果的图。通过C6STsiRNA，显著地抑制了αSMA、I型胶原、CTGF、TGFβ的表达。
图64是表示小鼠帕金森病模型中抗纤维形成效果的图。通过GalNAc4S-6ST siRNA，显著地抑制了脑组织的GalNAc4S-6ST、TGFβ、I型胶原、αSMA的表达。
图65是表示小鼠帕金森病模型中纤维芽细胞聚集的照片。通过GalNAc4S-6ST siRNA，纤维芽细胞(茶色)的脑组织聚集剧减。×200。
图66是表示小鼠帕金森病模型中神经保护作用的图。通过GalNAc4S-6ST siRNA，GDNF、Nurr1的表达显著地增强。
图67是表示小鼠帕金森病模型中多巴胺神经再生效果的照片。通过GalNAc4S-6ST siRNA，抑制了TH阳性多巴胺神经(绿色)的损失。×200。
图68是表示小鼠帕金森病模型中的多巴胺神经再生效果的照片。通过GalNAc4ST siRNA，抑制了TH阳性多巴胺神经(绿色)的损失。×200。
图69是表示2型糖尿病性视网膜病变模型小鼠的C4-硫酸酯酶的CSPG减弱效果的照片。表示了2型糖尿病模型小鼠视网膜中的CSPG(CS56)染色图像(茶色、箭头)。
图70是表示2型糖尿病性视网膜病变模型小鼠的C4-硫酸酯酶的血管增生抑制效果的照片。表示了2型糖尿病模型小鼠视网膜的血管内皮细胞(CD31)染色图像(茶色、箭头)。
图71是表示2型糖尿病性视网膜病变模型小鼠的C4-硫酸酯酶的胶原增生抑制效果的照片。表示了2型糖尿病模型小鼠视网膜的IV型胶原染色图像(茶色、箭头)。
图72是表示小鼠2型糖尿病模型的肝脏中的C4-硫酸酯酶的纤维芽细胞的聚集抑制效果的照片。倍率为50倍和100倍。
图73是表示小鼠2型糖尿病模型的肝脏中的巨噬细胞浸润抑制效果的照片。倍率为50倍和100倍。
图74是表示小鼠2型糖尿病模型的血清中的生化学检查(AST、ALT、TG)的结果的图。图中，未治疗组标记为unt、对照组标记为nor、C4-硫酸酯酶标记为C4sul。
图75是表示脑组织中的CSPG的局部存在的照片。该照片是使用酶抗体免疫染色法对脑组织中的CSPG的表达动态进行解析的结果。一抗使用CS-56(生化学工业公司制)、小鼠染色试剂盒进行染色。
图76是表示脑组织中的多巴胺能神经的局部存在的照片。是使用荧光免疫染色法进行解析的结果。
图77是表示利用实时PCR法的TNF-α的基因表达解析结果的图。图中表示了使用实时PCR对作为纤维化标记物的TGF-β、作为伴随巨噬细胞浸润的炎症指标的TNF-α的表达进行研究的结果。
图78是表示利用实时PCR法的Nurr1基因表达解析结果的图。图中表示了脑组织中的Nurr1的基因表达，是使用Cyber premix kit(Takara Bio公司制)和实时PCR基因扩增仪DICE(Takara Bio公司制)进行的。另外，图中表示了Nurr1与看家基因(β-肌动蛋白)的相对比值。
具体实施方式
以下详细地说明本发明。
本发明涉及以阻碍构成糖链的糖之一的N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化为机制的组织纤维形成抑制剂。
即，本发明提供以N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化抑制剂(本说明书中有时记为“本发明的抑制剂”或者仅记为“抑制剂”)为成分的组织纤维形成抑制剂。
本发明的“N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)”是作为己糖胺一种的半乳糖胺的N-乙酰基体。
另外，已知N-乙酰基半乳糖胺的1～6位的部位受到化学修饰。
本发明的特征在于阻碍了N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的部位的硫酸化。
被本发明的抑制剂阻碍的部位具体地为下述GalNAc化学式中用箭头表示的部位。
Figure BPA00001211568800121
对于本发明的抑制剂而言，硫酸化被阻碍的GalNAc上的部位为4位或6位，但4位和6位两者的硫酸化都被阻碍的情况也包含在本发明内。另外，本发明的GalNAc优选是含有在硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)中的糖。
本发明中，硫酸化被阻碍是指阻碍硫酸基转移至GalNAc上的4位或6位的部位、或者是从已经硫酸化的部位除去硫酸基、或者取代成其他的化学修饰等。
本发明的组织纤维形成抑制剂(本说明书中有时记为“本发明的药剂”)的特征在于，优选对生物组织(体内)的纤维形成具有抑制效果。
作为通过本发明的药剂抑制了纤维形成的组织并无特别限定，例如可举出心脏组织、消化道组织、肺组织、胰腺组织、肾脏组织、眼组织、肝脏组织、脑神经组织或皮肤组织等。
本发明中“纤维形成”还可表达为“纤维化”。另外，还可以使用“组织上的纤维形成性病变”、“纤维形成性组织变化”、“组织纤维新生”等表达来表示。
作为本发明的抑制剂，只要是具有阻碍N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化的作用的物质，则无特别限定。
作为本发明的抑制剂的优选方式，例如可举出具有阻碍N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的功能的活性的物质。
上述物质的优选方式例如可举出选自以下(a)～(c)的化合物(核酸)。
(a)针对编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录产物或其一部分的反义核酸
(b)具有使编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录产物特异性开裂的核酶活性的核酸
(c)具有利用RNAi效应来阻碍编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的表达的作用的核酸(抑制硫酸基转移酶基因表达的siRNA)
另外，作为“具有硫酸化阻碍作用的物质”，例如可以举出选自以下(a)～(c)的化合物。
(a)与N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶相结合的抗体
(b)N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶突变体
(c)与N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶相结合的低分子化合物
作为本发明的抑制剂的其他方式，例如可举出具有使N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基脱硫酸化的作用的物质。作为该物质，例如可举出使N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基脱硫酸化的酶(脱硫酸化酶)。
N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基的“脱硫酸化”是指N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基被除去。
作为脱硫酸化酶，例如可举出软骨素-4-硫酸酯酶(C4-硫酸酯酶)、软骨素-6-硫酸酯酶等。
作为本发明的硫酸基转移酶，只要是具有将硫酸基转移至GalNAc的4位或6位的活性的酶，则无特别限定，例如可举出以下的酶。
1)GalNAc4ST-1：N-乙酰基半乳糖胺4-磺基转移酶-1
别名CHST8：碳水化合物(N-乙酰基半乳糖胺4-O)磺基转移酶8
2)GalNAc4ST-2
别名CHST9：碳水化合物(N-乙酰基半乳糖胺4-O)磺基转移酶9
3)C4ST-1：软骨素-4-O-磺基转移酶-1
别名CHST11：碳水化合物(软骨素4)磺基转移酶11
4)C4ST-2
别名CHST12
5)C4ST-3
别名CHST13
6)C6ST-1：软骨素-6-O-磺基转移酶-1
别名CHST3：碳水化合物(软骨素6)磺基转移酶3
7)GalNAc4S-6ST：N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯6-O磺基转移酶
8)D4ST-1：皮肤素4磺基转移酶1
9)C6ST-2：软骨素-6-O-磺基转移酶-2
别名CHST7：碳水化合物(软骨素6)磺基转移酶7
另外，共有该特征的酶组并不一定对应于基因组DNA上的一个基因。例如软骨素-4-硫酸酯酶、软骨素-6-硫酸酯酶均可以作为以基因组数据库上多个登录号来参照的序列(例如Genbank登录号NT_039500(其一部分以登录号CAAA01098429(序列号：1)表示)、NT_078575、NT_039353、NW_001030904、NW_001030811、NW_001030796、NW_000349)由公共基因数据库Genbank获得。
作为本发明的硫酸基转移酶在公共基因数据库Genbank中的登录号、碱基序列、氨基酸序列，可以举出以下示例。
GalNAc4ST-1(登录号NM_175140、碱基序列的序列号：2、氨基酸序列的序列号：3)
GalNAc4ST-2(登录号NM_199055、碱基序列的序列号：4、氨基酸序列的序列号：5)
C4ST-1(登录号NM_021439、碱基序列的序列号：6、氨基酸序列的序列号：7)
C4ST-2(登录号NM_021528、碱基序列的序列号：8、氨基酸序列的序列号：9)
C4ST-3(登录号XM_355798、碱基序列的序列号：10、氨基酸序列的序列号：11)
D4ST(登录号NM_028117、碱基序列的序列号：12、氨基酸序列的序列号：13)
C6ST-1(登录号NM_016803、碱基序列的序列号：14、氨基酸序列的序列号：15)
C6ST-2(登录号AB046929、碱基序列的序列号：16、氨基酸序列的序列号：17)
GalNAc4S-6ST(登录号NM_015892、碱基序列的序列号：18、氨基酸序列的序列号：19)
除上述以外的蛋白质、例如与序列表所记载的序列具有高同源性(通常为70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上、最优选为95％以上)且带有上述蛋白质所具有的功能(例如与细胞内的构成成分相结合的功能等)的蛋白质也包含在本发明的上述蛋白质中。上述蛋白质例如是由在序列号：3、5、7、9、11、13、15、17的任一个氨基酸序列中添加、缺失、取代、插入了1个以上的氨基酸而得到的氨基酸序列所构成的蛋白质，通常变化的氨基酸数为30个氨基酸以内、优选10个氨基酸以内、更优选5个氨基酸以内、最优选3个氨基酸以内。
本发明的上述基因中例如包含与由序列号：2、4、6、8、10、12、14、16的任一个的碱基序列所构成的DNA相对应的其他生物的内源性基因(人的上述基因的同源物等)。
另外，与由序列号：2、4、6、8、10、12、14、16的任一个的碱基序列所构成的DNA相对应的其他生物的内源性DNA一般来说与各个序列号：2、4、6、8、10、12、14、16的任一个所记载的DNA具有高的同源性。高同源性是指50％以上、优选70％以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上(例如95％以上、进一步为96％、97％、98％或99％以上)的同源性。该同源性可以由mBLAST算法(Altschul et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-8；Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-7)来确定。另外，该DNA在从生物体内分离时，在严格的条件下会与各个序列号：2、4、6、8、10、12、14、16所记载的DNA杂交。这里，“严格的条件”例如可举出“2×SSC、0.1％SDS、50℃”、“2×SSC、0.1％SDS、42℃”、“1×SSC、0.1％SDS、37℃”，更严格的条件可举出“2×SSC、0.1％SDS、65℃”、“0.5×SSC、0.1％SDS、42℃”和“0.2×SSC、0.1％SDS、65℃”的条件。
本领域技术人员通过使用N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的脱硫酸化作用或硫酸化阻碍作用的活性测定方法，可以适当地从上述具有高同源性的蛋白质中获得与上述蛋白质功能相同的蛋白质。
另外，本领域技术人员还可以根据上述基因的碱基序列来适当地获得其他生物的相当于上述基因的内源性基因。另外，本说明书中，人以外的生物中相当于上述蛋白质和基因的上述蛋白质和基因、或者与上述蛋白质和基因在功能上相同的上述蛋白质和基因有时也仅以上述名称进行记载。
本发明的上述蛋白质除了以天然的蛋白质的形式进行制备之外，还可以利用了基因重组技术的重组蛋白质的形式来进行制备。天然的蛋白质例如可以通过对认为上述蛋白质表达的细胞(组织)的提取液利用使用了针对上述蛋白质的抗体的亲和层析的方法来进行制备。另一方面，重组蛋白质例如可以通过对利用编码上述蛋白质的DNA进行了转化的细胞进行培养来制备。本发明的上述蛋白质例如优选用于后述的筛选方法。
本发明的“核酸”是指RNA或DNA。另外，所谓PNA(肽核酸)等化学合成核酸类似物也包括在本发明的核酸内。PNA是将作为核酸基本骨架结构的五单糖-磷酸骨架取代成以甘氨酸为单元的聚酰胺骨架的物质，具有极其类似于核酸的3维结构。
作为阻碍特定内源性基因的表达的方法，本领域技术人员熟知的是利用反义技术的方法。作为反义核酸阻碍靶基因表达的作用，存在以下数个要因。即，通过形成三重链来阻碍转录开始、通过与利用RNA聚合酶形成了局部开环结构的部位形成杂交体来阻碍转录、通过与正处于合成过程的RNA形成杂交体来阻碍转录、通过形成内含子和外显子的接合点处的杂交体来阻碍剪接、通过与剪接体形成部位形成杂交体来阻碍剪接、通过与mRNA形成杂交体来阻碍从核向细胞质移动、通过与加帽部位或poly(A)添加部位形成杂交体来阻碍剪接、通过与翻译起始因子结合部位形成杂交体来阻碍翻译开始、通过与起始密码子附近的核糖体结合部位形成杂交体来阻碍翻译、通过与mRNA的翻译区域或多核糖体结合部位形成杂交体来阻碍肽链的伸长、以及通过与核酸和蛋白质的相互作用部位形成杂交体来阻碍基因表达等。这样，反义核酸通过阻碍转录、剪接或翻译等各种过程来阻碍靶基因的表达(平島和井上，新生化学実験講座2核酸IV遗伝子の複製と発現，日本生化学会編，東京化学同人，1993，319-347.)。
本发明中使用的反义核酸还可以通过上述的任一个作用来阻碍编码上述任一种硫酸基转移酶的基因的表达和/或功能。
作为一个方式，认为当设计与编码上述硫酸基转移酶的基因的mRNA的5′端附近的非翻译区域互补的反义序列时，对于阻碍基因的翻译是有效的。另外，还可以使用与密码子区域或3′侧的非翻译区域互补的序列。这样，不仅含有编码上述硫酸基转移酶的基因的翻译区域、而且还含有非翻译区域的序列的反义序列的核酸也包含在本发明中利用的反义核酸内。所使用的反义核酸连接在适当的启动子的下游、优选在3′侧连接含有转录终止信号的序列。如此制备的核酸可以通过使用公知的方法转化到所希望的动物(细胞)中。反义核酸的序列优选是与编码转化的动物(细胞)所具有的内源性硫酸基转移酶的基因或其一部分相互补的序列，但只要能够有效地抑制基因的表达，也可以不完全互补。被转录的RNA相对于靶基因的转录产物优选具有90％以上、最优选具有95％以上的互补性。为了使用反义核酸有效地阻碍靶基因的表达，优选反义核酸的长度至少为15个碱基以上且小于25个碱基，但本发明的反义核酸并非必须限定于该长度，例如也可以是100个碱基以上或500个碱基以上。
本发明的反义核酸并无特别限定，例如可以基于C4ST-1(GenBank的登录号NM_021439、序列号：6)、C4ST-2(GenBank的登录号NM_021528、序列号：8)、C4ST-3(GenBank的登录号XM_355798、序列号：10)等来制作。
编码上述硫酸基转移酶的基因的表达的阻碍还可以利用核酶或编码核酶的DNA来进行。核酶是指具有催化剂活性的RNA分子。核酶中存在具有多种活性的物质，其中通过以作为剪切RNA的酶的核酶为焦点进行的研究，能够设计部位特异性地剪切RNA的核酶。核酶中有如I型内含子型或Rnase P所含的M1RNA那样400个核苷酸以上大小的物质，也有被称作锤头型或发夹型的具有40个核苷酸左右的活性结构域的物质(小泉誠和大塚栄子，タンパク質核酸酵素，1990，35，2191.)。
例如，锤头型核酶的自剪切结构域是剪切G13U14C15这一序列的C15的3′侧，但对其活性而言U14和A9的碱基对形成是很重要的，还可以代替C15剪切A15或U15来获得(Koizumi，M.et al.，FEBS Lett，1988，228，228.)。当设计底物结合部位与靶部位附近的RNA序列相互补的核酶时，可以制作识别靶RNA中的序列UC、UU或UA的限制酶性RNA剪切核酶(Koizumi，M.et al.，FEBS Lett，1988，239，285.、小泉誠和大塚栄子，タンパク質核酸酵素，1990，35，2191.、Koizumi，M.et al.，Nucl Acids Res，1989，17，7059.)。
另外，发夹型核酶对于本发明的目的也有用。该核酶例如可在烟草环斑病毒的卫星RNA的负链中发现(Buzayan，JM.，Nature，1986，323，349.)。由发夹型核酶也可制作靶特异性RNA剪切核酶(Kikuchi，Y.and Sasaki，N.，Nucl Acids Res，1991，19，6751.、菊池洋，化学と生物，1992，30，112.)。这样，通过使用核酶将编码上述硫酸基转移酶的基因的转录产物特异性地剪切，可以阻碍该基因的表达。
内源性基因的表达的抑制还可进一步通过使用了具有与靶基因序列相同或相近序列的双链RNA的RNA干扰(RNA interference、以下简称为“RNAi”)来进行。
由于近年的基因组计划的完成，在人类的全碱基序列被解读、数量众多的疾病相关基因大量被确定的现在，正在大量进行以特定基因为靶标的治疗法、创新药物的开发。其中，发挥特异性转录后抑制效果的small interfering RNA(siRNA，小干扰RNA)在基因治疗中的应用备受关注。
RNAi是1998年由Fire等发现的现象(FireA，Nature(1998)391，：806-811)，双链RNA(double strand RNA)强烈地抑制相同靶基因的表达。由于与以往使用载体等的基因导入法相比更为简单、对靶标的特异性更高、可用于基因治疗，因此最近备受关注。另外，在哺乳类细胞中，通过使用短链dsRNA(siRNA)可以诱导RNAi，RNAi具有与敲除小鼠相比效果更稳定、实验更容易、费用更便宜等多个优点。
具有利用RNAi效应的阻碍作用的核酸一般也被称作siRNA或shRNA。RNAi是下述的现象：通过将由与靶基因的mRNA相同的序列构成的正义RNA和由与其互补的序列构成的反义RNA所形成的短链双链RNA(以下简称作“dsRNA”)导入到细胞等中，从而特异性且选择性地结合在靶基因mRNA上诱导破坏，将该靶基因剪切，由此高效地阻碍(抑制)靶基因的表达。例如当将dsRNA导入至细胞内时，抑制了与其RNA相同序列的基因的表达(基因抑制)。这样，RNAi由于能够抑制靶基因的表达，因此作为代替以往繁琐且低效的利用相同重组的基因破坏方法的简单的基因敲除方法或者可应用于基因治疗的方法而备受关注。
本发明中，RNAi所使用的RNA虽然没有必要与编码上述硫酸基转移酶的基因或该基因的部分区域完全相同，但优选具有完全的同源性。另外，末端部还可以具有2个碱基左右的突出。
在siRNA的设计中，作为靶标，只要是编码上述硫酸基转移酶的基因，则无特别限定，可以将任意区域全部作为靶标候补。
例如，可以基于C4ST-1基因的碱基序列(序列号：6)、C4ST-2基因的碱基序列(序列号：8)、C4ST-3基因的碱基序列(序列号：10)等来制作。更具体地说，可以将该序列的一部分区域作为靶标候补，例如可以基于C4ST-1基因的碱基序列的一部分区域(序列号：20)、C4ST-2基因的碱基序列的一部分区域(序列号：21)、C4ST-3基因的碱基序列的一部分区域(序列号：22)、C6ST-1基因的碱基序列的一部分区域(序列号：23)、C6ST-2基因的碱基序列的一部分区域(序列号：24)等来制作。更具体地说，还可以举出以本说明书具体示出的DNA序列(序列号：25、26、35～50、55～65、82～88)为靶标的siRNA。
为了将siRNA导入细胞，可以采用将体外合成的siRNA与质粒DNA连接以将其导入细胞的方法、将双链RNA退火的方法等。
另外，上述双链RNA分子也可以是一端封闭结构的分子、例如具有发夹结构的siRNA(shRNA)。shRNA被称作短发夹RNA(short hairpin RNA)，由于一根链的一部分区域与其它区域形成互补链，因此是具有茎环(stem-loop)结构的RNA分子。即，分子内可形成双链RNA结构的分子也包含在本发明的siRNA中。
另外，作为本发明的优选方式，能够利用RNAi效应抑制C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3等的表达的RNA(siRNA)、以本说明书具体示出的DNA序列(序列号：25、26、35～50、55～65、82～88)为靶标的siRNA中例如添加或缺失了1个或少数RNA的结构的双链RNA，只要是具有抑制编码上述硫酸基转移酶的基因的表达的功能，则都包含在本发明的siRNA中。
用于RNAi(siRNA)RNA并不需要必须与编码上述蛋白质的基因或该基因的部分区域完全同一(相同)，但优选具有完全的同一性(同源性)。
RNAi机理的详细情况仍有不清楚的地方，但认为是被称作DICER的酶(Rnase III核酸分解酶家族的一种)与双链RNA接触，双链RNA被分解为称作small interfering RNA或siRNA的小片段。本发明的具有RNAi效应的双链RNA还包含如上所述被DICER分解前的双链RNA。即，即便是原长且不具有RNAi效应的长链RNA，也可期待在细胞中分解为具有RNAi效应的siRNA，因此本发明的双链RNA的长度并无特别限定。
例如，可以预先用DICER将与编码上述硫酸基转移酶的基因的mRNA的全长或大致全长的区域相对应的长链双链RNA分解，将其分解产物作为本发明的药剂利用。该分解产物可以期待含有具有RNAi效应的双链RNA分子(siRNA)。根据该方法，可以不用特意选择期待具有RNAi效应的mRNA上的区域。即，并不需要必须正确地规定具有RNAi效应的本发明的上述基因的mRNA上的区域。
本发明的上述“能够利用RNAi效应抑制的双链RNA”对于本领域技术人员而言，可以基于编码成为该双链RNA的靶标的上述硫酸基转移酶的基因的碱基序列来适当制作。如果举出一例的话，可以基于序列号：25所记载的碱基序列来制作本发明的双链RNA。即，对于本领域技术人员而言，在通常试行的范围内可以适当地基于序列号：25所记载的碱基序列来选择作为该序列转录产物的mRNA的任意连续的RNA区域以制作与该区域相对应的双链RNA。另外，对于本领域技术人员而言，还可以通过公知的方法适当地从作为该序列转录产物的mRNA序列中选择具有更强RNAi效应的siRNA序列。另外，只要清楚其中一条链，则本领域技术人员可容易地清楚另一条链(互补链)的碱基序列。siRNA对于本领域技术人员而言可以使用市售的核酸合成机来适当地制作。另外，对于所需RNA的合成，还可以利用一般的合成委托服务。
另外，本发明的siRNA并不需要必须是针对靶序列的一组双链RNA，还可以是针对含有靶序列的区域的多组双链RNA的混合物。这里，作为对应于靶序列的核酸混合物的siRNA，本领域技术人员可以使用市售的核酸合成机和DICER酶来适当制作，另外，对于所需RNA的合成，可以利用一般的合成委托服务。此外，本发明的siRNA包括所谓的“siRNA鸡尾酒”。
另外，本发明的siRNA并非全部的核苷酸都是核糖核苷酸(RNA)。即，本发明中，构成siRNA的1个或多个核糖核苷酸也可以是对应的脱氧核糖核苷酸。该“对应”是指虽然糖部分的结构不同，但是是相同的碱基种类(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶(尿嘧啶)。例如，对应于具有腺嘌呤的核糖核苷酸的脱氧核糖核苷酸是指具有腺嘌呤的脱氧核糖核苷酸。另外，上述“多个”并无特别限定，优选指2～5个左右的少数。
进而，本发明的可表达上述RNA的DNA(载体)也包含在能够抑制编码本发明的上述蛋白质的基因的表达的化合物的优选方式中。例如，本发明的可表达上述双链RNA的DNA(载体)是具有编码该双链RNA的其中一个链的DNA和编码该双链RNA另一个链的DNA按照能够分别表达的方式与启动子连接而成的结构的DNA。本发明的上述DNA对于本领域技术人员而言可以利用一般的基因工程学技术来适当地制作。更具体地说，通过将编码本发明RNA的DNA适当插入公知的各种表达载体中，可以制作本发明的表达载体。
另外，本发明的表达阻碍物质中包括通过与编码上述硫酸基转移酶的基因的表达调节区域(例如启动子区域)相结合来阻碍编码上述硫酸基转移酶的基因的表达的化合物。该化合物例如可以通过使用编码上述硫酸基转移酶的基因的启动子DNA片断、以与该DNA片断的结合活性为指标的筛选方法来获得。另外，对于本领域技术人员而言，还可以对所希望的化合物利用公知的方法、例如报告基因分析法等来适当地判断是否阻碍了编码上述硫酸基转移酶的基因的表达。
另外，可表达本发明的上述RNA的DNA(载体)也包含在可阻碍编码本发明的上述硫酸基转移酶的基因的表达的化合物的优选方式中。例如本发明的可表达上述双链RNA的DNA(载体)是具有编码该双链RNA的其中一个链的DNA和编码该双链RNA另一个链的DNA按照能够分别表达的方式与启动子连接而成的结构的DNA。本发明的上述DNA对于本领域技术人员而言可以利用一般的基因工程学技术来适当地制作。更具体地说，通过将编码本发明的RNA的DNA适当插入公知的各种表达载体中，可以制作本发明的表达载体。
作为本发明的上述载体的优选方式，可以举出表达能够通过RNAi效应抑制C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3等的表达的RNA(siRNA)的载体。
本领域技术人员可以利用公知的方法来制备与上述硫酸基转移酶结合的抗体。如果是多克隆抗体，例如可如下获得。使兔子等小动物免疫天然的上述蛋白质、或者作为与GST的融合蛋白质而在微生物中有所表达的重组蛋白质或者其部分肽，获得血清。将其利用例如硫酸铵沉淀、蛋白A、蛋白G柱、DEAE离子交换色谱、耦合了上述硫酸基转移酶或合成肽的亲和层析柱等进行纯化，由此制备。另外，如果是单克隆抗体，例如可以如下制备：使小鼠等小动物免疫上述的硫酸基转移酶或其部分肽，从同一小鼠中取出脾脏将其磨碎，分离细胞，使用聚乙二醇等试剂使该细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，从由此获得的融合细胞(杂交瘤细胞)中选择产生与上述硫酸基转移酶结合的抗体的克隆。接着，将所得杂交瘤细胞移植于小鼠腹腔内，从同一小鼠回收腹水，将所得单克隆抗体利用例如硫酸铵沉淀、蛋白A、蛋白G柱、DEAE离子交换色谱、耦合了上述硫酸基转移酶或合成肽的亲和层析柱等进行纯化，由此制备。
本发明的抗体只要是结合于本发明的上述硫酸基转移酶，则无特别限定，除了上述多克隆抗体、单克隆抗体之外，还可以是人抗体、利用基因重组得到的人源化抗体及其抗体片段或抗体修饰物。
作为获得抗体的致敏抗原使用的本发明的蛋白质对于作为其来源的动物种类并无特别限定，优选哺乳动物、例如小鼠或人来源的蛋白质，特别优选人来源的蛋白质。本领域技术人员可以使用本说明书中公开的基因序列或氨基酸序列来适当获得人来源的蛋白质。
本发明中，作为致敏抗原使用的蛋白质可以是完整的蛋白质或者是蛋白质的部分肽。作为蛋白质的部分肽，例如可举出蛋白质的氨基(N)末端片段或羧基(C)末端片断。本说明书中的“抗体”是指与蛋白质的全长或片断发生反应的抗体。
另外，除了使人以外的动物免疫抗原以获得上述杂交瘤细胞之外，例如还可以在体外利用蛋白质、蛋白质表达细胞或其溶解物致敏人淋巴细胞、例如感染了EB病毒的人淋巴细胞，使致敏淋巴细胞与人来源的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞、例如U266相融合，从而获得产生具有与蛋白质的结合活性的所需的人抗体的杂交瘤。
本发明的针对上述硫酸基转移酶的抗体通过与该蛋白质相结合，可期待阻碍该蛋白质的表达或功能的效果。当以对人体投予所得抗体为目的(抗体治疗)来使用时，由于会降低免疫原性，因此优选人抗体或人源化抗体。
另外，本发明中作为可阻碍上述硫酸基转移酶的功能的物质还含有与上述硫酸基转移酶结合的低分子量物质(低分子化合物)。该低分子量物质可以是天然或人工的化合物。通常是本领域技术人员通过使用公知的方法可以制造或获得的化合物。此外，本发明的化合物还可通过后述的筛选方法获得。
另外，作为可阻碍本发明的上述硫酸基转移酶的表达或功能的物质，可以举出对上述硫酸基转移酶具有显性失活性质的突变体(显性失活蛋白质)。对N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶具有显性失活性质的该蛋白质突变体是指具有下述功能的蛋白质：通过使编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因表达，使得内源性的野生型蛋白质的活性消失或降低。
作为本发明药剂的N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化抑制剂具有治疗或预防纤维形成性疾病的效果。因此，作为本发明药剂的优选方式为纤维形成性疾病的治疗用或预防用。
这里，“治疗或预防”是指对呈现组织纤维形成的脏器、组织并非必须具有完全的治疗效果或预防效果，也可以是具有部分效果的情况。
本发明的组织纤维形成抑制剂具有通过阻碍作为纤维形成原因的N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化来抑制纤维形成的作用。因此，作为本发明的优选方式，例如提供以本发明的组织纤维形成抑制剂为有效成分的组织纤维形成性疾病治疗剂或预防剂。
另外，本发明的“组织纤维形成性疾病治疗剂”还可以表述为“组织纤维形成性疾病改善剂”、“抗组织纤维形成剂”等。另外，本发明的药剂还可以表述为“药品”、“药品组合物”、“治疗用药品”等。
其中，本发明的“治疗”还包括可预先抑制纤维形成的发生的预防效果。另外，并不限于对纤维形成性的脏器(组织)具有完全的治疗效果的情况，还可以是具有部分效果的情况。
本发明的药剂可以与生理学上允许的载体、赋形剂或稀释剂等混合，作为药品组合物经口或非经口投予。作为经口制剂，可以制成颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、溶剂、乳剂或悬浮剂等剂型。作为非经口制剂，可以选择注射剂、点滴剂、外用药剂、吸入剂(气雾剂)或栓剂等剂型。注射剂可以示出皮下注射剂、肌肉注射剂、腹腔内注射剂、颅骨内投予注射剂、或鼻腔内投予注射剂等。外用药剂可以示出经鼻投予剂或软膏剂等。按照含有作为主成分的本发明药剂的方式制成上述剂型的制剂技术是公知的。
例如，经口投予用的片剂可以通过在本发明的药剂中加入赋形剂、崩解剂、粘结剂和润滑剂等并进行混合、压缩整形来制造。赋形剂一般使用乳糖、淀粉或甘露醇等。崩解剂一般使用碳酸钙、羧甲基纤维素钙等。粘结剂使用阿拉伯胶、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮。作为润滑剂，公知的有滑石、硬脂酸镁等。
含有本发明药剂的片剂为了掩味或制成肠溶性制剂，可以实施公知的涂覆。涂覆剂可以使用乙基纤维素或聚氧乙二醇等。
另外，注射剂可以通过将作为主成分的本发明药剂与适当的分散剂一起溶解、使其溶解或分散于分散介质中来获得。通过分散介质的选择，还可以制成水性溶剂或油性溶剂的任一种剂型。制成水性溶剂时，以蒸馏水、生理盐水或林格氏液等为分散介质。制成油性溶剂时，分散介质利用各种植物油或丙二醇等。此时，还可根据需要添加对羟基苯甲酸酯等防腐剂。另外，注射剂中还可添加氯化钠或葡萄糖等公知的等渗剂。而且，还可添加苯扎氯铵或盐酸普鲁卡因等无痛化剂。
另外，通过将本发明的药剂制成固态、液态或半固态形状的组合物，可以制成外用剂。对于固态或液态的组合物，可以通过制成与上述相同的组合物来制成外用剂。对于半固态形状的组合物，可以在适当溶剂中根据需要添加增粘剂来制备。溶剂可以使用水、乙醇或聚乙二醇等。增粘剂一般使用膨润土、聚乙烯醇、丙烯酸、甲基丙烯酸或聚乙烯吡咯烷酮等。该组合物中可以添加苯扎氯铵等防腐剂。另外，通过组合可可脂等油性基材或纤维素衍生物等水性凝胶基材作为载体，还可以制成栓剂。
将本发明的药剂作为基因治疗剂使用时，除了通过注射直接投予本发明药剂的方法之外，还可举出投予带有核酸的载体的方法。作为上述载体，可以举出腺病毒载体、腺伴随病毒载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等，通过使用这些病毒载体，可以高效地进行投予。
另外，还可将本发明的药剂导入脂质体等磷脂囊泡中并投予该囊泡。利用脂质体转染法将保持有siRNA或shRNA的囊泡导入至规定细胞内。然后将所得细胞全身投予至例如静脉内、动脉内等。还可以局部投予至纤维形成组织等。siRNA在体外显示非常优异的特异性转录后抑制效果，但在体内由于血清中的核酸酶活性而被迅速地分解，因此持续时间有所限制，因而需要开发更优化且有效的传递系统。作为其一例，Ochiya，T等的Nature Med.，5：707-710，1999、Curr.Gene Ther.，1：31-52，2001报道了当作为生物亲和性材料的去端肽胶原与核酸混合而形成复合体时，具有保护核酸免受生物体中分解酶分解的作用，是作为siRNA的载体非常适用的载体，但本发明的药剂导入方法并不限定于此。
本发明的药剂在安全的投予量范围内对包含人在内的哺乳动物投予必要量(有效量)。本发明药剂的投予量可以考虑剂型的种类、投予方法、患者的年龄或体重、患者的症状等，最终根据医生或兽医的判断来适当决定。如果举出一例的话，虽然根据年龄、性别、症状、投予路径、投予次数、剂型的不同而不同，但在为腺病毒时的投予量为1天1次，每次106～1013个左右，以1周～8周的间隔投予。
另外，为了将siRNA或shRNA导入至目标组织或器官内，可以使用市售的基因导入试剂盒(例如AdenoExpress：Clontech公司)。
成为本发明药剂的治疗或预防对象的疾病只要是组织的纤维形成所引起的疾病，则无特别限定，优选可举出心脏疾病、消化道疾病、肝脏疾病、肺疾病、肾脏疾病、脑神经疾病、眼疾病、胰腺疾病等。
作为本发明的“纤维形成所引起的疾病”的具体例子并无特别限定，可举出以皮肤为代表的外皮和上皮组织中的弹性组织增生症、硬皮症、慢性腹膜炎、腹膜后纤维化等；结缔组织等支持组织、肌肉中的多发性肌炎、皮肌炎、结节性多发动脉炎、软组织纤维症、慢性类风湿性关节炎、手掌纤维瘤、腱炎、腱鞘炎、跟腱炎、足菌肿等；骨髓、心脏等血液组织、脉管系统中的骨髓纤维症、脾功能亢进症、脉管炎、心律不齐、动脉硬化、阻塞性血栓性血管炎、结节性纤维症、心绞痛、扩张性充血性心肌病、心衰竭、限制型心肌病、弥散性非梗阻性心肌病、阻塞性心肌病、肺源性心脏病、二尖瓣狭窄、主动脉瓣狭窄、慢性心包炎、心内膜纤维症、心内膜心肌纤维症等；肝脏等消化器官系统中的慢性胰腺炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、酒精性肝炎、慢性B型肝炎、慢性C型肝炎、威尔森氏病、肝硬化、病毒性肝炎、高雪氏病、糖原贮积病、α抗胰蛋白酶缺乏、血色病、酪氨酸血症、果糖血症、半乳糖血症、Zellweger氏症候群、先天性肝纤维症、门静脉高压症、肝肉芽肿症、布加氏综合征、原发性硬化性胆管炎、脂肪肝、非酒精性肝炎、肝纤维症、先天性肝纤维症、酒精性肝硬化、病毒性肝硬化、寄生虫性肝硬化、中毒性肝硬化、营养不良性肝硬化、充血性肝硬化、肝硬化症、夏科氏肝硬变、托德氏肝硬变、继发性胆汁性肝硬化、单叶性肝硬变、由慢性非化脓性破坏性胆炎转移的肝硬化、阻塞性肝硬化、细胆管炎性肝硬化、胆汁性肝硬化、萎缩性肝硬变、坏死后性肝硬化、肝炎后肝硬化、结节性肝硬化、混合型肝硬变、小结节性肝硬化、代偿性肝硬化、非代偿性肝硬化、大结节性肝硬化、中隔性肝硬化、隐源性肝硬化、门脉周围性肝硬化、门脉性肝硬化、原发性胆汁性肝硬化等；肺等呼吸系统中的球孢子菌病、芽生菌病、过敏性支气管肺曲霉病、肺出血肾炎综合征、成人呼吸窘迫综合征中的肺纤维症、慢性阻塞性肺病、肺不张、肺炎、石末肺、石棉肺、过敏性肺炎、特发性肺纤维症、淋巴细胞性间质性肺炎、郎格汉斯细胞肉芽肿症、囊性纤维症、脓疱性纤维症、肺纤维症、特发性肺纤维症、纤维化性肺泡炎、间质性纤维症、弥漫性肺纤维症、慢性间质性肺炎、支气管扩张症、细支气管纤维症、支气管周纤维症、胸膜纤维症等；肾脏等泌尿器官、生殖器官系统中的男性性腺功能降低症、肌强直性营养不良、佩洛尼氏病等所导致的纤维症、慢性肾小管间质性肾炎、常染色体隐性囊肾、骨髓瘤肾、肾盂积水、快速进行性肾小球肾炎、肾毒性疾病、黄色肉芽肿性肾盂肾炎、镰状细胞肾病、肾性尿崩症、常染色体显性多囊性肾病、慢性肾小球性肾炎、IgA肾病、肾硬化症、局灶性肾小球硬化、膜性肾炎、膜增生性肾小球肾炎、慢性肾盂肾炎、肾淀粉样变性、多囊性肾病、腹膜后纤维症、伴随狼疮肾炎等结缔组织病的肾病变、糖尿病性肾病、慢性前列腺炎、血吸虫病所导致的膀胱炎；乳腺纤维症、乳腺纤维腺痛等；脊椎等神经系统中的先天性斜颈、強直性脊柱炎、神经纤维瘤或脊髓损伤后的神经功能缺失等脊髓疾病、帕金森病或阿尔茨海默病等脑神经疾病；眼球中的眼晶状体后纤维化症、增殖性视网膜病变等；以及在全身产生病变的结节病、系统性红斑狼疮所导致的纤维症或全身性硬皮症、多发性肌炎、皮肌炎等，但本发明的“纤维形成所引起的疾病”并不限定于这些，其也包括由于皮肤或脏器等各生物组织中的纤维形成所产生的疾病。
另外，本发明涉及以N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化程度为指标的组织纤维形成抑制剂的筛选方法(本说明书中有时记为“本发明的方法”)。
作为本发明方法的优选方式，为包含选择阻碍构成糖链的N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化的化合物的工序的方法。
通过本发明的筛选方法，可以有效地获得用于组织纤维形成抑制剂或纤维形成性疾病治疗或预防剂的候补化合物。
本发明的筛选方法的优选方式为包含以下(a)～(c)的组织纤维形成抑制剂的筛选方法。
(a)使N-乙酰基半乳糖胺或含有N-乙酰基半乳糖胺的糖链与受试化合物接触的工序；
(b)测定N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化程度的工序；
(c)选择与不接触受试化合物的情况相比使硫酸化程度降低的化合物的工序。
以下举出本发明的筛选方法的方式。其中，以下所记载的方式中，作为所使用的N-乙酰基半乳糖胺、硫酸基转移酶、脱硫酸化酶等的来源，可举出人、小鼠、大鼠等来源，但并不限定于这些。
另外，作为以下所述方式所用的受试化合物，并无特别限定，例如可举出天然化合物、有机化合物、无机化合物、蛋白质、肽等单一化合物、以及化合物文库、基因文库的表达产物、细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物产物、海洋生物提取物、植物提取物等。
另外，本发明的方法中与受试化合物的“接触”通常通过将N-乙酰基半乳糖胺、硫酸基转移酶或脱硫酸化酶与受试化合物相混合来进行，但并不限定于该方法。例如，通过使表达这些蛋白质或其一部分的细胞与受试化合物接触，可以进行上述“接触”。
另外，作为以下所述方式中的“细胞”的来源，可举出人、小鼠、大鼠等来源的细胞，但并不特别限定为这些来源的细胞，还可利用按照表达在各个方式中所用的蛋白质的方式进行了转化的大肠杆菌、酵母等微生物细胞。例如，作为“表达编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的细胞”，可以利用表达内源性的编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的细胞；或导入外源性的编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因、对该基因有所表达的细胞。对外源性的编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因有所表达的细胞通常可以通过将插入了编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的表达载体导入宿主细胞来制作。该表达载体可以利用一般的基因工程学技术来制作。
另外，本领域技术人员可以利用公知的方法进行本发明方法中的硫酸化程度的测定。例如，使用与N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位或其一部分硫酸化结构结合的经标记的化合物或抗体等测定标记量，从而可以进行检测。另外，还可以使用色谱法或质谱分析法等进行检测。
本领域技术人员例如可以通过以下的公知方法来适当评价N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化程度。
(1)利用使用了标记色素(1-9-二甲基亚甲基蓝)的定量色素结合的方法(Nature.1998 Feb 26；391(6670)：908-11)
(2)利用使用(32P)3′，5′-ABP的光亲和性标记的方法(Mandon，E.C.，Milla，M.E.，Kempner，E.，and Hirschberg，C.B.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，10707-10711)
(3)利用使用3′-(32P)-βmethyleneb PAPS的光亲和性标记的方法(Ozeran，J.D.，Wesley，J.，and Schwarz，N.B.(1996)Biochemistry，35，3695-3703)
(4)利用阴离子交换树脂(硫酸化糖蛋白质的分离法)的方法(Vol.16，No.2(19860430)pp.69-72、北里大学ISSN：03855449)
(5)利用阿尔新蓝的sGAG比色染色(Anal Biochem.1998 Feb15；256(2)：229-37)
另外，本领域技术人员可以通过上述方法等容易地评价任意的物质是否是本发明的N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化抑制剂。
作为本发明的筛选方法的其他方式，可以举出包含选择使N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移活性降低的物质(化合物)的工序的方法。
本发明的上述方法例如由以下的工序构成。
(a)使N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶与受试化合物接触的工序；
(b)测定上述酶的硫酸基转移活性的工序；
(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使上述活性降低的化合物的工序。
上述方法中，首先使受试化合物与N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶接触。
本方法中，接着测定上述酶的硫酸基转移活性。然后选择与未接触受试化合物的情况(对照)相比使上述活性降低的化合物。使活性降低的化合物即成为纤维形成抑制剂或用于纤维形成性疾病治疗的药剂。
作为能够评价(测定)受试化合物是否具有上述硫酸基转移活性的方法，例如可举出以下方法。
在对促进N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化的细胞、细胞株培养一定时间的过程中混合各种受试化合物，利用例如检测4位硫酸化的抗体(克隆：LY111，2H6)或检测6位硫酸化的抗体(克隆：MC21C，MO225，CS-56、均为生化学工业公司制)可以简单地确认培养前后的硫酸化程度。还可以使用荧光标记抗体来比较培养前后的荧光数值，还可以在培养前后进行使用2-B-6或3-B-3抗体的检测方法。抑制细胞培养后的硫酸化增加(LY111或MC21C的荧光数值增加)的化合物或者促进细胞培养后的脱硫酸化进行(2-B-6或3-B-3的荧光数值增加)的化合物作为本发明的方法中的目标候补化合物被选择。
另外，还可以进一步选择性地利用公知的方法将例如C4ST-1或C6ST-1等硫酸基转移酶的基因导入至CHO细胞或L细胞等中来制作稳定表达的细胞株。通过使用这种稳定地添加了硫酸基的细胞株，可以更加清楚地判定治疗候补化合物。
本发明的其他优选方式为选择使本发明N-乙酰基半乳糖胺的硫酸基转移酶的基因表达量降低的化合物的包含以下工序(a)～(c)的组织纤维形成抑制剂的筛选方法。
(a)使受试化合物与表达编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的细胞接触的工序；
(b)测定上述细胞中的基因表达量的工序；
(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使上述基因表达量降低的化合物工序。
上述方法中，首先使受试化合物与表达编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的细胞接触。
本方法中，接着测定编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的表达量。这里，“基因的表达”包括转录和翻译两者。本领域技术人员可以通过公知的方法进行基因表达量的测定。
例如，根据常规方法从表达上述任一种蛋白质的细胞中提取mRNA，实施以该mRNA为模板的Northern杂交法、RT-PCR法、DNA阵列法等，从而可以测定该基因的转录量。另外，从表达编码上述任一种蛋白质的基因的细胞中回收蛋白质级分，利用SDS-PAGE等电泳法检测上述任一种蛋白质的表达，从而可进行基因翻译量的测定。进而，通过使用针对上述任一种蛋白质的抗体实施western-blotting法来检测该蛋白质的表达，从而可测定基因的翻译量。作为该蛋白质的检测中所使用的抗体，只要是能够检测的抗体，则无特别限定，例如可以利用单克隆抗体或多克隆抗体这两者。
本方法中，然后将该基因的表达量与未接触受试化合物的情况(对照)进行比较。
本方法中，接着选择与未接触受试化合物的情况相比使上述基因的表达量降低(抑制)的化合物。使其降低(抑制)的化合物即成为组织纤维形成抑制剂或用于纤维形成性疾病治疗的候补化合物。
另外，作为本发明筛选方法的一个方式，是以报告基因的表达量(水平)为指标来选择使编码本发明的N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的表达量(水平)降低的化合物的方法。本发明的上述方法例如包含以下工序(a)～(c)。
(a)使受试化合物与含有下述DNA的细胞或细胞提取液接触的工序，所述DNA具有编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域与报告基因功能性结合而成的结构；
(b)测定上述报告基因的表达量(水平)的工序；
(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使上述报告基因表达量(水平)降低的化合物的工序。
本方法中，首先使受试化合物与含有具有编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域与报告基因功能性结合而成的结构的DNA的细胞或细胞提取液接触。
这里，“功能性结合”是指按照通过转录因子与编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域结合来诱导报告基因的表达的方式，使编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域与报告基因相结合。因此，即便是报告基因与其它基因结合而形成与其它基因产物的融合蛋白质，只要通过转录因子与编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域结合而诱导了该融合蛋白质的表达，则其也包含在上述“功能性结合”的意义中。本领域技术人员可以通过公知的方法，根据编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的cDNA碱基序列来获得存在于基因组中的编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域。
作为本方法中所使用的报告基因，只要是能够检测其表达，则无特别限定，例如可举出CAT基因、lacZ基因、荧光素酶基因和GFP基因等。作为“含有具有编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域与报告基因功能性结合而成的结构的DNA的细胞”，例如可举出导入了插入有这种结构的载体的细胞。本领域技术人员可以通过公知的方法制作这种载体。载体向细胞内的导入可以通过一般的方法、例如磷酸钙沉淀法、电脉冲穿孔法、脂质体转染法、微注射法等实施。“含有具有编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域与报告基因功能性结合而成的结构的DNA的细胞”还包括在染色体中插入有该结构的细胞。DNA结构在染色体中的插入可以利用本领域技术人员通常使用的方法、例如利用同源重组的基因导入法来进行。
“含有具有编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域与报告基因功能性结合而成的结构的DNA的细胞提取液”例如可举出在市售的试管内转录翻译试剂盒中所含的细胞提取液中添加了具有编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域与报告基因功能性结合而成的结构的DNA而得到的细胞提取液。
这里，“接触”可以通过在“含有具有编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域与报告基因功能性结合而成的结构的DNA的细胞”的培养液中添加受试化合物、或者在含有该DNA的上述市售的细胞提取液中添加受试化合物来进行。受试化合物为蛋白质时，例如也可以通过将表达该蛋白质的DNA载体导入至该细胞中来进行。
本方法中，接着测定该报告基因的表达水平。本领域技术人员可以根据报告基因的种类利用公知的方法来测定该报告基因的表达水平。例如，当报告基因为CAT基因时，通过检测该基因产物导致的氯霉素的乙酰基化，可以测定报告基因的表达量。当报告基因为lacZ基因时，通过检测该基因表达产物的催化作用所导致的色素化合物的显色，可以测定报告基因的表达量；当报告基因为荧光素酶基因时，通过检测该基因表达产物的催化作用所导致的荧光化合物的荧光，可以测定报告基因的表达量；当报告基因为GFP基因时，通过检测GFP蛋白质所产生的荧光，可以测定报告基因的表达量。
本方法中，接着将所测定的报告基因表达量(水平)与不存在受试化合物时测定的情况(对照)进行比较。选择在上述报告基因与编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因功能性结合时，与对照相比使上述报告基因的表达水平降低(抑制)的化合物。使其降低(抑制)的化合物成即成为用于组织纤维形成抑制的药剂或用于纤维形成性疾病治疗的候补化合物。
本发明的筛选方法所发现的组织纤维形成抑制剂优选用于纤维形成性疾病的治疗用或预防用。
另外，本发明提供用于治疗或预防纤维形成性疾病的药品组合物的制造方法。本发明的上述制造方法例如包含以下的工序(a)和(b)。
(a)利用上述组织纤维形成抑制剂的筛选方法从受试试样中选择组织纤维形成抑制剂的工序；
(b)将上述药剂和药学上可允许的载体进行混合的工序。
本方法中，首先利用上述组织纤维形成抑制剂的筛选方法从受试试样中选择组织纤维形成抑制剂。
本方法中，接着将上述所选择的药剂和药学上可允许的载体混合。药学上可允许的载体例如可使用上述的载体。
另外，本发明提供用于实施本发明的筛选方法的含有各种药剂、试剂等的试剂盒。
本发明的试剂盒例如可以对应着所实施的筛选方法从本发明的上述各种试剂中适当选择。例如，本发明的试剂盒可以以本发明的N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶作为构成要素。本发明的试剂盒中还可以进一步含有本发明的方法中所使用的各种试剂、容器等。例如，可以适当含有抗体、探针、各种反应试剂、细胞、培养液、对照样品、缓冲液、记载使用方法的说明书等。
另外，本发明还提供包含向个体(例如患者等)投予本发明的药剂的工序的纤维形成性疾病的治疗或预防方法。
成为本发明的预防或治疗方法的对象的个体只要是可以罹患纤维形成性疾病的生物，则无特别限定，优选为人。
关于向个体的投予，一般来说本领域技术人员可通过公知的方法进行，例如动脉内注射、静脉内注射、皮下注射等。投予量根据患者的体重或年龄、投予方法等变化，只要是本领域技术人员(医生、兽医、药剂师等)，可适当选择适合的投予量。
另外，本发明还涉及本发明的药剂在组织纤维形成抑制剂的制造中的用途。
此外，本说明书中所引用的所有现有技术文献作为参照编入本说明书中。
实施例
以下，使用实施例进一步具体地说明本发明。但本发明的技术范围并不限定于这些实施例。
此外，本说明书中有时通过记载成为靶标的基因的DNA区域来表现siRNA的结构(序列)。对于本领域技术人员来说，根据作为靶序列记载的DNA序列的信息，可以容易地识别由对应于该DNA序列的双链RNA构成的siRNA的结构。
〔心脏组织〕
实施例1：小鼠心肌病模型的靶糖链基因的siRNA基因抑制效果的探 讨和基因水平的抗纤维形成效果的探讨
在该实施例及以下的实施例中，使用作为小鼠心肌病模型标准化了的盐酸多柔比星(DOX：协和发酵公司制)腹腔内投予模型。该小鼠模型虽然是传统的，但重现性优异且简单，因此作为心肌病模型广泛用于病理阐明或新型治疗实验等中(Longhu Li，Circulation.2006；113：535-543、Xiaoming Yi，Am J Physiol Heart Circ Physiol 290：H1098-H1102，2006、Kang YJ，J Biol Chem.2000 May 5；275(18)：13690-8、Nozaki N，Circulation.2004；110：2869-2874、Fisher PW，Circulation.2005；111：1601-1610)。
由于组织学上呈现心肌间质的纤维形成，因此是除了扩张型心肌病、限制型心肌病、肥大型心肌病、致心律失常型右室心肌病(ARVC)之外，在急性心肌梗塞、稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、心肌炎、瓣膜性心脏病、心律不齐、高血压症所续发的左心室重构中也常见的现象，是成为基于上述疾病的慢性心衰竭的心肌功能障害的原因的病理现象(Jugdutt BI，Circulation.108：1395-1403，2003)。
首先制作小鼠模型，对C57BL6/J小鼠(雄性、8周龄、日本CLEA公司制)腹腔内投予DOX(15mg/kg；协和发酵公司制)。投予后饲养1周，采集心脏组织。对照组使用同样的小鼠但不投予DOX，使用同时期购买和饲养的小鼠。
GalNAc 4S-6ST siRNA药剂在DOX投予的24小时之前，对每只小鼠腹腔内投予混合有GalNac 4S-6ST siRNA 1μg(北海道System Science公司制)和作为介质的1％去端肽胶原(高研公司制)200μL的物质。以下示出本实施例所使用的GalNac 4S-6ST siRNA药剂的碱基序列。序列并非仅限定于本例。
[人GalNac4-6STsiRNA](GeneBank登录号NM_015892)(北海道System Science公司制)
5’-ggagcagagcaagaugaauacaauc-ag-3’(序列号：25)
3’-ua-ccucgucucguucuacuuauguuag-5’(序列号：26)
对由心肌病模型小鼠摘出的脏器(心脏)每50mg加入RNA iso(Takara Bio公司制)1mL，使用电动均质机(DIGITAL HOMOGENIZER、AS ONE公司制)将其粉碎后，加入氯仿200μL(Sigma Aldrich Japan公司制)并稳定地混合后冰冷约5分钟，使用离心分离机(Centrifuge 5417R、eppendorf公司制)在12,000rpm、4℃下离心分离15分钟。将离心分离后的上清液500μL移至另外的埃彭道夫管中，添加与上清液等量的异丙醇500μL(Sigma Aldrich Japan公司制)并混合后，添加1μL的肝糖(Invitrogen公司制)并冰冷15分钟。冰冷15分钟后，在12,000rpm、4℃下离心15分钟，之后用75％乙醇1000μL(Sigma Aldrich Japan公司制)洗涤3次，将所得RNA沉淀物自然干燥30分钟～1小时后，溶解于大塚蒸馏水50μL(大塚制药公司制)中，然后用大塚蒸馏水(大塚制药公司制)稀释100倍，在UV板(Corning Costar公司制)上利用读板器(POWER Wave XS、BIO-TEK公司制)计算所提取的样品中的RNA浓度。
接着，为了进行逆转录反应(cDNA合成)，进行以下工序。进行计算将所得RNA样品调整为500ng/20μL的浓度，使用BLOCK INCUBATOR培养箱(ASTEC制)在68℃下加热3分钟，然后冰冷10分钟。冰冷后，添加80μL的预先制备的RT Pre Mix液(组成：25mM MgCl2 18.64μL(Invitrogen公司制)、5×Buffer 20μL(Invitrogen公司制)、0.1M DTT 6.6μL(Invitrogen公司制)、10mM dNTP mix 10μL(Invitrogen公司制)、Rnase抑制剂2μL(Invitrogen公司制)、MMLV逆向转录酶1.2μL(Invitrogen公司制)、随机引物2μL(Invitrogen公司制)、灭菌蒸馏水19.56μL(大塚蒸馏水：大塚制药公司制))，使用BLOCK INCUBATOR培养箱(ASTEC公司制)在42℃下加热反应1小时，1小时后使用BLOCK INCUBATOR培养箱(ASTEC公司制)在99℃下加热5分钟后进行冰冷，制作所需要的cDNA 100μL，使用合成所得的cDNA，按以下组成进行定量PCR反应。对于定量PCR，使用SYBR premix试剂盒(Takara Bio公司制)和实时PCR基因扩增仪DICE(Takara Bio公司制)进行。PCR反应的条件为95℃下10秒、95℃下5秒和60℃下30秒的40个循环，最后进行熔解曲线分析。以下示出定量PCR中所使用的引物的碱基序列。
[定量PCR引物序列]
* 小鼠GalNac4S-6ST(Takara Bio公司制)
正向：5’-GTGAGTTCTGCTGCGGTCCA-3’(序列号：27)
反向：5’-AGTCCATGCTGATGCCCAGAG-3’(序列号：28)
* 小鼠前胶原Type 1 alpha2(Takara Bio公司制)
正向：5’-ACCCGATGGCAACAATGGA-3’(序列号：29)
反向：5’-ACCAGCAGGGCCTTGTTCAC-3’(序列号：30)
* 小鼠α-SMA(Takara Bio公司制)
正向：5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’(序列号：31)
反向：5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’(序列号：32)
* 小鼠r核糖体18S(Takara Bio公司制)
正向：5’-TTCTGGCCAACGGTCTAGACAAC-3’(序列号：33)
反向：5’-CCAGTGGTCTTGGTGTGCTGA-3’(序列号：34)
如图2所示，对GalNac4S-6ST、I型胶原、α-SMA的基因表达进行研究的结果是，在GalNac 4S-6ST siRNA治疗组中，与未治疗组相比，可见显著地(P＜0.001、vs未治疗组)抑制了GalNac4S-6ST的表达。另外，作为心肌病病症很重要的纤维形成的指标，分别研究α-SMA、I型胶原的基因表达，结果可确认GalNac 4S-6ST siRNA治疗组与未治疗组相比，表达显著地降低(P＜0.001，vs未治疗组)。考察这些结果可知，伴随着GalNAc4S-6ST siRNA的靶标基因抑制效应，在基因表达水平上抑制了心肌的纤维形成的发展。
本发明的药剂例如作为心肌纤维形成抑制剂是有用的。
实施例2：小鼠心肌病模型中GalNAc4S-6ST siRNA的心肌肥大的抑制 效果
该实施例中，测定心肌病模型小鼠的心脏重量(mg)和体重(g)，计算作为心肌肥大指标的心脏重量-体重比，对GalNAc4S-6ST(GalNac)siRNA心肌肥大抑制效果进行比较研究。心肌肥大也是显示组织的纤维性变化的指标。
图1表示对siRNA治疗组(n＝4)及未治疗组(n＝4)的心脏重量(mg)-体重(g)比进行计算的结果。其结果是：未治疗组的比值为6.376±0.484、siRNA治疗组的值为5.442±0.203。该结果可见，与未治疗组相比，siRNA治疗组中可见值显著减少(p＜0.05：t检验)。这是表示GalNAc 4S-6ST siRNA具有抑制病态心肌肥大的效果的结果。
本发明的药剂例如作为心肌肥大抑制剂(心肌肥大治疗剂)是有用的。
实施例3：小鼠心肌病模型中GalNAc 4S-6ST siRNA的I型胶原沉积抑 制效果的探讨
本实施例中，使用心肌病模型小鼠的心脏样品对GalNAc 4S-6ST siRNA的I型胶原沉积(纤维形成的指标)的抑制效果进行比较研究。将从与实施例1相同的小鼠采集的心脏的组织样品包埋于冷冻用包埋剂OCTCOMPOUND(Miles公司制)，利用低温恒温器(Carl Zeiss公司制)切薄片，用丙酮(Sigma Aldrich Japan公司制)将所得切片固定10分钟后，利用磷酸缓冲液进行洗涤，然后添加作为一抗的抗I型胶原兔抗血清(兔多克隆抗体、1∶2000稀释；LSL公司制)，并在室温下反应1小时。接着，添加作为二抗的过氧物酶标记的山羊来源抗兔IgG(1∶200稀释；cappel公司制)，并在室温下反应30分钟。在反应后的样品中添加DAB底物(Nichirei公司制)。使用光学显微镜(Leica公司制)观察该标本。
组织所见示于图3。对于未治疗组，在心肌纤维间可确认非常强的I型胶原的阳性信号。与此相对，对于siRNA治疗组，I型胶原的阳性信号远远弱于未治疗组。考察以上的I型胶原的免疫染色的结果时可知，GalNAc4S-6ST siRNA对于心肌组织中的I型胶原的过剩沉积具有抑制效果。此结果与实施例1所示的定量PCR的结果相关联。
本发明的药剂例如作为心肌组织的I型胶原沉积抑制剂是有用的。
实施例4：小鼠心肌病模型中GalNAc 4S-6ST siRNA的III型胶原沉积 抑制效果的探讨
本实施例中，使用心肌病模型小鼠的心脏样品对GalNAc 4S-6ST siRNA的III型胶原沉积(纤维形成的活性的指标)的抑制效果进行比较研究。将利用与实施例3相同的方法获得的组织切片用丙酮(Sigma Aldrich Japan公司制)固定10分钟后，利用磷酸缓冲液进行洗涤，然后添加作为一抗的抗III型胶原兔抗血清(兔多克隆抗体、1∶2000稀释；LSL公司制)，并在室温下反应1小时。接着，添加作为二抗的过氧物酶标记的山羊来源抗兔IgG(1∶200稀释；cappel公司制)，并在室温下反应30分钟。在反应后的样品中添加DAB底物(Nichirei公司制)。使用光学显微镜(Leica公司制)观察该标本。
组织所见示于图4。对于未治疗组，在心肌纤维间可确认稍强的III型胶原的阳性信号。与此相对，对于siRNA治疗组，III型胶原的阳性信号与对照组为相同程度。考察以上的III型胶原的免疫染色的结果时可知，GalNAc 4S-6ST siRNA具有抑制心肌组织中的III型胶原的沉积的效果、即对于活性的胶原的沉积也具有有效的抑制效果。
本发明的药剂例如作为心肌组织的III型胶原沉积抑制剂是有用的。
实施例5：小鼠心肌病模型中GalNAc 4S-6ST siRNA的纤维芽细胞浸 润抑制效果的探讨
本实施例中，通过DOX投予对GalNAc 4S-6ST siRNA对于浸润至心肌病模型小鼠的心肌组织内的纤维芽细胞动态的药理效果进行探讨。将利用与实施例3相同的方法获得的组织切片用丙酮(Sigma Aldrich Japan公司制)固定10分钟后，利用磷酸缓冲液进行洗涤，然后添加作为一抗的抗小鼠纤维芽细胞抗体(ER-TR7∶大鼠单克隆抗体、1∶400稀释；BMA Biomedicals公司制)，并在室温下反应1小时。接着，添加作为二抗的过氧物酶标记的山羊来源抗大鼠免疫球蛋白抗体(1∶200稀释；Biosource公司制)，并在室温下反应30分钟。在反应后的样品中添加DAB底物(Nichirei公司制)。使用光学显微镜(Leica公司制)观察该标本。
组织所见示于图5。照片为聚焦于心室间隔部分的照片。对于未治疗组，与对照组相比可见大量纤维芽细胞的浸润。与此相对，对于siRNA治疗组而言，与未治疗组相比，减小了纤维芽细胞的浸润程度。此结果表示GalNAc4S-6ST siRNA具有抑制心肌组织中的纤维芽细胞的浸润的药理效果，此效果为抗纤维形成作用之一。
本发明的药剂例如作为心肌组织的纤维芽细胞浸润抑制剂是有用的。
〔消化道组织〕
实施例6：小鼠肠道纤维形成模型的GalNAc4S-6ST的临床纤维形成抑 制效果
使C57BL/6J小鼠(雌性、6周龄、日本CLEA公司制)自由饮用含有3％葡聚糖硫酸钠(DSS；和光公司制)的高氯水8天，从而制作结肠炎模型。该DSS诱发性结肠炎模型的重现性优异，作为小鼠溃疡性结肠炎或称作克罗恩病的炎症性肠疾病的标准实验模型而广泛使用，另外还是显示作为肠道狭窄的组织学特征的全层性炎症-纤维性变化以及肌肉层肥厚的模型(Sasaki N，J Inflamm.2005 2：13、总说：Pucilowska JB et al.Am J Physiol Gastroenterol Liver Physiol.279：G653-G659，2000)。因此，除了炎症性肠疾病之外，是在呈现组织上的肠道狭窄的病态，即肠道白塞病(单纯性溃疡)、肠易激综合征、缺血性肠炎、药源性肠炎、放射性肠炎、贲门失迟缓症、伴随硬皮病的食道狭窄、伴随SLE(系统性红斑狼疮：systemic lupuserythematosus)的肠道狭窄、先天性巨结肠、肠道摘除后的狭窄(术后狭窄)、对消化道系统的癌(舌癌、上咽头癌、咽喉癌、食道癌、胃癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌)进行内窥镜粘膜切除手术后的肠道狭窄、肠梗阻等疾病中广泛共通的组织学所见。
在给予3％DSS水的同时，将与实施例1相同的GalNAc 4S-6ST siRNA(1μg/只)混合在预先使用PBS稀释了10倍的去端肽胶原(Koken公司制)中，对小鼠腹腔内注射200μl。将进行了此处置的小鼠组分为GalNAc 4S-6ST siRNA组、未混合GalNAc 4S-6ST siRNA而仅进行了去端肽胶原处置的组和对照组，一边使其饮用3％DSS水，一边记录7天的体重和疾病的活性指数(DAI)评分(Kihara M，Gut.200352：713-9)。DAI的评价标准如下所述。
表1
  指数   体重减少   大便性状   便隐血
  0   无   正常   正常
  1   1-5％   便隐血(Hem occult)(+)
  2   5-10％   软便   便隐血(Hem occult)(++)
  3   10-20％   便隐血(Hem occult)(+++)
  4   ＞20％   腹泻   严重出血(Gross bleeding)
将DSS水给水第一天(第0天)作为1，将记录各个小鼠的DAI的结果示于图6。在第3天，与对照组相比，GalNAc4S-6ST siRNA投予组显示出显著的低值(p＜0.001、t检验)。由此结果可知，GalNAc4S-6ST基因的表达抑制带来从较早期开始即抑制炎症活性的效果。
然后，在第5天处死小鼠后测定大肠长度，结果GalNAc4S-6ST siRNA投予组显著地(p＜0.005、t检验)抑制了大肠的短缩(图6)。大肠长度是反映肠道纤维形成或狭窄的决定性指标。因此可知，GalNAc4S-6ST siRNA投予组在临床上也强烈地抑制肠道纤维性变化。
本发明的药剂例如作为肠道纤维性变化抑制剂是有用的。
实施例7：小鼠肠道纤维形成模型的GalNAc4S-6ST siRNA的肠道纤维 形成抑制效果
本实施例中，利用实时定量PCR法探讨GalNAc 4S-6ST siRNA投予所导致的大肠局部的纤维形成相关基因表达。
利用与实施例6相同的方法制作肠道纤维形成模型，在第7天处死小鼠。将所采集的大肠的一部分放入1.5ml管中，用液氮进行冷冻。利用与实施例1相同的方法进行cDNA合成，进行定量PCR。引物的序列、PCR循环也相同。
将结果示于图7。本模型中GalNAc4S-6ST基因的表达增强，但可确认通过GalNAc4S-6ST siRNA治疗，将其显著地(p＜0.001、t检验)抑制。另外，通过GalNAc4S-6ST siRNA，还显著地(均为p＜0.001、t检验)抑制了作为纤维形成指标的I型胶原以及α-SMA的表达增强。本结果表明，通过抑制GalNAc4S-6ST的表达，可以有效地抑制大肠的纤维性变化的增强。
本发明的药剂例如作为大肠的纤维性变化抑制剂是有用的。
实施例8：小鼠肠道纤维形成模型的GalNAc4S-6ST siRNA的组织性纤 维形成抑制效果
利用与实施例6相同的方法制作肠道纤维形成模型，在第7天处死小鼠。利用与实施例3相同的方法将所采集的大肠制作成冷冻块及组织切片。将大肠组织切片的马松染色图像示于图8。马松染色是将胶原纤维视觉化、用于评价组织的纤维性变化的指标。在GalNAc4S-6ST siRNA投予组中，与对照组相比，明显地抑制了全层性(粘膜固有层、粘膜下层、肌肉层)的胶原纤维的沉积。
本发明的药剂例如作为全层性(粘膜固有层、粘膜下层、肌肉层)的胶原纤维沉积抑制剂是有用的。
实施例9：小鼠肠道纤维形成模型的GalNAc4S-6ST siRNA的组织学纤 维芽细胞浸润抑制效果
利用与实施例6相同的方法制作肠道纤维形成模型，在第7天处死小鼠。利用与实施例3相同的方法将所采集的大肠制作成冷冻块及组织切片。将所得切片用丙酮(和光公司制)固定10分钟后，利用磷酸缓冲液洗涤，添加作为一抗的抗ER-TR7抗体(大鼠单克隆抗体、1μg/ml、BMA公司制)，在室温下反应1小时。接着，使用过氧物酶标记抗大鼠IgG(1∶200稀释)进行二抗反应后，添加DAB底物(Nichirei Biosciences公司制)使其显色。之后利用Lillie-Mayer hematoxylin(武藤化学公司制)进行核染色，在光学显微镜(Leica公司制)下观察试样，观察以茶色信号可视化的抗体结合。
结果，GalNAc4S-6ST siRNA治疗组与对照组相比，明显地抑制了纤维芽细胞的全层性的浸润(图9)。因此可知，通过GalNAc4S-6ST基因表达抑制，抑制了组织病变局部的纤维芽细胞的浸润及锚定，从而减轻了纤维性变化的增强。
本发明的药剂例如作为纤维芽细胞浸润抑制剂或纤维芽细胞锚定抑制剂是有用的。
实施例10：小鼠肠道纤维形成模型的GalNAc4S-6ST siRNA的组织学 巨噬细胞浸润抑制效果
利用与实施例6相同的方法制作肠道纤维形成模型，在第7天处死小鼠。利用与实施例3相同的方法将所采集的大肠制作成冷冻块及组织切片。将所得切片用丙酮(和光公司制)固定10分钟后，利用磷酸缓冲液洗涤，添加作为一抗的抗F4/80抗体(clone A3-1、大鼠单克隆抗体、2μg/ml：CALTAG LABORATORIES公司制)，在室温下反应1小时。接着，使用过氧物酶标记抗大鼠IgG(1∶200稀释)进行二抗反应后，添加DAB底物(Nichirei Biosciences公司制)使其显色。之后利用Lillie-Mayer hematoxylin(武藤化学公司制)进行核染色，在光学显微镜(Leica公司制)下观察试样，观察以茶色信号可视化的抗体结合。
结果，GalNAc4S-6ST siRNA治疗组与对照组相比，明显地抑制了巨噬细胞的全层性的浸润(图10)。因此可知，通过GalNAc4S-6ST基因表达抑制，抑制了巨噬细胞和纤维芽细胞这样的使纤维性变化持续和增强的责任细胞组的浸润，综合地抑制了组织的纤维性变化。
本发明的药剂例如作为巨噬细胞或纤维芽细胞的浸润抑制剂是有用的。
实施例11：小鼠肠道纤维形成模型的GalNAcST siRNA的组织学巨噬 细胞浸润抑制效果
GalNAc4S-6ST是将硫酸基转移至4位经硫酸化的N乙酰基半乳糖胺的6位上的酶。本实施例中，还对作为4位硫酸转移酶的GalNAc-4ST1、GalNAc-4ST2家族的作用进行了研究。利用与实施例6相同的方法制作肠道纤维形成模型。在第7天处死小鼠。本实施例中，不仅混合GalNAc 4S-6STsiRNA、还混合GalNAc 4ST-1和GalNAc 4ST-2(Gene world公司制)，按每只小鼠1μg混合作为介质的1％去端肽胶原(高研公司制)200μL，将该混合物进行腹腔内投予。将该siRNA投予组记为GalNAcST siRNA投予组。对照组与实施例6相同。本实施例中所使用的GalNAc 4S-6ST siRNA、GalNAc 4ST-1、GalNAc 4ST-2的碱基序列如下所示。序列并非仅限定于本例。
[GalNAC 4ST-1 siRNA混合(鸡尾酒)序列](GenBank登录号NM_175140)(Gene world公司制)
5’-ACCCCCAACTCGGAACGATGCGGCT-3’(序列号：35)
5’-TGCATGTTCTCGTCCATCCTGCTG-3’(序列号：36)
5’-CGCCACCGTGTACTGTACTGTGAAGT-3’(序列号：37)
5’-AGGCT GCTCCAACTG GAAGAGGGTG-3’(序列号：38)
[GalNAC4ST-2 siRNA混合序列](GenBank登录号NM_199055)(Geneworld公司制)
5’-ATATAGTATCTAGGATATATGTAG-3’(序列号：39)
5’-GAAGTACCAAAAGCTGGCTGCTCTA-3’(序列号：40
5’-TTCTATCACTTGGACTATTTGATGTT-3’(序列号：41)
5’-TACACAACTCCACATTTGTAATTTG-3’(序列号：42)
[GalNAc 4S-6ST siRNA混合序列](GenBank登录号NM_029935)(Gene world公司制)
5’-CCAGAAGCCAAGCTCATTGTTATG-3’(序列号：43)
5’-CTGTGGAGAGGTTGTACTCAGACTA-3’(序列号：44)
5’-ATTTGCCTGGAAGACAACGTGAGAGC-3’(序列号：45)
5’-GTCCCTTCTGCAGAAGCTGGGCCCACT-3’(序列号：46)
小鼠肠道纤维形成模型中，如实施例6～10详细地探讨所示，组织的纤维性变化由于集中在大肠长度上，因此本实施例中，以第7天的大肠长度作为决定性的评价点。GalNAcST siRNA投予组与对照组相比，显著地(p＜0.01、t检验)抑制了大肠的短缩(图11)。因此可知，通过抑制GalNAc4ST-1、GalNAc 4ST-2基因的表达，可以抑制肠道纤维形成。
本发明的药剂例如作为肠道纤维形成抑制剂是有用的。
〔肺组织〕
实施例12：小鼠肺气肿模型的C6ST-1 siRNA在肺泡间质的效果
本实施例中使用作为基本肺气肿小鼠模型的猪胰腺来源弹性蛋白酶(PPE)气管内投予模型。虽然该小鼠模型很传统，但重现性优异且简单，因此作为肺气肿模型被广泛使用。由于组织学上确认了炎症细胞向肺泡间质的浸润，因此除了在肺气肿或慢性支气管炎等慢性阻塞性肺病(COPD：chronic obstructive pulmonary disease)之外，在特发性间质性肺炎(IIPs：idiopathic interstitial pneumonias)、尘肺、肺结核后遗症等引起慢性呼吸衰竭的疾病的组织所见中也可见(Karlinsky JB et al Am Rev Respir Dis 1978；117：1109-1133.、Otto-Verberne CJ et al Protective effect of pulmonary surfactant on elastase-induced emphysema in mice.Eur Respir J 1992；5：1223-1230.、Janoff A et al Prevention of elastase-induced experimental emphysema by oral administration of a synthetic elastase inhibitor.Am Rev Respir Dis 1980；121：10251-1029.、Christensen TG，et al.Irreversible bronchial goblet cell metaplasia in hamsters with elastase-induced panacinar emphysema.J Clin Invest 1977；59：397-404.、Lucey EC，et al.Remo deling of alveolar walls after elastase treatment of hamsters：results of elastin andcollagen mRNA in situ hybridization.Am J Respir Crit Care Med 1998；158：555-564.、Snider GL，Lucey EC，Stone PJ.Animal models of emphysema.Am Rev Respir Dis1986；133：149-169.)。
本实施例中，使用肺气肿模型小鼠的肺组织样品进行苏木精-曙红染色(HE染色)，对C6ST-1 siRNA的气肿性病变抑制效果进行比较研究。
最初是小鼠模型的制作，对C57BL6/J小鼠(雌性、5～6周龄、日本CLEA公司制)气管内投予PPE(4个单位；Calbiochem-Novabiochem公司制)。投予后饲养3周，采集肺组织。对照组使用同样的小鼠，但未投予PPE。
C6ST-1 siRNA的投予与实施例1同样地进行。在PPE投予后每周腹腔内投予混合了C6ST-1 siRNA 1μg(ambion公司制)和作为siRNA介质的1％去端肽胶原(高研公司制)的混合物。投予量为200μL/小鼠。
*[C6ST-1 siRNA混合序列](GenBank登录号NM_016803)
5’-gcgccccctctccccatggagaaag-3’(序列号：47)
5’-gctttgcctcaggatttccgggacc-3’(序列号：48)
5’-ggttcagccttggtctaccgtgatgtc-3’(序列号：49)
5’-gcagttgttgctatgcgacctgtat-3’(序列号：50)
将所采集的右肺组织包埋于冷冻用包埋剂OCT COMPOUND(Miles公司制)，使用液氮制作冷冻块。使用低温恒温器(Microm公司制)由该冷冻块制作厚度为6μm的切片。
用1％戊二醛(Nacalai Tesque公司制)固定所得切片10分钟后，再用甲醛钙液固定10分钟。用磷酸缓冲液洗涤后，利用Lillie-Mayer hematoxylin液(Sigma Aldrich Japan公司制)在室温下染色5分钟，使用脱色液(含0.5％HCL的70％乙醇、均使用Nacalai Tesque公司制试剂制作)轻轻地洗涤。之后水洗10分钟。利用曙红酒精溶液在室温下染色5分钟，水洗10分钟。用100％乙醇轻轻地洗涤后静置3分钟。然后利用二甲苯(Nacalai Tesque公司制)轻轻地洗涤后静置10分钟。使用光学显微镜(Leica公司制)对该标本进行观察，确认组织的样子。
所得组织图示于图12。在对照组(PPE未投予小鼠)的所见中，可以确认蜂巢样的肺泡隔壁为特征性的正常肺实质的组织。但是，在中央照片所示的未治疗组(PPE投予、C6ST-1 siRNA未投予)中，可观察到作为肺气肿特征所见的伴随肺泡隔壁的破坏消失和气腔扩大的气肿性病变。与此相对，在酶治疗组(PPE投予、C6ST-1 siRNA投予)中虽然观察到若干的肺泡隔壁的消失和气肿性病变，但可观察到其程度被大幅度改善。
实施例13：小鼠肺气肿模型的C6ST-1 siRNA所产生的肺间质纤维化 抑制效果
本实施例中，利用实时定量PCR法探讨C6ST-1 siRNA投予所导致的肺泡间质的纤维化相关基因表达。
利用与实施例12相同的方法制作COPD模型。将所采集的肺组织的一部分放入1.5ml管中，利用液氮进行冷冻。利用与实施例1相同的方法进行cDNA合成，进行定量PCR。I型胶原和α-SMA的引物序列、PCR循环相同。以下示出C6ST-1的引物的序列。
[定量PCR引物序列]
* 小鼠C6ST-1(Takara Bio公司制)
正向：5’-TGTTCCTGGCATTTGTGGTCATA-3’(序列号：51)
反向：5’-CCAACTC GCTCAGGGACAAGA-3’(序列号：52)
将结果示于图13。本模型中，C6ST-1基因的表达增强，但可以确认通过C6ST-1 siRNA治疗，将其显著地(p＜0.01、t检验)抑制。另外，通过C6ST-1 siRNA，也显著地(均为p＜0.01、t检验)抑制了作为纤维化指标的I型胶原及α-SMA的表达增强。本结果表示，通过抑制C6ST-1的表达，可以有效地抑制肺间质的纤维性变化的增强。
本发明的药剂例如作为肺间质的纤维性变化抑制剂是有用的。
实施例14：小鼠肺气肿模型的C6ST-1 siRNA的组织学纤维芽细胞浸 润抑制效果
利用与实施例12相同的方法制作肠道纤维形成模型。利用与实施例3相同的方法将所采集的肺组织制作冷冻块及组织切片。用丙酮(和光公司制)将所得切片固定10分钟后，利用磷酸缓冲液洗涤，添加作为一抗的抗ER-TR7抗体(大鼠单克隆抗体、1μg/ml、BMA公司制)，在室温下反应1小时。接着，使用过氧物酶标记抗大鼠IgG(1∶200稀释)进行二抗反应后，添加DAB底物(Nichirei Biosciences公司制)使其显色。之后利用Lillie-Mayer hematoxylin(武藤化学公司制)进行核染色，在光学显微镜(Leica公司制)下观察试样，观察以茶色信号可视化的抗体结合。
结果是对照组中可见纤维芽细胞强烈地聚集在肺泡隔壁发生了破坏的间质(图14、对照组的图左)。另外，在肺泡隔壁正被破坏的部位的间质上也可见大量的聚集(图14、对照组的图右)，因此在COPD等病态中获得了从纤维芽细胞的过量聚集导致肺泡壁破坏过程的预想之外的结果。另一方面，C6ST-1 siRNA治疗组中明显地抑制了纤维芽细胞向肺泡组织间质的浸润(图14)。因此可知，通过C6ST-1基因表达抑制，抑制了肺泡组织间质的纤维芽细胞的浸润及锚定，从而减轻了纤维性变化的增强。
本发明的药剂例如作为肺泡组织间质的纤维芽细胞浸润或锚定抑制剂是有用的。
实施例15：小鼠肺气肿模型的C6ST-1 siRNA的组织学巨噬细胞浸润 抑制效果
利用与实施例12相同的方法制作COPD模型。利用与实施例3相同的方法将所采集的肺组织制作冷冻块及组织切片。用丙酮(和光公司制)将所得切片固定10分钟后，利用磷酸缓冲液洗涤，添加作为一抗的抗F4/80抗体(clone A3-1、大鼠单克隆抗体、2μg/ml、CALTAG LABORATORIES公司制)，在室温下反应1小时。接着，使用过氧物酶标记抗大鼠IgG(1∶200稀释)进行二抗反应后，添加DAB底物(Nichirei Biosciences公司制)使其显色。之后利用Lillie-Mayer hematoxylin(武藤化学公司制)进行核染色，在光学显微镜(Leica公司制)下观察试样，观察以茶色信号可视化的抗体结合。
结果是，C6ST-1 siRNA治疗组与对照组相比，明显地抑制了巨噬细胞向肺泡间质的浸润(图15)。因此可知，通过C6ST-1基因表达抑制，抑制了巨噬细胞和纤维芽细胞这样的使纤维性变化持续并增强的责任细胞组的浸润，综合地抑制了组织的纤维性变化。
本发明的药剂例如作为巨噬细胞向肺泡间质的浸润抑制剂是有用的。
实施例16：小鼠肺气肿模型的C6ST-1 siRNA的呼吸功能保存效果
本实施例中，为了探讨C6ST-1 siRNA的肺气肿模型小鼠的临床效果，以静态肺顺应性(statistic compliance：Cst)为指标，对于对呼吸功能造成的影响进行评价。Cst表示肺组织的易伸展性，作为伴随肺泡区域组织破坏的疾病的肺气肿的Cst提高。
利用与实施例12所示方法相同的顺序制作肺气肿模型小鼠，利用C6ST-1 siRNA进行治疗。使用麻醉药使这些小鼠的自主呼吸停止后，使用FlexiVent(SCIREQ公司制)呼吸功能解析装置的P-V roop mode测定Cst。小鼠和FlexiVent的连接使用以下的方法进行：在小鼠的自主呼吸停止后，进行正中切开，在气管内插入专用的插管，将支气管周围结扎。
本实施例的结果示于图16。对照组为42.62±2.25μL/cmH2O，未治疗组为51.22±5.2μL/cmH2O(vs对照组P＝0.03，t检验)，可见统计学上显著的增加。另外，C6ST-1 siRNA投予组的Cst为42.92±1.82μL/cmH2O(vs未治疗组P＝0.03，t检验)，与未治疗组相比，显著地降低。
因此，C6ST-1 siRNA投予组显著地抑制了伴随通过PPE气管内投予所诱发的肺气肿的Cst增加。另外，本实施例所示的结果表明，通过抑制C6ST-1的基因表达，不仅具有抑制伴随肺组织的间质纤维性变化的肺泡破坏的效果，还具有改善实际的临床症状(呼吸状态)的效果。
本发明的药剂例如作为肺泡破坏抑制剂是有用的。
实施例17：小鼠肺气肿模型的C6ST-1 siRNA的组织保存效果
在作为特征性病理现象显示肺泡的气腔扩大的肺气肿中，随着气肿性病变的发展，肺容量增加。本实施例的目的是确证C6ST-1 siRNA的治疗效果不仅抑制在细胞水平上的破坏、而且还涉及到脏器的形态维持和保存。
本实施例中所使用的肺组织使用在实施例12中使用过的肺组织的右肺来进行。利用磷酸缓冲液轻轻洗涤从小鼠摘出的肺组织后，放入在相同玻璃容器中装满的磷酸缓冲液中。预先测定装满磷酸缓冲液的玻璃容器的重量，将在容器内装入肺组织后所增加的重量换算成液量，作为肺容量。
本实施例的结果示于图17。对照组的肺容量为277.5±61.85μL，未治疗组为413.33±77.67μL(vs对照组P＝0.024，t检验)，可见统计学上显著的肺容量增加。另外，C6ST-1 siRNA治疗组的肺容量为292.5±51.23μL(vs未治疗组P＝0.027，t检验)，与未治疗组相比，可见肺容量显著地降低。
综合这些结果，通过抑制C6ST-1的基因表达，有效地抑制了伴随通过PPE的气管内投予所诱发的肺气肿的肺容量增加。因此显示出，不仅抑制在细胞水平上的破坏，还具有脏器的形态维持和保存的效果或者被破坏的组织的修复效果。
本发明的药剂例如作为伴随肺气肿的肺容量增加抑制剂是有用的。
实施例18：小鼠肺气肿模型的GalNAcST siRNA所产生的肺间质纤维 化抑制效果
用另一个实施例来显示4位和6位硫酸化是重要的。本实施例中，利用与实施例11相同的方法，通过实时定量PCR法探讨GalNAcST siRNA投予所导致的肺泡间质的纤维化相关基因表达。siRNA的序列与实施例11相同。
利用与实施例12相同的方法制作肺气肿模型。将所采集的肺组织的一部分放入1.5ml管中，利用液氮进行冷冻。利用与实施例1相同的方法进行cDNA合成，进行定量PCR。引物的序列、PCR循环与实施例1以及13相同。TGF-β的序列如下所示。
[定量PCR引物序列]
* 小鼠TGF-β(Takara Bio公司制)
正向：5’-GTGTGGAGCAACATGTGGAACTCTA-3’(序列号：53)
反向：5’-TTGGTTCAGCCACTGCCGTA-3’(序列号：54)
将结果示于图18。本实施例中，作为纤维化指标的I型胶原、α-SMA以及TGF-β的表达增强被GalNAcST siRNA显著地(均为p＜0.01、t检验)抑制。该结果表明，通过抑制GAlNAc4ST-1、GAlNAc4ST-2以及GAlNAc4S-6ST的表达，有效地抑制了肺间质的纤维性变化的增强。
本发明的药剂例如作为肺间质的纤维性变化抑制剂是有用的。
实施例19：小鼠肺气肿模型的GalNAcST siRNA的呼吸功能保存效果
本实施例中，为了探讨GalNAcST siRNA在肺气肿模型小鼠的临床效果，以静态肺顺应性(statistic compliance：Cst)为指标，对于对呼吸功能造成的影响进行评价。
利用与实施例12所示方法相同的顺序制作肺气肿模型小鼠，利用GalNAcST siRNA进行治疗。使用麻醉药使这些小鼠的自主呼吸停止后，使用FlexiVent(SCIREQ公司制)呼吸功能解析装置的P-V roop mode测定Cst。小鼠和FlexiVent的连接使用以下的方法进行：在小鼠的自主呼吸停止后，进行正中切开，在气管内插入专用的插管，将支气管周围结扎。
本实施例的结果示于图18。对照组为42.62±2.25μL/cmH2O、未治疗组为51.22±5.2μL/cmH2O(vs对照组P＝0.03，t检验)，可见统计学上显著的增加。另外，C6ST-1 siRNA投予组的Cst为44.15±2.29μL/cmH2O(vs未治疗组P＝0.0018，t检验)，与未治疗组相比，显著地降低。
因此可知，GalNAcST siRNA投予组显著地抑制了伴随通过PPE气管内投予所诱发的肺气肿的Cst增加。另外，本实施例所示的结果表明，通过抑制GAlNAc4ST-1、GAlNAc4ST-2以及GAlNAc4S-6ST的基因表达，不仅具有抑制伴随肺组织的间质纤维性变化的肺泡破坏的效果，还具有改善实际的临床症状(呼吸状态)的效果。
本发明的药剂例如作为肺泡破坏抑制剂或呼吸状态改善剂是有用的。
实施例20：小鼠肺气肿模型的GalNAcST siRNA的组织保存效果
本实施例的目的是确证GalNAcST siRNA的治疗效果不仅是抑制在细胞水平上的破坏、而且还涉及脏器的形态维持和保存的效果。
本实施例中所使用的肺组织使用在实施例12中使用过的肺组织的右肺来进行。利用磷酸缓冲液轻轻洗涤从小鼠摘出的肺组织后，放入在相同玻璃容器中装满的磷酸缓冲液中。预先测定装满磷酸缓冲液的玻璃容器的重量，将在容器内装入肺组织后所增加的重量换算成液量，作为肺容量。
本实施例的结果示于图20。对照组的肺容量为277.5±61.85μL，未治疗组为413.33±77.67μL(vs对照组P＝0.024，t检验)，可见统计学上显著的肺容量增加。另外，GalNAcST siRNA治疗组的肺容量为315±51.96μL(vs未治疗组P＝0.049，t检验)，与未治疗组相比，可见肺容量显著地降低。
综合这些结果，通过抑制GAlNAc4ST-1、GAlNAc4ST-2以及GAlNAc4S-6ST的基因表达，有效地抑制了伴随通过PPE的气管内投予所诱发的肺气肿的肺容量增加。因此，不仅抑制了在细胞水平上的破坏，而且还具有脏器的形态维持和保存的效果或者被破坏的组织的修复效果。
本发明的药剂例如作为肺的形态维持剂或肺的形态保存剂是有用的。
〔胰腺组织〕
以下的实施例中，通过出生后第2天的C57BL/6JcL小鼠(雌性、日本CLEA公司制)的链脲佐菌素投予来制作2型糖尿病模型，探讨C4ST-1(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶1)siRNA、C4ST-2(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶2)siRNA、C4ST-3(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶3)siRNA处置所导致的体重变化、血糖值变化、基因表达或胰腺组织的纤维性变化。各siRNA的投予方法利用与实施例1相同的方法进行。以下示出序列。
*[C4ST-1 siRNA混合序列]
C4ST1(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶1)(GenBank登录号NM_021439)
5’-ACAAAGCCATGAAGCCGGCGCTGCTGGAAGTGATGAGGATGAACAGAATT-3’(序列号：55)
5’-CAACCTGAAGACCCTTAACCAGTACA-3’(序列号：56)
5’-GCATCCCAGAGATCAACCACCGCTTG-3’(序列号：57)
*[C4ST-2 siRNA混合序列]
C4ST2(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶2)(GenBank登录号NM_021528)
5’-GCCAGGAGTGGGCCCAGCCCAGGGC-3’(序列号：58)
5’-ATGACCAAGCCGCGGCTCTTCCGGCTG-3’(序列号：59)
5’-AGAGCCTGCTGGACCGGGGCAGCCCCTA-3’(序列号：60)
5’-GAGACCCCCTGGACATCCCCCGGGAACA-3’(序列号：61)
*[C4ST-3 siRNA混合序列]
C4ST3(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶3)(GenBank登录号XM_355798)
5’-ATGACTGTCGCCTGCCACGCGTGCCA-3’(序列号：62)
5’-CAGCATGGGAAGACGCTCCTGTTGCA-3’(序列号：63)
5’-TCCAAGCGCAATCCCTGCGCACGAGGCG-3’(序列号：64)
5’-GCCTGGCCTGCTGCCCTCGCTGGCC-3’(序列号：65)
首先，为了制备样品，如下进行。
实施例21：利用链佐星诱发性C57BL/6JcL 2型糖尿病模型小鼠的 C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA处置时的抗肥胖效果的探 讨
对妊娠第14天的C57BL/6JcL小鼠(日本CLEA公司制)进行饲养并使其生产，对出生后第2天的C57BL/6JcL雌性小鼠以20μL/只分别皮下注射链佐星10mg/mL(SIGMA公司制)，给予CE-2(日本CLEA公司制)的饲料、灭菌水，饲养直至达到4周龄，从4周龄开始给予高脂饮食(日本CLEA公司制)、灭菌水，饲养2周。在第2周，将siRNAC4ST-1(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶1)、C4ST-2(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶2)、C4ST-3(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶3)1μg(GeneWorld公司制)与作为siRNA介质的1％去端肽胶原(高研公司制)相混合，将该混合物每周1次地腹腔内投予200μL，进行2次(2周)处置。在实验第14天尾静脉投予处置BrdU 5mg/mL(ZyMED Laboratory.Inc公司制)，1小时后进行解剖，摘出肝脏、胰腺、肾脏、睾丸、卵巢、肌肉，获得免疫染色用样品、基因表达解析用样品。对于体重变化，在实施例期间经时地测定14天。
图21显示结果。纵轴表示体重(g)、横轴表示测定天数(days)。由图21可知，与对照组相比，C4ST-1 siRNA处置组、C4ST-2 siRNA处置组、C4ST-3 siRNA处置组在处置第10天后有抑制体重增加的倾向。C4ST-2 siRNA处置组、C4ST-3 siRNA处置组在处置第18天显著地(均为p＜0.05)抑制了体重增加。该结果表示，通过抑制C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3的表达，可以抑制伴随2型糖尿病的肥胖。
本发明的药剂例如作为体重增加抑制剂或伴随2型糖尿病的肥胖抑制剂是有用的。
实施例22：利用链佐星诱发性C57BL/6JcL 2型糖尿病模型小鼠的 C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA处置时胰岛素抵抗性的探 讨
在解剖前一天，作为胰岛素抵抗性试验(Insulin-tolerance test)，腹腔内投予处置人结晶胰岛素(0.75U/kg)，使用Glu-Test Ace血糖值测定器(BOMBYX药品公司制)测定0分钟后、15分钟后、60分钟后的血糖值来进行评价。将siRNA处置后的0分钟后、15分钟后、60分钟后的血糖值变化示于图22。纵轴表示血糖值(mg/dL)、横轴表示胰岛素抵抗性试验后、0分钟后、15分钟后、60分钟后。
由图22可知，与对照组相比，虽然C4ST-1 siRNA处置组、C4ST-2 siRNA处置组、C4ST-3 siRNA处置组在处置后、0分钟后、15分钟后未见显著的血糖值减少，但在60分钟后在C4ST-1 siRNA处置组、C4ST-2 siRNA处置组、C4ST-3 siRNA处置组分别可见显著的血糖值减少。该结果表示，通过C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3的表达抑制，可有效地改善作为2型糖尿病的本质性功能障害的胰岛素抵抗性。
本发明例如作为2型糖尿病的胰岛素抵抗性改善剂是有用的。
实施例23：利用链佐星诱发性C57BL/6JcL 2型糖尿病模型小鼠的 C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA处置时胰腺组织基因表达 的探讨
相对于每50mg从链佐星诱发性C57BL/6JcL雌性小鼠摘出的脏器(胰腺)，与实施例1同样地制备cDNA，按以下组成进行PCR反应。
混合PCR缓冲液2μL[组成：166mM(NH4)2SO4(Sigma Aldrich Japan公司制)、670mM Tris pH8.8(Invitrogen公司制)、67mM MgCl2·6H2O(Sigma Aldrich Japan制)、100mM 2-巯基乙醇](WAKO公司制)]、25mM dNTP mix 0.8μL(Invitrogen公司制)、DMSO 0.6μL(Sigma Aldrich Japan公司制)、正向引物0.2μL(GeneWorld公司制)、反向引物0.2μL(GeneWorld公司制)、大塚蒸馏水15.7μL(大塚制药公司制)、Taq聚合酶0.1μL(Perkin Elmer公司制)、上述所得的cDNA 1μL，通过自动基因扩增仪(eppendorf公司制))使其进行94℃：45秒、56℃：45秒、72℃：60秒的35个循环。反应结束后，在所得PCR产物中加入2μL Loading Dye(Invitrogen公司制)，制作1.5％UltraPure Agarose(Invitrogen公司制)凝胶、利用Mupid-2 plus(ADVANCE公司制)进行100V、20分钟的电泳。电泳后，使用1×LoTE[组成：3mM Tris-HCl(pH7.5)(Invitrogen公司制)、0.2mM EDTA(pH7.5)(Sigma Aldrich Japan公司制)]在10000倍稀释的溴化乙锭(Invitrogen公司制)染色液中振荡20分钟～30分钟，然后使用设置于I-Scope WD(ADVANCE制)的EXILIM(CASIO公司制)进行凝胶拍照，确认基因表达。
以下示出此次所用的引物(正向、反向)(GeneWorld公司制)。
[引物序列]
*GAPDH
正向：5’-CTGCCAAGTATGACATCA-3’(序列号：66)
反向：5’-TACTCCTTGGAGGCCATGTAG-3’(序列号：67)
*C4ST1(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶1)
正向：5’-gtggatgaggaccacgaact-3’(序列号：68)
反向：5’-cttttcaagcggtggttgat-3’(序列号：69)
*C4ST2(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶2)
正向：5’-acctcctagacccacacacg-3’(序列号：70)
反向：5’-ggatgttggcaaaccagtct-3’(序列号：71)
*C4ST3(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶3)
正向：5’-atgagcccttcaacgaacac-3’(序列号：72)
反向：5’-tggtagaaggggctgatgtc-3’(序列号：73)
将结果示于图23。通过RT-PCR，作为阳性对照(Positive control)的GAPDH的表达分别在对照组、C4ST1(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶1)、C4ST2(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶2)、C4ST3(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶3)中可见，与对照组相比，C4ST1(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶1)siRNA、C4ST2(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶2)siRNA、C4ST3(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶3)siRNA处置组可见表达减少，通过去端肽胶原介质C4ST1(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶1)siRNA、C4ST2(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶2)siRNA、C4ST3(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶3)siRNA投予，可确认C4ST1(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶1)、C4ST2(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶2)、C4ST3(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶3)基因的抑制。
实施例24：利用链佐星诱发性C57BL/6JcL 2型糖尿病模型小鼠的 C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA处置时胰腺淀粉样前体蛋 白质蓄积的探讨
本实施例中，使用2型糖尿病模型小鼠的胰腺组织样品，对C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA的淀粉样前体蛋白质(APP：Amyloid precursor protein)沉积抑制效果进行了比较研究。早就已知β细胞存在的胰岛中的APP、淀粉样纤维的沉积是2型糖尿病的重要病理组织所见，近年来还已知其与阿尔茨海默病有关(Johnson KH et al.N Eng J Med 321：513，1989.、Rhodes CJ.Science 307：380，2005.、Haan MN.Nat Clin Pract Neurol3：159，2006.、Prentki M et al.J Clin Invest 116：1802，2006.)。
利用与实施例3相同的方法，将所得组织样品切片使用抗淀粉样前体蛋白山羊抗体(calbiochem公司)进行染色，对组织水平的表达进行评价和探讨。图24表示正常小鼠组、对照组、C4ST-2 siRNA处置组的组织图像。2型糖尿病模型小鼠的胰岛上APP的沉积有所增强，但与对照组相比，C4ST-2 siRNA处置组中可见明显地被抑制。
本发明的药剂例如作为淀粉样纤维沉积抑制剂是有用的。
实施例25：利用链佐星诱发性C57BL/6JcL 2型糖尿病模型小鼠的 C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA处置时组织学纤维芽细胞 浸润抑制效果
利用与实施例3相同的方法将所采集的胰腺组织制作冷冻块和组织切片。用丙酮(和光公司制)将所得切片固定10分钟后，用磷酸缓冲液进行洗涤，添加作为一抗的抗ER-TR7抗体(大鼠单克隆抗体、1μg/ml：BMA公司制)，在室温下使其反应1小时。接着，使用过氧物酶标记抗大鼠IgG(1∶200稀释)进行二抗反应后，添加DAB底物(Nichirei Biosciences公司制)使其显色。之后，利用Lillie-Mayer hematoxylin(武藤化学公司制)进行核染色，在光学显微镜(Leica公司制)下观察试样，观察以茶色的信号可视化的抗体结合。
结果是，C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA各治疗组与对照组相比，明显地抑制了纤维芽细胞向胰腺胰岛的浸润(图25)。因此可知，通过C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3基因表达抑制，抑制了纤维芽细胞向β细胞布局部存在的胰岛的浸润和锚定，从而减轻了组织的纤维性变化的增强。
本发明的药剂例如作为对胰岛的纤维芽细胞浸润抑制剂是有用的。
实施例26：利用链佐星诱发性C57BL/6JcL 2型糖尿病模型小鼠的 C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA处置时组织学巨噬细胞浸 润抑制效果
利用与实施例3相同的方法将所采集的胰腺组织制作冷冻块和组织切片。用内酮(和光公司制)将所得切片固定10分钟后，用磷酸缓冲液进行洗涤，添加作为一抗的抗F4/80抗体(clone A3-1、大鼠单克隆抗体、2μg/ml：CALTAG LABORATORIES公司制)，在室温下使其反应1小时。接着，使用过氧物酶标记抗大鼠IgG(1∶200稀释)进行二抗反应后，添加DAB底物(Nichirei Biosciences公司制)使其显色。之后，利用Lillie-Mayer hematoxylin(武藤化学公司制)进行核染色，在光学显微镜(Leica公司制)下观察试样，观察以茶色的信号可视化的抗体结合。
结果是，C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA各治疗组与对照组相比，明显地抑制了巨噬细胞向肺泡间质的浸润(图26)。因此可知，通过C6ST-1基因表达抑制，抑制了巨噬细胞和纤维芽细胞这样使纤维性变化持续和增强的责任细胞组的浸润，综合地抑制了组织的纤维性变化。
本发明的药剂例如作为对肺泡间质的巨噬细胞浸润抑制剂是有用的。
实施例27：利用链佐星诱发性C57BL/6JcL 2型糖尿病模型小鼠的 GalNAcST siRNA处置时胰岛素抵抗性的探讨
为了表示4位和6位硫酸化是重要的，再示出另一个实施例。本实施例中，利用与实施例11、实施例18相同的方法探讨利用GalNAcST siRNA投予所产生的胰岛素抵抗性的改善。利用与实施例21相同的方法制作2型糖尿病模型，利用与实施例22相同的方法检查胰岛素抵抗性。将结果示于图27。
通过GalNAcST siRNA投予，可见胰岛素负荷后的良好的血糖降低作用。本结果表示，通过抑制GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GalNAc4S-6ST的表达，可以有效改善伴随胰腺组织胰岛的纤维性变化的胰岛素抵抗性。
本发明的药剂例如作为血糖降低剂或胰腺组织的胰岛素抵抗性改善剂是有用的。
〔肾脏组织〕
肾脏组织的纤维性变化认为是所有肾疾病的终结点。从传统上来说，1)间质性肾疾病(tubulointerstitial disease)是肾纤维形成的代表性疾病。其除了药源性、感染性、放射线性、重金属性间质性肾障碍之外，还包含干燥综合征或移植排斥反应(慢性移植物肾病等)、移植物抗宿主反应(移植物抗宿主病等)等。接着，可举出2)血管性肾疾病。除了伴随所谓高血压的肾硬化症之外，近年来还包含伴随动脉硬化症、代谢综合征的纤维形成。进而，即便是肾小球原发疾病，也会产生蛋白尿等结果、间质的纤维形成，从而导致慢性肾功能不全，因此还有3)原发性肾小球疾病、以及4)继发性肾小球疾病的肾纤维性变化。3)中还包含IgA肾病、微小病变型肾病综合症、膜性肾病、膜性增生性肾炎、局灶节段性肾小球硬化(FGFS)，4)中还包含糖尿病性肾病、伴随SLE(系统性红斑狼疮)的狼疮肾炎、伴随慢性类风湿性关节炎的肾病、淀粉样肾病、伴随B型肝炎或C型肝炎的肾病等。最后可举出5)伴随尿路梗阻的间质性肾疾病，其包含尿路结石、肿瘤、神经原性膀胱功能障碍等。
近年来，作为根据肾功能的程度进行分类-诊断的临床的疾病概念，将这些疾病组统称为慢性肾病(CKD)。CKD随着间质的纤维性变化而缓慢发展，导致慢性肾功能不全、ESRD(终末期肾疾病)。一直以来，对于ESRD，仅人工透析是决定性的治疗方法。通过使用血管紧张素系的降压剂，也可能减缓向ESRD的发展，但仍未确立以肾纤维形成本身为靶标的治疗法。迫切希望对CKD的新型治疗，由该病态发展过程以纤维性变化作为治疗靶标，作为与原发疾病种类无关而通用的治疗战略具有决定性意义。据报告，CKD在全世界上存在5亿人的患者、随着生活习惯的变化，预测今后患者数会进一步增加，而且大规模试验表明在接受人工透析之前因心血管障碍而死亡的风险极高，因此将CKD作为21世纪型的疾病来进行积极的治疗变成医疗界的重大课题(Sergio A et al.Hypertension 38：635，2001.、Weiner DE et al.JASN 15：1307，2004.、Anavekar Ns et al.N Eng J Med 351：1285，2004.、Remuzzi G et al.J Clin Invest116：288，2006.、TonelliM et al.BMJ 332：1426，2006.、Khwaja A et al.Kidney International doi：10.1038/sj.ki.5002489)。
本实施例中，探讨修饰4位和6位硫酸基的糖链基因阻碍对肾间质的组织学纤维性变化造成的变化。
实施例28：小鼠糖尿病性肾病模型的C4ST-1 siRNA的抗纤维形成效 果的探讨
利用与实施例28相同的方法制作2型糖尿病模型。对妊娠第14天C57BL/6JcL小鼠(日本CLEA公司制)进行饲养并使其生产，对出生后第2天的C57BL/6JcL小鼠投予链脲佐菌素(STZ：Sigma公司制)，制作STZ诱发糖尿病模型。对小鼠皮下注射STZ(10mg/ml)20μl，2天内共计进行3次，共投予60μl。将其与小鼠母亲一起用通常饲料饲养至4周龄，在满4周龄时使其离乳后，给予高脂饮食(日本CLEA公司制)，饲养2周。在第2周，将混合有C4ST-1(软骨素D-N-乙酰基半乳糖胺-4-O-磺基转移酶1)siRNA 1μg(GeneWorld公司制)和作为siRNA介质的0.1％去端肽胶原(高研公司制)的混合物每周1次地腹腔内投予200μL(1次/1周)，进行2次(2周)处置。在实验第14天进行解剖，摘出肾脏，获得免疫染色用样品。有关基因表达或体重、胰岛素抵抗性的效果如实施例21、22、23记载所述。
用丙酮(和光公司制)将所得肾脏组织样品切片固定10分钟后，用磷酸缓冲液进行洗涤，添加作为一抗的抗ER-TR7抗体(大鼠单克隆抗体、1μg/ml、BMA公司制)，在室温下使其反应1小时。接着，使用过氧物酶标记抗大鼠IgG(1∶200稀释)进行二抗反应后，添加DAB底物(Nichirei Biosciences公司制)使其显色。之后，利用Lillie-Mayer hematoxylin(武藤化学公司制)进行核染色，在光学显微镜(Leica公司制)下观察试样，观察以茶色的信号可视化的抗体结合。
结果是，C4ST-1 siRNA治疗组与对照组相比，肾皮质及髓质中纤维芽细胞(ER-TR7阳性细胞)的浸润少(图28、原图为彩色)。另外，为了对炎症性细胞的纤维形成进行定量，计数ER-TR7阳性细胞。在显微镜下以400倍对各个标本观察10个视野，对阳性细胞数进行计数，比较对照组和C4ST-1 siRNA投予组。结果是，与对照组相比，C4ST-1 siRNA治疗组的ER-TR7的阳性率显著地降低(p＜0.001)。
实施例29：小鼠糖尿病性肾病模型的C4ST-1 siRNA的巨噬细胞浸润 效果的探讨
用丙酮(和光公司制)将所得肾脏组织样品切片固定10分钟后，用磷酸缓冲液进行洗涤，添加作为一抗的抗ER-TR7抗体(大鼠单克隆抗体、1μg/ml、BMA公司制)，在室温下使其反应1小时。接着，使用过氧物酶标记抗大鼠IgG(1∶200稀释)进行二抗反应后，添加DAB底物(Nichirei Biosciences公司制)使其显色。之后，利用Lillie-Mayer hematoxylin(武藤化学公司制)进行核染色，在光学显微镜(Leica公司制)下观察试样，观察以茶色的信号可视化的抗体结合。
结果是，C4ST-1 siRNA治疗组与对照组相比，肾皮质及髓质中的巨噬细胞(F4/80阳性细胞)的浸润少(图29、原图为彩色)。另外，与实施例29同样地对组织病变进行定量时，与对照组相比，C4ST-1 siRNA治疗组的巨噬细胞的阳性率显著地降低(p＜0.001)。
实施例30：小鼠糖尿病性肾病模型的C4ST-1 siRNA的组织中纤维芽 细胞活化的探讨
用丙酮(和光公司制)将肾脏组织样品切片固定10分钟后，用磷酸缓冲液进行洗涤，添加作为一抗的抗人平滑肌纤维肌动蛋白抗体(αSMA∶小鼠单克隆抗体、1∶100、DACO公司制)，在室温下使其反应1小时。接着，使用Histofine小鼠染色试剂盒(Nichirei Biosciences公司制)进行二抗反应后，添加DAB底物(Nichirei Biosciences公司制)使其显色。之后，利用Lillie-Mayer hematoxylin(武藤化学公司制)进行核染色，在光学显微镜(Leica公司制)下观察试样，观察以茶色的信号可视化的抗体结合。
结果是，C4ST-1 siRNA治疗组与对照组相比，近肾小球及间质中的αSMA阳性细胞的锚定明显地减少(图30、原图为彩色)。αSMA是纤维芽细胞活化的功能性标记物，该结果表示，通过抑制C4ST-1的基因表达，浸润至组织的纤维芽细胞的活化抑制。
本发明的药剂例如作为纤维芽细胞活化抑制剂是有用的。
实施例31：小鼠糖尿病性肾病模型的GalNAc4S-6ST siRNA的组织中 纤维性变化的探讨
利用与实施例28相同的方法制作糖尿病性肾病模型，探讨GalNAc4S-6ST siRNA的效果。本实施例中更长期地对经过进行观察。GalNAc4S-6ST siRNA的序列与实施例1相同，在8周龄及9周龄时各实施各1次腹腔内投予。进而，作为比较对象，以相同过程进行以30mg/kg的容量经口投予作为血管紧张素II受体阻碍剂(ARB)的Valsartan。在10周龄时，采集用于免疫组织学检查和基因表达检查的肾脏组织。利用与实施例1相同的方法进行肾脏组织的定量PCR，探讨基因表达。本实施例中，作为内部对照，使用36B4，以下示出其序列。
[定量PCR引物序列]
* 小鼠36B4(Takara Bio公司制)
正向：5’-TTCCAGGCTTTGGGCATCA-3’(序列号：74)
反向：5’-ATGTTCAGCATGTTCAGCAGTGTG-3’(序列号：75)
将结果示于图31(其中，GalNAc4S-6ST在图中记为G#1)。糖尿病性肾病模型中，肾脏组织的GalNAc4S-6ST的表达增强，但通过GalNAc4S-6ST siRNA的投予，显著地抑制了肾脏组织中的GalNAc4S-6ST基因表达。进而，显著地抑制了作为纤维化标记物的αSMA和TGFβ的表达增强。对ARB和治疗效果进行比较研究时，对于TGFβ而言，两组均显示抑制效果，未见显著性差异，但对于αSMA而言，GalNAc4S-6ST siRNA投予组与ARB投予组相比，显示了显著性的抑制效果。该结果表明，通过抑制GalNAc4S-6ST的基因表达，可以抑制表示肾脏组织中的纤维性变化的标记物。而且还表明，对于纤维芽细胞的活化(αSMA的增强)而言，GalNAc4S-6ST siRNA的效果显著地优异。
实施例32：小鼠糖尿病性肾病模型的GalNAc4S-6ST siRNA对纤维芽 细胞浸润的探讨
纤维芽细胞在肾组织内的浸润程度利用与实施例28相同的方法加以免疫组织学探讨，并进行定量评价。结果示于图32。通过GalNAc4S-6ST siRNA投予，显著地抑制了纤维芽细胞在肾间质内的浸润。在间质整体的定量检索中，未见与ARB的显著性差异，但在限定于浸润至近肾小球区域的纤维芽细胞的研究中，GalNAc4S-6ST siRNA投予组显示了如图所示的明显的抑制效果。
本发明的药剂例如作为纤维芽细胞的肾间质内浸润抑制剂是有用的。
实施例33：小鼠糖尿病性肾病模型的GalNAc4S-6ST siRNA对巨噬细 胞的探讨
纤维芽细胞在肾组织内的浸润程度利用与实施例29相同的方法加以免疫组织学探讨，并进行定量评价。结果示于图34。通过GalNAc4S-6ST siRNA投予，显著地抑制了巨噬细胞在肾间质内的浸润。在间质整体的定量检索中，未见与ARB的显著性差异，但在限定于浸润至近肾小球区域的巨噬细胞的研究中，GalNAc 4S-6ST siRNA投予组显示了如图所示的明显的抑制效果。
本发明的药剂例如作为巨噬细胞的肾间质内浸润抑制剂是有用的。
实施例34：小鼠糖尿病性肾病模型的GalNAc4S-6ST siRNA对肾小球 基底膜肥厚的探讨
利用与实施例32、33相同的方法进行IV型胶原的免疫染色。添加作为一抗的抗小鼠IV型胶原兔抗血清(LSL公司制)，在室温下反应1小时。接着，使用过氧物酶标记抗兔IgG(1∶200稀释)进行二抗反应后，添加DAB底物(Nichirei Biosciences公司制)使其显色。之后利用Lillie-Mayer hematoxylin(武藤化学公司制)进行核染色，在光学显微镜(Leica公司制)下观察试样，观察以茶色的信号可视化的抗体结合。
为了定量IV胶原的蓄积，测定在肾小球周围以茶色信号可视化的胶原的厚度。在监测器上使用游标卡尺对各个标本在15～20个肾小球中的肾小球周围最肥厚部分的厚度进行测量。结果，与对照组相比，GalNAc4S-6ST siRNA投予组显著地抑制了肾小球基底膜(GBM)的肥厚(图34)。与ARB进行比较时，GalNAc4S-6ST siRNA投予组显示了更有优势地抑制肥厚的倾向。
本发明的药剂例如作为肾小球基底膜肥厚抑制剂是有用的。
实施例35：小鼠糖尿病性肾病模型的GalNAc4S-6ST siRNA对血管紧 张素路径的探讨
对于糖尿病性肾病的纤维形成而言，报告了血管紧张素II的相关性。本实施例中，利用肾脏组织的定量PCR进行血管紧张素路径的探讨。本模型中，血管紧张素原及血管紧张素转换酶(ACE)的表达可见增强(图35)，认为这是增强肾局部的血管紧张素II的要因。在GalNAc4S-6ST siRNA投予组中，可见血管紧张素原和ACE的抑制效果(图35)。由本结果可知，通过利用GalNAc4S-6ST的基因抑制来抑制纤维芽细胞的浸润和活性，对于血管紧张素路径而言，也显示了改善效果。
本发明的药剂例如作为血管紧张素原表达抑制剂或血管紧张素转换酶抑制剂是有用的。
实施例36：小鼠糖尿病性肾病模型的GalNAc4S-6ST siRNA对血清肌 酸酐浓度的探讨
在从糖尿病性肾病发展至ESRD的过程中，由于伴随着肾功能的降低、血清肌酸酐浓度上升，因此是临床上最常用的肾功能标记物。但是，已知在血清肌酸酐上升时，已经导致功能上的肾元的50％功能降低，如何在肌酸酐上升前保护肾功能是临床上很大的课题。
本模型中，在组织学纤维形成已经进行的18周龄，终于可见血清肌酸酐浓度的上升(图36)。与对照组相比，GalNAc4S-6ST siRNA投予组抑制了血清肌酸酐的上升(图36)。本结果表示，通过GalNAc4S-6ST的基因抑制，抑制了肾组织的纤维性变化，从而呈现出抑制血清肌酸酐上升、即抑制肾功能降低这样极为有效的肾保护作用。
本发明的药剂例如作为肾功能降低抑制剂或肾保护剂是有用的。
实施例37：小鼠糖尿病性肾病模型的GalNAcST siRNA的抗纤维化效 果的探讨
用另一个实施例来表示4位及6位硫酸化的重要的。利用与实施例11相同的方法，探讨GalNAcST siRNA投予所导致的肾间质的纤维性变化。GalNAcST siRNA的投予过程与实施例28相同。利用与实施例31相同的方法，进行使用了肾脏组织的定量PCR。本实施例中，内部对照使用β-肌动蛋白，以下示出其序列。
[定量PCR引物序列]
* 小鼠β肌动蛋白(Takara Bio公司制)
正向：5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’(序列号：76)
反向：5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’(序列号：77)
如图37所示，糖尿病性肾病模型的肾组织中可见GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GalNAc4S-6ST的表达增强，但通过GalNAcST siRNA投予，显著地抑制了所有的基因表达。
实施例38：小鼠糖尿病性肾病模型的GalNAcST siRNA的抗纤维形成 以及肾保护作用的探讨
GalNAcST siRNA投予组与对照组相比，还显著地抑制了作为肾组织中的纤维形成标记物的αSMA、TGFβ、CTGF的表达增强(图38)。而且，还显著地抑制了ACE的表达增强。本结果表明，通过抑制GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GalNAc4S-6ST的表达，抑制了肾组织的纤维形成、有助于肾保护。与实施例35的结果相合并可知，即便抑制任一个基因，ACE的降低都很显著，因此还表明具有血压降低作用。
本发明的药剂例如作为降压剂是有用的。
实施例39：小鼠药源性间质性肾炎模型的GalNAc4S-6ST siRNA对基 因表达的探讨
本实施例中，对典型的药源性间质性肾炎的GalNAc4S-6ST siRNA的效果进行探讨。首先制作小鼠模型，对C57BL6/J小鼠(雄性、8周龄、日本CLEA公司制)腹腔内投予阿霉素(15mg/kg；协和发酵公司制)。投予后饲养1周，采集肾脏组织。对照组使用同样的小鼠，但未投予阿霉素，使用同时期购买、饲养的小鼠。
GalNAc 4S-6ST siRNA利用与实施例1相同的方法，在投予阿霉素24小时之前对每只小鼠腹腔内投予混合有GalNAc 4S-6ST siRNA 1μg(北海道System Science公司制)和作为介质的1％去端肽胶原(高研公司制)200μL的混合物。在本实施例的典型性药源性间质性肾炎模型中，也可见肾脏组织的GalNac 4S-6ST的表达增强(图39)，通过GalNAc 4S-6ST siRNA投予，显著地抑制了其表达。
实施例40：小鼠药源性间质性肾炎模型的GalNAc4S-6ST siRNA对基 因表达的探讨
本实施例中，利用与实施例34相同的方法进行I型胶原的免疫染色。添加作为一抗的抗大鼠I型胶原兔抗血清(LSL公司制)，在室温下使其反应1小时。接着，使用过氧物酶标记抗兔IgG(1∶200稀释)进行二抗反应后，添加DAB底物(Nichirei Biosciences公司制)使其显色。之后利用Lillie-Mayer hematoxylin(武藤化学公司制)进行核染色，在光学显微镜(Leica公司制)下观察试样，观察以茶色信号可视化的抗体结合。
将结果示于图40。对照组中，从近肾小球至间质广泛地可见I型胶原的沉积，而GalNac 4S-6ST投予组显著地抑制了沉积。本结果表明，对于药源性间质性肾炎而言，抑制了GalNac4S-6ST的表达，从而可以抑制肾组织的纤维性变化。
本发明的药剂例如作为肾组织的纤维性变化抑制剂是有用的。
实施例41：利用单侧输尿管结扎术(UUO)形成的肾纤维化模型小鼠 的C6ST siRNA的抗纤维化效果的探讨
首先是关于小鼠肾纤维化模型的制作，对C57BL/6JcL小鼠(雌性、8周龄、日本CLEA公司制)进行单侧输尿管结扎术(UUO)，制作肾纤维化模型。该肾纤维症模型小鼠的重现性优异，在小鼠的肾纤维症实验体系中被广泛使用(American journal of pathology 2003 163；4 1261-1273)。在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下将小鼠开腹，使输尿管露出，利用4-0号手术用线将右输尿管结扎2个位置，使用1-0号手术用线将腹膜、皮肤缝合。
作为肾纤维化模型小鼠的典型例，使用利用单侧输尿管结扎术(UUO)形成的肾纤维化模型小鼠，利用PCR法确认C6ST siRNA投予所产生的C6ST表达的抑制效果。对C57BL/6JcL小鼠(雌性、8周龄、日本CLEA公司制)实施UUO，制作肾纤维化模型。另外，在就要实施UUO之前，对小鼠腹腔内注射200μl的C6ST-1 siRNA、C6ST-2 siRNA混合物(1μg/只、GeneWorld公司制)或PBS混合于作为siRNA介质的0.1％去端肽胶原(高研公司制)的混合物。将进行了该处置的小鼠组分为C6ST siRNA组、对照组。在实验第8天进行解剖，摘出UUO施术肾，获得免疫染色用样品、基因表达解析用样品。利用与实施例1相同的方法进行定量PCR。
以下示出此次所用的C6ST-1 siRNA、C6ST-2引物(正向、反向)(GeneWorld公司制)。
[引物序列]
*C6ST1(软骨素6-磺基转移酶-1)
正向：5’-tgtgtggacacacctcccta-3’(序列号：78)
反向：5’-cttcaaaggtccccttcctc-3’(序列号：79)
*C6ST2(软骨素6-磺基转移酶-2)
正向：5’-cagcttgagccatttcaaca-3’(序列号：80)
反向：5’-gggtgaggcctttaggaaac-3’(序列号：81)
[C6ST-1混合序列](GeneBank登录号NM_016803)(Gene world公司制)
5’-gcgccccctctccccatggagaaag-3’(序列号：82)
5’-gctttgcctcaggatttccgggacc-3’(序列号：83)
5’-ggttcagccttggtctaccgtgatgtc-3’(序列号：84)
5’-gcagttgttgctatgcgacctgtat-3’(序列号：85)
[C6ST-2混合序列](GeneBank登录号NM_021715)(Gene world公司制)
5’-tggggagagtgaggattcggtgaa-3’(序列号：86)
5’-cggacgtgggactcgtcgaggacaaag-3’(序列号：87)
5’-cgaaagtacctgcccgcccgtttcgc-3’(序列号：88)
结果可见肾脏中的C6ST-2(G#10)的表达增强(图41、将C6ST-2标记为G#10)。C6ST siRNA治疗组可见表达减少，通过去端肽胶原介质C6ST siRNA投予，确认了C6ST-2基因的抑制(图41)。另外，通过C6ST siRNA投予，还显著地抑制了TGFβ、αSMA、I型胶原、CTGF等纤维形成标记物的表达增强。
实施例42：利用单侧输尿管结扎术(UUO)形成的肾纤维形成模型小 鼠的C6ST siRNA对纤维芽细胞浸润的探讨
使用冷冻用包埋剂OCT COMPOUND(Sakura公司制)将所摘出的组织包埋，利用液氮制作冷冻块，使用低温恒温器(Micro-edge公司制)制作厚度为6μm的切片。利用与实施例28相同的方法，将所得切片使用抗ER-TR7抗体进行免疫染色。在光学显微镜(Leica公司制)下观察试样，观察以茶色信号可视化的抗体结合，并进行定量化。
结果是，对于UUO施术肾而言，C6ST siRNA治疗组与对照组相比，肾间质中的纤维芽细胞的聚集被显著地抑制(图42)。
本发明的药剂例如作为肾间质的纤维芽细胞聚集抑制剂是有用的。
实施例43：利用单侧输尿管结扎术(UUO)所形成的肾纤维形成模型 小鼠的C6ST siRNA对巨噬细胞浸润的探讨
与实施例42同样地用抗F4/80抗体进行免疫染色、定量化。结果是，对于UUO施术肾而言，C6ST siRNA治疗组与对照组相比，肾间质中的巨噬细胞的聚集被显著地抑制(图43)。
本发明的药剂例如作为肾间质的巨噬细胞聚集抑制剂是有用的。
实施例44：利用单侧输尿管结扎术(UUO)所形成的肾纤维形成模型 小鼠的C6ST siRNA对胶原蓄积的探讨
与实施例42同样地用抗IV型胶原抗体进行免疫染色，与实施例34同样地进行定量化。结果是，对于UUO施术肾而言，C6ST siRNA治疗组与对照组相比，肾小球基底膜的纤维性肥厚被显著地抑制(图44)。由此可知，通过抑制C6ST-2的基因表达，可抑制炎症性细胞的浸润、纤维形成。
本发明的药剂例如作为炎症性细胞浸润抑制剂是有用的。
实施例45：利用单侧输尿管结扎术(UUO)所形成的肾纤维形成模型 小鼠的C6ST siRNA对纤维芽细胞活化的探讨
与实施例30同样地用抗αSMA抗体进行免疫染色。结果是，对于UUO施术肾而言，C6ST siRNA治疗组与对照组相比，可见间质、特别是近肾小球区域的αSMA阳性细胞明显减少(图45)。本结果表明，通过抑制C6ST-1以及C6ST-2的基因表达，抑制了聚集于肾间质的纤维芽细胞的活化。
本发明的药剂例如作为肾间质的纤维芽细胞活化抑制剂是有用的。
实施例46：利用单侧输尿管结扎术(UUO)所形成的肾纤维形成模型 小鼠的C6ST siRNA对ACE表达的探讨
同样地使用抗人ACE兔抗体(Santa Cruz公司制)进行免疫染色。结果是，对于UUO施术肾而言，C6ST siRNA治疗组与对照组相比，可见间质、特别是近肾小球区域的ACE阳性细胞的明显减少(图46)。本结果表明，通过抑制C6ST-2的基因表达，抑制了聚集于肾间质的纤维芽细胞的活化，与此同时还抑制了ACE的表达。由于ACE抑制具有血压降低作用，因此本结果也可强烈地认为具有血压下降或动脉硬化抑制作用。
本发明的药剂例如作为动脉硬化抑制剂是有用的。
〔眼组织〕
眼组织与其它脏器同样，对于由于各种原因造成的侵袭会发生纤维性变化，导致视力下降/损失。作为主要的疾病，可举出糖尿病视网膜病变、视网膜静脉闭塞症、早产儿视网膜病变、老年性黄斑变性、视网膜色素变性等，还包括伴随角膜炎症所产生的纤维形成、伴随青光眼的纤维形成、伴随白内障的纤维形成(总论：Fiedlander M.J Clin Invest 117：576-586，2007、Harada T et al.Genes and Dev.21：367-378，2007)。病理组织学上伴随纤维形成的视细胞的损伤和减少是视力降低的重大原因，因此作为用于防止所有眼疾病的视力降低的新型治疗战略，期待抑制眼组织的纤维形成。
本实施例中，以糖尿病性视网膜病变模型中的视网膜的纤维形成及与此相伴的视细胞的损失为中心加以探讨。
实施例47：小鼠糖尿病性视网膜病变模型的GalNAc4S-6ST(G#1)siRNA对胶原聚集的探讨：
对妊娠第14天的C57BL6J/JcL小鼠(日本CLEA公司制)进行饲养并使其生产，对出生后第2天的C57BL6J/JcL雌性小鼠以20μL/只分别皮下注射链脲佐菌素10mg/mL(Sigma公司制)，给予CE-2(日本CLEA公司制)的饲料、灭菌水，饲养至4周龄，从4周龄开始给予高脂饮食(日本CLEA公司制)、灭菌水，饲养2周。在第8周和第9周利用与实施例11相同的方法，将混合有每只小鼠1μg的GalNac4S-6ST(G#1)siRNA(北海道SystemScience公司制)和作为介质的1％去端肽胶原(高研公司制)200μL的混合物腹腔内投予。在第18周，为了探讨GalNac4S-6ST(G#1)siRNA的效果，将两组小鼠的眼球摘出，加以免疫组织学的探讨。
用摘出眼制作冷冻块和切片。用丙酮(Sigma Aldrich Japan公司制)将切片固定10分钟后，利用磷酸缓冲液进行洗涤，然后添加作为一抗的兔来源抗IV型胶原抗血清(1∶2000稀释；LSL公司制)，在室温下反应1小时。接着，添加作为二抗的过氧物酶标记抗兔IgG(1∶25稀释；Cappel公司制)，在室温下反应30分钟后，添加DAB底物(Nichirei公司制)，进行酶色素反应。使用光学显微镜(Leica公司制)观察该标本。
将所得视网膜的组织图像示于图47。对照组中，从对于视力很重要的视神经节细胞层(GCL：ganglion cell layer)至内颗粒层(INL：innernuclear layer)，IV型胶原的沉积有所增加，与此相对，GalNac4S-6ST(G#1)siRNA投予组中，特别是GCL的胶原增生被显著地抑制。
本发明的药剂例如作为视神经节细胞层的胶原增生抑制剂是有用的。
实施例48：小鼠糖尿病性视网膜病变模型的GalNac4S-6ST(G#1)siRNA对硫酸软骨素蛋白多糖聚集的探讨：
利用与实施例47相同的方法进行视网膜的免疫组织学探讨。添加作为一抗的抗硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)抗体(clone CS56、小鼠单克隆抗体、1∶100；生化学工业公司制)，在室温下反应1小时。接着，使用Histofine小鼠染色试剂盒(Nichirei公司制；针对小鼠单克隆抗体使用)进行二抗反应。
如图48所示，对照组中，在从视网膜的GCL及外颗粒层(ONL：outer nuclear layer)至视网膜色素上皮细胞层的部分，可见CS56阳性所见的明显增强。与此相对，GalNac4S-6ST(G#1)siRNA投予组中，CS56强度显著地减弱。与此相伴，GCL层的神经节细胞及视网膜色素上皮细胞的形态极为良好地得以维持。
由以上可知，本模型小鼠中被诱发的视网膜组织的CSPG的沉积通过GalNac4S-6ST(G#1)siRNA的生物体内投予而被显著地抑制。除了认为CSPG与胶原一起对于纤维形成病变形成很重要之外，还报告了其阻碍神经节细胞拉伸轴突的过程(Brittis PA et al.Science 255：733，1992)。该报告中仅有体外的实验结果以及发生过程的报告，对于在生物体内病变的作用完全是未知的，本结果首次表明了在病变组织中的作用。
实施例49：小鼠糖尿病性视网膜病变模型的GalNac4S-6ST(G#1) siRNA对神经胶质细胞聚集的探讨：
作为视网膜损伤时的生物体防御机制的一个环节，报告了视神经的再生，还报告了与这种伤害后再生有关的视神经前体细胞是神经胶质细胞(Fischer AJ et al.Nature neuroscience 4：247，2001、Ooto S et al.PNAS 101：13645，2004)。本实施例中，作为神经胶质细胞的标记物，使用抗GFAP山羊抗体(Santa Cruz公司制)，利用与实施例47相同的方法进行免疫染色。
将结果示于图49。正常组、对照组中未见GFAP阳性神经胶质细胞数的变化，但GalNac4S-6ST(G#1)siRNA投予组中，从INL至GCL，可见显著的细胞数增加。由于报告了视神经的再生从INL向GCL发生，因此本结果显示了通过GalNac4S-6ST(G#1)siRNA使视神经的再生活跃地进行的过程。
本发明的药剂例如作为视神经再生剂是有用的。
实施例50：小鼠糖尿病性视网膜病变模型的GalNac4S-6ST(G#1) siRNA对神经节细胞的探讨：
使用实施例47中制作的样品，对神经节细胞的数量进行定量。结果表明，在糖尿病性视网膜病变模型中也可见GCL的神经节细胞的减少，但通过GalNac4S-6ST(G#1)siRNA投予，显著地恢复了这种损失(图50)。
实施例51：小鼠糖尿病性视网膜病变模型的GalNac4S-6ST(G#1) siRNA对基因表达的探讨：
利用与实施例1相同的方法提取眼组织的RNA，进行定量PCR。通过对作为缪勒氏细胞标记物的谷氨酸合成酶(GS)的表达变化进行解析，对视神经再生能力加以探讨。以下示出PCR引物序列。
[定量PCR引物序列]
* 小鼠GS(Takara Bio公司制)
正向：5’-CTGTGAGCCCAAGTGTGTGGA-3’(序列号：89)
反向：5’-GTCTCGAAACATGGCAACAGGA-3’(序列号：90)
结果示于图51。通过GalNac4S-6ST(G#1)siRNA投予，可以显著地抑制眼组织的GalNAc4S-6ST的表达增强。与此相伴，GalNac4S-6ST(G#1)siRNA投予组中，眼组织中的GS的表达显著地上升。本结果表明，通过GalNac4S-6ST(G#1)siRNA投予，导致缪勒氏细胞的再生、即视神经的恢复。
由本实施例可知，通过抑制GalNAc4S-6ST的基因表达，可以抑制视网膜组织的纤维性变化，结果避免了基于神经节细胞再生的视细胞损失。这种组织学所见以青光眼或糖尿病性视网膜病变为代表，是在广泛的眼纤维化病变中共通的所见。
本发明的药剂例如作为缪勒氏细胞再生剂或神经节细胞再生剂是有用的。
〔肝脏组织〕
肝脏中的组织的纤维性变化是所有肝疾病的进行状态或最终状态。不仅限于病毒性肝炎(A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒、G型肝炎病毒)来源的肝纤维形成，还涉及酒精性肝功能障碍、非酒精性脂肪性肝损伤(NAFLD及NASH)、代谢性肝功能障碍、药源性肝功能障碍、特发性门静脉高压、布-加氏综合症、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、胆道系统疾病(包含胆道闭锁症和胆道扩张症)、肿瘤等胰腺疾病所导致的胆道闭锁、移植物抗宿主反应、慢性排斥反应等多个分支(Bataller R et al.J Clin Invest115：209，2005.Iredale JP.J Clin Invest 117：539，2007)。本实施例中，进行肝脏组织水平的纤维性变化的探讨。
实施例52：小鼠脂肪性肝损伤模型的GalNAcST siRNA对基因表达的 效果的探讨
将妊娠第14天的C57BL/6JcL小鼠(日本CLEA公司制)进行饲养并使其生产，对出生后第2天的C57BL/6JcL小鼠投予链脲佐菌素(STZ：Sigma公司制)。对小鼠皮下注射STZ(10mg/ml)20μl，2天共计进行3次，共投予60μl。将其与小鼠母亲一起用通常饲料饲养至4周龄，满4周龄时使其离乳后，给予高脂饮食(日本CLEA公司制)，饲养2周。在第2周，每周1次腹腔内投予实施例11所记载的GalNAcST siRNA 200μL(1次/1周)，进行2次(2周)处置。实验第14天解剖，将肝脏摘出，获得基因表达解析以及免疫染色用样品。
本实施例中，利用与实施例1相同的方法进行肝脏组织的定量PCR。将结果示于图52。本模型的肝脏组织中，GalNAc4S-6ST的表达增强，但通过GalNAcST siRNA投予，被显著地抑制。
实施例53：小鼠脂肪性肝损伤模型的GalNAcST siRNA的抗纤维形成 效果的探讨
利用与实施例52相同的方法，探讨肝脏组织的纤维形成标记物的表达。本模型中，I型胶原以及αSMA的表达显著地提高(图53)。因此表示了肝脏组织的纤维性变化增强。与此相对，通过GalNAcST siRNA投予，显著地抑制了这些纤维形成标记物的增强。
实施例54：小鼠脂肪性肝损伤模型的GalNAcST siRNA对纤维芽细胞 浸润的探讨
接着，利用与实施例3相同的方法进行肝脏组织的免疫染色。添加作为一抗的大鼠抗小鼠纤维芽细胞抗体(cloneER-TR7；1∶500稀释；BMA公司制)，在室温下使其反应1小时。接着，添加作为二抗的过氧物酶标记抗大鼠IgG(1∶200稀释；Biosource公司制)，在室温下使其进一步反应30分钟后，添加DAB底物(Nichirei公司制)。在光学显微镜(Leica公司制)下观察试样，确认以茶色信号可视化的抗体结合。
将所得肝组织的免疫染色图像的例子示于图53。对照组中，纤维芽细胞的聚集明显，可见形成桥状的组织图像。与其相比较，GalNAcST siRNA投予组基本未见纤维芽细胞的聚集。
实施例55：小鼠脂肪性肝损伤模型的GalNAcST siRNA的纤维形成评 分的探讨
根据实施例54中所进行的免疫组织学染色，按照以往报道(Dai K，et al.World J Gactroenterol.31：4822-4826，2005、Hillebrandt S，et al.Nature Genetics 37：835-843，2005)，用纤维形成度数来评价各试样的肝纤维形成的程度。纤维形成度数的评价标准如下所述。0度：正常、1度：可见由中心静脉的少量的胶原伸长；2度：可见由中心静脉的清楚的胶原伸长、但并非是包围整个肝脏的程度；3度：可见由中心静脉的清楚的胶原伸长、是包围整个肝脏的程度；4度：可见整个肝脏的弥漫性胶原伸长、形成了假小叶。
将结果示于图55。各棒状图表示各组的纤维形成度数的平均值±标准偏差。与对照组相比，GalNAcST siRNA投予组(p＜0.01、t检验)统计学上显著地减轻了纤维形成。由以上可知，GalNAcST siRNA的投予发挥了临床学上也优异的肝纤维形成抑制效果。
实施例56：小鼠脂肪性肝损伤模型的GalNAcST siRNA对巨噬细胞浸 润的探讨
接着，利用与实施例54相同的方法进行肝脏组织的免疫染色。添加作为一抗的大鼠抗小鼠F4/80抗体(cloneA3-1；2μg/mi；CALTAG LABORATORIES公司制)，在室温下使其反应1小时。接着，添加作为二抗的过氧物酶标记抗大鼠IgG(1∶200稀释；Biosource公司制)，在室温下使其进一步反应30分钟，添加DAB底物(Nichirei公司制)。在光学显微镜(Leica公司制)下观察试样，确认以茶色的信号可视化的抗体结合。
将所得肝组织的免疫染色图像的例子示于图56。对照组中，巨噬细胞的聚集明显，可见形成了炎症集聚层的组织图像。与此相比较，GalNAcST siRNA投予组未见巨噬细胞的过剩聚集。
实施例57：小鼠脂肪性肝损伤模型的GalNAcST siRNA对肝脂质代谢 的探讨
利用与实施例52相同的方法研究肝脏的脂质代谢相关基因的表达。ChREBP(碳水化合物反应元件结合蛋白)以及ACC2(乙酰辅酶A羧化酶-2)的表达增强，但在GalNAcST siRNA投予组中被显著地抑制(图57)。本结果表示，通过抑制GAlNAc4ST-1、GalNAc4ST-2以及GalNAc4S-6ST的基因表达，可以抑制肝脏组织的纤维性变化，结果可以改善糖脂质代谢。
本发明的药剂例如作为糖脂质代谢改善剂是有用的。
实施例58：小鼠脂肪性肝损伤模型的C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、 C4ST-3 siRNA对纤维芽细胞聚集的探讨
利用与实施例52相同的方法制作脂肪性肝损伤模型，利用同样的投予方案投予实施例21所记载的C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA，采集肝脏组织。
接着，利用与实施例3相同的方法进行肝脏组织的免疫染色。添加作为一抗的大鼠抗小鼠纤维芽细胞抗体(cloneER-TR7；1∶500稀释；BMA公司制)在室温下使其反应1小时。接着，添加作为二抗的过氧物酶标记抗大鼠IgG(1∶200稀释；Biosource公司制)，在室温下使其进一步反应30分钟，添加DAB底物(Nichirei公司制)。在光学显微镜(Leica公司制)下观察试样，确认以茶色的信号可视化的抗体结合。
将所得肝组织的免疫染色图像的例子示于图58。对照组中，纤维芽细胞的聚集明显，可见形成了桥状的组织图像。与此相比较，C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA投予组中，在所有的组中均未见纤维芽细胞的聚集。
实施例59：小鼠脂肪性肝损伤模型的C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、 C4ST-3 siRNA对纤维形成评分的探讨
根据实施例58所进行的免疫组织学染色，用纤维形成度数来评价各试样的肝纤维形成的程度。将结果示于图59。各棒状图表示各组的纤维形成度数的平均值±标准偏差。与对照组相比，C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA投予组(p＜0.001、t检验)全部在统计学上显著地减轻了纤维形成。由以上可知，C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA的投予发挥了临床学上也优异的肝纤维形成抑制效果。
实施例60：小鼠脂肪性肝损伤模型的C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、 C4ST-3siRNA 对肝细胞功能障碍的探讨
按实施例58的方案，在处死小鼠时实施采血，将血清中ALT(丙氨酸氨基转移酶)值委托给SRL公司进行测定。将结果示于图60。血清ALT值是表示肝细胞破坏的临床上最常用的指标。对照组中可见血清ALT值的上升，与此相对，C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA投予组可见平均值50％以下的降低(图60)。本结果表示，通过抑制C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3的基因表达，可以抑制肝脏组织的纤维性变化，结果可减轻肝细胞功能障碍。
本发明的药剂例如作为肝细胞功能障碍减轻剂是有用的。
实施例61：小鼠肝纤维症模型的C6ST siRNA的抗纤维形成效果的探 讨
本实施例中，使用实验最常用的小鼠四氯化碳诱发肝硬化模型进行实验。首先是制作小鼠模型，对C57BL6/J小鼠(雌性、5～6周龄、日本CLEA公司制)每周2次腹腔内注射四氯化碳(25μL/100g体重；Sigma-Aldrich公司制)，共进行4周(8次)，引发肝纤维症。然后，每周2次追加投予四氯化碳，共进行2周(共计12次)，诱发肝硬化。将诱发了肝硬化的小鼠处死，采集其肝脏(硬变肝)。另外，在对照实验中，从未进行四氯化碳投予的同周龄C57BL6/J小鼠(雌性、日本CLEA公司制)中采集肝脏(正常肝)。
与四氯化碳的追加投予(从第9次～第12次，共计4次)同样地腹腔内投予共计4次的与实施例41相同的C6ST siRNA及其对照。追加投予结束后，将两组小鼠处死，制作肝脏组织切片，进行免疫组织学研究。添加作为一抗的大鼠抗小鼠纤维芽细胞抗体(cloneER-TR7；1∶500稀释；BMA公司制)，在室温下使其反应1小时。接着，添加作为二抗的过氧物酶标记抗大鼠IgG(1∶200稀释；Biosource公司制)，在室温下使其进一步反应30分钟，添加DAB底物(Nichirei公司制)。在光学显微镜(Leica公司制)下观察试样，确认以茶色的信号可视化的抗体结合。
将所得肝组织的免疫染色图像的例子示于图61。对照组中，纤维芽细胞的聚集明显，可见形成了桥状的组织图像。与此相比较，C6ST siRNA投予组中，在所有的组均未见纤维芽细胞的聚集。
实施例62：小鼠肝纤维症模型的C6ST siRNA的纤维形成评分的探讨
根据实施例61中进行的免疫组织学染色，利用纤维形成度数来评价各试样的肝纤维形成的程度。将结果示于图62。各棒状图表示各组的纤维形成度数的平均值±标准偏差。与对照组相比，C6ST siRNA(p＜0.05、t检验)全部在统计学上显著地减轻了纤维形成。由以上可知，C4ST-1 siRNA、C4ST-2 siRNA、C4ST-3 siRNA的投予发挥了临床学上也优异的肝纤维形成抑制效果。
实施例63：小鼠肝纤维症模型的C6ST siRNA的抗纤维形成效果的探 讨
利用与实施例1相同的方法从肝脏组织中提取RNA，进行定量PCR。将结果示于图63。对照组中可见作为纤维形成标记物的αSMA、I型胶原、CTGF、TGFβ的表达增强，但C6ST siRNA投予组中被显著地抑制。本结果表示，通过C6ST-1、C6ST-2的基因表达抑制，可以抑制肝脏组织的纤维性变化。
〔脑神经组织〕
本实施例中，作为帕金森病小鼠模型，使用基本的MPTP诱发帕金森病模型。此模型虽然很传统，但重现性优异且简单，因此常用作帕金森病模型。组织学上的特征在于，炎症细胞向脑实质组织内的浸润和多巴胺产生神经元的减少。作为这种病变中的神经元减少的原因，传统上认为是神经原纤维性变化。
因此，不仅包含神经被阻碍的病态，即帕金森病、进行性核上性麻痹、大脑皮质基底节变性症、阿尔茨海默病、多聚谷氨酰胺病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、脊髓性进行性肌萎缩、脊延髓肌萎缩症、亨丁顿舞蹈症、多发性硬化症等代表性的神经变性疾病，还包含多系统萎缩症(纹状体黑质变性症、橄榄体脑桥小脑萎缩症、Shy-Drager综合症)、肾上腺脑白质营养不良、格林-巴利综合症、重症肌无力症、Fisher综合症、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经炎、Lewis-Sumner症候群、Crow-Fukase综合征、正常压力脑积水、脊髓空洞症、朊病毒病(克雅氏病、GSS氏病、致命性家族性失眠症)、亚急性硬化性全脑炎(SSPE)、进行性多灶性白质脑病(PML)、脊髓小脑变性症等。进而，还包括脑外伤后遗症、脑血管病(脑梗塞、脑出血)后遗症、病毒性脑炎后遗症、细菌性脑膜炎后遗症、脊髓损伤后遗症、以及脊髓神经、末梢神经、听觉神经、视神经等中的神经原纤维性变化。特别是，自古认为上述后遗症是抑郁状态等精神疾病的基础，因此神经原纤维性变化作为精神症状的原因也是很重要的。
实施例64：利用MPTP诱发性C57BL/6JcL帕金森病模型小鼠的 GalNAc4S-6ST siRNA处置对抗纤维形成效果的探讨
本实施例中，制作利用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)选择性地使多巴胺神经元变性的帕金森病的小鼠模型(Amende et al.(2005)Journal of NeuroEngineering and Rehabilitation 2(20)1-13)，投予GalNAc4S-6ST siRNA，比较研究治疗后的基因表达和组织的样子。
对妊娠第14天的C57BL/6JcL小鼠(日本CLEA公司制)进行饲养并使其生产，对8周龄的C57BL/6JcL雌性小鼠(日本CLEA公司制)分别腹腔内投予200μL的混合了与实施例1相同的GalNAc4S-6ST siRNA 1μg(GeneWorld公司制)和作为siRNA介质的1％去端肽胶原(高研公司制)的混合物。之后，在第2天、第3天、第4天后，以30mg/kg向体内投予3次仅选择性破坏多巴胺神经元的MPTP(Sigma Aldrich Japan公司制)，对其进行饲养。在实验第8天，尾静脉内投予处置BrdU 5mg/mL(ZyMED Laboratory.Inc公司制)100μl，1小时后实施解剖，将脑摘出，获得免疫染色用样品、基因表达解析用样品。
基因表达利用与实施例1相同的方法定量地进行研究。将结果示于图64。该帕金森病模型中，脑组织的GalNAc4S-6ST以及作为纤维形成标记物的TGFβ、I型胶原、αSMA的表达增强，但通过GalNAc4S-6ST siRNA投予，显著地抑制了它们的表达。因此可知，通过抑制GalNAc4S-6ST的表达，可以抑制脑组织中的纤维性变化。
本发明的药剂例如作为脑组织的纤维性变化抑制剂是有用的。
实施例65：利用MPTP诱发性C57BL/6JcL帕金森病模型小鼠的 GalNAc4S-6ST siRNA处置对纤维芽细胞聚集的探讨
与实施例3同样地使用脑组织的样品，对脑内神经细胞中的纤维形成，比较通过GalNAc4S-6ST生物体内投予所获得的组织所见。用4％PFA磷酸缓冲液(Nacalai Tesque公司制)固定所得切片10分钟后，利用脱离子水进行洗涤，添加作为一抗的纤维芽细胞抗体(ER-TR7；1∶100稀释；BMA公司制)，在4℃下使其反应一晚。接着，添加作为二抗的Alexa488标记抗大鼠IgG 山羊抗体(1∶200稀释；Invitrogen公司)，在室温下使其反应30分钟。
将利用以上手法获得的组织图像示于图65。未治疗组中的强阳性信号是在胼胝体后部顆粒皮质附近与对照组相比显示出脑内的纤维芽细胞的浸润的结果。而且，GalNAc4S-6ST siRNA治疗组中，纤维芽细胞的阳性所见剧减。由以上的结果可知，帕金森病小鼠模型的被诱发的脑组织中的ER-TR7的阳性信号所见通过GalNAc4S-6ST siRNA生物体内投予而被显著地抑制。
实施例66：利用MPTP诱发性C57BL/6JcL帕金森病模型小鼠的 GalNAc4S-6ST siRNA处置对神经保护效果的探讨
接着，为了研究上述的纤维形成是否伴有神经细胞的减少，利用与实施例64相同的方法，对神经再生相关基因的脑组织中的表达进行定量。控制多巴胺神经的生存和分化并促进再生的因子GDNF、以及作为形成多巴胺神经的因子的Nurr1的表达由于GalNAc4S-6ST siRNA投予而增强(图66)。本结果表示，通过抑制GalNAc4S-6ST的表达，可以促进脑组织中的多巴胺神经的再生。
本发明的药剂例如作为脑组织的多巴胺神经再生促进剂是有用的。
实施例67：利用MPTP诱发性C57BL/6JcL帕金森病模型小鼠的 GalNAc4S-6ST siRNA处置对神经保护效果的探讨
为了最终明确以上实施例所示的结果，使用作为多巴胺神经元标记物的抗酪氨酸羟化酶抗体对所获得的组织样品切片进行多巴胺神经元的染色，比较研究组织所见。该酪氨酸羟化酶(TH：thyrosine hydroxylase)是将多巴胺前体转变成多巴胺的酶。将利用与实施例64相同的方法获得的切片用4％PFA磷酸缓冲液(Nacalai Tesque公司制)固定10分钟后，利用脱离子水进行洗涤，添加作为一抗的兔多克隆抗酪氨酸羟化酶抗体(1∶50稀释；Calbiochem公司)，在室温下使其反应1小时。接着，添加作为二抗的Alexa488标记抗兔驴抗体(1∶200稀释；Invitrogen公司)，在室温下使其反应30分钟。
图67表示对照组、未治疗组、GalNAc4S-6ST siRNA、处置组各自的组织图像(原图为彩色)。在中脑上丘附近，对照组可确认酪氨酸羟化酶正常地表达，但未治疗组中表现为阴性的信号。这说明通过MPTP将多巴胺神经元选择性地破坏。另一方面，可以确认进行了GalNAc4S-6ST siRNA处置的组的信号比未治疗组强。即可获得以下结论：通过GalNAc4S-6STsiRNA的生物体内投予，随着纤维性变化的抑制，可以期待多巴胺神经元的功能恢复。
本发明的药剂例如作为多巴胺神经元功能恢复剂是有用的。
实施例68：利用MPTP诱发性C57BL/6JcL帕金森病模型小鼠的 GalNAcST siRNA处置对神经保护效果的探讨
与实施例64同样地将妊娠第14天的C57BL/6JcL小鼠(日本CLEA公司制)饲养并使其生产，对8周龄的C57BL/6JcL雌性小鼠(日本CLEA公司制)分别腹腔内投予200μL的混合有GalNAcST(混合有GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2和GALNAC4S-6ST的混合序列)siRNA 1μg(GeneWorld公司制)和作为siRNA介质的1％去端肽胶原(高研公司制)的混合物。之后，在第2天、第3天、第4天后，以30mg/kg向体内投予3次仅选择性破坏多巴胺神经元的MPTP(Sigma Aldrich Japan公司制)，将其进行饲养。在实验第8天，尾静脉内投予处置BrdU 5mg/mL(ZyMED Laboratory.Inc公司制)100μl，1小时后实施解剖，将脑摘出，获得免疫染色用样品、基因表达解析用样品。
与实施例67同样地用抗TH抗体对所得切片进行免疫染色。将结果示于图68。进行了GalNAcST siRNA处置的组中，可确认抑制了TH阳性多巴胺神经细胞的减少。即可获得以下结论：通过GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GalNAc4S-6ST的表达抑制，与实施例67同样，可以抑制神经原纤维性变化，可期待多巴胺神经元的功能恢复。
本发明的药剂例如作为神经原纤维性变化抑制剂是有用的。
实施例69：链脲佐菌素诱发性2型糖尿病性视网膜病变模型小鼠的C4- 硫酸酯酶的效果：硫酸化CSPG的减弱
对妊娠第14天的C57BL/6JcL小鼠(日本CLEA公司制)进行饲养并使其生产，对出生后第2天的C57BL/6JcL雌性小鼠以20μL/只分别皮下注射链佐星10mg/mL(SIGMA公司制)，给予CE-2(日本CLEA公司制)的饲料、灭菌水直至达到4周龄，从4周龄开始给予高脂饮食(日本CLEA公司制)、灭菌水，饲养2周。在第2周，以4个单位/只给予chondro-4-脱硫酸化酶(C4-硫酸酯酶)(20个单位/ml；生化学工业公司制)、并以2次/周进行腹腔内投予溶剂(磷酸缓冲液)的4次(2周)处置。在第14天，为了探讨C4-硫酸酯酶的效果，将两组小鼠的眼球摘出，加以免疫组织学探讨。
用摘出眼制作冷冻块和切片。用丙酮(Sigma Aldrich Japan公司制)将切片固定10分钟后，利用磷酸缓冲液进行洗涤，然后添加作为一抗的抗硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)抗体(cloneCS56、小鼠单克隆抗体、10μg/mL；生化学工业公司制)，在室温下反应1小时。接着，使用Histofine小鼠染色试剂盒(Nichirei公司制；针对小鼠单克隆抗体使用)进行二抗反应后，添加DAB底物(Nichirei公司制)，进行酶色素反应。使用光学显微镜(Leica公司制)观察该标本。
将所得组织图像示于图69(原图为彩色)。未治疗组中，在视网膜的玻璃体侧新发现CS56阳性所见。与此相对，酶治疗组中CS56强度减弱。CS56是识别硫酸基的抗体，其减弱反映了4位硫酸基的减弱。由以上可知，该模型小鼠中被诱发的视网膜组织中的CSPG沉积通过C4-硫酸酯酶的生物体内投予而被修饰、受到抑制。
C4-硫酸酯酶是将GalNAc的4位硫酸基进行脱硫酸化的酶。因此，通过阻碍GalNAc的4位硫酸化，可以在生物水平上抑制组织的纤维形成。即，GalNAc的4位硫酸基的脱硫酸化酶作为组织纤维形成抑制剂是有用的。
实施例70：链脲佐菌素诱发性2型糖尿病性视网膜病变模型小鼠的C4- 硫酸酯酶的效果：血管内皮细胞增生的抑制
将通过与实施例69相同的方法获得的切片用丙酮(Sigma Aldrich Japan公司制)固定10分钟后，利用磷酸缓冲液进行洗涤，添加作为一抗的大鼠来源抗血管内皮细胞抗体(CD31；1∶200稀释；Phamingen公司制)，在室温下反应1小时。接着，添加作为二抗的过氧物酶标记驴来源抗大鼠IgG(1∶200稀释；Biosource公司制)，在室温下反应30分钟。在反应后的样品中添加DAB底物(Nichirei公司制)。使用光学显微镜(Leica公司制)观察此标本。将所得组织图像示于图70(原图为彩色)。未治疗组中，视网膜玻璃体侧的CD31阳性细胞的数量增加，还可见一部分突出至玻璃体的图像。认为这反映了糖尿病性视网膜病变的增生前视网膜病变的阶段，显示出模型的有效性。与此相对，酶治疗组中，相同部位的CD31阳性细胞的数量明显减少。由以上的结果可知，在2型糖尿病模型中，视网膜玻璃体侧的血管内皮细胞数增加，但通过C4-硫酸酯酶投予，这种血管增生被抑制。
即，GalNAc的4位硫酸基的脱硫酸化酶作为血管增生抑制剂是有用的。
实施例71：链脲佐菌素诱发性2型糖尿病性视网膜病变模型小鼠的C4- 硫酸酯酶的效果：胶原增加性变化的抑制：
将通过与实施例69相同的方法获得的切片用丙酮(Sigma Aldrich Japan公司制)固定10分钟后，利用磷酸缓冲液进行洗涤，添加作为一抗的兔来源抗IV型胶原抗体(1∶250稀释；Sigma公司制)，在室温下反应1小时。接着，添加作为二抗的过氧物酶标记抗兔IgG(1∶200稀释；Jackson Immuno Research公司制)，在室温下反应30分钟。在反应后的样品中添加DAB底物(Nichirei公司制)。使用光学显微镜(Leica公司制)观察此标本。
将所得组织图像示于图71(原图为彩色)。未治疗组中，随着视网膜玻璃体侧的IV型胶原阳性所见的增加，可见平行连接于视网膜内界膜的所见。这表明在静脉形态异常的同时，发生胶原的增生、即纤维化变化。与此相对，酶治疗组显著地抑制了相同部位的IV型胶原的增生。由以上的结果可知，在2型糖尿病模型内可见视网膜胶原增生，但通过C4-硫酸酯酶投予，可将其抑制。
即，GalNAc的4位硫酸基的脱硫酸化酶作为2型糖尿病性视网膜病变的治疗剂是有用的。
实施例72：2型糖尿病模型小鼠的肝脏的纤维芽细胞的局部存在
实施例72～74中，使用由前述(实施例69～71)2型糖尿病模型小鼠采集的肝脏对C4-硫酸酯酶在肝脏中的抗纤维化效果(以纤维芽细胞的组织浸润为指标)进行比较和探讨。冷冻块的制作、免疫染色的手法等全部利用上述方法进行。如图72所示，未治疗组中可见大量纤维芽细胞的浸润。与此相对，C4-硫酸酯酶治疗组与未治疗组相比，纤维芽细胞的浸润程度少。此结果表明，C4-硫酸酯酶具有抑制纤维芽细胞浸润的药理作用，此效果为抗纤维化作用之一。
即，GalNAc的4位硫酸基的脱硫酸化酶作为纤维芽细胞浸润抑制剂是有用的。
实施例73：2型糖尿病模型小鼠的肝脏的巨噬细胞的局部存在
实施例73中，使用由前述(实施例69～71)2型糖尿病模型小鼠采集的肝脏对C4-硫酸酯酶在肝脏中的抗炎症效果(以巨噬细胞的组织浸润为指标)进行比较和探讨。冷冻块的制作、免疫染色的手法等全部利用上述方法进行。如图73所示，未治疗组中可见伴随点的形成的大量巨噬细胞的浸润。与此相对，C4-硫酸酯酶治疗组与未治疗组相比，巨噬细胞的浸润程度少。此结果表明，C4-硫酸酯酶具有抑制巨噬细胞浸润的药理作用，此效果为抗炎症作用之一。
即，GalNAc的4位硫酸基的脱硫酸化酶作为巨噬细胞浸润抑制剂或抗炎症剂是有用的。
实施例74：2型糖尿病模型小鼠的血清生化学检查所见
实施例74是为了补充实施例72和实施例73的结果而进行了解析。本实施例中，使用从前述(实施例69～71)2型糖尿病模型小鼠采集的血清，测定作为肝功能指标的天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、作为脂质代谢指标的三脂酰甘油(TG)。图74表示了其结果。生化学检查依赖于检查受委托者的测定。未治疗组(unt)与对照组(nor)相比，AST、ALT、TG的任一值均为上升倾向。另一方面，C4-硫酸酯酶治疗组(C4sul)中，AST、ALT、TG的检查值的上升与未治疗组(unt)相比，有被抑制的倾向。这些结果支持了实施例72和实施例73的结果，表示通过C4-硫酸酯酶的抗纤维化效果和抗炎症效果，肝功能被保护。
即，GalNAc的4位硫酸基的脱硫酸化酶作为针对肝功能疾病的治疗剂是有用的。
实施例75：MPDP诱发性帕金森模型小鼠的脑组织的CSPG表达的比 较
本实施例中，使用作为1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)代谢产物的MPDP制作模型来进行本实验。
对8周龄的C57BL/6JcL雌性小鼠(日本CLEA公司制)以100μl/每只分别在第0天、第2天腹腔内投予C4-硫酸酯酶(生化学工业公司制)4U/ml，对于siRNA，在第0天前投予GalNAc4S-6ST siRNA(北海道System Science公司制)1μg/1％去端肽胶原/200μl。在第2天、第3天、第4天以(30mg/kg)连续投予MPDP(Sigma Aldrich Japan公司制)。
以下示出本实施例中所用的小鼠GalNAc4S-6ST siRNA药剂的碱基序列。序列并非仅限于本例。
[小鼠GalNac4-6STsiRNA](GeneBank登录号NM_029935)(北海道System Science公司制)
5’-gcagcccagcaagaugaauaagauc-ag-3’(序列号：91)
3’-ua-cgucgggucguucuacuuauucuag-5’(序列号：92)
在第8天，尾静脉内投予处置BrdU 5mg/mL(ZyMED Laboratory.Inc公司制)100μl，1小时后解剖，摘出脑，获得免疫染色用样品、基因表达解析用样品。相对于每50mg的如上摘出的脏器(脑)，添加RNA-Bee(TEL-TEST公司制)1mL，使用电动均质机(DIGITAL HOMOGENIZER、ASONE公司制)将其粉碎后，加入氯仿200μl(Sigma Aldrich Japan公司制)并稳定地混合后冰冷约5分钟，使用离心分离机(Centrifuge 5417R、eppendorf公司制)在12,000rpm、4℃下离心分离15分钟。将离心分离后的上清液500μL移至其它的埃彭道夫管中，加入与上清液等量的异丙醇500μL(Sigma Aldrich Japan公司制)并混合后，添加1μL的肝糖(Invitrogen公司制)，冰冷15分钟。冰冷15分钟后，在12,000rpm、4℃下离心15分钟，之后利用75％乙醇1000μl(Sigma Aldrich Japan公司制)洗涤3次，将所得RNA沉淀物自然干燥30分钟～1小时后，使其溶解于大塚蒸馏水50μl(大塚制药公司制)，然后使用大塚蒸馏水(大塚制药公司制)稀释100倍，在UV板(Corning Costar公司制)上利用读板器(POWER Wave XS、BIO-TEK公司制)计算所提取样品中的RNA浓度。
接着，为了进行RT反应(cDNA合成)，进行以下工序。进行计算将所得RNA样品调整至500ng/20μl的浓度，使用BLOCK INCUBATOR培养箱(ASTEC制)在68℃下加热3分钟，冰冷10分钟。冰冷后，加入80μl的预先制备的RT Pre Mix液(组成：25mM MgCl2 18.64μl(Invitrogen公司制)、5×Buffer 20μl(Invitrogen公司制)、0.1M DTT 6.6μl(Invitrogen公司制)、10mM dNTP mix 10μl(Invitrogen公司制)、Rnase抑制剂2μl(Invitrogen公司制)、MMLV逆向转录酶1.2μl(Invitrogen公司制)、随机引物2μl(Invitrogen公司制)、灭菌蒸馏水19.56μl(大塚蒸馏水：大塚制药公司制)，使用BLOCK INCUBATOR培养箱(ASTEC公司制)在42℃下加热反应1小时，在1小时后使用BLOCK INCUBATOR培养箱(ASTEC公司制)在99℃下加热5分钟后进行冰冷，制作所需要的cDNA 100μl，使用合成所得的cDNA，按以下组成进行PCR反应。
混合PCR缓冲液2μl[组成：166mM(NH4)2SO4(Sigma Aldrich Japan公司制)、670mM Tris-HCl pH8.8(Invitrogen公司制)、67mM MgCl2·6H2O(Sigma Aldrich Japan公司制)、100mM 2-巯基乙醇](WAKO公司制))、25mM dNTP mix 0.8μl(Invitrogen公司制)、DMSO 0.6μl(Sigma AldrichJapan公司制)、正向引物0.2μl(Gene world公司制)、反向引物0.2μl(GeneWorld公司制)、大塚蒸馏水15.7μl(大塚制药公司制)、Taq聚合酶0.1μl(Perkin Elmer公司制)、如上所得的cDNA 1μl，利用自动基因扩增仪(eppendorf公司制)进行94℃：45秒钟、55℃：45秒钟、72℃：60秒钟的30个循环。反应结束后，在所得PCR产物中加入2μl的Loading Dye(Invitrogen公司制)，制作1.5％UltraPure Agarose(Invitrogen公司制)凝胶，利用Mupid-2plus(ADVANCE公司制)进行100V、20分钟的电泳。电泳后，使用1×LoTE[组成：3mM Tris-HCl(pH7.5)(Invitrogen公司制)、0.2mM EDTA(pH7.5)(Sigma Aldrich Japan公司制)]稀释10000倍，在溴化乙锭(Invitrogen公司制)染色液中振荡20分钟后，利用设置于I-ScopeWD(ADVANCE公司制)的EXILIM(CASIO公司制)进行凝胶拍摄，确认基因表达。另外，冷冻块的制作、免疫染色的方法等全部利用上述方法进行。
对于MPDP诱发性帕金森模型的CSPG表达，利用使用了CS-56抗体(抗CSPG抗体：生化学工业公司制，1∶100稀释)的免疫染色进行研究，将结果示于图75。如图75所示，未治疗组中，CSPG阳性的信号强烈地表达。与此相对，C4-硫酸酯酶治疗组、基因治疗组中，阳性信号的表达降低。
实施例76：MPDP诱发性帕金森模型小鼠的脑组织的多巴胺神经元的 局部存在
为了明确C4-硫酸酯酶和GalNAc4S-6ST siRNA对多巴胺能神经的药理效果，使用利用了抗酪氨酸氢氧化酶(tyrosine hydroxylase，TH，1∶20稀释)抗体、作为二抗的Alexa-488标记抗兔IgG抗体(Invitrogen公司制，1∶200稀释)的荧光免疫染色对MPDP诱发性帕金森模型的多巴胺能神经的局部存在进行解析。如图76所示，脑组织中多巴胺能神经的局部存在在未治疗组中与其它组相比，阳性的信号较弱地表达。与此相对，C4-硫酸酯酶治疗组、基因治疗组中，阳性信号的表达未见与对照组有很大的差异。通过C4-硫酸酯酶投予、siRNA投予，显示出多巴胺能神经的保护作用或再生-修复促进作用的结果。
即，GalNAc的4位或6位的抑制剂(GalNAc的4位硫酸基的脱硫酸化酶和GalNAc4S-6ST siRNA)作为多巴胺能神经保护剂或再生-修复促进剂是有用的。
实施例77：MPDP诱发性帕金森模型小鼠的脑组织的炎症相关基因的 表达解析
为了比较C4-硫酸酯酶和GalNAcsiRNA的抗炎症效果，使用利用上述方法从与实施例75、实施例76中所用的组织切片相同的样品中提取的总RNA，对TNF-α的表达利用定量PCR法进行解析。对于定量PCR，使用SYBR premix试剂盒(Takara Bio公司制)和实时PCR基因扩增仪DICE(Takara Bio公司制)进行。PCR反应的条件为95℃：10秒、95℃：5秒和60℃：30秒的40个循环，最后进行熔解曲线分析。以下示出所用引物的碱基序列。
小鼠β-肌动蛋白(Takara Bio公司制)
正向：5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’(序列号：93)
反向：5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’(序列号：94)
肿瘤坏死因子(TNF-α)：(Takara Bio公司制)
正向：5’-CAGGAGGGAGAACAGAAACTCCA-3(序列号：95)
反向：5’-CCTGGTTGGCTGCTTGCTT-3’(序列号：96)
如图77所示，与未治疗组相比，C4-硫酸酯酶治疗组中TNF-α的表达被抑制。基因治疗组中，停留在显示出表达抑制的倾向。由这些结果可知，C4-硫酸酯酶具有抑制炎症的作用。
即，GalNAc的4位硫酸基的脱硫酸化酶作为抗炎症剂是有用的。
实施例78：MPDP诱发性帕金森模型小鼠的脑组织的炎症相关基因的 表达解析
本实施例中，为了补充实施例73的结果，将作为与多巴胺能神经表达有关的基因的Nurr1作为标记物进行探讨。显示使用上述的定量PCR法对C4-硫酸酯酶和GalNAc4S-6ST所造成的影响进行探讨的结果。以下示出所用引物的碱基序列。
核受体亚家族4GroupA member2(Nurr1)：(Takara Bio公司制)
正向：5’-CTGCCCTGGCTATGGTCACA-3’(序列号：97)
反向：5’-AGACAGGTAGTTGGGTCGGTTCA-3’(序列号：98)
如图78所示，C4-硫酸酯酶治疗组、基因治疗组与未治疗组相比，Nurr1的基因表达显著地(P＜0.001)增加。该结果支持了实施例76的结果，显示了通过C4-硫酸酯酶投予、siRNA投予所带来的多巴胺能神经的保护作用或再生-修复促进作用。
即，GalNAc的4位或6位的抑制剂(GalNAc的4位硫酸基的脱硫酸化酶和GalNAc4S-6ST siRNA)作为多巴胺能神经保护剂或再生-修复促进剂是有用的。
本发明提供通过阻碍糖链相关基因的功能来抑制生物组织水平的纤维形成的药剂。该药剂对于组织纤维形成性疾病的治疗或预防是有用的。
慢性的组织纤维形成(纤维形成性组织变化)可在全身脏器发生，是由于脏器功能不全使个体至死的疾病群的总称(总论：Wynn TA，J.Clin.Invest.117：524-529，2007)。
纤维形成性疾病认为是慢性炎症的最终阶段，是在全身脏器内发生、导致该脏器功能不全以至于使个体死亡的疾病的总称。心血管疾病、脑血管疾病等以往死亡率高的疾病的本质被认为是组织水平上的纤维形成及与其相伴的功能不全，认为欧美国家死因的45％是由于纤维形成所导致的。根据该新的见解，个体的因病死亡集中于癌症、感染症、纤维形成这3种。不仅是以往概念的肝硬化、肺纤维症、肾硬化症，癌症、感染症以外的极为多样的慢性疾病主要可以定义为“纤维形成性疾病”。特别是，随着近年的生活习惯变化(俗称欧美化)，NASH(非酒精性脂肪性肝炎)或CKD(慢性肾疾病)等威胁生命的新型疾病(疾病概念)剧增，这些疾病是由于组织的纤维形成所导致的这一发现显示了“纤维形成性疾病”治疗剂确立的紧迫性。但是，目前具有仅以移植或人工脏器对应、并没有根本性的治疗方法的决定性课题。
本发明提供以最近刚刚确定但功能仍是未知的糖链基因为靶标的利用全新方法抑制纤维形成性疾病(组织的纤维形成性病变以及与其相伴的功能不全)的技术。
临床上也呈现难治性功能不全的纤维形成性疾病不仅是死亡的决定性原因，而且还有显著阻碍日常QQL(生活质量)的疾病。组织纤维形成抑制剂的确立是极为重要的，但目前并没有市售的药剂。在实验水平上，以TGF-β阻碍剂为中心对血管紧张素阻碍剂、炎症性细胞因子阻碍剂、TLR阻碍剂、MMP阻碍剂等进行了专心的研究，但仍没有确立了有效性的方法(总论：Wynn TA，J.Clin.Invest.117：524-529，2007)。
本发明人在各种脏器的纤维形成性疾病模型动物中对受试体投予靶糖链基因阻碍剂，谋求减轻纤维形成性病变以及恢复脏器功能。
纤维形成性疾病的确认决定性地以病理图像(包含纤维芽细胞或胶原的免疫染色、马森染色)进行。治疗效果(纤维形成阻碍效果)除了病理图像之外，还通过临床症状、各脏器的胶原表达量来决定。
作为技术方法，利用针对糖链基因的核酸药品(siRNA)，通过直接的基因抑制法证明了治疗效果。
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Claims (12)

1.一种组织纤维形成抑制剂，其以N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化抑制剂为成分。
2.根据权利要求1所述的药剂，其特征在于，对生物组织的纤维形成具有抑制效果。
3.根据权利要求1或2所述的药剂，其特征在于，所述抑制剂具有阻碍N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶功能的活性。
4.根据权利要求3所述的药剂，其特征在于，所述抑制剂是抑制N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶基因的表达的siRNA。
5.根据权利要求1或2所述的药剂，其特征在于，所述抑制剂是N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基的脱硫酸化酶。
6.根据权利要求1～5任一项所述的药剂，其用于治疗或预防纤维形成性疾病。
7.一种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含选择阻碍构成糖链的N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化的化合物的工序。
8.一种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含以下的工序(a)～(c)：
(a)使N-乙酰基半乳糖胺或含有N-乙酰基半乳糖胺的糖链与受试化合物接触的工序；
(b)测定N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸化程度的工序；
(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使硫酸化程度降低的化合物的工序。
9.一种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含以下的工序(a)～(c)：
(a)使N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶与受试化合物接触的工序；
(b)测定所述酶的硫酸基转移活性的工序；
(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使所述活性降低的化合物的工序。
10.一种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含以下的工序(a)～(c)：
(a)使受试化合物与表达编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的细胞接触的工序；
(b)测定所述细胞中的基因表达量的工序；
(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使所述基因表达量降低的化合物的工序。
11.一种组织纤维形成抑制剂的筛选方法，其包含以下的工序(a)～(c)：
(a)使受试化合物与含有下述DNA的细胞或细胞提取液接触的工序，所述DNA具有编码N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基转移酶的基因的转录调节区域与报告基因功能性结合而成的结构；
(b)测定所述报告基因的表达量的工序；
(c)选择与未接触受试化合物的情况相比使所述报告基因的表达量降低的化合物的工序。
12.用于治疗或预防纤维形成性疾病的药品组合物的制造方法，其包含以下的工序(a)和(b)：
(a)利用权利要求7～11任一项所述的方法从受试试样中选择组织纤维形成抑制剂的工序；
(b)将所述药剂和药学上可允许的载体进行混合的工序。
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