JPWO2009005123A1 - インターフェロンβ産生促進剤及びその製造法 - Google Patents

Abstract

インターフェロンβ産生促進剤及びその製造法の提供。乳酸菌の培養物、菌体又は菌体成分を有効成分とするインターフェロンβ産生促進剤。菌体成分としてはＲＮＡが使用できる。また乳酸菌としてはラクトバチルス属、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属又はストレプトコッカス属に属するものが使用できる。インターフェロンβ産生促進剤は、乳酸菌を培養し、培養物、菌体又は菌体成分を採取することにより製造することができる。

Description

本発明は、インターフェロンβ産生促進剤及びその製造法に関する。

インターフェロンβは免疫細胞が抗ウィルス機能を作用させるうえで、最初に産生される生理活性物質である。インターフェロンβが樹状細胞、マクロファージ等の抗原提示細胞から産生されることでインターフェロン・レギュラトリー・ファクター７の発現量が上昇し、それによりインターフェロンαの産生やインターロイキン１２等の様々な炎症性サイトカインの産生が誘導され、Ｔｈ１型免疫が誘導される。それによりインターフェロンγの産生も誘導される。これらのことから、インターフェロンβはＴｈ１型免疫の誘導において最も重要な物質であると考えられる。
インターフェロンβの産生が促進されると、Ｔｈ１型免疫への誘導、免疫細胞の活性化、ウィルスに対する感染抵抗性の増強が起こる。従って、インターフェロンβの産生促進剤は、免疫賦活剤、抗Ｉ型アレルギー剤、Ｂ型及びＣ型肝炎の治療剤、或いは癌免疫療法剤などとして使用可能である。さらに加齢に伴って生じる免疫力の低下も補うことができる。
乳酸菌の摂取により、インターフェロンαの産生が促進されることは公知である（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。また、テトラジェノコッカス属に属する乳酸菌がインターフェロンγの産生を促進することも公知である（例えば、特許文献２参照）。ただし、乳酸菌がインターフェロンβの産生を促進することは知られていない。
インターフェロンβは抗腫瘍作用、抗ウィルス作用、細胞増殖・分化の調節作用等を有することから、抗癌治療、Ｂ型及びＣ型肝炎治療など種々の疾病の治療に用いられている。インターフェロンβは経口摂取により用いられるが、経口摂取では体内に吸収されづらく、十分な効果を期待できなかった。さらに、連続して摂取することで白血球数の減少、血小板数の減少、脱毛、発熱、痛み、疲労感等の副作用を招くという問題がある。このため、副作用が少なく、安全性の高いインターフェロンβ産生促進剤の提供が求められていた。

特開平９−１８８６２７号公報 特開２００６-０２８０４７号公報 「食品と開発 Ｖｏｌ．４２， Ｎｏ．５」２００７年、ｐ．８５−８７

本発明は、インターフェロンβ産生促進剤及びその製造法の提供を課題とする。

本発明者らは、種々の属に属する乳酸菌が、インターフェロンβ産生を促進することを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に関する。
（１）乳酸菌の培養物、菌体又は菌体成分を有効成分とするインターフェロンβ産生促進剤。
（２）菌体成分がＲＮＡである上記（１）記載のインターフェロンβ産生促進剤。
（３）乳酸菌がラクトバチルス属、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ストレプトコッカス属又はビフィドバクテリウム属に属することを特徴とする、上記（１）又は（２）記載のインターフェロンβ産生促進剤。
（４）上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のインターフェロンβ産生促進剤を含む食品。
（５）乳酸菌を培養し、培養物、菌体又は菌体成分を採取することを特徴とするインターフェロンβ産生促進剤の製造法。

本発明により、インターフェロンβ産生促進剤及びその製造法が提供された。該インターフェロンβ産生促進剤は、免疫賦活剤、抗Ｉ型アレルギー剤、Ｂ型及びＣ型肝炎の治療剤、或いは癌免疫療法剤として好適に使用できる。

種々の乳酸菌の菌体による、腹腔滲出マクロファージ細胞のインターフェロンβ産生促進試験の結果を示す図である。 種々の乳酸菌の菌体による、マウス骨髄由来樹状細胞のインターフェロンβ産生促進試験の結果を示す図である。 乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラスの菌体及びＲＮａｓｅＡ処理をした菌体による、骨髄由来樹状細胞のインターフェロンβ産生促進試験の結果を示す図である。 乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラスの菌体及びＲＮａｓｅＡ処理をした菌体による、骨髄由来樹状細胞のインターロイキン１２産生促進試験の結果を示す図である。 乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラスの菌体による、ＴＬＲ３ノックアウトの骨髄由来樹状細胞のインターフェロンβ産生促進試験の結果を示す図である。 乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラスの菌体による、ＴＲＩＦノックアウトの骨髄由来樹状細胞のインターフェロンβ産生促進試験の結果を示す図である。 乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラスの菌体による、インターフェロンβ試験のインターロイキン１２産生促進試験の結果を示す図である。 乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラスの菌体による、インターロイキン１２ｐ３５ｍＲＮＡ発現量促進試験の結果を示す図である。 乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラスの菌体による、インターロイキン１２ｐ４０ｍＲＮＡ発現量促進試験の結果を示す図である。 乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラスの菌体による、インターフェロン・レギュラトリー・ファクター７ｍＲＮＡ発現量促進試験の結果を示す図である。 乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラスの菌体による、インターフェロンγ発現細胞の増加と、抗インターフェロンβ抗体による抑制の結果を示す図である。

（１）インターフェロンβ産生促進剤
本発明のインターフェロンβ産生促進剤は、乳酸菌の培養物、菌体又は菌体成分を有効成分とする。乳酸菌とは、例えば、ラクトバチルス属、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属又はストレプトコッカス属の乳酸菌である。
インターフェロンβ産生促進活性を示す限り、有効成分である乳酸菌の培養物、菌体又は菌体成分は、どのような方法で調製されたものでもよい。乳酸菌の菌体は、培養物を遠心分離等して培地を除去することにより得られる。菌体成分とは、例えば、乳酸菌が生産するＲＮＡであり、具体的には１本鎖ＲＮＡ又は２本鎖ＲＮＡである。乳酸菌のＲＮＡは通常の分画方法によって得ることができる。
免疫賦活、或いは感染抵抗性増強を目的として本発明のインターフェロンβ産生促進剤を摂取する場合、その摂取量は、摂取者の症状や体格に合わせて適宜設定すればよい。テトラジェノコッカス属に属する乳酸菌の菌体を有効成分とする場合、その摂取量は、例えば１〜１０００ｍｇ／体重６０ｋｇ／日である。
有効成分である乳酸菌の培養物、菌体又は菌体成分は単独で使用してもよいし、飲食品、医薬品に添加して使用することもできる。

（２）インターフェロンβ産生促進剤の製造法
本発明のインターフェロンβ産生促進剤は、乳酸菌を培養し、培養物、菌体又は菌体成分を採取することにより得られる。有効成分であるインターフェロンβ産生促進活性を示す成分が得られる限り、乳酸菌の培養条件や、有効成分である培養物、菌体又は菌体成分の採取方法は特に限定されない。
以下に、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ１９１５（財団法人 野田産業科学研究所より入手）の菌体を有効成分とするインターフェロンβ産生促進剤の製造法を例示する。
まず、例えばＭＲＳ培地にペディオコッカス・ペントサセウスを植菌し、２５〜３７℃で２４〜７２時間培養する。培養後の培地を、限外ろ過膜や遠心濃縮機によって培地を除去して集菌する。得られた菌体を、水や食塩水等で洗浄する。
上記のようにして得られた菌体、或いは菌体を水や食塩水に懸濁した菌体懸濁液は、本発明のインターフェロンβ産生促進剤として使用可能である。

〔マウス腹腔浸出マクロファージを用いた各種乳酸菌のインターフェロンβ産生促進試験〕
表１に示す乳酸菌を使用し、インターフェロンβ産生促進試験を実施した。

１．乳酸菌懸濁液の調製
ＭＲＳ培地に各種乳酸菌を１×１０^７個／ｍｌとなるように接種した。テトラジェノコッカス属は、食塩１０％を含有するＭＲＳ培地に１×１０^７個／ｍｌとなるように接種した。３０℃で４８〜７２時間静置培養した後、９５℃で１０分間の煮沸殺菌を行った。その後、遠心濃縮機によって培地を除去して集菌した。生理食塩水にて菌体を洗浄後、細胞培養用のＲＰＭＩ培地に波長６００ｎｍで吸光度が０．１２５となるように懸濁し、乳酸菌懸濁液を調製した。

２．インターフェロンβ産生促進試験
調製した乳酸菌懸濁液のインターフェロンβ産生促進活性を、マウス（８〜１２週齢ＢＡＬＢ／ｃ、雄、チャールズリバー社）より採取、調製した腹腔滲出マクロファージ細胞を用いて評価した。
（１）腹腔滲出マクロファージ細胞の採取、調製
チオグリコレート２ｍｌを腹腔内に投与し、刺激したマウスから、投与３日後に無菌的に腹腔滲出マクロファージを採取した。採取したマクロファージを独自に調整したＦＢＳ溶液にて洗浄後、細胞数を測定し、２×１０^６個／ｍｌの濃度になるようにＲＰＭＩ １６４０培地で調製した。調整したマクロファージ細胞溶液を９６穴組織培養プレートに１穴当たり１００μｌを播種した。これにＲＰＭＩ １６４０培地、あるいは上記の濃度で調整した乳酸菌菌体懸濁液をそれぞれ１穴当たり１００μｌ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で培養し、共培養開始後３時間、６時間の培養上清を回収した。
（２）インターフェロンβ産生促進活性の測定
上記のように経時的に回収した培養上清を、上清を経時的に回収し、インターフェロンβ測定キット（ＰＢＬ社製）を用い、エンザイムイムノアッセイにより測定した。

結果を図１に示す。共培養の開始後６時間目において、テトラジェノコッカス属、ラクトバチルス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属及びストレプトコッカス属の乳酸菌が、腹腔滲出マクロファージ細胞のインターフェロンβ産生を促進することが確認された。以上により、乳酸菌の菌体が、インターフェロンβ産生促進剤として有用であることが示された。

〔骨髄由来樹状細胞を用いた各種乳酸菌のインターフェロンβ産生促進試験〕
表２に示す乳酸菌を使用し、インターフェロンβ産生促進試験を実施した。

１．乳酸菌懸濁液の調製
ＭＲＳ培地に各種乳酸菌を１×１０^７個／ｍｌとなるように接種した。テトラジェノコッカス属は、食塩１０％を含有するＭＲＳ培地に１×１０^７個／ｍｌとなるように接種した。３０℃で４８〜７２時間静置培養した後、９５℃で１０分間の煮沸殺菌を行った。その後、遠心濃縮機によって培地を除去して集菌した。生理食塩水にて菌体を洗浄後、細胞培養用のＲＰＭＩ培地に乳酸菌懸濁液を調製した。

２．インターフェロンβ産生促進試験
（１）骨髄由来樹状細胞懸濁液の調製
骨髄由来樹状細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスもしくはC５７BL／６マウスをイソフルラン吸入麻酔下に頸椎脱臼して安楽死させた後、下肢から大腿骨、頸骨を取り出し、氷冷した１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，非動化したもの）加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社製）の入った細胞培養用６ｃｍ ディッシュ（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に入れた。１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０を注入して骨髄を押し出した後、懸濁した。得られた細胞懸濁液をセルストレイナー（４０μｍ， ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ）で濾過した後、４４０×ｇで５分間遠心分離した。

溶血バッファー（５ｍＬ，０．１５５Ｍ ＮＨ_４Ｃｌ，０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ， ｐＨ７．５）を加え５分間氷上に置いた後、１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１１６４０（５ｍＬ）を加えて遠心分離し、１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０でさらに２回洗浄した。ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）標識抗Ｉ−Ａ抗体（Ｃｌｏｎｅ Ｍ５／１１４．１４．２， ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製， ０．２ｍｇ／ｍＬ）、ＰＥ標識抗ＣＤ４抗体（Ｃｌｏｎｅ ＧＫ１．５， ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製，０．２ｍｇ／ｍＬ）及びＰＥ標識抗ＣＤ８抗体（Ｃｌｏｎｅ ５３−６．７，ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製，０．２ｍｇ／ｍＬ）をＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒでそれぞれ１０００倍希釈した抗体カクテル（１００μＬ／１０^７ ｃｅｌｌｓ）及びウサギＩｇＧ（５０μｇ／ｍＬ， Ｚｙｍｅｄ社製）を加え、氷上で３０分間静置した。

ＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した後、抗ＰＥ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ（２０μＬ／１０^７ ｃｅｌｌｓ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）とＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（８０μＬ／１０^７ ｃｅｌｌｓ）を加え、４〜８℃で１５分間静置した。反応液の２０倍量のＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した後、ＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．５ｍＬ／１０^８ ｃｅｌｌｓ）に懸濁し、自動磁気分離システム（Ａｕｔｏ ＭＡＣＳ， Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）を用いてネガティブフラクションを分離した。分離した細胞を１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄した後、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）加基本培地に懸濁した。基本培地は、ペニシリン（１００，０００ Ｕ／Ｌ，明治製菓社製）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／Ｌ，明治製菓社製）、２−メルカプトエタノール（５０μＭ，Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｌ−グルタミン酸（２ｍＭ，ナカライテスク社製）、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ，同仁化学研究所製）加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に非働化したＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を１０％添加したものを用いた。

ＧＭ−ＣＳＦはマウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を導入したｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａ Ｘ６３−Ａｇ８（Ｊ５５８Ｌ−ＧＭ−ＣＳＦ）の培養上清を基本培地に１０％添加した。細胞液をトリパンブルー（Ｇｉｂｃｏ社製）で懸濁し、血球計算板を用いて細胞数を計測した後、細胞培養用６ウェルプレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に１．２×１０^６／４ｍＬ／ウェルとなるように分注し、培養した。培養開始後３日目及び６日目に培地を２ｍＬ吸引除去して新しいＧＭ−ＣＳＦ加基本培地を２ｍＬ加え、培養開始後８日目に浮遊細胞を未成熟樹状細胞として回収した（ＣＤ１１ｃ陽性細胞＞８５％）。細胞を１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した後、基本培地に懸濁し、骨髄由来樹状細胞懸濁液とした。

（２）インターフェロンβ産生促進活性の測定
上記のようにして得た２種類の細胞懸濁液と、乳酸菌懸濁液とを一定の割合（骨髄由来樹状細胞数：乳酸菌数＝１：５０）で混合し、共培養を行った。培養6時間後に上清を回収し、実施例１と同様にエンザイムイムノアッセイにより、上清中インターフェロンβ濃度を測定した。
結果を図２に示す。図に示すように各種乳酸菌、ビフィドバクテリウム属よりインターフェロンβの産生が確認された。

〔テトラジェノコッカス属に属する乳酸菌のインターフェロンβ産生促進試験〕
１．乳酸菌懸濁液の調製
乳酸菌としてテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１（Tetragenococcus halophilus Th221）を使用した。当該菌株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１３１０である。
まず、食塩１０％を含有したＭＲＳ培地にテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１を１×１０^７個／ｍｌとなるように接種した。３０℃で４８〜７２時間静置培養した後、９５℃で１０分間の煮沸殺菌を行った。生理食塩水にて菌体を洗浄後、生理食塩水に１×１０^９個／ｍｌとなるように懸濁し、乳酸菌懸濁液を調製した。

２．ＲＮａｓｅＡ処理
上記乳酸菌懸濁液に１０μｇ／ｍｌとなるようにＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社製 Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ）を添加し、１時間、３７℃でインキュベートを行った。その後、生理食塩水にて菌体を洗浄し、再び生理食塩水に１×１０^９個／ｍｌとなるように懸濁し、乳酸菌懸濁液を調製した。
３．インターフェロンβ産生促進試験
上記にて調製した乳酸菌懸濁液のインターフェロンβ産生促進活性及びインターロイキン１２産生促進活性を、６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本エスエルシー社製）より採取、調製した骨髄由来樹状細胞を用いて評価した。

（１）骨髄由来樹状細胞懸濁液の調製
骨髄由来樹状細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスをイソフルラン吸入麻酔下に頸椎脱臼して安楽死させた後、下肢から大腿骨、頸骨を取り出し、実施例２と同様に調整した。

（２）インターフェロンβ産生促進活性の測定
上記のようにして得た２種類の細胞懸濁液と、乳酸菌懸濁液とを一定の割合（骨髄由来樹状細胞数：乳酸菌数＝１：５０）で混合し、共培養を行った。上清を経時的に回収し、実施例１と同様にエンザイムイムノアッセイにより、上清中インターフェロンβ濃度を測定した。
結果を図３に示す。乳酸菌懸濁液が骨髄由来樹状細胞のインターフェロンβ産生を促進し、乳酸菌懸濁液のＲＮａｓｅＡ処理によりインターフェロンβ産生促進活性が低下した。
以上から、インターフェロンβ産生促進活性の有効成分がＲＮＡであることが示された。

４．インターロイキン１２産生促進活性の測定
上記で回収した上清のインターロイキン１２濃度をエンザイムイムノアッセイにより測定した。エンザイムイムノアッセイは、ラット抗マウスインターロイキン１２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）を０．２Ｍ、ｐＨ６．０のリン酸緩衝液で２μｇ／ｍｌに調製した溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当たり１００μｌ加え、室温で一晩放置しラット抗マウスインターロイキン１２抗体を各穴に付着させたプレートを用いて行った。培養上清を１穴当たり１００μl加え室温で９０分間放置し、培養上清のマウスインターロイキン１２をプレートに付着したラット抗マウスインターロイキン１２抗体と結合させた。
洗浄後ラットビオチン化抗マウスインターロイキン１２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）を加え、プレートに結合させたマウスインターロイキン１２に結合させた。洗浄後ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ 社製）を加え、ビオチンと結合させた。ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ 社製）を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４５０ｎｍを測定し、リコンビナントマウスインターロイキン１２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 社製）で作成した標識曲線から、培養上清中のインターロイキン１２の濃度を求めた。
結果を図４に示す。インターフェロンβとインターロイキン１２の産生促進活性の間に高い相関が見られ、インターフェロンβの産生と共にＴｈ１型免疫誘導に関わるインターロイキン１２の産生が誘導された。以上より、乳酸菌の刺激によりインターフェロンβ産生が促進され、それにより免疫調節作用が誘導されることが確認された。

〔ＴＬＲ３ノックアウトマウスを使用したインターフェロンβ産生促進試験〕
乳酸菌の構成成分を認識するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に着目し、２本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲ３をノックアウトしたマウス（６〜１２週齢Ｃ５７ＢＬ／６、雌、兵庫医科大学より分与）を用いて、インターフェロンβ産生促進活性を評価した。骨髄由来樹状細胞の調製、乳酸菌の調製、インターフェロンβ産生促進活性の測定は実施例２と同様の方法で行った。共培養開始後１２、２４時間目の上清中のインターフェロンβ濃度を測定した。

結果を図５に示す。ＴＬＲ３をノックアウトした細胞においてインターフェロンβ産生促進活性が低下した。以上により、インターフェロンβ産生促進活性にＴＬＲ３が関わっていること、即ち、インターフェロンβ産生促進活性の有効成分に乳酸菌の２本鎖ＲＮＡが関わっていることが示された。

〔ＴＲＩＦノックアウトマウスを使用したインターフェロンβ産生促進試験〕
ＴＲＩＦというアダプター分子はＴＬＲ３からのシグナルを伝達する。このアダプター分子をノックアウトしたマウス（６〜１２週齢Ｃ５７ＢＬ／６、雌、兵庫医科大学より分与）を用いて、実施例３と同様にインターフェロンβ産生亢進活性を評価した。骨髄由来樹状細胞の調製、乳酸菌の調製、インターフェロンβ産生促進活性の測定は実施例２と同様の方法で行った。共培養開始後１２、２４時間目の上清のインターフェロンβ濃度を測定した。

結果を図６に示す。ＴＲＩＦをノックアウトした細胞においてインターフェロンβ産生促進活性が低下した。以上により、乳酸菌によるインターフェロンβ産生促進活性がＴＲＩＦを経由するシグナルであることが確認された。

〔食品の製造例〕
ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ１９１５株を、１００ｍｌのＭＲＳ培地で３０℃、２４時間培養した後、生理食塩水中に分散、遠心分離することにより、菌体ペーストを得た。

これを無調整豆乳（紀文フードケミファ製）に添加し、３０℃で２４時間培養することにより、ヨーグルト様食品を得た。

〔インターフェロンβ中和試験〕
インターフェロンβとインターロイキン１２の間に高い相関が確認されたことから、ラット由来抗マウスインターフェロンβ抗体（Ｙａｍａｓａ社製）を８０μｇ／ｍｌとなるように培養液に添加し、骨髄由来樹状細胞より培養上清中へ分泌されたインターフェロンβを中和したときのインターロイキン１２産生量を測定した。
骨髄由来樹状細胞の調製、乳酸菌の調製、インターロイキン１２産生促進活性の測定は、実施例３と同様の方法で行った。
インターロイキン１２ｐ３５、インターロイキン１２ｐ４０、インターフェロン・レギュラトリー・ファクター７のｍＲＮＡ発現量は、定量的リアルタイムＰＣＲ法により測定を行った。
ｍＲＮＡの抽出は、共培養開始６時間目にＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて行った。その後、総ＲＮＡ量が３００ｎｇとなるように抽出液を分取後、ＥｘＳｃｒｉｐｔ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。

これを用い、Ｓｙｂｒ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）により定量的リアルタイムＰＣＲを行った。各ｍＲＮＡに対する特異的なプライマーとして、インターロイキン１２ｐ３５は、センス ５’−ＣＴＴＡＧＣＣＡＧＴＣＣＣＧＡＡＡＣＣＴ−３’（配列番号１）、アンチセンス ５’−ＴＴＧＧＴＣＣＣＧＴＧＴＧＡＴＧＴＣＴ−３’（配列番号２）、インターロイキン１２ｐ４０は、センス ５’−ＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＡＧＣＡＧＴＡＧＣＡ−３’（配列番号３）、アンチセンス ５’−ＣＴＧＣＡＧＡＣＡＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＴ−３’（配列番号４）、インターフェロン・レギュラトリー・ファクター７は、センス ５’−ＡＣＡＧＧＧＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＴＧＣＧ−３’（配列番号５）、アンチセンス ５’−ＴＣＣＡＡＧＣＴＣＣＣＧＧＣＴＡＡＧ−３’（配列番号６）、βアクチンは、センス ５’−ＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧ−３’（配列番号７）、アンチセンス ５’−ＧＧＴＣＴＴＴＡＣＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧＴＣ−３’（配列番号８）を用い、Ｍｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）により測定した。各発現量は、βアクチンの発現量にて標準化を行い、刺激前に対する相対発現量を求めた。
インターフェロンβを中和することによりインターロイキン１２産生量が減少した。結果を図７に示す。

ｍＲＮＡ発現量は、インターロイキン１２ｐ３５が減少しており、インターフェロンβがインターロイキン１２ｐ３５に影響を与えていることが示された。結果を図８に示す。
一方、インターロイキン１２ｐ４０の発現量に影響はなかった。結果を図９に示す。
また、インターフェロンβにより誘導されるインターフェロン・レギュラトリー・ファクター７の発現量も減少していた。結果を図１０に示す。
以上から、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１の刺激により骨髄由来樹状細胞から産生されたインターフェロンβが、インターロイキン１２ｐ３５産生を誘導することによりインターロイキン１２の産生促進に関わっていることが示された。

〔乳酸菌によるインターフェロンβを介したインターフェロンγ産生細胞の誘導〕
骨髄由来樹状細胞とＣＤ４^＋ Ｔ細胞の共培養を行なうとき、乳酸菌のインターフェロンβ産生促進作用によりインターフェロンγ産生細胞が誘導されるかを確認した。
骨髄由来樹状細胞の調製、乳酸菌の調整は実施例３と同様に行なった。また、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞はＤＯ１１．１０マウスの脾臓から調製した。ＤＯ１１．１０マウスの脾臓を採取後、メッシュによりすり潰し、脾臓細胞を得た。その後、抗マウスＣＤ４ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と３０分間インキュベートし、Ａｕｔｏ ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）により、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞を得た。
９６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり１×１０^５個の骨髄由来樹状細胞と５×１０^５個のＣＤ４^＋ Ｔ細胞及び５×１０^６個のテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１を培養した。ラット由来抗マウスインターフェロンβ抗体（Ｙａｍａｓａ社製）を８０μｇ／ｍｌとなるように培養液に添加し、骨髄由来樹状細胞より培養上清中へ分泌されたインターフェロンβを中和した。コントロール抗体として、抗ラットＩｇＧ１抗体を用いた。
培養開始３日目に培地交換を行い、７日目にフローサイトメトリー ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ社製）を用いて、インターフェロンγ産生細胞、インターロイキン４産生細胞の割合を調べた。測定には抗マウスインターフェロンγ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と抗マウスインターロイキン４抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いた。
結果を図１１に示す。テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１の刺激によりインターフェロンγ産生細胞の割合が増加した。また、抗インターフェロンβ抗体により、インターフェロンγ産生細胞の誘導が抑制された。このことから、乳酸菌の刺激により、インターフェロンβを介してインターフェロンγ産生細胞が誘導されることが確認された。

本発明により、インターフェロンβ産生促進剤が提供された。該インターフェロンβ産生促進剤は、免疫賦活剤、抗Ｉ型アレルギー剤、Ｂ型及びＣ型肝炎の治療剤、或いは癌免疫療法剤に使用できる。

Claims (5)

1. 乳酸菌の培養物、菌体又は菌体成分を有効成分とするインターフェロンβ産生促進剤。
2. 菌体成分がＲＮＡである請求項１記載のインターフェロンβ産生促進剤。
3. 乳酸菌がラクトバチルス属、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属又はストレプトコッカス属に属することを特徴とする、請求項１又は２記載のインターフェロンβ産生促進剤。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のインターフェロンβ産生促進剤を含む食品。
5. 乳酸菌を培養し、培養物、菌体又は菌体成分を採取することを特徴とするインターフェロンβ産生促進剤の製造法。

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