JPWO2007099711A1

JPWO2007099711A1 - 分化誘導剤

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Publication number: JPWO2007099711A1
Application number: JP2008502669A
Authority: JP
Inventors: 謙之竹井; 信行榎本; 信紘佐藤
Original assignee: Juntendo University
Current assignee: Juntendo University
Priority date: 2006-02-28
Filing date: 2007-02-28
Publication date: 2009-07-16
Also published as: WO2007099711A1

Abstract

骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導剤を提供すること。ヘパリンまたはその塩を有効成分とする骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導剤。

Description

本発明は、分化誘導剤、特に骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導剤に関する。

内皮細胞は、血管やリンパ管の内壁をなす細胞であり、このうち血管内皮細胞は、血液と血管壁との接点に位置し、物質の透過性を制御する役割を担うとともに、血液と組織との情報伝達の役割を担っている。これら内皮細胞は、高脂血症、高血圧症、糖尿病などの疾患によって損傷を受けることが知られており、修復方法の研究がされている。
とりわけ、肝類洞内皮細胞は免疫応答・炎症制御、微小循環制御、物質交換などを介して、肝機能発現に重要な貢献をなしている。類洞内皮細胞は、ハイポキシアや障害因子に極めて脆弱であり、その機能障害や細胞死による損失は、慢性肝炎、肝硬変、劇症肝不全、肝癌、移植後のグラフト障害など主要な肝疾患においてその病態惹起機序の中心的な役割を果たしている（非特許文献１〜３）。
一方、骨髄細胞は、さまざまな臓器における未成熟細胞の起源となることが示唆されており（非特許文献４〜６）、近年肝臓などの組織においては、移植した骨髄細胞から分化させて再生させることが検討されている（非特許文献７〜９）。
これらの背景から、骨髄由来細胞の分化誘導を用いることにより、損傷した類洞内皮細胞を正所性に再生することが可能になれば、現在有効な治療法が存在しない肝硬変、劇症肝炎など難治性肝疾患の画期的な治療法になることが期待される。

一方、ヘパリンは、肝臓、小腸、肺、皮膚などに存在する複雑な構造をもつヘテロ多糖であり、強い血液抗凝固活性を有することから、汎発性血管内血液凝固症候群（ＤＩＣ）の治療、種々の血栓塞栓症（静脈血栓症、心筋梗塞症、肺塞栓症、脳塞栓症、四肢動脈血栓塞栓症、術中・術後の血栓塞栓症など）の治療および予防のほか、血液透析・人工心肺などの体外循環装置使用時や血管カテーテル挿入時または輸血および血液検査の際などにおける血液凝固の防止に用いられている。また、ヘパリンの投与により、肝細胞や類洞内皮細胞の増殖因子である肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の発現を上昇させ、肝再生を促進させることが報告されている（非特許文献１０〜１２）。しかしながら、通常の肝再生においては、既存の肝細胞の複製のみが行われ、骨髄細胞からの分化は稀であり、骨髄細胞の分化との関係については何ら知られていない。

ＴａｋｅｉＹ，ｅｔａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙｔｏｓｉｎｕｓｏｉｄａｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ：ＤＮＡｎａｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｂｅａｒｉｎｇｈｙａｌｕｒｏｎａｎ−ｇｌｙｃｏｃａｌｙｘ．ＦＡＳＥＢＪ，２００４；１８：６９９−７０１．（１０．１０９６／ｆｊ．０３−０４９４ｆｊｅ）．ＢａｃｈＦＨ，ＲｏｂｓｏｎＳＣ，ＷｉｎｋｌｅｒＨ，ｅｔａｌ．Ｂａｒｒｉｅｒｓｔｏｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．ＮａｔｕｒｅＭｅｄ１９９５；１：８６９−８７３Ｍｏｃｈｉｄａ，Ｓ．，Ｏｇａｔａ，Ｉ．，Ｈｉｒａｔａ，Ｋ．，Ｏｈｔａ，Ｙ．，Ｙａｍａｄａ，Ｓ．，ａｎｄＦｕｊｉｗａｒａ，Ｋ．（１９９０）Ｐｒｏｖｏｃａｔｉｏｎｏｆｍａｓｓｉｖｅｈｅｐａｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓｂｙｅｎｄｏｔｏｘｉｎａｆｔｅｒｐａｒｔｉａｌｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙｉｎｒａｔｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ９９，７７１-７７７ＫｒａｕｓｅＤＳ，ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ２００１；１０５：３６９−７７．ＴａｎａｋａＲ，ｅｔａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ２００３；１１７：５３１−９．ＪａｃｋｓｏｎＫＡ，ｅｔａｌ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ２００１；１０７：１３９５−４０２．ＦｕｊｉｉＨ，ｅｔａｌ．ＪＨｅｐａｔｏｌ２００２；３６：６５３−９．ＦｅｒｒｙＮ，ｅｔａｌ．ＪＨｅｐａｔｏｌ２００２；３６：６５９−７．ＧｒｏｍｐｅＭ．ＳｅｍｉｎＬｉｖｅｒ２００３；２３：３６３−７２．ＭａｔｓｕｍｏｔｏＫ，ｅｔａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ１９９６；２２７：４５５−６１．ＮａｋａｏＴ，ｅｔａｌ．ＪＨｅｐａｔｏｌ２００２；３７：８７−９２．ＩｓｈｉｉＴ，ｅｔａｌ．ＪＢｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１９９５；１１７：１１０５−１２．

したがって、本発明の目的は、骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導剤を提供することにある。

本発明者らは、鋭意検討したところ、従来血液凝固阻止剤などとして用いられていたヘパリンまたはその塩が、骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導を顕著に促進させることを見出した。

すなわち、本発明は、ヘパリンまたはその塩を有効成分とする骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導剤を提供するものであり；ヘパリンまたはその塩を有効量投与することを特徴とする骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導方法を提供するものであり；骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導剤の製造のためのヘパリンまたはその塩の使用を提供するものである。

ヘパリンまたはその塩は、骨髄細胞から内皮細胞への分化を誘導する作用を有することから、骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導剤の有効成分として用いることができる。本発明の分化誘導剤を用いれば、ｉｎｖｉｔｒｏでの骨髄細胞から内皮細胞への分化を効率的に行うことができるほか、生体内に投与することにより、内皮細胞に障害のある器官の再生に供することができる。本発明の分化誘導剤は、特に、炎症などの疾患を発症している対象組織に骨髄細胞を移植したのち用いることにより、内皮細胞への優れた分化誘導効果が得られる。

四塩化炭素投与群の肝小葉のＨＥ（ヘマトキシリンエオシン）染色像（図１ａ）、アザン染色像（図１ｂ）である。四塩化炭素投与群の肝小葉の抗ＧＦＰ抗体染色像である。コントロール群の肝小葉の抗ＧＦＰ抗体染色像（図３ａ、ｄ）、抗ＣＤ３１抗体染色像（図３ｃ）および重ね合わせ像（図３ｂ）である。四塩化炭素投与群の肝小葉の抗ＧＦＰ抗体染色像（図４ａ、ｄ）、抗ＣＤ３１抗体染色像（図４ｃ）および重ね合わせ像（図４ｂ）である。四塩化炭素＋ダルテパリンナトリウム投与群の肝小葉の抗ＧＦＰ抗体染色像（図５ａ、ｄ）、抗ＣＤ３１抗体染色像（図５ｃ）および重ね合わせ像（図５ｂ）である。ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞数の、各群における比較を示したグラフである。

本発明の分化誘導剤に用いられるヘパリンとしては、例えば、健康な食用獣（例えば、ウシ、ブタ等）の肝臓、肺あるいは腸粘膜から得られ、ウロン酸とグルコサミンが交互に１，４結合した構造を有し、５０００〜２００００の平均分子量からなるムコ多糖類の硫酸エステルが挙げられる。また、ヘパリンとしては、優れた分化誘導効率が得られる点から、低分子ヘパリンが好ましい。低分子ヘパリンとしては、平均分子量２０００〜１００００のものが挙げられる。低分子ヘパリンとしては、出血等のリスクが低いため安全性が高く、また、分化誘導促進活性に優れている点から、平均相対分子量が約５０００で、９０％が分子量２０００〜９０００の範囲に分布し、硫酸エステル化の度合が二糖当たり２〜２．５であるダルテパリンが好ましい。ヘパリンの塩としては、ナトリウム塩、カルシウム塩等が例示される。

ヘパリンは既に医薬・化粧品原料として開発されており市販品を利用することができるが、ヘパリンの調製は、第１４日本薬局方に開示された方法等に準じた方法により行うことができる。低分子ヘパリンは、ウシまたはブタ腸粘膜由来のヘパリンを過酸化水素と硫酸第二銅により分解して得ることができる。

後記実施例に示すとおり、ヘパリンは、四塩化炭素肝障害モデルマウスにおいて、骨髄細胞から内皮細胞への分化を誘導した。したがって、ヘパリンは、骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導剤の有効成分として用いることができる。従来ヘパリンは、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の発現を上昇させ、それにより肝実質細胞や類洞内皮細胞などの非実質細胞を増殖させることが報告されている。しかしながら、通常の肝再生においては、既存の肝細胞の複製のみが行われ、骨髄細胞からの分化は稀であり骨髄細胞の分化との関係については何ら知られておらず、ヘパリンが骨髄細胞の分化を誘導することは意外なことである。

本発明の分化誘導剤は、生体内における骨髄細胞の他、生体内から分離されｉｎｖｉｔｒｏの系で培養される骨髄細胞からの分化誘導に用いられるが、生体内における骨髄細胞の分化誘導に好適に用いられる。
また、本発明の分化誘導剤は、生体が本来有する骨髄細胞からの分化誘導、および対象組織に移植された骨髄細胞の分化誘導に用いることができ、このうち、高い分化誘導効率が得られ疾患の治療効果に優れる点から、対象組織に移植された骨髄細胞の分化誘導に好適に用いられる。この場合、本発明の分化誘導剤は、移植後にヘパリンまたはその塩を投与するのが好ましい。
本発明の分化誘導剤は、ヘパリンまたはその塩により優れた分化誘導効率が得られる点から、骨髄細胞が移植される対象組織が肝臓である場合に好適に用いられる。また、骨髄細胞が移植される臓器は、炎症等の疾患を発症している場合に好適に用いられる。臓器が肝臓の場合、疾患としては、劇症肝炎、慢性肝炎等の肝炎、肝硬変などの終末期肝疾患、肝臓癌が挙げられ、肝炎を発症している場合に好適に用いられる。肝炎を発症している肝臓に対して用いた場合、本発明の分化誘導剤により、肝臓の類洞内皮細胞への分化を誘導することもできる。肝臓に移植された骨髄細胞は、肝実質細胞などに分化することも報告されているが、本発明の分化誘導剤により、類洞内皮細胞への分化を誘導することもできる。

本発明の分化誘導剤が用いられる対象としては、例えば、ヒト、マウス、ラットなどの哺乳類が挙げられる。

本発明の分化誘導剤は、一般的な医薬製剤の形態で用いられるが、その代表的なものとして、注射剤（液剤、懸濁剤等）等が挙げられる。

注射剤として調製する場合、液剤、乳剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であることが好ましく、これらの形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野において慣用されているもの、例えば水、エタノール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用することができる。この場合等張性の溶液を調製するのに必要な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有させてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。

本発明のこれら医薬製剤の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度およびその他の条件により適宜選択されるが、通常ヘパリンの質量として、体重１ｋｇ当り、一日約５Ｉ．Ｕ．／Ｋｇ〜１００Ｉ．Ｕ．／Ｋｇを１時間〜２４時間で注入するのがよい。

以下に実施例を示し、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

参考例１ＧＦＰ陽性骨髄細胞の調製
８週齢ＧＦＰトランスジェニックマウス（ＯｋａｂｅＭ，ｅｔａｌ．ＦＥＢＳＬｅｔｔ１９９７；４０７：３１３−９）を、５−フルオロウラシル（１５０μｇ／ｇＢＷ）で処理し、増殖細胞を破壊した。４８時間後、頚椎脱臼により屠殺し四肢を除去したのち、２８Ｇ針を用いてダルベッコ修正イーグル培地（ＧＩＢＣＯ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮｅｗＹｏｒｋ）により洗い出し、大腿骨、頚骨髄腔からＧＦＰ陽性骨髄細胞を得た。

実施例１骨髄移植された肝炎発症マウスからの肝小葉組織の調製
〔肝炎発症マウスへの骨髄移植〕
メス８週齢Ｃ５７／Ｂ６マウス（日本チャールズリバー（株））に、個体１ｋｇあたり０．２ｍｌの四塩化炭素を、４週間にわたり週２回の頻度で投与した。４週間の四塩化炭素投与後のマウスの全身に、致死量のＸ線（１０Ｇｙ）を照射したのち、参考例１で得られた１×１０^７のＧＦＰ陽性骨髄細胞を、３１Ｇの針で尾静脈に注入し、骨髄移植を行った。骨髄移植された一部の群のマウスに、骨髄移植の翌日からダルテパリンナトリウム５０ＩＵ／ｋｇを２８日間連続腹腔内投与し、四塩化炭素＋ダルテパリンナトリウム投与群とした。ダルテパリンナトリウムを投与しなかったマウスは、四塩化炭素投与群とした。また、四塩化炭素を投入していないＣ５７／Ｂ６マウスに対して、上と同様にして１×１０^７のＧＦＰ陽性骨髄細胞を注入して骨髄移植したものを用意し、コントロール群とした。
〔肝小葉組織の調製〕
それぞれの群のマウスについて、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）バッファーによって心臓経由で肝臓をかん流し、肝臓中に混入した血液細胞を除去した。かん流した肝臓を、４％パラホルムアルデヒドによって一晩固定したのち、数日間３０％スクロースで処理した。得られた肝臓組織をパウダードライアイスで凍結させ、低温保持装置（ＬＥＩＣＡＣＭ１９００、（株）ＦＩＮＥＴＥＣ）によって１８μｍの組織切片とした。
四塩化炭素投与群の組織のＨＥ（ヘマトキシリンエオシン）染色像、アザン染色像の代表的な顕微鏡写真を、それぞれ図１ａ、図１ｂに示す。図１ａに示すとおり、炎症細胞の浸潤は認められなかったが、図１ｂのように、肝組織の線維化が認められ、肝障害が起こっていることが確かめられた。

実施例２ＧＦＰ陽性細胞、ＣＤ３１陽性細胞の観察
得られた組織の抗ＧＦＰ抗体染色像、および抗ＣＤ３１抗体染色像を観察した。すなわち、得られた組織切片をＰＢＳバッファーによって３回洗浄したのち、１０％ヤギ血清に１時間浸漬した。血清を洗浄後、抗ＧＦＰ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で１時間処理し、続いて、ＴＲＩＴＣヤギ抗ＩｇＧ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を３７℃で１時間培養し、２次抗体処理した。顕微鏡観察は、１％ゼラチン／生理食塩液を載せたスライドガラス上で行った。また、抗ＣＤ３１抗体染色像も、抗ＧＦＰ抗体の代わりに抗ＣＤ３１抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いた他は同様の手法により得た。

〔コントロール群〕
コントロール群由来の組織の染色像を図３に示す。図３ａ、ｄは、抗ＧＦＰ抗体染色像を示す。また、図３ｄで示す領域における抗ＣＤ３１抗体（内皮細胞マーカー）染色像を、図３ｃに示す。図３ｂは、これら抗ＧＦＰ抗体染色像と抗ＣＤ３１抗体染色像を重ね合わせた像である。これらに示されるように、ＧＦＰ陽性細胞はわずかに観察されたが、ＧＦＰ陽性でありかつＣＤ３１陽性である細胞は、ほとんど見られなかった。

〔四塩化炭素投与群〕
四塩化炭素投与群における組織の抗ＧＦＰ抗体染色像を、図２、図４ａ、図４ｄに示す。図２、図４ａ、図４ｄに示されるとおり、肝小葉におけるＧＦＰ陽性細胞の大半の細胞は、門脈域から中心静脈域にかけて、網目構造状に広がっており、肝実質細胞の中にはほとんど観察されなかった。このことから、ＧＦＰ陽性細胞は類洞内皮細胞に密接に関係すると考えられる。
また、内皮細胞マーカーである抗ＣＤ３１抗体染色像を図４ｃに示し、同領域の抗ＧＦＰ抗体染色像（図４ｄ）との重ね合わせた像を図４ｂに示す。図４ｂ中の矢印は、ＧＦＰ陽性であるとともにＣＤ３１陽性である細胞を示す。これらに示されるように、ＧＦＰ陽性細胞の大半が、ＣＤ３１陽性であった。このことから、移植された骨髄細胞は、類洞内皮細胞に特異的に分化したものと考えられる。

〔四塩化炭素＋ダルテパリンナトリウム投与群〕
四塩化炭素投与群における組織の抗ＧＦＰ抗体染色像および抗ＣＤ３１抗体染色像を、図５に示す。図５ａ、ｄは抗ＧＦＰ抗体染色像を、図５ｃは抗ＣＤ３１抗体染色像を、図５ｂは図５ｄと図５ｃとの重ね合わせた像である。これらに示されるように、四塩化炭素投与群に比べて、ＧＦＰ陽性細胞の顕著な増加が観察された。また、ＧＦＰ陽性細胞の大半は、ＣＤ３１陽性であった。

〔分化誘導効率の定量的比較〕
得られた染色像をもとに、ＧＦＰ陽性かつＣＤ３１陽性細胞（ＧＦＰ＋ＣＤ３１＋細胞）の単位領域中における数を求め、上の３群間で比較した（図６）。図６に示されるように、コントロール群では１領域あたり１．０±１．２ときわめて少数であったのに対し、四塩化炭素投与群では１領域あたり３．８±１．３と多数であった。また、四塩化炭素＋ダルテパリンナトリウム投与群では１領域あたり８．３±１．３であり、骨髄細胞から分化した類洞内皮細胞数の顕著な増加が観察された（四塩化炭素投与群との対比でｐ＜０．０５）。以上のことから、肝炎を発症した肝臓に骨髄細胞を移植した場合、類洞内皮細胞に分化することが明らかになり、また、ダルテパリンナトリウムの投与により、この分化誘導効率が顕著に上昇することが明らかになった。

Claims

ヘパリンまたはその塩を有効成分とする骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導剤。
ヘパリンが低分子ヘパリンである請求項１記載の分化誘導剤。
骨髄細胞が、移植された骨髄細胞である請求項１または２記載の分化誘導剤。
対象組織に骨髄細胞を移植した後、ヘパリンまたはその塩を投与するものである請求項３記載の分化誘導剤。
対象組織が肝臓である請求項４記載の分化誘導剤。
対象組織が肝炎を発症している肝臓である請求項５記載の分化誘導剤。
内皮細胞が、肝類洞内皮細胞である請求項１〜６のいずれか１項記載の分化誘導剤。
ヘパリンまたはその塩を有効量投与することを特徴とする骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導方法。
ヘパリンが低分子ヘパリンである請求項８記載の分化誘導方法。
骨髄細胞が、移植された骨髄細胞である請求項８または９記載の分化誘導方法。
対象組織に骨髄細胞を移植した後、ヘパリンまたはその塩を投与するものである請求項１０記載の分化誘導方法。
対象組織が肝臓である請求項１１記載の分化誘導方法。
対象組織が肝炎を発症している肝臓である請求項１２記載の分化誘導方法。
内皮細胞が、肝類洞内皮細胞である請求項８〜１３のいずれか１項記載の分化誘導方法。
骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導剤の製造のためのヘパリンまたはその塩の使用。
ヘパリンが低分子ヘパリンである請求項１５記載の使用。
骨髄細胞が、移植された骨髄細胞である請求項１５または１６記載の使用。
対象組織に骨髄細胞を移植した後、ヘパリンまたはその塩を投与するものである請求項１７記載の使用。
対象組織が肝臓である請求項１８記載の使用。
対象組織が肝炎を発症している肝臓である請求項１９記載の使用。
内皮細胞が、肝類洞内皮細胞である請求項１５〜２０のいずれか１項記載の使用。