WO2007099711A1 - 分化誘導剤 - Google Patents

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Yoshiyuki Takei
Nobuyuki Enomoto
Nobuhiro Sato
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)

Definitions

  • the present invention relates to a differentiation inducer, in particular, a differentiation inducer from bone marrow cells to endothelial cells.
  • Endothelial cells are the cells that form the inner walls of blood vessels and lymphatic vessels. Among these, vascular endothelial cells are located at the contact points between blood and blood vessel walls and play a role in controlling the permeability of substances. It plays the role of information transmission between blood and tissues. These endothelial cells are known to be damaged by diseases such as hyperlipidemia, hypertension, and diabetes, and repair methods are being studied.
  • hepatic sinusoidal endothelial cells make important contributions to the expression of liver function through immune responses, inflammation control, microcirculation control, substance exchange, and the like.
  • Sinusoidal endothelial cells are extremely vulnerable to hypoxia damaging factors and their loss of function and cell death can be attributed to major liver diseases such as chronic hepatitis, cirrhosis, fulminant hepatic failure, liver cancer, and post-transplantation graph dysfunction. It plays a central role in the pathogenesis (non-patent literature "! ⁇ 3").
  • Non-Patent Documents 4 to 6 bone marrow cells have been suggested to be the origin of immature cells in various organs.
  • tissues such as liver are differentiated from transplanted bone marrow cells and regenerated. (Non-Patent Documents 7 to 9).
  • heparin is a heteropolysaccharide having a complex structure existing in the liver, small intestine, lung, skin, and the like, and has strong blood anticoagulant activity.
  • DIC blood coagulation syndrome
  • thromboembolism venous thrombosis, myocardial infarction, pulmonary embolism, cerebral embolism, limb arterial thromboembolism, intraoperative and postoperative thromboembolism, etc.
  • extracorporeal circulation devices such as hemodialysis and cardiopulmonary bypass, inserting a vascular catheter, or transfusions and blood tests.
  • heparin administration has been reported to increase the expression of hepatocyte growth factor (HG F), a growth factor of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells, and promote liver regeneration (Non-patent Document 1). 0 ⁇ 1 2).
  • HG F hepatocyte growth factor
  • Non-patent Document 1 a growth factor of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells
  • Non-Patent Document 1 Ta kei Y, eta I. Ta retedenedeliverytosin usoidalendothelia I eel I s: DNA nanoassociatebearingh ya I uronan—g I ycoca I y x. FASEB J, 2 004: 1 8: 699-701. (1 0. 1 096 / fj. 03-0494 fje).
  • Non-patent document 2 Bach FH, Robson SC, Winkler H, eta I. Barrierstoxenotransp I antatio n. Nature Med 1 995; 1: 869-873
  • Non-patent document 3 Mochida, S., O ata, I., H irata, K., Ohta, Y., Y amada, S., and F ujiwara, K. (1 990) Provocation of ma ssivehepaticnecrosisb yendotoxinafterpartia I hepatect omy inrats. Ga stroenterology 99, 77 1- / / 7
  • Non-Patent Document 4 Krause DS, eta I. Cell 2001; 1 05: 369-77.
  • Non-Patent Document 5 Tanaka R, eta I. N euroscienc e 2003; 1 1 7: 531 -9.
  • Non-Patent Document 6 Jac k son K A, e t a I. J C lin I n v est 2001; 1 07: 1 395-402.
  • Non-Patent Document 7 F u j i i H, e t a I. J H e p a tol 20 02: 36: 653-9.
  • Non-Patent Document 8 F e r r y N, e t a I. J H e p a t o l 20
  • Non-patent document 9 G r omp e M. S e min L i v e 2003 2003; 2
  • Non-Patent Document 10 Mats umo t o K, et a I. B i o c h em B i o p h ys Res Com n 1 996; 227: 455-6
  • Non-Patent Document 11 N aka o T, e t a I. J H e pa t o l 2 002: 37: 87-92.
  • Non-Patent Document 12 Ishi i T, e ta I. J B i o c h em (T o kyo) 1 995; 1 1 7: 1 1 05- 1 2.
  • an object of the present invention is to provide an agent for inducing differentiation of bone marrow cells into endothelial cells.
  • heparin or a salt thereof conventionally used as a blood coagulation inhibitor or the like significantly promotes differentiation induction from bone marrow cells to endothelial cells.
  • the present invention provides an agent for inducing differentiation of bone marrow cells into endothelial cells, comprising heparin or a salt thereof as an active ingredient; and administering an effective amount of heparin or a salt thereof.
  • a method for inducing differentiation from bone marrow cells to endothelial cells; for the production of a differentiation inducer from bone marrow cells to endothelial cells The use of heparin or a salt thereof is provided.
  • heparin or a salt thereof has an action of inducing differentiation from bone marrow cells to endothelial cells, it can be used as an active ingredient of an agent for inducing differentiation from bone marrow cells to endothelial cells.
  • differentiation-inducing agent of the present invention differentiation from bone marrow cells to endothelial cells can be efficiently performed in vitro, and when administered in vivo, regeneration of organs with impaired endothelial cells can be performed. Can be used.
  • the differentiation-inducing agent of the present invention can provide an excellent differentiation-inducing effect on endothelial cells, particularly by transplanting bone marrow cells to a target tissue developing a disease such as inflammation.
  • FIG. 1a Azan staining image (Fig. 1b).
  • FIG. 2 is an anti-G F P antibody stained image of hepatic lobule in the carbon tetrachloride administration group.
  • FIG. 3 Anti-G F P antibody-stained image (Fig. 3a, d), anti-CD31 antibody-stained image (Fig. 3c) and superimposed image (Fig. 3b) of liver lobule in the control group.
  • FIG. 4 Anti-G FP antibody-stained image (Fig. 4a, d), anti-CD31 antibody-stained image (Fig. 4c) and superimposed image (Fig. 4b) of liver lobule in the carbon tetrachloride administration group.
  • FIG. 5 Anti-G F P antibody staining image (Fig. 5 a, d), anti-CD 31 antibody staining image (Fig. 5 c) and overlay image of liver lobule in the group treated with carbon tetrachloride + dalteparin sodium
  • FIG. 6 is a graph showing a comparison of 0 “ ⁇ + ⁇ 031 + cell count in each group.
  • the heparin used in the differentiation-inducing agent of the present invention is, for example, obtained from the liver, lung or intestinal mucosa of a healthy edible animal (eg, urchin, pig, etc.), and uronic acid and darcosamine are alternately used.
  • a healthy edible animal eg, urchin, pig, etc.
  • uronic acid and darcosamine are alternately used.
  • examples include sulfates of mucopolysaccharides having a structure of 1, 4 bonds and an average molecular weight of 5000-20000.
  • Parin is preferably a low molecular weight heparin from the viewpoint of obtaining excellent differentiation induction efficiency. Examples of the low molecular weight heparin include those having an average molecular weight of 200000 to 10:00.
  • the low molecular weight heparin is highly safe because it has a low risk of bleeding and the like, and has an excellent differentiation induction promoting activity, so the average relative molecular weight is about 500,000 and 90% has a molecular weight of 20 Dalteparin having a distribution in the range of 0 to 900 and a degree of sulfate esterification of 2 to 2.5 per disaccharide is preferred.
  • heparin salts include sodium salts and calcium salts.
  • Heparin has already been developed as a pharmaceutical ⁇ cosmetic raw material, and a commercially available product can be used. Heparin is prepared by a method according to the method disclosed in the 14th Japanese Pharmacopoeia. be able to. Low molecular weight heparin can be obtained by decomposing heparin derived from ushi or porcine intestinal mucosa with hydrogen peroxide and cupric sulfate.
  • heparin induced differentiation from bone marrow cells to endothelial cells in a model mouse with carbon tetrachloride hepatopathy. Therefore, heparin can be used as an active ingredient of an agent for inducing differentiation from bone marrow cells to endothelial cells.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • heparin has been reported to increase the expression of hepatocyte growth factor (HGF), thereby proliferating nonparenchymal cells such as liver parenchymal cells and sinusoidal endothelial cells.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • nonparenchymal cells such as liver parenchymal cells and sinusoidal endothelial cells.
  • the differentiation inducer of the present invention is used for inducing differentiation from bone marrow cells in vivo, as well as from bone marrow cells separated from the body and cultured in an in vitro system. It is suitably used for induction.
  • the differentiation inducer of the present invention can be used for differentiation induction from bone marrow cells inherent in a living body and differentiation induction of bone marrow cells transplanted into a target tissue, and among them, high differentiation induction efficiency can be obtained. Because of its excellent therapeutic effect on diseases, it is preferably used for inducing differentiation of bone marrow cells transplanted into the target tissue.
  • the present invention The differentiation inducer is preferably administered with heparin or a salt thereof after transplantation.
  • the differentiation-inducing agent of the present invention is preferably used when the target tissue to which bone marrow cells are transplanted is the liver because heparin or a salt thereof provides excellent differentiation induction efficiency.
  • An organ into which bone marrow cells are transplanted is preferably used when a disease such as inflammation has developed.
  • the disease include fulminant hepatitis, hepatitis such as chronic hepatitis, end-stage liver disease such as cirrhosis, and liver cancer. It is preferably used when hepatitis develops.
  • the differentiation-inducing agent of the present invention can induce differentiation of the liver into sinusoidal endothelial cells. It has been reported that bone marrow cells transplanted into the liver are differentiated into hepatocytes, but differentiation into sinusoidal endothelial cells can also be induced by the differentiation inducer of the present invention.
  • Examples of the subject to which the differentiation-inducing agent of the present invention is used include mammals such as rabbits, mice, and rabbits.
  • the differentiation inducer of the present invention is used in the form of a general pharmaceutical preparation, and typical examples thereof include injections (solutions, suspensions, etc.) and the like.
  • solutions, emulsions and suspensions are preferably sterilized and isotonic with blood clots, and are used in this field as diluents when molded into these forms.
  • water, ethanol, macrogol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters and the like can be used.
  • the amount of sodium chloride, glucose or glycerin necessary to prepare an isotonic solution may be contained in the pharmaceutical preparation, and a normal solubilizing agent, buffer, soothing agent, etc. may be added. It's good.
  • the dosage of these pharmaceutical preparations of the present invention is appropriately selected according to the usage, patient age, sex, disease severity and other conditions.
  • the mass of heparin is 1 per 1 kg body weight.
  • Approximately 5 1 .U.ZK g to 10 0 I 0 U.ZK g should be infused in 1 hour to 24 hours.
  • mice Eight-week-old GFP transgeneic mice (OkabeM, etaIFEBSLett1997: 407: 313-9) were treated with 5_fluorouracil (150 gZg BW) to destroy the proliferating cells. 48 hours later, the limbs were removed by cervical dislocation, and then washed with Dulbecco's modified Eagle medium (GI BCO, Grand Island, New York) using a 28G needle. GFP-positive bone marrow cells were obtained.
  • 5_fluorouracil 150 gZg BW
  • mice Female 8-week-old C57ZB6 mice (Nippon Charles Ribaichi Co., Ltd.)
  • 0.2 ml of carbon tetrachloride per kg was applied twice a week for 4 weeks. 4 weeks four mice systemic after carbon tetrachloride administration, after irradiation lethal dose of X-rays (1 0 G y), a 0 FP-positive bone marrow cells 1 X 1 0 7 obtained in Reference Example 1, Bone marrow transplantation was performed by injecting into the tail vein with a 31 G needle. A group of mice that had undergone bone marrow transplantation received dalteparin sodium 50 I UZkg intraperitoneally for 28 days from the day after bone marrow transplantation, to obtain a carbon tetrachloride + dalteparin sodium administration group.
  • mice that did not receive dalteparin sodium were treated with carbon tetrachloride. Further, carbon tetrachloride and then against the C57ZB6 mice not put chloride, by injecting G FP-positive bone marrow cells in the same manner as the above 1 X 1 0 7 prepared those bone marrow transplantation, and the control group .
  • liver was perfused via the heart with PBS (phosphate buffered saline) buffer to remove blood cells contaminated in the liver.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Perfused liver with 4% paraform After fixation with aldehyde, it was treated with 30% sucrose for several days.
  • the obtained liver tissue was frozen with powder dry ice and made into 18 m tissue sections using a cryostat (LEI CA CM 1 900, FI NETEC).
  • Figures 1a and 1b show typical photomicrographs of HE (hematoxylin eosin) -stained and azan-stained images of tissues in the carbon tetrachloride administration group, respectively. As shown in Fig. 1a, infiltration of inflammatory cells was not observed, but as shown in Fig. 1b, fibrosis of the liver tissue was observed, confirming that liver damage had occurred.
  • HE hematoxylin eosin
  • an anti-GFP antibody-stained image and an anti-CD31 antibody-stained image of the obtained tissue were observed. That is, the obtained tissue section was washed 3 times with PBS buffer and then immersed in 10% goat serum for 1 hour. After washing the serum, it was treated with anti-G FP antibody (Santa Cruz Biotechnology) for 1 hour, followed by TRITC goat anti-Ig G antibody (Santa Cruz Biotechno Iogy) at 37 ° C. Incubated for 1 hour and treated with secondary antibody. Microscopic observation was performed on a glass slide on which 1% gelatin Z physiological saline was placed. An anti-CD31 antibody staining image was also obtained in the same manner except that an anti-CD31 antibody (BD Bioscience) was used instead of the anti-GFP antibody.
  • FIG. Figures 3a and d show anti-G F P antibody stained images.
  • an anti-CD31 antibody (endodermal cell marker) stained image in the region shown in Fig. 3d is shown in Fig. 3c.
  • Fig. 3b is an image obtained by superimposing these anti-GFP antibody-stained images and anti-CD31 antibody-stained images. As can be seen, a few GFP-positive cells were observed, but few cells were GFP-positive and CD31-positive.
  • Figures 2, 4a, and 4d show anti-GFP antibody-stained images of tissues in the carbon tetrachloride administration group.
  • Fig. 2 Fig. 4a, Fig. 4d, G in liver lobule
  • Most of the FP-positive cells spread in a network structure from the portal vein region to the central vein region, and were hardly observed in hepatocytes. This suggests that GFP-positive cells are closely related to sinusoidal endothelial cells.
  • an anti-CD31 antibody staining image as an endothelial cell marker is shown in Fig. 4c, and an image superimposed with the anti-GFP antibody staining image (Fig. 4d) in the same region is shown in Fig. 4b.
  • the arrows in Figure 4b indicate cells that are GFP positive and CD 3 1 positive. As can be seen, the majority of GFP positive cells were CD31 positive. This suggests that the transplanted bone marrow cells have differentiated specifically into sinusoidal endothelial cells.
  • Fig. 5 shows the anti-GFP antibody-stained and anti-CD31 antibody-stained images of the tissues in the carbon tetrachloride administration group.
  • Figures 5a and 5d are anti-GFP antibody-stained images
  • Figure 5c is an anti-CD31 antibody-stained image
  • Figure 5b is a superimposed image of Figures 5d and 5c.
  • a marked increase in G F P positive cells was observed compared to the carbon tetrachloride administration group.
  • the majority of G F P positive cells were CD 31 positive.
  • the number of GFP-positive and CD31-positive cells (GFFP + CD31 + cells) in the unit region was determined and compared among the above three groups (Fig. 6).
  • the control group had a very small number of 1.0 ⁇ 1.2 per region, whereas the carbon tetrachloride group had a large number of 3.8 ⁇ 1.3 per region. there were.
  • the carbon tetrachloride + dalteparin sodium administration group 8.3 ⁇ 1.3 per region, and a marked increase in the number of sinusoidal endothelial cells differentiated from bone marrow cells was observed (carbon tetrachloride administration group). In contrast with p 0. 05).

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Abstract

　骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導剤を提供すること。 　ヘパリンまたはその塩を有効成分とする骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導剤。

Description

明 細 書
分化誘導剤
技術分野
[0001 ] 本発明は、 分化誘導剤、 特に骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導剤に関す る。
背景技術
[0002] 内皮細胞は、 血管やリンパ管の内壁をなす細胞であり、 このうち血管内皮 細胞は、 血液と血管壁との接点に位置し、 物質の透過性を制御する役割を担 うとともに、 血液と組織との情報伝達の役割を担っている。 これら内皮細胞 は、 高脂血症、 高血圧症、 糖尿病などの疾患によって損傷を受けることが知 られており、 修復方法の研究がされている。
とりわけ、 肝類洞内皮細胞は免疫応答，炎症制御、 微小循環制御、 物質交 換などを介して、 肝機能発現に重要な貢献をなしている。 類洞内皮細胞は、 ハイポキシァゃ障害因子に極めて脆弱であり、 その機能障害や細胞死による 損失は、 慢性肝炎、 肝硬変、 劇症肝不全、 肝癌、 移植後のグラフ卜障害など 主要な肝疾患においてその病態惹起機序の中心的な役割を果たしている （非 特許文献"!〜 3 ) 。
一方、 骨髄細胞は、 さまざまな臓器における未成熟細胞の起源となること が示唆されており （非特許文献 4〜6 ) 、 近年肝臓などの組織においては、 移植した骨髄細胞から分化させて再生させることが検討されている （非特許 文献 7〜9 ) 。
これらの背景から、 骨髄由来細胞の分化誘導を用いることにより、 損傷し た類洞内皮細胞を正所性に再生することが可能になれば、 現在有効な治療法 が存在しない肝硬変、 劇症肝炎など難治性肝疾患の画期的な治療法になるこ とが期待される。
[0003] 一方、 へパリンは、 肝臓、 小腸、 肺、 皮膚などに存在する複雑な構造をも つへテロ多糖であり、 強い血液抗凝固活性を有することから、 汎発性血管内 血液凝固症候群 （D I C) の治療、 種々の血栓塞栓症 （静脈血栓症、 心筋梗 塞症、 肺塞栓症、 脳塞栓症、 四肢動脈血栓塞栓症、 術中 ·術後の血栓塞栓症 など） の治療および予防のほか、 血液透析，人工心肺などの体外循環装置使 用時や血管カテーテル挿入時または輸血および血液検査の際などにおける血 液凝固の防止に用いられている。 また、 へパリンの投与により、 肝細胞や類 洞内皮細胞の増殖因子である肝細胞成長因子 （HG F) の発現を上昇させ、 肝再生を促進させることが報告されている （非特許文献 1 0〜1 2) 。 しか しながら、 通常の肝再生においては、 既存の肝細胞の複製のみが行われ、 骨 髄細胞からの分化は稀であり、 骨髄細胞の分化との関係については何ら知ら れていない。
非特許文献 1 ： Ta k e i Y， e t a I . Ta r e t e d e n e d e l i v e r y t o s i n u s o i d a l e n d o t h e l i a I e e l I s : D N A n a n o a s s o c i a t e b e a r i n g h y a I u r o n a n— g I y c o c a I y x. FASEB J , 2 004 : 1 8 : 699-701. (1 0. 1 096/ f j . 03-0494 f j e) .
非特許文献 2 : Ba c h FH， Ro b s o n SC， W i n k l e r H , e t a I . Ba r r i e r s t o x e n o t r a n s p I a n t a t i o n. N a t u r e Me d 1 995 ; 1 : 869-873 非特許文献 3： Mo c h i d a, S. ， O a t a, I . , H i r a t a, K. ， O h t a , Y. ， Y a m a d a , S. ， a n d F u j i w a r a , K. ( 1 990) P r o v o c a t i o n o f ma s s i v e h e p a t i c n e c r o s i s b y e n d o t o x i n a f t e r p a r t i a I h e p a t e c t omy i n r a t s . Ga s t r o e n t e r o l o g y 99 , 77 1 - / / 7 非特許文献 4： K r a u s e DS， e t a I . Ce l l 2001 ; 1 05 : 369-77.
非特許文献 5： T a n a k a R, e t a I . N e u r o s c i e n c e 2003 ; 1 1 7 : 531 -9.
非特許文献 6： J a c k s o n K A, e t a I . J C l i n I n v e s t 2001 ； 1 07 ： 1 395-402.
非特許文献 7： F u j i i H， e t a I . J H e p a t o l 20 02 : 36 : 653-9.
非特許文献 8： F e r r y N， e t a I . J H e p a t o l 20
02 ； 36 ： 659-7.
非特許文献 9： G r omp e M. S e m i n L i v e r 2003 ； 2
3 ： 363-72.
非特許文献 10： Ma t s umo t o K， e t a I . B i o c h em B i o p h y s Re s Commu n 1 996 ; 227 : 455-6
1.
非特許文献 11 : N a k a o T， e t a I . J H e p a t o l 2 002 : 37 : 87-92.
非特許文献 12： I s h i i T， e t a I . J B i o c h em (T o k y o) 1 995 ; 1 1 7 : 1 1 05- 1 2.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] したがって、 本発明の目的は、 骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導剤を提 供することにある。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、 鋭意検討したところ、 従来血液凝固阻止剤などとして用い られていたへパリンまたはその塩が、 骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導を 顕著に促進させることを見出した。
[0007] すなわち、 本発明は、 へパリンまたはその塩を有効成分とする骨髄細胞か ら内皮細胞への分化誘導剤を提供するものであり ；へパリンまたはその塩を 有効量投与することを特徴とする骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導方法を 提供するものであり ；骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導剤の製造のための へパリンまたはその塩の使用を提供するものである。
発明の効果
[0008] へパリンまたはその塩は、 骨髄細胞から内皮細胞への分化を誘導する作用 を有することから、 骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導剤の有効成分として 用いることができる。 本発明の分化誘導剤を用いれば、 i n V i t r oで の骨髄細胞から内皮細胞への分化を効率的に行うことができるほか、 生体内 に投与することにより、 内皮細胞に障害のある器官の再生に供することがで きる。 本発明の分化誘導剤は、 特に、 炎症などの疾患を発症している対象組 織に骨髄細胞を移植したのち用いることにより、 内皮細胞への優れた分化誘 導効果が得られる。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]四塩化炭素投与群の肝小葉の HE (へマトキシリンェォシン） 染色像
(図 1 a) 、 ァザン染色像 （図 1 b) である。
[図 2]四塩化炭素投与群の肝小葉の抗 G F P抗体染色像である。
[図 3]コントロール群の肝小葉の抗 G F P抗体染色像 （図 3 a、 d) 、 抗 CD 31抗体染色像 （図 3 c) および重ね合わせ像 （図 3 b) である。
[図 4]四塩化炭素投与群の肝小葉の抗 G FP抗体染色像 （図 4 a、 d) 、 抗 C D31抗体染色像 （図 4 c) および重ね合わせ像 （図 4 b) である。
[図 5]四塩化炭素 +ダルテパリンナ卜リゥム投与群の肝小葉の抗 G F P抗体染 色像 （図 5 a、 d) 、 抗 CD 31抗体染色像 （図 5 c) および重ね合わせ像
(図 5 b) である。
[図6]0「卩+〇031 +細胞数の、 各群における比較を示したグラフである 発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明の分化誘導剤に用いられるへパリンとしては、 例えば、 健康な食用 獣 （例えば、 ゥシ、 ブタ等） の肝臓、 肺あるいは腸粘膜から得られ、 ゥロン 酸とダルコサミンが交互に 1， 4結合した構造を有し、 5000〜 2000 0の平均分子量からなるムコ多糖類の硫酸エステルが挙げられる。 また、 へ パリンとしては、 優れた分化誘導効率が得られる点から、 低分子へパリンが 好ましい。 低分子へパリンとしては、 平均分子量 2 0 0 0〜 1 0 0 0 0のも のが挙げられる。 低分子へパリンとしては、 出血等のリスクが低いため安全 性が高く、 また、 分化誘導促進活性に優れている点から、 平均相対分子量が 約 5 0 0 0で、 9 0 %が分子量 2 0 0 0〜 9 0 0 0の範囲に分布し、 硫酸ェ ステル化の度合が二糖当たり 2〜 2 . 5であるダルテパリンが好ましい。 へ パリンの塩としては、 ナトリウム塩、 カルシウム塩等が例示される。
[0011 ] へパリンは既に医薬■化粧品原料として開発されており市販品を利用する ことができるが、 へパリンの調製は、 第 1 4日本薬局方に開示された方法等 に準じた方法により行うことができる。 低分子へパリンは、 ゥシまたはブタ 腸粘膜由来のへパリンを過酸化水素と硫酸第二銅によリ分解して得ることが できる。
[0012] 後記実施例に示すとおり、 へパリンは、 四塩化炭素肝障害モデルマウスに おいて、 骨髄細胞から内皮細胞への分化を誘導した。 したがって、 へパリン は、 骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導剤の有効成分として用いることがで きる。 従来へパリンは、 肝細胞成長因子 （H G F ) の発現を上昇させ、 それ により肝実質細胞や類洞内皮細胞などの非実質細胞を増殖させることが報告 されている。 しかしながら、 通常の肝再生においては、 既存の肝細胞の複製 のみが行われ、 骨髄細胞からの分化は稀であり骨髄細胞の分化との関係につ いては何ら知られておらず、 へパリンが骨髄細胞の分化を誘導することは意 外なことである。
[0013] 本発明の分化誘導剤は、 生体内における骨髄細胞の他、 生体内から分離さ れ i n v i t r oの系で培養される骨髄細胞からの分化誘導に用いられる が、 生体内における骨髄細胞の分化誘導に好適に用いられる。
また、 本発明の分化誘導剤は、 生体が本来有する骨髄細胞からの分化誘導 、 および対象組織に移植された骨髄細胞の分化誘導に用いることができ、 こ のうち、 高い分化誘導効率が得られ疾患の治療効果に優れる点から、 対象組 織に移植された骨髄細胞の分化誘導に好適に用いられる。 この場合、 本発明 の分化誘導剤は、 移植後にへパリンまたはその塩を投与するのが好ましい。 本発明の分化誘導剤は、 へパリンまたはその塩によリ優れた分化誘導効率 が得られる点から、 骨髄細胞が移植される対象組織が肝臓である場合に好適 に用いられる。 また、 骨髄細胞が移植される臓器は、 炎症等の疾患を発症し ている場合に好適に用いられる。 臓器が肝臓の場合、 疾患としては、 劇症肝 炎、 慢性肝炎等の肝炎、 肝硬変などの終末期肝疾患、 肝臓癌が挙げられ、 肝 炎を発症している場合に好適に用いられる。 肝炎を発症している肝臓に対し て用いた場合、 本発明の分化誘導剤により、 肝臓の類洞内皮細胞への分化を 誘導することもできる。 肝臓に移植された骨髄細胞は、 肝実質細胞などに分 化することも報告されているが、 本発明の分化誘導剤により、 類洞内皮細胞 への分化を誘導することもできる。
[0014] 本発明の分化誘導剤が用いられる対象としては、 例えば、 ヒ卜、 マウス、 ラッ卜などの哺乳類が挙げられる。
[0015] 本発明の分化誘導剤は、 一般的な医薬製剤の形態で用いられるが、 その代 表的なものとして、 注射剤 （液剤、 懸濁剤等） 等が挙げられる。
[0016] 注射剤として調製する場合、 液剤、 乳剤および懸濁剤は殺菌され、 かっ血 液と等張であることが好ましく、 これらの形態に成形するに際しては、 希釈 剤としてこの分野において慣用されているもの、 例えば水、 エタノール、 マ クロゴール、 プロピレングリコール、 エトキシ化イソステアリルアルコール 、 ポリオキシ化イソステアリルアルコール、 ポリオキシエチレンソルビタン 脂肪酸エステル類等を使用することができる。 この場合等張性の溶液を調製 するのに必要な量の食塩、 ブドウ糖あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有 させてもよく、 また通常の溶解補助剤、 緩衝剤、 無痛化剤等を添加してもよ い。
[0017] 本発明のこれら医薬製剤の投与量は、 用法、 患者の年齢、 性別、 疾患の程 度およびその他の条件により適宜選択されるが、 通常へパリンの質量として 、 体重 1 k g当り、 一日約 5 1 . U . Z K g〜 1 0 0 I . U . Z K gを 1時 間〜 2 4時間で注入するのがよい。 実施例
[0018] 以下に実施例を示し、 本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明はこれら 実施例に制限されるものではない。
[0019] 参考例 1 G FP陽性骨髄細胞の調製
8週齢 G F Pトランスジエニックマウス （O k a b e M, e t a I FEBS L e t t 1 997 : 407 : 31 3— 9) を、 5 _フルォ ロウラシル （1 50 gZg BW) で処理し、 増殖細胞を破壊した。 48 時間後、 頸椎脱臼により屠殺し四肢を除去したのち、 28G針を用いてダル べッコ修正イーグル培地 （G I BCO, G r a n d I s l a n d, N ew Yo r k) により洗い出し、 大腿骨、 頸骨髄腔から G FP陽性骨髄細 胞を得た。
[0020] 実施例 1 骨髄移植された肝炎発症マウスからの肝小葉組織の調製
〔肝炎発症マウスへの骨髄移植〕
メス 8週齢 C57ZB6マウス （日本チャールズリバ一 （株） ） に、 個体
1 k gあたり 0. 2m lの四塩化炭素を、 4週間にわたり週 2回の頻度で投 与した。 4週間の四塩化炭素投与後のマウスの全身に、 致死量の X線 （1 0 G y) を照射したのち、 参考例 1で得られた 1 X 1 07の0 F P陽性骨髄細胞 を、 31 Gの針で尾静脈に注入し、 骨髄移植を行った。 骨髄移植された一部 の群のマウスに、 骨髄移植の翌日からダルテパリンナトリウム 50 I UZk gを 28日間連続腹腔内投与し、 四塩化炭素 +ダルテパリンナ卜リゥム投与 群とした。 ダルテパリンナトリウムを投与しなかったマウスは、 四塩化炭素 投与群とした。 また、 四塩化炭素を投入していない C57ZB6マウスに対 して、 上と同様にして 1 X 1 07の G FP陽性骨髄細胞を注入して骨髄移植し たものを用意し、 コントロール群とした。
〔肝小葉組織の調製〕
それぞれの群のマウスについて、 PBS (p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e) バッファーによって心臓経由で肝臓をかん流し、 肝臓中に混入した血液細胞を除去した。 かん流した肝臓を、 4%パラホルム アルデヒドによってー晚固定したのち、 数日間 30%スクロースで処理した 。 得られた肝臓組織をパウダードライアイスで凍結させ、 低温保持装置 （L E I CA CM 1 900、 （株） F I NETEC) によって 1 8 mの組 織切片とした。
四塩化炭素投与群の組織の HE (へマトキシリン ェォシン） 染色像、 ァザ ン染色像の代表的な顕微鏡写真を、 それぞれ図 1 a、 図 1 bに示す。 図 1 a に示すとおり、 炎症細胞の浸潤は認められなかったが、 図 1 bのように、 肝 組織の線維化が認められ、 肝障害が起こっていることが確かめられた。
[0021] 実施例 2 G F P陽性細胞、 C D 31陽性細胞の観察
得られた組織の抗 G F P抗体染色像、 および抗 C D 31抗体染色像を観察 した。 すなわち、 得られた組織切片を PBSバッファーによって 3回洗浄し たのち、 1 0%ャギ血清に 1時間浸潰した。 血清を洗浄後、 抗 G FP抗体 （ S a n t a C r u z B i o t e c h n o l o g y社） で 1時間処理し、 続いて、 T R I T Cャギ抗 I g G抗体 （S a n t a C r u z B i o t e c h n o I o g y社） を 37°Cで 1時間培養し、 2次抗体処理した。 顕微鏡 観察は、 1 %ゼラチン Z生理食塩液を載せたスライドガラス上で行った。 ま た、 抗 CD 31抗体染色像も、 抗 G FP抗体の代わりに抗 CD 31抗体 （B D B i o s c i e n c e社） を用いた他は同様の手法により得た。
[0022] 〔コントロール群〕
コントロール群由来の組織の染色像を図 3に示す。 図 3 a、 dは、 抗 G F P抗体染色像を示す。 また、 図 3 dで示す領域における抗 CD 31抗体 （内 皮細胞マーカー） 染色像を、 図 3 cに示す。 図 3 bは、 これら抗 G FP抗体 染色像と抗 CD 31抗体染色像を重ね合わせた像である。 これらに示される ように、 G FP陽性細胞はわずかに観察されたが、 G FP陽性でありかつ C D31陽性である細胞は、 ほとんど見られなかった。
[0023] 〔四塩化炭素投与群〕
四塩化炭素投与群における組織の抗 G FP抗体染色像を、 図 2、 図 4 a、 図 4 dに示す。 図 2、 図 4 a、 図 4 dに示されるとおり、 肝小葉における G F P陽性細胞の大半の細胞は、 門脈域から中心静脈域にかけて、 網目構造状 に広がっており、 肝実質細胞の中にはほとんど観察されなかった。 このこと から、 G F P陽性細胞は類洞内皮細胞に密接に関係すると考えられる。 また、 内皮細胞マーカーである抗 CD 3 1抗体染色像を図 4 cに示し、 同 領域の抗 G F P抗体染色像 （図 4 d) との重ね合わせた像を図 4 bに示す。 図 4 b中の矢印は、 G F P陽性であるとともに CD 3 1陽性である細胞を示 す。 これらに示されるように、 G F P陽性細胞の大半が、 CD 3 1陽性であ つた。 このことから、 移植された骨髄細胞は、 類洞内皮細胞に特異的に分化 したものと考えられる。
[0024] 〔四塩化炭素 +ダルテパリンナ卜リゥム投与群〕
四塩化炭素投与群における組織の抗 G F P抗体染色像および抗 C D 3 1抗 体染色像を、 図 5に示す。 図 5 a、 dは抗 G F P抗体染色像を、 図 5 cは抗 CD 3 1抗体染色像を、 図 5 bは図 5 dと図 5 cとの重ね合わせた像である 。 これらに示されるように、 四塩化炭素投与群に比べて、 G F P陽性細胞の 顕著な増加が観察された。 また、 G F P陽性細胞の大半は、 CD 3 1陽性で あった。
[0025] 〔分化誘導効率の定量的比較〕
得られた染色像をもとに、 G F P陽性かつ CD 3 1陽性細胞 （G F P + C D 3 1 +細胞） の単位領域中における数を求め、 上の 3群間で比較した （図 6) 。 図 6に示されるように、 コントロール群では 1領域あたり 1. 0± 1 . 2ときわめて少数であつたのに対し、 四塩化炭素投与群では 1領域あたり 3. 8± 1. 3と多数であった。 また、 四塩化炭素 +ダルテパリンナ卜リウ ム投与群では 1領域あたり 8. 3 ± 1. 3であり、 骨髄細胞から分化した類 洞内皮細胞数の顕著な増加が観察された （四塩化炭素投与群との対比で pく 0. 05) 。 以上のことから、 肝炎を発症した肝臓に骨髄細胞を移植した場 合、 類洞内皮細胞に分化することが明らかになり、 また、 ダルテパリンナ卜 リウムの投与により、 この分化誘導効率が顕著に上昇することが明らかにな

Claims

請求の範囲
[I] へパリンまたはその塩を有効成分とする骨髄細胞から内皮細胞への分化誘 導剤。
[2] へパリンが低分子へパリンである請求項 1記載の分化誘導剤。
[3] 骨髄細胞が、 移植された骨髄細胞である請求項 1または 2記載の分化誘導 剤。
[4] 対象組織に骨髄細胞を移植した後、 へパリンまたはその塩を投与するもの である請求項 3記載の分化誘導剤。
[5] 対象組織が肝臓である請求項 4記載の分化誘導剤。
[6] 対象組織が肝炎を発症している肝臓である請求項 5記載の分化誘導剤。
[7] 内皮細胞が、 肝類洞内皮細胞である請求項 1〜 6のいずれか 1項記載の分 化誘導剤。
[8] へパリンまたはその塩を有効量投与することを特徴とする骨髄細胞から内 皮細胞への分化誘導方法。
[9] へパリンが低分子へパリンである請求項 8記載の分化誘導方法。
[10] 骨髄細胞が、 移植された骨髄細胞である請求項 8または 9記載の分化誘導 方法。
[I I] 対象組織に骨髄細胞を移植した後、 へパリンまたはその塩を投与するもの である請求項 1 0記載の分化誘導方法。
[12] 対象組織が肝臓である請求項 1 1記載の分化誘導方法。
[13] 対象組織が肝炎を発症している肝臓である請求項 1 2記載の分化誘導方法
[14] 内皮細胞が、 肝類洞内皮細胞である請求項 8〜 1 3のいずれか 1項記載の 分化誘導方法。
[15] 骨髄細胞から内皮細胞への分化誘導剤の製造のためのへパリンまたはその 塩の使用。
[16] へパリンが低分子へパリンである請求項 1 5記載の使用。
[17] 骨髄細胞が、 移植された骨髄細胞である請求項 1 5または 1 6記載の使用
[18] 対象組織に骨髄細胞を移植した後、 へパリンまたはその塩を投与するもの である請求項 1 7記載の使用。
[19] 対象組織が肝臓である請求項 1 8記載の使用。
[20] 対象組織が肝炎を発症している肝臓である請求項 1 9記載の使用。
[21] 内皮細胞が、 肝類洞内皮細胞である請求項 1 5〜 2 0のいずれか 1項記載 の使用。
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