JPWO2005100447A1 - Ｐｅｇ−機能性核酸コンジュケート - Google Patents

Abstract

機能性オリゴヌクレオチドとポリ（エチレンオキシド）とのコンジュゲート、ならびに該コンジュゲートとカチオン性ポリマーによるポリイオン複合体およびそのミセルが提供される。このミセルによれば、オリゴヌクレオチドの動物細胞内での安定性が図られ、そして標的遺伝子への特異的結合性が向上する。

Description

本発明は、生化学、薬剤学の分野で有用なオリゴヌクレオチドの誘導体、より具体的には生理学的環境下で安定に存在することができ、しかもある特定の標的遺伝子のヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドとポリ（エチレンオキシド）のコンジュゲート、さらには、該コンジュゲートのポリイオン複合体に関する。

遺伝子を生体内の標的部位へ送達するためのキャリアとして、改変レトロウイルス、改変アデノウイルス等に加え、安全性の観点から、合成キャリア、例えば、カチオニックリポソーム、膜融合リポソーム、ポリカチオン（例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリ−Ｌ−リジン、キトサン）、ポリカチオン含有ブロックコポリマー等の使用が検討されてきた。就中、片岡を初めとする本発明者の一部により提案されたポリイオン複合体ミセル（ＰＩＣミセル）を利用するＤＮＡの送達系は、一般的に、薬物内包ミセルの安定性、標的細胞もしくは組織内への移行性、組織内での薬物の安定性が良く、有望な送達系である（例えば、下記の非特許文献１参照）。しかし、ある特定の標的遺伝子の発現を制御するために該遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する系では、上記のＰＩＣミセル系を利用しても分子量の比較的小さなオリゴヌクレオチドをＰＩＣミセル内に安定に保持することが困難な場合があった。
本発明者らの一部は、オリゴヌクレオチドであっても、それをポリ（エチレンオキシド）と共有結合させてコンジュゲートとした後、ポリカチオンとＰＩＣミセルを形成させることによりＰＩＣミセル内にオリゴヌクレオチドを比較的安定に保持できることを見出した。さらに、該コンジュゲートを形成する際に、連結基部分に生理学的環境下、特に、エンドソームのｐＨ（＝５．５）において開裂できるエステル結合を組み込むことにも成功し、公表した（例えば、下記の非特許文献２参照。）。また、こうしてＰＩＣミセル内に内包されたオリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヌクレアーゼの作用に抵抗性も示す。
他方、オリゴヌクレオチド誘導体それ自体がヌクレアーゼに抵抗性を示すものとして、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（例えば、下記の非特許文献３参照。）、ホスホロアミデートオリゴヌクレオチド（例えば、下記の非特許文献４参照。）および２′−Ｏ−メチルホスホエートオリゴヌクレオチド（例えば、下記の非特許文献５参照。）も合成され、一部は遺伝子治療法の確立を目差して臨床試験に供されているものもある。また、遺伝子治療の標的遺伝子の発現を確実に抑制することを目差し、標的遺伝子と特異的に共有結合により架橋し得るようにオリゴヌクレオチド内の２−アミノプリン環の６位に−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ（Ｏ）_ｎＰｈ（ここで、ｎは０〜２の整数を表す。）で表される基（ビニル基の前駆基）を導入した機能性オリゴヌクレオチドも提案されている（例えば、下記の非特許文献６または特許文献１参照）。具体的には、このような機能性オリゴヌクレオチドは、該ビニル基の前駆基を利用してｉｎ ｖｉｔｒｏで相補的な配列のオリゴヌクレオチドのシトシンのアミノ基と共有結合により架橋することも示されている。
引用文献の一覧
特開２００１−２０６８９６号公報 Ｋａｔａｏｋａ ｅｔ ａｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２９（１９９６）８５５６〜８５５７ Ｏｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００３，４，１４２６−１４３２ Ｓｔｅｐｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５３（１９９４）５３３６−５３４６ Ｂａｒａｋ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０００ ３９，１１５６−１１６１ Ｌｅｓｎｉｋ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９８，３７，６９９１−６９９７ Ｎａｇａｔｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，６７５３−６７５４

以上に述べたオリゴヌクレオチドおよびＰＩＣミセルはオリゴヌクレオチド（機能性オリゴヌクレオチドを包含する）のヌクレアーゼに対する抵抗性を高めるか、あるいは標的遺伝子への強固な結合を形成することに成功している。しかしながら、ヌクレアーゼに対する抵抗性を高め、かつ、生体の特定の器官または細胞内で標的遺伝子へ特異的に結合しうる機能性オリゴヌクレオチドまたはかようなオリゴヌクレオチドの送達系を提供することは、依然として必要である。本発明は、かようなニーズに応えるものである。
本発明は、ある一定のオリゴヌクレオチド（非特許文献２参照）とポリ（エチレンオキシド）のコンジュゲートを内包するＰＩＣミセルが動物細胞内に効果的に取り込まれ、しかも標的遺伝子の発現を強く抑制し得ることを見出した。また、非特許文献３および非特許文献４に記載された機能性オリゴヌクレオチドもポリ（エチレンオキシド）とのコンジュゲートを形成させ、ポリカチオンとのＰＩＣミセルにすると動物細胞内へ安定かつ、効果的に送達でき、しかも標的遺伝子の発現を抑制しうることも見出した。
さらに、これらのコンジュゲートは、水性媒体中で極めて可動性が高く、親水性の高いポリ（エチレンオキシド）鎖がオリゴヌクレオチド鎖に共有結合しているにもかかわらず、標的遺伝子と特異的に結合し（水素結合等を介して）、さらに機能性オリゴヌクレオチド（非特許文献４参照）とポリ（エチレンオキシド）のコンジュゲートにあっては、標的遺伝子の発現が非機能性オリゴヌクレオチドを用いたコンジュゲートよりも有意に強く抑制されるとの、驚くべき作用効果を奏することも見出された。これは、理論に拘束されるものでないがポリ（エチレンオキシド）またはその鎖が近傍に存在するにもかかわらず、機能性オリゴヌクレオチドの標的遺伝子への特異的な接近を可能にし、しかも機能性オリゴヌクレオチド上のビニル基と標的遺伝子中のシチジン上のアミノ基とが共有結合を形成することによると考えられる。
したがって、本発明によれば、ある特定の遺伝子の発現を抑制する系で有用なオリゴヌクレオチドのコンジュゲートが提供される。具体的には、本発明によれば、一般式（Ａ）：
ＦｕＮＴ−Ｌ_１−Ｌ_２−ＰＥＧ （Ａ）
式中、ＦｕＮＴはリボースの３′もしくは５′ヒドロキシル基末端においてリン酸エステル結合を介してＬ_１−Ｌ_２−ＰＥＧに結合した機能性オリゴヌクレオチドの残基を表し、ここで機能性オリゴヌクレオチドは、
ａ） 標的遺伝子の発現に関与するヌクレオチド配列に対して、相補的であるかまたはストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列からなり、かつ、該オリゴヌクレオチド配列中に存在する少なくとも１個の２−アミノプリン環の６位に、式−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ（Ｏ）_ｎＲ（ここで、ｎは０〜２の整数を表し、Ｒはオキシ（＝Ｏ）、シアノもしくはカルボキシで置換されていてもよいＣ_１−Ｃ_６アルキルまたはオキシ（＝Ｏ）、シアノ、ニトロ、カルボキシ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルもしくはハロで置換されていてもよいフェニルを表す。）を有するか、あるいは
ｂ） 標的遺伝子の発現に関与するヌクレオチド配列に対して、相補的であり、かつ、各ヌクレオチドのホスフェート部がホスホロチオエート、ホスホロアミデートおよび２′−Ｏ−メチルホスホエートの形態にあるものからなる群より選ばれるものであり、
Ｌ_１は酸素原子もしくは硫黄原子により１もしくは２以上の箇所で中断されていてもよい総原子数３〜３０のアルキレン基を表し、
Ｌ_２は生理学的条件下で開裂しうる連結基を表し、そして
ＰＥＧはＬ_２との末結合末端に、連結基を場合により介して、水素原子、アルキル基、アラルキル基、官能基もしくはリガンドの残基を担持するポリ（エチレンオキシド）基を表す、
で表されるオリゴヌクレオチドとポリエチレンオキシドのコンジュゲートが、提供される。
また、本発明によれば、該コンジュゲートとポリカチオン性セグメントを含むポリマーとのポリイオン複合体（ＰＩＣ）も提供される。
以下、本発明をより具体的に記述する。
本発明に従う、コンジュゲートおよびポリイオン複合体は、ある特定の遺伝子の発現を抑制することを主たる目的とするものである。したがって、機能性オリゴヌクレオチドは特定の遺伝子（または標的遺伝子）の発現に関与するヌクレオチド配列に対して、相補的であるか、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる配列を含むものである。本発明に関連して、標的遺伝子の発現に関与するヌクレオチド配列とは、特定のコーディング配列およびそれらの転写や翻訳に関与する遺伝子またはその遺伝子領域における配列をも包含する。したがって、これらの配列に相補的である配列（一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチド）には、限定されるものでないが、標的遺伝子の転写の阻害、ＲＮＡプロセシング阻害、ｍＲＮＡの核からの移行阻害、翻訳阻害をもたらすものが挙げられる。
特に、上記のａ）に分類できる機能性オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド配列中に、式（Ｂ）：

（式中、ｎは０〜２の整数を表し、Ｒはオキシ（＝Ｏ）、シアノ（−ＣＮ）、ニトロ、カルボキシで置換されていてもよいＣ_１〜Ｃ_６アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル等）またはオキシ、ニトロ、カルボキシ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル（例えば、メチル）もしくはハロ（例えば、フッ素、塩素）で置換されていてもよいフェニルを表す。）
の機能性ヌクレオチド単位を少なくとも１個有し、このような単位における−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ（Ｏ）_ｎＲ基を利用して、標的遺伝子の相補的なオリゴヌクレオチド配列におけるシトシンのアミノ基（−ＮＨ_２）との間で共有結合を形成しうる。また、この機能性ヌクレオチド単位は、機能性オリゴヌクレオチド鎖中のいかなる位置に存在していてもよい。このような共有結合は、標的遺伝子と機能性オリゴヌクレオチドとが水性媒体または生理学的環境下で接触した場合に、−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ（Ｏ）_ｍＲが−ＣＨ＝ＣＨ_２に変換され、次いでアミノ基と反応することにより形成されるものと理解されている。
しかし、機能性オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が標的遺伝子の特定のヌクレオチド配列に、必ずしも完全に相補的でない場合であっても、ストリンジェントな条件下（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８９，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの１．１０１〜１．１０４頁参照）で該遺伝子にハイブリダイズしうる限り、配列特異的な結合がもたらされるので、このような機能性オリゴヌクレオチドも本発明の範囲内にある。
他方、上記のｂ）に分類される機能性オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのホスフェート結合が、それぞれ式（Ｃ）〜（Ｅ）：

で表されるようなホスホロチオエート、ホスホロアミデートおよび２′−Ｏ−メチルホスホエート結合に誘導されたものである。
本発明にいうオリゴヌクレオチドは、所謂、「オリゴ」が意味する数個から１０数個のヌクレオチドからなるものに限定されず、最大、２００個までのヌクレオチドからなるものも包含する。しかし、オリゴデオキシヌクレオチドにあっては、１０〜５０のヌクレオチドを含むものが好ましい。
また、各ヌクレオチド間のホスホジエステル結合の向きは、通常、３′→５′もしくは５′→３′であるが、ヌクレオチドの種類によっては、２′→５′もしくは５′→２′であってもよく、また、これらの結合様式が混在していてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡを構成するいずれのものであってもよい。
このようなオリゴヌクレオチドには、通常のＤＮＡおよびＲＮＡの方向付けに基づいて、３’末端側（すなわち、リボースの５’位はリン酸ジエステル結合に関与している。）の３’ヒドロキシル基か、または５’末端側（すなわち、リボースの３’位はリン酸ジエステル結合に関与している。）の５’ヒドロキシル基を介するリン酸エステル結合を形成するように式−Ｌ_１−Ｌ_２−ＰＥＧで表される基が共有結合される。
該式中のＬ_１は、酸素もしくは硫黄原子、または−ＮＨＣＯ−、好ましくは酸素原子により１もしくは２以上の箇所で中断されていてもよい総原子数３〜３０のアルキレン基であることができる。このようなアルキレン基は、分岐していてもよく、したがって、限定されるものでないが、
−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２（ＣＨ_３）ＣＨ−、−ＣＨ_２（ＣＨ_２）_２ＣＨ_２−、
−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、

−ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_２ＯＨ）ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨＣＯＣＨ_２ＣＨ_２−等が例示される。
Ｌ_２は連結基を表し、本発明の目的に沿う限り、ＦｕＮＴ−Ｌ_１部とＰＥＧ部とを連結しうるいかなる基、例えば、アルキレン基（上記の例示を参照。）、アリレン基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＳＳ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯ−ＮＨ−、−ＳＯ−から選ばれる１種以上からなるものであってもよい。限定されるものでないが、Ｌ_２の例としては、−ＳＳ−、−ＳＣＨ_２ＣＨ_２−ＣＯＯ−、−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯ−、−ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯ−、−ＳＣＨ_２ＣＨ_２−ＣＯＯＣＨ_２−、−ＳＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯ−が挙げられる。このような連結基のうち、生理学的条件下（動物の組織、細胞、体液等に含まれるペプチダーゼ、エステラーゼ、還元性物質等の存在下）で開裂されうる基、例えば−ＳＳ−基、−ＣＯＯ−もしくは−ＯＣＯ−基を連結基内に少なくとも１個含むものが好ましい。特に、エンドソームのｐＨ（＝５．５）で開裂しうる連結基を１個含むものが好ましい。
−ＰＥＧは未結合末端（Ｌ_２との結合末端のもう一方の末端）に連結基を場合により介して、水素原子、アルキル基、アラルキル基、官能基もしくはリガンドの残基を担持するポリ（エチレンオキシド）基を表す。具体的には、−ＰＥＧは、式（Ｆ）：
−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｌ_３−Ｘ （Ｆ）
式中、Ｌ_３は単結合または上記のＬ_１もしくはＬ_２について定義したのと同義のアルキレン基もしくは連結基から選ばれる連結基であり、
Ｘは水素原子もしくは、アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、ブチル、またはヘキシル等）、アラルキル基（例、ベンジル、フェネチル等）、ヒドロキシル基、アルデヒド（もしくはホルミル基：−ＣＨＯ）、アセタール化ホルミル基、アミノ基、保護されたアミノ基、マレイミド基、カルボキシル基および保護されたカルボキシル基（なお、「保護された」と称する場合の保護基は、限定されるものでないが、ペプチド合成で慣用されるアミノ基およびカルボキシル基に対する保護基を意味する。）からなる群より選ばれる官能基または該官能基を介して結合したリガンド（例、糖、ビオチン、ハプテン、ホルモン、または酵素の基質等）の残基であり、そして
ｎは５〜５００の整数である、
で表されるポリ（エチレンオキシド）基である。
式（Ｆ）または−Ｌ_２−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｌ_３−Ｘをもたらすポリ（エチレンオキシド）誘導体は、本発明者らの一部によって提案されたヘテロテレケリック親−疎水性ブロックコポリマーを製造する際の、中間段階である、ポリ（エチレンオキシド）セグメントの形成に従って（例えば、ＷＯ ９６／３３２３３、ＷＯ ９６／３２４３４、ＷＯ ９７／０６２０２、前述の特許文献１および２参照。）、または必要により、それらに当業技術分野で周知の技法を加えて製造することができる。
限定されるものでないが、典型的なポリ（エチレンオキシド）誘導体の製造法は次に示す反応スキームに従って実施できる。
スキーム１：

スキーム２：

以上の反応スキームに示す各反応段階の条件は、前述の特許文献１を参照できる。
次に、一般式（Ａ）におけるＬ_２に−ＳＳ−結合または−ＣＯＯ−結合を有するオリゴヌクレオチドとポリエチレンオキシドのコンジュゲートは、例えば、次に示す反応スキームに従って製造できる。
スキーム３：

スキーム４：

上式中、ｏｌｉｇｏ−ＦｕＮＴは、上記の機能性オリゴヌクレオチドについて定義したａ）およびｂ）に分類されるものであることができる。
ａ）に分類されるものは、非特許文献４または特許文献１に記載された方法に基づいて取得でき、またｂ）に分類されるものは、非特許文献３に記載された方法に基づいて取得できる。また、ｏｌｉｇｏ−ＦｕＮＴ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＨの取得には、非特許文献２に記載の方法を参考にすることができる。
本発明の機能性オリゴヌクレオチドが標的とする遺伝子は、本発明の目的に沿う限り、如何なる遺伝子であってもよいが、好ましくは、動物の病原遺伝子およびそれらの発現に関与するＤＮＡまたはＲＮＡ部分であることができる。限定されるものでないが、標的遺伝子には、非小細胞肺癌などに関係のあるＰＫＣα、悪性黒色腫などに関係のあるＢＣＬ−２、クローン病に関係のあるＩＣＡＭ−１、Ｃ型肝炎に関係のあるＨＣＶ、関節リウマチ、乾鮮に関係のあるＴＮＦα、喘息に関係のあるアデノシンＡ１受容体、卵巣癌などに関係のあるｃ−ｒａｆ ｋｉｎａｓｅ、膵臓癌などに関係のあるＨ−ｒａｓ、冠動脈疾患癌に関係のあるｃ−ｍｙｃ、大腸癌に関係のあるＰＫＡ ＲＩα、エイズに関係のあるＨＩＶ、固形癌に関係のあるＤＮＡメチル−トランスフェラーゼ、癌に関係のあるＶＥＧＦ受容体、腎臓癌に関係のあるリボヌクレオチド還元酵素、ＣＭＶ性網膜炎に関係のあるＣＭＶ ＩＥ２、前立腺癌に関係のあるＭＭＰ−９、悪性グリオーマに関係のあるＴＧＦβ２、多発性硬化症に関係のあるＣＤ４９ｄ、糖尿病に関係のあるＰＴＰ−１Ｂ、癌に関係のあるｃ−ｍｙｂ、乳癌などに関係のあるＥＧＦＲ、癌に関係のあるｍｄｒ１およびＧＬＵＴ−１の遺伝子を挙げることができる。そしてこれらの遺伝子の発現を効果的に抑制することのできるアンチセンス配列も、それ自体公知の配列のものを利用できる。
こうして取得される本発明に従うコンジュゲートは、必要により、さらにリガンドを付する反応に供してもよい。例えば、上記の（ｆ）または（ｇ）で表されるコンジュゲートのアセタール化ホルミル基［（ＣＨ_３ＣＨ_２Ｏ）ＣＨ−］を酸加水分解に供してホルミル基（−ＣＨＯ）に転化し、次いで、必要によりアミノ基を導入するかもしくはアミノ基を保持するリガンドとの反応により、リガンドをコンジュゲートに導入することもできる。
これらのコンジュゲートは、ポリカチオン性セグメントを含むポリマーと水性媒体（例えば、緩衝化された生理食塩水、等）中でＰＩＣを形成し、自動的に会合（または自己集成）してＰＩＣミセルを形成し得る。このようなＰＩＣまたはＰＩＣミセルも本発明の一態様である。本発明によれば、ポリカチオン性セグメントを含むポリマーとしては、ポリカチオン性セグメントがポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリメタクリル酸ジ−Ｃ_１−３アルキルアミノエチル、オリゴアルギニン、ｔａｔおよびＫＡＬＡからなる群より選ばれるホモポリマー、さらには、該ポリカチオン性セグメントとポリ（エチレンオキシド）セグメントを含有するブロックコポリマーを挙げることができる。
これらのポリマーは、一部は市販されており、それらをそのまま用いるか、また、非特許文献１等を参考に取得したものを用いることができる。
上記のＰＩＣミセルは、希薄な水溶液でも安定に機能性オリゴヌクレオチドとポリ（エチレンオキシド）のコンジュゲートをミセル内に保持することができる。また、該ＰＩＣミセルは動物細胞に効果的に取り込まれ、エンドソームのｐＨ（＝５．５）の環境下で該コンジュゲートから機能性オリゴヌクレオチドを開裂して放出でき、しかも上記のａ）に分類される機能性オリゴヌクレオチドは配列特異的に標的遺伝子に共有結合の形成を介して架橋しうるので、該遺伝子の発現をより確実に抑制できる。したがって、上記のＰＩＣミセルはｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ−ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの系での遺伝子の発現を制御するのに使用できるとともに、遺伝子治療の分野でも有用である。

図１のａ）は、ＰＥＧと機能性オリゴヌクレオチドとの反応におけるＨＰＬＣ変化（０時および４時間後）を示すチャートであり、ｂ）は、ＰＥＧ−修飾オリゴヌクレオチコンジュゲート（２−カルボキシフェニルスルフィド体）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。
図２は、本発明に従うコンジュゲートおよび該コンジュゲートとＰＩＣミセルのアンチセンス効果の結果を示すグラフである。縦軸は、ホタルルシフェラーゼの発現量／ウミシイタケルシフェラーゼの発現量（％）を表し、横軸に示す（１）〜（１２）は、実施例２を参照されたい。
図３は、本発明に従う、リガンド（ラクトース）を有するコンジュゲートとポリリジンからなるＰＩＣミセルのアンチセンス効果を示すグラフである。縦軸は、ホタルルシフェラーゼの発現量／ウミシイタケルシフェラーゼの発現量（％）を表し、横軸は、ＰＥＧ−機能性オリゴヌクレオチドコンジュゲートを表す。黒塗りバーは、ラクトースありＳＰｈコンジュゲートのＰＩＣミセルに関し、そして白抜きバーは、ラクトースなしＳＰｈコンジュゲートのＰＩＣミセルに関する結果である。
以下、具体的な態様を挙げてさらに本発明を説明する。
参考製造例１：アセタール−ＰＥＯ−アクリレートの製造

アルゴン下、ナスフラスコ中、室温において、開始剤３，３−ジエトキシ−１−プロパノール１．０ｍｍｏｌ（０．１６ｍＬ）を溶媒テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２５ｍｌにマイクロシリンジで加え、Ｋ−ナフタレン１．０ｍｍｏｌ（０．３２５ｍｏｌ／１−ＴＨＦ溶液、３．１ｍＬ）を加えて１０分間メタル化を施した。次いで、エチレンオキシド１１０ｍｍｏｌ（５．５ｍＬ）を加えて水冷下で２日間撹拌し、アニオン開環重合を行った。その後、トリエチルアミンを３倍モル量３．０ｍｍｏｌ（０．４２ｍＬ）と停止剤としてアクリロイルクロライドを３倍モル量３．０ｍｍｏｌ（０．２４ｍＬ）を順次加え、室温において１日停止反応を行った。その後、２−プロパノール沈澱（２ｌ）、遠心分離（５０００×ｇ、４５分間）、減圧乾燥、ベンゼン凍結乾燥により精製を行った。この生成物の収量は５．０ｇ（９８％）であった。
ゲルパーミエーションクロマトグラフィーの測定により、得られたポリマーは単峰性であり、その数平均分子量は４８３０であり、仕込み分子量５０８０とほぼ一致していることが確認できた。
同様にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計）の測定においても、得られたポリマーは単峰性であり、その数平均分子量は４４６０であった。また、これらのピークの測定値と計算値を比較した結果、このポリマーはエチレンオキシド骨格を主鎖に有し、α−末端にアセタール基、ω−末端にアクリレート基を有するヘテロテレケリックポリエチレンオキシドであることが確認された。
さらに、得られたポリマーの重ＤＭＳＯ中での^１Ｈ−ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴）スペクトルより、このポリマーの平均分子量は４８７０と計算された。またこのポリマーはエチレンオキシド骨格を主鎖に有し、α−末端にアセタール基、ω−末端にアクリレート基を有するヘテロテレケリックポリエチレンオキシドであることが確認された。

実施例１：アセタール−ＰＥＧ−機能性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの製造

式中、Ｘは、下記式のいずれかで表されるデオキシヌクレオチド誘導体残基である。

２−アミノ−６−ビニルプリンのアミダイト前駆体を用いて２−アミノ−６−ビニルプリンを含む３′末端アミノオリゴマーを合成した。このオリゴマー０．５μｍｏｌを１．５μｍｏｌのマグネシウムモノパーフタレート（ＭＭＰＰ）を用いて酸化し、引き続き反応液をアルカリ性（ｐＨ１０）にすることでビニル基を有する３′末端アミノオリゴマーを効率よく合成した。このオリゴマー０．５μｍｏｌにチオフェノール１０μｍｏｌおよび２−カルボキシチオフェノール２５μｍｏｌを反応させビニル体の安定前駆体であるスルフィド誘導体を合成した。さらに、保護したチオール基を有する活性エステル３−（２−ピリジルチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシイミジル（ＳＰＤＰ）を１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むリン酸緩衝液中（ｐＨ７．５）で反応させ、次いでジチオスレイトールで還元することで、３′末端にチオール基を有する機能性オリゴヌクレオチドを合成した。得られた３′末端にチオール基を有する修飾オリゴヌクレオチド０．２μｍｏｌをＰＥＧ誘導体とリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、５時間反応させた。目的のＰＥＧと機能性オリゴヌクレオチドがコンジュゲーションしたＰＥＧ−機能性オリゴヌクレオチドコンジュゲートが収率よく得られた（図１参照）なお、反応スキームを参照されたい。

実施例２： ＰＥＧ−機能性オリゴヌクレオチドコンジュゲートとポリリジンからなるポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ミセルの製造
ＰＥＧ−機能性オリゴヌクレオチドコンジュゲート６０ｎｍｏｌおよびポリリジン（平均重合度＝１００）１４４ｎｍｏｌを、それぞれ１０ｍＭトリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）に溶解させた後、０．１μｍのフィルターで濾過しゴミを取り除いた。次に、これらの溶液をポリリジンの正電荷とＰＥＧ−機能性オリゴヌクレオチドコンジュゲートの負電荷の比が１（Ｎ／Ｐ＝１）となるように混合した。さらに、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４、０．３Ｍ ＮａＣｌ）を混合液と同量加え、１２時間静置しＰＩＣミセルを形成させた。
実施例３： ＰＥＧ−機能性オリゴヌクレオチドコンジュゲートとポリリジンからなるＰＩＣミセルのアンチセンス効果
２４穴ポリスチレン製細胞培養プレート（ファルコン社製）に、人肝癌細胞（Ｈｕｈ７ ｃｅｌｌ）を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、２４時間培養した後、市販の遺伝子導入試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（１．２２μＬ／ｗｅｌｌ，インビィトロジェン社製）を用い、ホタルルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ（ｐＧＬ３，０．０８４μｇ／ｗｅｌｌ，プロメガ社製）とウミシイタケルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ（ｐＲＬ−ＴＫ，０．７５μｇ／ｗｅｌｌ，プロメガ社製）のレポーター遺伝子を細胞にトランスフェクションした。次に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子に対するアンチセンス配列を有するＰＩＣミセル溶液（実施例２で調製した）、ＰＥＧ−機能性オリゴヌクレオチドコンジュゲート単独および機能性オリゴヌクレオチド単独の溶液を所定量加え（培地濃度換算で５μＭのコンジュゲートとなるように加え）、２４時間細胞と接触させた。培地交換後、さらに２４時間培養した後、細胞を回収し両レポーター遺伝子の発現量をＤｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）により測定しアンチセンス効果を評価した（ｎ＝３）。
比較のために、実施例３と同様の条件で、ＰＥＧ−アンチセンスＤＮＡコンジュゲートとポリリジンからなるＰＩＣミセル、ＰＥＧ−アンチセンスＤＮＡコンジュゲート単独およびアンチセンスＤＮＡ単独のアンチセンス効果も評価した。
結果を図２に示す。図中、コントロール（１）、アンチセンスＤＮＡ単独（２）、ＳＰｈ機能性オリゴヌクレオチド単独（３）、ＰＥＧ−アンチセンスＤＮＡコンジュゲート単独（４）およびＰＥＧ−Ｓｐｈ機能性オリゴヌクレオチドコンジュゲート単独（５）では、アンチセンス効果を全く示さないことが確認された。一方、ＰＩＣミセルでは、アンチセンス効果を示すことが確認された。具体的には、ＳＭｅ構造を有するＰＥＧ−機能性オリゴヌクレオチドコンジュゲートのＰＩＣミセル（８）（約８０％のアンチセンス効果）およびＳＰｈ構造を有するＰＥＧ−機能性オリゴヌクレオチドコンジュゲートのＰＩＣミセル（９）（約８０％のアンチセンス効果）は、ＰＥＧ−アンチセンスＤＮＡコンジュゲートＰＩＣミセル（６）（約５５％のアンチセンス効果）よりも、高いアンチセンス効果を示すことが確認された。
また、ランダムな塩基配列（ホタルルシフェラーゼ遺伝子に関係ない配列）を有するＳＰｈ構造を有するＰＥＧ−機能性オリゴヌクレオチドコンジュゲートのＰＩＣミセル（１０）では、アンチセンス効果を全く示さなかったことから、以上のアンチセンス効果が標的遺伝子特異的なものであることがわかる。
さらに、一塩基ミスマッチ配列有するＰＥＧ−アンチセンスＤＮＡコンジュゲートＰＩＣミセル（１１）のアンチセンス効果は、一塩基ミスマッチを有さないＰＩＣミセルとほぼ同等であったのに対し、一塩基ミスマッチ配列有するＳＰｈ構造を有するＰＥＧ−機能性オリゴヌクレオチドコンジュゲートのＰＩＣミセル（１２）のアンチセンス効果は、一塩基ミスマッチを有さないＰＩＣミセルに比べ著しくアンチセンス効果が低下することが確認されたことから、このＳＰｈ構造を有するＰＥＧ−機能性オリゴヌクレオチドコンジュゲートのＰＩＣミセル（９）が高い配列認識を持っていることが明らかとなった。
実施例３と同様の条件で、ラクトース（リガンド）を有するＳＰｈ構造を有するＰＥＧ−機能性オリゴヌクレオチドコンジュゲートとポリリジンからなるＰＩＣミセルのアンチセンス効果も評価した。
結果を図３に示す。１μＭおよび５μＭのいずれの濃度においても、ラクトースを有するＳＰｈ構造を有するＰＥＧ−機能性オリゴヌクレオチドコンジュゲートＰＩＣミセル（黒塗りバー）のほうが高いアンチセンス効果を示すことが確認された。

本発明に従う、ＰＥＧ−機能性オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、特に、ポリカチオンと安定且つ、標的特異性を示し、各種疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制して、対応する疾患の治療に使用することができ、例えば、医薬製造業で利用できる。

Claims (10)

1. 一般式（Ａ）：
   ＦｕＮＴ−Ｌ_１−Ｌ_２−ＰＥＧ （Ａ）
   式中、ＦｕＮＴはリボースの３′もしくは５′ヒドロキシル基末端においてリン酸エステル結合を介してＬ_１−Ｌ_２−ＰＥＧに結合した機能性オリゴヌクレオチドの残基を表し、ここで機能性オリゴヌクレオチドは、
   ａ） 標的遺伝子の発現に関与するヌクレオチド配列に対して、相補的であるかまたはストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列からなり、かつ、該オリゴヌクレオチド配列中に存在する少なくとも１個の２−アミノプリン環の６位に、式−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ（Ｏ）_ｎＲ（ここで、ｎは０〜２の整数を表し、Ｒはオキシ（＝Ｏ）、シアノもしくはカルボキシで置換されていてもよいＣ_１−Ｃ_６アルキルまたはオキシ（＝Ｏ）、シアノ、ニトロ、カルボキシ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルもしくはハロで置換されていてもよいフェニルを表す）を有するか、あるいは
   ｂ） 標的遺伝子の発現に関与するヌクレオチド配列に対して、相補的であり、かつ、各ヌクレオチドのホスフェート部がホスホロチオエート、ホスホロアミデートおよび２′−Ｏ−メチルホスホエートの形態にあるものからなる群より選ばれるものであり、
   Ｌ_１は酸素原子もしくは硫黄原子により１もしくは２以上の箇所で中断されていてもよい総原子数３〜３０のアルキレン基を表し、
   Ｌ_２は生理学的条件下で開裂しうる連結基を表し、そして
   ＰＥＧはＬ_２との末結合末端に、連結基を場合により介して、水素原子、アルキル基、アラルキル基、官能基もしくはリガンドの残基を担持するポリ（エチレンオキシド）基を表す、
   で表されるオリゴヌクレオチドとポリエチレンオキシドのコンジュゲート。
2. 機能性オリゴヌクレオチドがアンチセンスデオキシオリゴヌクレオチドであって、該デオキシオリゴヌクレオチドにおける少なくとも１個の２−デオキシグアノシンの６位に、式−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ（Ｏ）_ｎＲ′（ここで、ｎは０〜２の整数を表し、Ｒ′はメチルまたはフェニルを表す）を有し、そしてポリ（エチレンオキシド）の数平均分子量が２００〜３００００である請求項１に記載のコンジュゲート。
3. Ｌ_２の生理学的条件下で開裂しうる連結基が主鎖にエステル結合（−ＣＯＯ−）またはジスルフィド結合（−ＳＳ−）を有する請求項１に記載のコンジュゲート。
4. −ＰＥＧが式：
   −（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｌ_３−Ｘ
   式中、Ｌ_３は単結合またはＬ_１もしくはＬ_２について定義したのと同義のアルキレン基もしくは連結基から選ばれる連結基であり、
   Ｘは水素原子もしくは、アルキル基、アラルキル基、ヒドロキシル基、ホルミル基、アセタール化されたホルミル基、アミノ基、保護されたアミノ基、マレイミド基、カルボキシル基および保護されたカルボキシル基からなる群より選ばれる官能基または該官能基を介して結合したリガンドを表し、そしてｎが５〜５００の整数である請求項１〜３のいずれかに記載のコンジュゲート。
5. オリゴヌクレオチドが１０〜５０のヌクレオチドを含むオリゴデオキシヌクレオチドである請求項１に記載のコンジュゲート。
6. ポリカチオン性セグメントを含むポリマーと請求項１に記載のコンジュゲートを含有する複合体。
7. ポリカチオン性セグメントを含むポリマーがホモポリマーまたは該セグメントとポリ（エチレンオキシド）セグメントとを含有するブロックコポリマーである請求項６に記載の複合体。
8. ポリカチオン性セグメントがポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリメタクリル酸 ２−（Ｎ，Ｎ−ジ−Ｃ_１−３アルキルアミノ）エチル、オリゴアルギニン、ｔａｔおよびＫＡＬＡからなる群より選ばれるホモポリマーである請求項６に記載の複合体。
9. 複合体が水性媒体中でポリ（エチレンオキシド）鎖から主として構成されるシエル部と機能性オリゴヌクレオチドから主として構成されるコア部とからなるポリイオン複合体ミセルを形成する請求項６に記載の複合体。
10. 機能性オリゴヌクレオチドがアンチセンスデオキシオリゴヌクレオチドであって、該デオキシオリゴヌクレオチドにおける少なくとも１個の２−デオキシグアノシンの６位に、式−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ（Ｏ）_ｎＲ′（ここで、ｎは０〜２の整数を表し、Ｒ′はメチルまたはフェニルを表す。）を有する請求項６に記載の複合体。

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